JP4025833B2

JP4025833B2 - 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット並びに遺伝子分析装置

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Publication number: JP4025833B2
Application number: JP28415496A
Authority: JP
Inventors: 利夫高間
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2016-10-25
Also published as: DE69724375D1; DE69724375T2; EP0838527B1; EP0838527A1; US6423490B1; JPH10117798A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子、すなわちデオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」という）およびリボ核酸（以下「ＲＮＡ」という）の分析方法に関し、詳しくは、凝集性物質の凝集程度の測定により短時間で簡単に遺伝子の分析を行うことが可能な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット並びに遺伝子分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子工学に関する技術の革新は目覚ましく、特に、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法の開発により、目的とするＤＮＡの大量複製が可能となった。
【０００３】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーなしでは働かないという原理に基づくものであり、試料中のＤＮＡを熱で変性させて一本鎖とし、ついで温度を下げてプライマーを結合させ、この状態で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成するという、一連のサイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡを大量に増幅させるものである。したがって、特定のプライマーを予め化学合成等により準備して用いれば、目的とするＤＮＡを大量に調製することができる。ここで、目的とするＤＮＡが調製されたか否かの判断は、従来、電気泳動法、ドットブロット法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｄＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法およびＰＣＲ−蛍光法等により行われていた。
【０００４】
前記電気泳動法は、電界をかけたゲル中の遺伝子の移動度の差を検出する方法であり、遺伝子の分析方法としては一般的な方法である。前記ドットブロット法は、試料より抽出した遺伝子を段階的に薄めていってニトロセルロースフィルターやナイロン膜に等容量スポットし、放射性同位元素（³²Ｐ）によって標識されたＤＮＡまたはＲＮＡ等とハイブリダイズさせた後、Ｘ線フィルムに露光して解析するか、その後スポットに対応する部分の膜を切り取ってシンチレーションカウンターで計測し対象物の量の増減を診断する方法である。前記ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、放射能（³²Ｐ）標識されたプライマーを用いて試料ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した後、得られた標識ＤＮＡ断片を加熱変性して一本鎖ＤＮＡとし、これを中性のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離して、オートラジオグラフィーによりバンドの位置を検出する方法である。そして、ＰＣＲ−蛍光法は、インターカレーター性蛍光物質の存在下でＰＣＲを行い、その蛍光強度の変化を追跡することによって標的核酸の初期量を求める１段階の測定方法である（医学のあゆみ、Ｖｏｌ．１７３Ｎｏ．１２１９９５．６．１７ｐ９５９−ｐ９６３）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの分析方法は、特別な装置を必要とし、操作が煩雑で時間がかかり、分析方法によっては分析対象遺伝子が限定されるという問題があった。
【０００６】
具体的にいうと、まず、前記電気泳動法では、電気泳動の担体となるゲルを予め調製する作業があり、電気泳動に約７５分の長時間を必要とする。前記ドットブロット法およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ法では、通常、放射性同位元素を用いるため安全性に問題があり、放射性同位元素を用いない方法では、ＤＮＡプローブに蛍光物質または発光物質で標識する必要があるため繁雑となり、また膜転写の操作にも時間がかかる。そして、ＰＣＲ−蛍光法では、蛍光光度計を必要とし、また一本鎖ＤＮＡの検出が困難であるという問題がある。また、これら従来の分析方法に共通する問題として、試料中に遺伝子以外の他の物質が混在すると分析ができないという問題がある。このため、ＰＣＲを行った試料（ＰＣＲ産物）について分析する場合は、予め精製する必要があり煩雑であった。
【０００７】
本発明は、前記従来の問題を解決するためになされたもので、迅速かつ簡単で分析対象遺伝子が限定されない遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット並びに遺伝子分析装置の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と、凝集性物質と、遺伝子結合性凝集促進性物質とを準備し、前記試料に前記遺伝子結合性凝集促進性物質および前記凝集性物質を供給し、前記凝集性物質の凝集程度を測定する。
【０００９】
すなわち、本発明の遺伝子の分析方法では、遺伝子結合性凝集促進性物質が、遺伝子に結合すると、凝集性物質の凝集が促進されないことを利用するものである。したがって、凝集性物質の凝集程度を測定すれば、分析対象試料中の遺伝子の存在の確認やその量を測定できる。そして、この凝集程度の測定は、後述のように、目視や分光光度計による吸光度の測定等により行うことができ、特別の装置を必要とすることなく簡単に行える。このように、本発明の遺伝子の分析方法では、遺伝子結合性凝集促進性物質および凝集性物質の添加、凝集程度の測定という単純な操作で構成されているため、簡単な分析方法となっている。また、凝集性物質の凝集は、１〜２秒の短時間でおこり、凝集程度の測定も短時間で行うことができため、本発明の遺伝子の分析方法は、分析操作全体を短時間で迅速に行うことができる。さらに、本発明の遺伝子の分析方法は、精製を行わないＰＣＲ産物のような他の物質が混在する試料であっても、遺伝子の分析が可能な方法である。
【００１０】
本発明において、「遺伝子結合性凝集促進性物質」とは、遺伝子に結合する性質と、凝集性物質の凝集を促進させる性質とを併せ持ち、遺伝子に結合すれば凝集を促進できなくなる物質をいう。また、本発明において「凝集性物質」とは、前記遺伝子結合性凝集促進性物質により、速やかに凝集する物質をいう。
【００１１】
また、本発明の遺伝子の分析方法において、前記試料に対する前記遺伝子結合性凝集促進性物質および凝集性物質の供給順序は特に限定するものではなく、前記両者を同時に供給してもよく、若しくは前記遺伝子結合性凝集促進性物質を供給した後、前記凝集性物質を供給してもよい。
【００１２】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子としては、例えば、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）等がある。
【００１３】
そして、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料として、ＰＣＲ産物を用いる場合に有効な分析方法となる。先に述べたように、ＰＣＲ法は目的とするＤＮＡを増幅する方法であるが、試料中に目的とするＤＮＡがない場合にはＰＣＲ産物中のＤＮＡ量は微量なものとなる。したがって、ＰＣＲ産物を分析対象試料として本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、凝集性物質の凝集程度を測定することにより、すなわち、凝集の有無を判定することにより、短時間で簡単に目的ＤＮＡが増幅されたか否かが確認できる。また、凝集程度とＤＮＡ量との関係を示す検量線を予め作成しておけば、増幅されたＤＮＡ量を測定することもできる。
【００１４】
この他に、ストランドディスプレースメントアンプリフィケーション法（Ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、リガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮＡの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行った試料にも、本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、ＰＣＲ法の場合と同様に、好結果を得ることができる。
【００１５】
なお、前記ＳＤＡ法としては、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０．Ｎｏ．７１６９１−１６９６に記載の方法があげられる。
【００１６】
また、前記ＬＣＲ法とは、９４℃でも熱変性しない耐熱性ＤＮＡリガーゼを使用することに特徴を有するＤＮＡ増幅法であり、この方法は、ミスマッチをもたない正常人のＤＮＡ試料の場合には用いた２種類のオリゴヌクレオチドがＤＮＡリガーゼによって接続され、つぎの反応サイクルの基質となって次々と増幅されるのに対し、ミスマッチをもつ場合は接続されないためそこで反応が止まってしまうという原理に基づく。
【００１７】
また、前記Ｑβ法は、ＲＮＡレプリカーゼの一種で基質となるＲＮＡと特異性が高いＱβレプリカーゼを用いてＲＮＡを増幅する方法である。具体的には、まず、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの下流にＭＤＶ−１・ＲＮＡ（ＤＮＡ化したもの）をつないだプラスミドベクターを据え、増幅したいＤＮＡ断片をＭＤＶ−１の間に挿入する（２０〜８００ｂｐ程度が挿入可能）。つぎに、制限酵素で切断してからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを働かせ、これをＲＮＡ化する。挿入断片を含んだＭＤＶ−１・ＲＮＡは、以後のＱβレプリカーゼによる複製サイクルを繰り返すことにより増幅させることができる。
【００１８】
さらに、本発明の遺伝子の分析方法の適用範囲はこれらの試料に限定されず、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＣＰＲ法、ＳＩＲ法等によりＤＮＡあるいはＲＮＡの増幅操作を行った試料についてもＰＣＲ法と同様に適用することができる。なお、ＮＡＳＢＡ法はＲＮＡの増幅方法であり、その他の方法はＤＮＡの増幅方法である。
【００１９】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡである場合（前記二本鎖ＤＮＡ増幅試料を含む）、遺伝子結合性凝集促進性物質としては、例えば、下記の式（化１）で表される４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、チアゾールオレンジ、下記の式（化２）で表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）およびアクリジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ I（商品名、モレキュラープローブス社製）があげられる、このなかでも、ＤＡＰＩが好ましい。これは、ＤＡＰＩが二本鎖ＤＮＡとより選択的に複合体を形成し、他の物質、例えばＲＮＡには結合しにくいという性質を持ち、このため、ＲＮＡ等の他の遺伝子が混在する試料であっても、二本鎖ＤＮＡを選択的に検出できるからである。
【００２０】
【化１】

【００２１】
【化２】

【００２２】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子がＲＮＡの場合（前記ＲＮＡ増幅試料を含む）、遺伝子結合性凝集促進性物質としては、例えば、ＥｔＢｒ、チアゾールオレンジ、前記式（化２）で表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）、アクリジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ II （商品名、モレキュラープローブス社製）もあげられる。このなかで、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ II が、よりＲＮＡと選択的に複合体を形成する。
【００２３】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子が一本鎖ＤＮＡの場合、遺伝子結合性凝集促進性物質としては、前記ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ II があげられる。
【００２４】
本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子がＲＮＡとＤＮＡの複合体の場合、遺伝子結合性凝集促進性物質としては、例えば、先に述べた、ＤＮＡ結合性凝集促進性物質、ＲＮＡ結合性凝集促進性物質を使用できる。
【００２５】
本発明の遺伝子の分析方法において、前記凝集性物質としては、銀コロイド、金コロイド、銅コロイドおよびラテックスが好ましい。これらは、作製が簡単で取扱いが容易だからである。前記ラテックスの種類としては、例えば、着色ラテックス、カルボキシル化ラテックス、アミノ化ラテックスがあげられる。なお、前記銀コロイド等は、市販品を使用してもよいし、常法により調製して使用してもよい。
【００２６】
本発明の遺伝子の測定方法において、目的とする遺伝子の検出を行う場合は、前記凝集程度の測定を、目視による測定で行うことが簡単で好ましい。また、本発明の遺伝子の測定方法において、目的とする遺伝子の量や濃度を測定する場合は、前記凝集程度の測定を、分光光度計による吸光度の測定により行えば、正確な測定ができて好ましい。
【００２７】
そして、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性凝集促進性物質を含有する試薬Ｒ１と、凝集性物質を含有する試薬Ｒ２とを備える。このキットを用いれば、本発明の遺伝子の分析方法が、さらに迅速かつ簡単に実施できるようになる。
【００２８】
また、本発明の遺伝子分析装置は、遺伝子結合性凝集促進性物質を含有する試薬Ｒ１を分析対象試料に供給する手段と、凝集性物質を含有する試薬Ｒ２を前記試薬Ｒ１が供給された分析対象試料に供給する手段と、前記試薬Ｒ１およびＲ２が添加された前記分析対象試料中の前記凝集性物質の吸光度を測定する光学測定系とを備える装置である。この装置を用いることにより、遺伝子分析を自動的に行うことが可能となる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明の遺伝子の分析方法の実施の形態について説明する。
【００３０】
図１に、本発明を、ＰＣＲを行った試料に適用した例を示す。この図では、右側にターゲットＤＮＡが存在しない試料についてＰＣＲを行った例を、左側にターゲットＤＮＡについてＰＣＲを行った例を、それぞれ示す。
【００３１】
まず、同図（ａ）に示すように、ＤＮＡ試料を準備する。この試料には、ＤＮＡの他に、２つのプライマー１、２と、ＤＮＡポリメラーゼ（図示せず）およびデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ、図示せず）が添加されている。そして、この試料を加熱すると、ＤＮＡが熱変性して一本鎖ＤＮＡに解離する。そして、試料を冷却すると、ターゲットＤＮＡにはプライマー１、２が相補的に結合するが、ターゲットＤＮＡ以外には結合しない。そして、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡでは伸長反応が起るが、ターゲットＤＮＡ以外では、プライマーが結合していないため、伸長反応は起らない。そして、前記の一連の操作を約２０〜３０回繰り返すと同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡは大量に増幅されるが、ターゲットＤＮＡを含まない試料では全く増幅されない。
【００３２】
そして、同図（ｃ）に示すように、試料に遺伝子結合性凝集促進性物質を加えると、２本鎖ＤＮＡ中にインターカレートされて結合する。したがって、図示のように、ターゲットＤＮＡの試料では、二本鎖ＤＮＡが多数存在し、これに前記遺伝子結合性凝集促進性物質がほぼ全部結合する。これに対し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、二本鎖ＤＮＡがほとんど存在しないため、前記遺伝子結合性凝集促進性物質の大部分は、試料中において遊離状態で存在している。そして、同図（ｄ）に示すように、凝集性物質の一つである銀コロイドを試料に添加する。すると、図示のように、ターゲットＤＮＡ試料では、前記遺伝子結合性凝集促進性物質がＤＮＡに結合しているため、前記銀コロイドは、凝集しても僅かであり肉眼による目視観察では無視できるものである。これに対し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、ほとんどの前記遺伝子結合性凝集促進性物質が遊離状態で存在し、これが前記銀コロイドの凝集を促進する。そして、この凝集は、肉眼による目視観察で容易に検出できる。
【００３３】
したがって、銀コロイドの凝集が観察された試料中には、ターゲットＤＮＡが存在しないと判断でき、銀コロイドの凝集が観察されず、観察されたとしても僅かである場合は、試料中にターゲットＤＮＡが存在すると判断できる。このように、本発明によれば、従来の電気泳動法等のように、特別の装置を使用することなく、簡単かつ短時間で遺伝子の分析を行うことができる。
【００３４】
なお、本発明の遺伝子の分析方法において、遺伝子結合性凝集促進性物質（ａ）および凝集性物質（ｂ）の添加割合は、分析対象となる遺伝子の種類等により適宜決定されるが、通常、容積比として、ａ：ｂ＝１：９の割合である。
【００３５】
また、本発明において、分光光度計を用いた吸光度測定により凝集程度を測定する場合、前記吸光度は、凝集性物質の種類により適宜決定される。例えば、銀コロイドの吸光度は３９０ｎｍであり、金コロイドの吸光度は、５２０ｎｍである。
【００３６】
つぎに、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性凝集促進性物質を含有する試薬Ｒ１および凝集性物質を含有する試薬Ｒ２を備える。
前記試薬Ｒ１は、前記遺伝子結合性凝集促進性物質の他に、他の成分を含有してもよい。また、前記試薬Ｒ２も、前記凝集性物質の他に、例えば、ポリリン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、界面活性剤等の安定化剤を含有してもよい。
【００３７】
本発明の遺伝子分析用キットの使用方法は、前述の方法と同様であり、分析対象試料に前記試薬Ｒ１および試薬Ｒ２をこの順序で添加して混合し、この試料中の前記凝集性物質の凝集程度を測定すればよい。このキットを用いれば、予め必要な成分が適量配合されているため、従来のように分析の度に試薬を調製する必要がなくなり、さらに迅速かつ簡単な遺伝子の分析が可能となる。
【００３８】
つぎに、本発明の遺伝子分析装置の構成の一例を図２に示す。図示のように、この装置は、試薬Ｒ１の供給手段１と、試薬Ｒ２の供給手段２と、光学測定系とを備える。前期試薬Ｒ１およびＲ２の供給手段１、２は、通常、ポンプ、ステッピングモーター（またはＤＣモーター）、シリンジ等から構成されており、試薬Ｒ１と試薬Ｒ２とが、この順序で試料に供給されるように制御される。前記光学測定系は、光源３、レンズ４、フィルター６、検出器８、信号増幅機９、演算器（中央処理装置）８および表示器１１とから構成されている。そして、試料を注入するセル５は、レンズ４とフィルター６との間に配置される。
【００３９】
この装置において、遺伝子の分析はつぎのようにして行われる。まず、分析対象試料が注入されたセル５に、供給手段１、２により、試薬Ｒ１およびＲ２が順次供給される。そして、光源３から、照射された特定波長の光が、レンズ４、セル５、フィルター６を、この順序で透過し、検出器８に到達する。この検出器８により、光の強度が電気信号に変換され、この電気信号が信号増幅機９により増幅され、さらに演算器１０により演算処理され、この演算された結果が、表示器１１に表示される。
【００４０】
つぎに、本発明の遺伝子分析装置の他の構成例を図３に示す。この図に示す装置は、スペクトルの差をとる装置であり、基本的構成は図２の装置と同一であり、図２と同一部分には同一符号を付している。
【００４１】
図示のように、この装置は、サンプルの吸光度を測定する系列と、ブランクを測定する系列とを有する。すなわち、まず、分析対象試料が注入されたセル５ａと、精製水あるいはバッファーが注入されたセル５ｂに、供給手段１、２により、試薬Ｒ１およびＲ２がそれぞれ供給される。そして、光源３から照射された特定波長の光が、それぞれ、レンズ４ａ，４ｂ、セル５ａ，５ｂ、フィルター６ａ，６ｂを、この順序で透過し、それぞれ検出器８ａ，８ｂに到達する。そして、これら検出器８ａ，８ｂにより、サンプルおよびブランクの透過光の強度が電気信号に変換され、この電気信号が信号増幅機９ａ，９ｂにより増幅されて、演算器１０に送られる。この演算器１０において、電気信号を演算処理するとともにサンプルの透過光の強度からブランクの透過光の強度が差し引かれ、この結果が、表示器１１に表示される。このように、差スペクトルをとる装置によれば、他の物質の吸光等の影響を排除でき、より正確な結果を得ることができる。
【００４２】
なお、以上の説明において、ＰＣＲにより増幅された二本鎖ＤＮＡを分析対象遺伝子とした例をとりあげたが、本発明はこれに限定するものではなく、この他ＳＤＡ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＬＣＲ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｑβ法により増幅されたＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体等にも適用が可能である。これらの遺伝子を分析する場合も、分析対象の遺伝子に合わせて遺伝子結合性凝集促進性物質を適宜選択して使用する他は、前述と同様の操作を行えばよく、これにより迅速かつ簡単なＲＮＡ等の遺伝子の分析ができる。
【００４３】
【実施例】
つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
【００４４】
（実施例１）
まず、以下に示す成分を精製水に溶解してＰＣＲバッファーを調製した。

【００４５】
そして、このＰＣＲバッファー１０μｌに下記に示す成分を添加して、ＰＣＲ反応液を調製した。なお、下記のプライマー１、２は、下記のλＤＮＡの６０１２塩基対（ｂｐ）部位を増幅するように設計されたプライマーである。
【００４６】

【００４７】
そして、このＰＣＲ反応液を用い、以下のサイクルでＰＣＲを行った。
（ＰＣＲサイクル）
ステップａ（９４℃１０分）：１サイクル
ステップｂ（９４℃１分）→ステップｃ（６８℃４分）：３０サイクル
ステップｄ（６８℃７分）：１サイクル
【００４８】
つぎに、ＤＮＡ精製を行った。すなわち、まず、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１５０ｍＡ，２時間）にかけ、目的のＤＮＡ画分を分離した。そして、目的とするＤＮＡのバンドがあるゲル部分を切り出した。切り出したゲルを、Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ＴＡＥ）バッファーとともに透析チューブに入れてチューブの両端をシーラーで閉じた。この透析チューブを、その長軸が電場の方向と直角方向になるように電気泳動槽内に設置し、槽内をＴＡＥバッファーで満たし、通電した（１５０ｍＡ、３時間）。通電終了後、透析チューブ内のＴＡＥバッファーを回収し、これを遠心管に移し、エタノール沈殿を行った。そして得られた沈殿を蒸留水に溶解し、これを精製ＤＮＡ試料とした。
【００４９】
つぎに、得られた精製ＤＮＡ試料４０μｌにＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０^-4ｍｏｌ／ｌ）１０μｌを加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液（濃度：０．１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、凝集程度を測定した。この測定は、目視による外観観察と、分光光度計での吸光度（３９０ｎｍ）の測定により行った。この結果を、下記の表１に示す。
【００５０】
なお、対照として、ＤＮＡに代えて、蒸留水１μｌを用いた他は、実施例１と同様にしてＰＣＲおよび精製を行い、さらに実施例１と同様にして、ＤＡＰＩおよび銀コロイドを添加し、凝集程度の測定を行った。この結果も下記の表１に示す。
【００５１】
【表１】

【００５２】
前記表１に示すように、λ−ＤＮＡの６０１２ｂｐ部位をＰＣＲで増幅した場合と、増幅しなかった場合（対照）とでは、外観観察および吸光度の測定において、明らかな差異が認められた。これらの結果から、本発明の遺伝子の分析方法により、ＰＣＲ法によりＤＮＡが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別できるといえる。
【００５３】
（実施例２）
濃度８ＯＤのλ−ＤＮＡ（４８５０２ｂｐ）４０μｌに、濃度１０^-4ＭのＤＡＰＩ溶液５μｌを加え、さらに銀コロイド３６０μｌを加えて、実施例１と同様にして凝集程度を測定した。この結果を、下記の表２に示す。
【００５４】
なお、対照として、精製水４０μｌに、濃度１０^-4ＭのＤＡＰＩ溶液５μｌを加え、さらに銀コロイド３６０μｌを加えて、実施例１と同様にして凝集程度を測定した。この結果も下記の表２に示す。
【００５５】
【表２】

【００５６】
前記表２に示すように、λ−ＤＮＡが存在する場合と、存在しない場合（対照）とでは、外観観察および吸光度の測定において、明らかな差異が認められた。
【００５７】
（実施例３）
１本鎖オリゴＤＮＡ（東亜合成化学社、塩基数：３０ｍｅｒ）を準備した。この塩基配列を下記に示す。

【００５８】
つぎに、濃度１ＯＤの前記オリゴＤＮＡ３０μｌに、濃度１０^-4ＭのＤＡＰＩ溶液１０μｌを加え、さらに銀コロイド３６０μｌを加えて、実施例１と同様にして凝集程度を測定した。この結果を、下記の表３に示す。
【００５９】
なお、対照として、精製水３０μｌに、濃度１０^-4ＭのＤＡＰＩ溶液１０μｌを加え、さらに銀コロイド３６０μｌを加えて、実施例１と同様にして凝集程度を測定した。この結果も下記の表３に示す。
【００６０】
【表３】

【００６１】
前記表３に示すように、１本鎖オリゴＤＮＡが存在する場合と、存在しない場合（対照）とでは、外観観察および吸光度の測定において、明らかな差異が認められた。この結果から、本発明の遺伝子の分析方法により、１本鎖オリゴＤＮＡの存在が、迅速かつ簡単に判別できるといえる。
【００６２】
（実施例４）
濃度８ＯＤのλ−ＤＮＡ（４８５０２ｂｐ）４０μｌに、濃度１０^-4ＭのＤＡＰＩ溶液５μｌを加え、さらに金コロイド３６０μｌを加えて、実施例１と同様にして凝集程度を測定した。この結果を、下記の表４に示す。
【００６３】
なお、対照として、精製水４０μｌに、濃度１０^-4ＭのＤＡＰＩ溶液５μｌを加え、さらに金コロイド３６０μｌを加えて、実施例１と同様にして凝集程度を測定した。この結果も下記の表４に示す。
【００６４】
【表４】

【００６５】
前記表４に示すように、λ−ＤＮＡが存在する場合と、存在しない場合（対照）とでは、外観観察および吸光度の測定において、明らかな差異が認められた。
【００６６】
（実施例５）
実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物についてＤＮＡ精製を行わずに、実施例１と同様にしてそのまま凝集程度を測定した。その結果を下記の表５に示す。
【００６７】
なお、対照として、ＤＮＡに代えて、蒸留水１μｌを用いた他は、実施例５と同様にしてＰＣＲを行い、さらに実施例５と同様にして、凝集程度の測定を行った。この結果も下記の表５に示す。
【００６８】
【表５】

【００６９】
前記表５に示すように、λ−ＤＮＡの６０１２ｂｐ部位をＰＣＲで増幅した場合と、増幅しなかった場合（対照）とでは、外観観察および吸光度の測定において、明らかな差異が認められた。これらの結果から、本発明の遺伝子の分析方法により、精製しないＰＣＲ産物についても、ＤＮＡが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別できるといえる。
【００７０】
（実施例６）
各種濃度（３３．５ｍｇ／ｍｌ，２７ｍｇ／ｍｌ，１６．７５ｍｇ／ｍｌ，３．３５ｍｇ／ｍｌ）のλ−ＤＮＡ（４８５０２ｂｐ）８０μｌに、濃度１０^-4ＭのＤＡＰＩ溶液１０μｌを加え、さらに銀コロイド７２０μｌを加え、３９０ｎｍの吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度と吸光度との関係を調べた。この結果を、図４のグラフに示す。
【００７１】
図４のグラフに示すように、ＤＮＡ濃度が高くなるにしたがい、吸光度も直線的に上昇した。このグラフは、検量線として使用できるため、これを用いれば、分析対象試料中のＤＮＡ濃度を測定することが可能となる。
【００７２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝子の分析方法は、電気泳動法等による従来の遺伝子の検出方法と比べて、特別な装置を必要とすることなく、迅速かつ簡単に遺伝子の分析を行うことができ、しかも分析対象の遺伝子の種類を問わない。このため、本発明の分析方法を、例えば、ＰＣＲ法に適用すれば、目的とするＤＮＡの増幅を短時間で簡単に確認することができ、つぎの段階の実験への移行を判断することができる。また、本発明の分析方法は、精製を行わないＰＣＲ産物のように、他の物質が混在している試料であっても、遺伝子の分析が可能である。そして、本発明の分析方法は、その操作が単純であるため、分析を自動化することが可能であり、これによりさらに迅速かつ簡単に遺伝子の分析ができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図（ａ）〜（ｄ）は、本発明の遺伝子の分析方法をＰＣＲに適用した場合の実施例の一連の操作を示す説明図である。
【図２】本発明の遺伝子分析装置の一実施例の構成を示す模式図である。
【図３】本発明の遺伝子分析装置のその他の実施例の構成を示す模式図である。
【図４】本発明の一実施例におけるＤＮＡ濃度と吸光度の関係を示すグラフである。

Claims

遺伝子の分析方法であって、
分析対象試料と凝集性物質と遺伝子結合性凝集促進性物質とを準備すること、
前記試料に前記遺伝子結合性凝集促進性物質及び前記凝集性物質を供給すること、
並びに、前記凝集性物質の凝集程度を測定することを含み、
前記遺伝子結合性凝集促進性物質が、遺伝子に結合する性質と凝集性物質の凝集を促進させる性質とを併せ持ち、かつ、遺伝子に結合すれば凝集を促進できなくなる物質である遺伝子の分析方法。
分析対象となる遺伝子が二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
分析対象試料が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、ストランドディスプレースメントアンプリフィケーション法（ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料およびリガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料から選択された少なくとも一つの試料である請求項１または２記載の遺伝子の分析方法。
分析対象となる遺伝子がリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
分析対象試料が、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮＡの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行った試料である請求項１または４記載の遺伝子の分析方法。
分析対象となる遺伝子が一本鎖ＤＮＡである請求項１記載の遺伝子の分析方法。
分析対象となる遺伝子がＲＮＡとＤＮＡの複合体である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
遺伝子結合性凝集促進性物質が、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、エチジウムブロマイド、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
遺伝子結合性凝集促進性物質が、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された少なくとも一つである請求項１、４および５のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
凝集性物質が、銀コロイド、金コロイド、銅コロイドおよびラテックスからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
凝集程度の測定が、目視による測定である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
凝集程度の測定が、分光光度計による吸光度の測定である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
請求項１から１２のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法を行うためのキットであって、前記遺伝子結合性凝集促進性物質を含有する試薬Ｒ１と、前記凝集性物質を含有する試薬Ｒ２とを備える遺伝子分析用キット。