DE69724375T2

DE69724375T2 - Verfahren zur Messung der Polynukleotidkonzentration

Info

Publication number: DE69724375T2
Application number: DE69724375T
Authority: DE
Inventors: Toshio Nara-shi Takama
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-23
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2017-10-24
Also published as: US6423490B1; JP4025833B2; DE69724375D1; EP0838527B1; EP0838527A1; JPH10117798A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Polynucleotiden, wie Desoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA), in einer Probe unter Verwendung der Agglutination eines Mittels bzw. Wirkstoffs, sowie ein Kit und eine Vorrichtung zur Verwendung bei diesem Verfahren.
Die neueren Innovationen auf dem Gebiet der Gentechnologie sind bemerkenswert. Insbesondere die Entwicklung eines Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Verfahrens ermöglichte die massenhafte Replikation von Ziel-DNA. Das PCR-Verfahren beruht auf dem Prinzip, daß DNA-Polymerase ohne einen Primer nicht arbeitet. Das PCR-Verfahren wird zur Amplifikation von DNA in großen Mengen eingesetzt, indem der folgende Zyklus wiederholt wird: (1) DNA in einer Probe wird hitzedenaturiert, wodurch einzelsträngige DNA entsteht, (2) ein Primer wird unter verringerter Temperatur an die DNA gebunden, und (3) die DNA wird mittels thermostabiler DNA-Polymerase unter diesen Bedingungen hergestellt. Folglich kann die Ziel-DNA in großen Mengen hergestellt werden, indem ein spezifischer Primer eingesetzt wird, der mittels chemischer Synthese oder anderweitig hergestellt wird. Bei diesem Verfahren wird die Replikation der Ziel-DNA in der Regel durch Elektrophorese, ein Dot-Blot-Verfahren, ein PCR-SSCP-(Einzelstrangkonformationspolymorphismus-)Verfahren, ein PCR-Fluoreszenzverfahren oder dgl. überwacht.
Bei der Genanalyse ist Elektrophorese ein gemeinhin angewandtes Verfahren zum Nachweis der Mobilität von Poly nucleotiden in einem Gel in Anwesenheit eines elektrischen Felds. Das Dot-Blot-Verfahren wird verwendet, um zu beurteilen, ob die Menge des Analyten gestiegen ist oder abgenommen hat, mit den folgenden Schritten: (1) Das aus einer Probe gewonnene Polynucleotid wird allmählich verdünnt, und eine äquivalente Menge wird auf ein Nitrocellulosefilter oder eine Nylonfolie punktförmig aufgetragen, (2) mit dem radioaktiven Isotop (³²P) markierte DNA, RNA und dgl. wird mit dem Polynucleotid hybridisiert, und (3) das Polynucleotid wird mit einem Röntgenfilm exponiert und analysiert, oder der Punktbereich der Folie wird nach der Hybridisierung ausgeschnitten und mit einem Szintillationszähler gemessen. Das PCR-SSCP-Verfahren ist ein Verfahren zum Nachweis der Position einer Bande mittels Autoradiographie durch die folgenden Schritte: (1) Proben-DNA wird mit dem PCR-Verfahren unter Verwendung eines mit dem radioaktiven Isotop (³²P) markierten Primers amplifiziert, (2) das erhaltene markierte DNA-Fragment wird hitzedenaturiert, was zu einzelsträngiger DNA führt, und (3) einzelsträngige DNA wird mittels Elektrophorese unter Verwendung eines nativen Polyacrylamidgels getrennt. Das PCR-Fluoreszenzverfahren umfaßt einen ersten Schritt zur Gewinnung einer anfänglichen Menge der Ziel-Nucleinsäure, indem die Änderung in der Fluoreszenzintensität verfolgt wird, nachdem eine PCR in Anwesenheit eines interkalierenden fluoreszierenden Materials durchgeführt wurde (Progress in Medical, Bd. 173, Nr. 12, 17. Juni 1995, Seiten 959–963).
Diese Analyseverfahren leiden jedoch unter dem Nachteil, daß eine spezielle Vorrichtung benötigt wird, die Handhabung kompliziert ist und lange dauert. Außerdem ist die Art des Polynucleotids, das analysiert werden kann, im Hinblick auf das gewählte Analyseverfahren beschränkt.
Genauer gesagt ist Elektrophorese eine komplizierte und langwierige Technik, bei der ein Gel als Träger hergestellt und im Hinblick auf die Größe der DNA ein Gel (eine Gelgröße) ausgewählt werden müssen, für das (die) eine PCR durchgeführt wurde. Üblicherweise dauert die Elektrophorese einer Probe etwa 75 Minuten, und es handelt sich daher nicht um eine schnelle Technik.
Beim Dot-Blot-Verfahren und beim PCR-SSCP-Verfahren gibt es in der Regel aufgrund der Verwendung eines Radioisotops einen Sicherheitsfaktor. Bei dem Verfahren, bei dem kein Radioisotop eingesetzt wird, muß die DNA-Sonde mit einer fluoreszierenden Substanz oder einem lumineszenten Material markiert werden. Dadurch wird das Verfahren kompliziert, und die Handhabung der Übertragung auf Folie ist langwierig. Außerdem wird beim PCR-Fluoreszenzverfahren ein Fluoreszenzphotometer benötigt, und es ist schwierig, einzelsträngige DNA nachzuweisen. Die herkömmlichen Analyseverfahren haben das gemeinsame Problem, daß die Analyse nicht in Anwesenheit anderer Materialien außer Polynucleotid durchgeführt werden kann. Daher sollte eine Probe, mit der eine PCR durchgeführt wurde, (ein PCR-Produkt) vor der Analyse gereinigt werden. Dies macht die Gesamthandhabung langwierig.
Aus der WO 90/02205 ist ein Verfahren bekannt zum Nachweis von Nucleinsäuren in einer Probe durch Bestimmung der Agglutination oder Hemmung der Agglutination von suspendierbaren Teilchen, an die ein Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaars gebunden ist. Das Vorliegen oder Fehlen von Nucleinsäuresequenzen in einer Probe wird bestimmt, indem die Agglutination von Teilchen nachgewiesen wird, an die ein Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaars gebunden ist, der über einen Nucleinsäuresequenzkomplex vernetzt wird, der mit mindestens zwei Mole külen eines Bindungspartners eines spezifischen Bindungspaars markiert ist, die sich in einem geeigneten Abstand voneinander befinden, so daß der Komplex als Brücke zwischen mindestens zwei Teilchen dienen kann, die mit einem zweiten Bindungspartner eines spezifischen Bindungspaars markiert sind.
Die Erfindung strebt eine Lösung dieser und anderer Probleme in den bekannten Techniken zur Messung der Polynucleotidkonzentration in einer Probe an.
Somit stellt die vorliegende Erfindung unter einem Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Polynucleotiden in einer Probe bereit, das die folgenden Schritte umfaßt: (1) Herstellen einer Probe, eines agglutinierenden Mittels und eines Agglutinationsförderers, der an Polynucleotide binden kann, (2) Mischen der Probe, des Mittels und des Förderers und (3) Messen des Grads der Agglutination des Mittels. Vorzugsweise wird das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Polynucleotids verwendet.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Prinzip, daß die Agglutination des Mittels nicht durch den Förderer gefördert wird, wenn dieser an ein Polynucleotid gebunden ist. Daher ist es durch Messen des Grads der Agglutination möglich, das Vorliegen von Polynucleotid in der Probe zu bestätigen und, in einer bevorzugten Ausführungsform, dessen Konzentration zu messen. Die Messung des Grads der Agglutination kann leicht durch Messen der Extinktion mit einem Spektralphotometer oder einfach durch Betrachtung durchgeführt werden. Erfindungsgemäß ist das Mischen der Probe mit dem Mittel und dem Förderer ein einfacher Schritt. Überdies kann das erfindungsgemäße Verfahren als Ganzes in einem kurzen Zeitraum durchgeführt werden, weil die Agglutination des Mittels gewöhnlich in z. B. 1–2 Sekun den erfolgt und die Messung des Grads der Agglutination ebenfalls in einem kurzen Zeitraum ausgeführt werden kann. Außerdem kann die Polynucleotidkonzentration in einer Probe sogar dann durch das erfindungsgemäße Verfahren gemessen werden, wenn andere Materialien als Polynucleotid in der Probe enthalten sind, z. B. ein PCR-Produkt, das nicht gereinigt wurde.
Erfindungsgemäß betrifft der Ausdruck "ein Agglutinationsförderer, der an Polynucleotide binden kann" ein Material, dessen Eigenschaften die Bindung an Polynucleotid und die Förderung der Agglutination des agglutinierenden Mittels sind und das die Agglutination des Mittels nicht fördern kann, wenn es an ein Polynucleotid gebunden ist. Der Begriff "ein agglutinierendes Mittel" betrifft erfindungsgemäß ein Material, das in Gegenwart des Förderers schnell agglutiniert.
Der Förderer und das Mittel können gleichzeitig oder nacheinander zur Probe gegeben werden, z. B. kann der Förderer vor dem Mittel hinzugegeben werden.
Das untersuchte Polynucleotid kann beispielsweise einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, RNA, ein Komplex aus RNA und DNA oder PNA (Peptid-Nucleinsäure) usw. sein. Das erfindungsgemäße Verfahren ist an einer Probe, die dem PCR-Verfahren unterworfen wurde (PCR-Produkt), oder an einer DNA-Probe wirksam. Wie oben erwähnt, wird das PCR-Verfahren zur Amplifikation von Ziel-DNA verwendet. Wenn die Ziel-DNA in der Probe nicht vorliegt, würden Spuren von DNA im PCR-Produkt gefunden. Daher kann durch Messung des Grads der Agglutination gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren einfach und schnell bestimmt werden, ob Ziel-DNA amplifiziert wurde oder nicht. Außerdem kann die Menge der amplifizierten DNA gemessen werden, vorausgesetzt daß zuvor eine Kalibrie rungskurve hergestellt wurde, die den Agglutinationsgrad und die DNA-Menge in Beziehung setzt.
Überdies kann das erfindungsgemäße Verfahren nutzbringend auf Proben angewendet werden, bei denen die DNA-Amplifikation durch das Strang-displacement-Amplifikations-(SDA-)Verfahren oder durch das Ligase-Kettenreaktions-(LCR-)Verfahren durchgeführt wurde und bei denen die RNA-Amplifikation unter Verwendung von Qβ-Replicase (Qβ-Verfahren) durchgeführt wurde. Das SDA-Verfahren umfaßt das in Nucleic Acids Research, Bd. 20, Nr. 7, 1691–1696 beschriebene Verfahren. Das LCR-Verfahren ist das Verfahren, bei dem thermostabile DNA-Ligase verwendet wird, die durch Wärme (sogar bei 94°C) nicht denaturiert wird. Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip, daß bei normalen DNA-Proben ohne Fehlpaarungen die beiden verwendeten Arten von Oligonucleotiden durch die DNA-Ligase gebunden werden, wodurch sie als Substrat im nächsten Reaktionszyklus und in der DNA-Amplifikation wirken. Wenn die DNA Fehlpaarungen aufweist, wird die Reaktion gestoppt, weil die beiden Arten von Oligonucleotiden nicht gebunden werden können.
Eine RNA-Replicase mit hoher Spezifität für Substrat-RNA wird beim Qβ-Verfahren eingesetzt. Zunächst wird der mit MDV-1-RNA (in DNA umwandelbare RNA) verbundene Plasmidvektor stromabwärts des Promotors von T7-RNA-Polymerase eingebracht und das zu amplifizierende DNA-Fragment in MDV-1 inseriert (ein Fragment von etwa 20–800 bp kann dort inseriert werden). Nach Spaltung unter Verwendung eines Restriktionsenzyms wird das DNA-Fragment unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase in RNA umgewandelt. Die MDV-1-RNA, in die das DNA-Fragment eingebracht wurde, kann durch Wiederholen des Replikationszyklus' mit Qβ-Replicase amplifiziert werden.
Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auf Proben nutzbringend angewendet werden, bei denen die Amplifikation von DNA oder RNA durch ein 3SR-Verfahren, ein NASBA-Verfahren, ein CPR-Verfahren, ein SIR-Verfahren oder dgl. durchgeführt wird. Das NASBA-Verfahren ist ein RNA-Replikationsverfahren, die anderen Verfahren sind DNA-Replikationsverfahren.
Zur erfindungsgemäßen Messung der Konzentration von doppelsträngiger DNA (einschließlich einer durch ein DNA-Replikationsverfahren behandelten Probe) kann der Förderer 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) sein, das in Formel 1 nachstehend gezeigt ist, Ethidiumbromid (EtBr), Thiazolorange, Bisbenzimid (Hoechst 33258, Produkt der Hoechst AG), das in Formel 2 nachstehend gezeigt ist, und Acridinorange. Außerdem kann SYBR Green I (Molecular Probes Co., Ltd.) eingeschlossen sein. Vorzugsweise ist das gewählte Mittel DAPI, da es an doppelsträngige DNA bindet und einen Komplex bildet, aber kaum an anderes Material, wie RNA, bindet. Daher kann doppelsträngige DNA selektiv durch DAPI nachgewiesen werden.
Zur erfindungsgemäßen Messung der Konzentration an RNA (einschließlich einer RNA-Amplifikationsprobe) kann der Förderer z. B. EtBr, Thiazolorange, Bisbenzimid (Hoechst 33258, Produkt der Hoechst AG), das in Formel 2 gezeigt ist, und Acridinorange sein. Außerdem kann SYBR Green II (Molecular Probes Co., Ltd.) eingeschlossen sein. Unter den vorstehend genannten Materialien bindet SYBR Green II selektiver unter Bildung eines Komplexes an RNA.
Zur erfindungsgemäßen Messung der Konzentration an einzelsträngiger DNA kann SYBR Green II als Förderer eingesetzt werden.
Zur Messung der Konzentration eines Komplexes aus RNA und DNA kann ein Mittel als Förderer eingesetzt werden, das an DNA und/oder RNA bindet.
Erfindungsgemäß kann das Mittel beispielsweise ein Silberkolloid, ein Goldkolloid, ein Kupferkolloid oder ein Latex sein, das leicht herzustellen und leicht zu behandeln ist. Der Latex kann zum Beispiel ein gefärbter Latex, ein carboxylierter Latex oder ein aminierter Latex sein. Ein kommerzielles Produkt kann beim erfindungsgemäßen Verfahren als Silberkolloid und dgl. eingesetzt werden. Das Silberkolloid und dgl. kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden.
Beim Meßschritt ist bevorzugt, den Grad der Agglutination durch einfache Betrachtung zu messen. Wenn gewünscht ist, die Konzentration an Polynucleotid zu messen, ist es bevorzugt, den Grad der Agglutination durch Messen der Extinktion mit einem Spektralphotometer zu bestimmen, so daß eine genaue Messung möglich ist.
Unter einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Kit bereit, mit einem Reagenz R1, das einen Agglutinationsförderer umfaßt, der an Polynucleotide binden kann und die Agglutination des agglutinierenden Mittels nicht fördern kann, wenn er an Polynucleotide gebunden ist, und einem Reagenz R2, das ein agglutinierendes Mittel umfaßt. Die Messung der Polynucleotidkonzentration kann unter Verwendung dieses Kits schneller und einfacher durchgeführt werden.
Eine Vorrichtung, die sich zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet, umfaßt: (1) Einrichtungen zum Einbringen eines Reagenzes R1 in eine Probe, das einen Agglutinationsförderer umfaßt, der an Polynucleotide binden kann und die Agglutination des agglutinierenden Mittels nicht fördern kann, wenn er an Polynucleotide gebunden ist, (2) Vorrichtungen zum Einbringen eines Reagenzes R2, das ein agglutinierendes Reagenz umfaßt, in das im Schritt (1) hergestellte Gemisch und (3) ein System zur Messung der Extinktion von Strahlung durch die Agglutination. Diese Vorrichtung ermöglicht die automatische Durchführung der Messung der Polynucleotidkonzentration.
Der vorliegenden Beschreibung sind die folgenden Figuren beigefügt
1 zeigt eine Reihe von Handhabungen bei einer Ausführungsform, bei der das erfindungsgemäße Verfahren auf PCR angewendet wurde;
2 ist eine Schemazeichnung einer Vorrichtung, die sich zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet.
3 ist eine Schemazeichnung einer weiteren Vorrichtung, die sich zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet.
4 ist ein Graph, der den Zusammenhang zwischen der DNA-Konzentration und der Extinktion bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform zeigt.
1 zeigt ein Beispiel, bei dem die vorliegende Erfindung auf eine Probe angewendet wurde, mit der eine PCR durchgeführt wurde. Bei dem Beispiel auf der rechten Seite der 1 wurde eine PCR für Proben durchgeführt, in denen keine Ziel-DNA (3) vorlag, und auf der linken Seite wurde eine PCR für Proben durchgeführt, in denen Ziel-DNA (4) vorlag.
Wie in (a) gezeigt, wird zuerst eine DNA-Probe hergestellt. Die Primer (1) und (2) und DNA-Polymerase (in der Figur nicht gezeigt) sowie Desoxyribonucleotidtriphosphat (DNTP, in der Figur nicht gezeigt) werden zu den Proben hinzugefügt. Wenn die Probe erhitzt wird, wird die DNA denaturiert und zu einzelsträngiger DNA dissoziiert. wenn die Probe abgekühlt wird, werden die Primer 1 und 2 komplementär an die Ziel-DNA, aber nicht an andere DNA als die Ziel-DANN gebunden. Wie in (b) gezeigt, erfolgt eine Verlängerung der Ziel-DNA durch die DNA-Polymerase. Dies erfolgt jedoch nicht für andere DNA als die Ziel-DNA, weil die Primer nicht an die DNA gebunden sind. Wenn diese Reihe von Manipulationen etwa 20–30mal wiederholt wurde, ist die Ziel-DNA in großen Mengen amplifiziert, wie in (b) gezeigt. Andere DNA als die Ziel-DNA wird jedoch überhaupt nicht amplifiziert.
Wie in (c) gezeigt, interkaliert der Förderer (5) in doppelsträngige DNA, wenn er zu den Proben hinzugegeben wird. Folglich liegt eine große Menge an doppelsträngiger DNA in der Ziel-DNA-Probe vor, wie in der Figur gezeigt, und fast der gesamte Förderer ist an die doppelsträngige DNA gebunden. Dagegen liegt in der Probe, die keine Ziel-DNA umfaßt, der größere Teil des Förderers in der Probe in freiem Zustand vor, weil es fast keine doppelsträngige DNA gibt. Ein Silberkolloid (6), das als Agglutinierungsmittel wirkt, wird wie in (d) gezeigt zu den Proben gegeben. Wenn der Förderer an DNA in der Ziel-DNA-Probe gebunden ist, wie in der Figur gezeigt, kann das mit dem bloßen Auge sichtbare Silberkolloid als Spuren vernachlässigt werden. Wenn der Förderer dagegen in freiem Zustand in der Probe vorliegt, ist die Agglutination des Silberkolloids verstärkt, und die Agglutination kann durch Betrachtung mit bloßem Auge leicht nachgewiesen werden.
Also kann bestimmt werden, daß keine Ziel-DNA in der Probe vorliegt, in der Agglutination des Silberkolloids beobachtet wird, und daß Ziel-DNA in einer Probe vorliegt, in der Agglutination von Silberkolloid nicht oder in Spuren beobachtet wird. Somit kann erfindungsgemäß eine Polynucleotidanalyse leicht in kurzer Zeit durchgeführt werden, ohne daß wie bei der herkömmlichen Elektrophorese eine spezielle Vorrichtung verwendet wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden gewöhnlich der Förderer (a) und das Agglutinierungsmittel (b) im Volumenverhältnis von a : b = 1 : 9 zugegeben, obwohl das genaue Verhältnis je nach der Art des untersuchten Polynucleotids bestimmt wird.
Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Messung des Grads der Agglutination durch Messen der Extinktion unter Verwendung eines Spektralphotometers durchgeführt wird, wird die Extinktionswellenlänge durch das Agglutinie rungsmittel vorgegeben. Zum Beispiel ist die Extinktion von Silberkolloid 390 nm und von Goldkolloid 520 nm.
Beim erfindungsgemäßen Kit kann das Reagenz R1 andere Materialien als den Förderer umfassen, z. B. Stabilisatoren, wie Polyphosphorsäure, Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Tensid und dgl.
Das Kit kann gemäß dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, d. h. die Reagenzien R1 und R2 werden nacheinander zu der Probe gegeben, miteinander gemischt, und der Grad der Agglutination des Agglutinierungsmittels in der Probe wird gemessen. Das Kit ermöglicht eine schnelle und einfache Durchführung der Messung der Polynucleotidkonzentration, weil die richtige Menge der notwendigen Bestandteile zuvor hergestellt wurde und es somit nicht nötig ist, die Reagenzien jedes Mal herzustellen, wenn die Messung durchgeführt wird, wie bei herkömmlichen Verfahren.
2 zeigt ein Beispiel für eine Vorrichtung, die sich zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet. Die Vorrichtung ist ausgestattet mit Zuleitungseinrichtungen 1 für das Reagenz R1, Zuleitungseinrichtungen 2 für das Reagenz R2 und einem optischen Meßsystem. Die Zuleitungseinrichtungen 1 und 2 umfassen gewöhnlich eine Pumpe, einen Stepper-Motor (oder Gleichstrommotor), eine Spritze usw. und können die Zugabereihenfolge steuern, so daß Reagenz R1 vor Reagenz R2 zur Probe gegeben wird. Die Meßvorrichtung umfaßt eine Lichtquelle 3, eine Linse 4, ein Filter 6, eine Nachweisvorrichtung 8, einen Signalverstärker 9, einen Computer (eine zentrale Verarbeitungseinheit) 10 und eine Anzeige 11. Die Zelle 5, in die die Probe injiziert wird, befindet sich zwischen der Linse 4 und dem Filter 6.
Bei dieser Vorrichtung wird die Messung der Polynucleotidkonzentration wie folgt durchgeführt. Zuerst werden die Reagenzien R1 und R2 nacheinander durch die Zuleitungseinrichtungen 1 und 2 in die Zelle 5 eingeleitet, in die die Probe eingespritzt worden ist. Strahlung von der Quelle 3 mit einer spezifischen Wellenlänge gelangt durch die Linse 4, die Zelle 5 und das Filter 6 in dieser Reihenfolge und erreicht die Nachweisvorrichtung B. Die Lichtintensität wird durch die Nachweisvorrichtung 8 in ein elektrisches Signal umgewandelt, und das elektrische Signal wird durch den Signalverstärker 9 verstärkt. Die mathematische Verarbeitung erfolgt durch den Computer 10, und das Ergebnis der mathematischen Verarbeitung wird auf der Anzeige 11 angezeigt.
3 zeigt eine weitere Vorrichtung, die sich zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet. Die in dieser Figur gezeigte Vorrichtung mißt Differenzspektren. Die Grundbauweise ist identisch mit der Vorrichtung in 2, und in beiden 1 und 2 sind die gleichen Teile mit der gleichen Nummer bezeichnet.
Die Vorrichtung wird mit einer Extinktionsmeßvorrichtung ausgestattet, und das System mißt einen Leerwert. Zunächst werden die Reagenzien R1 und R2 jeweils über die Zuleitungseinrichtungen 1 und 2 in die Zelle 5a, in die die Probe eingespritzt wurde, und in die Zelle 5b eingebracht, in die gereinigtes Wasser oder Pufferlösung injiziert wurde. Als nächstes gelangt das eingestrahlte Licht von der Lichtquelle 3 mit einer spezifischen Wellenlänge durch die Linsen 4a und 4b, die Zellen 5a und 5b und die Filter 6a und 6b in dieser Reihenfolge und erreicht die Nachweisvorrichtungen 8a bzw. 8b. Die Intensität des hindurchgelassenen Lichts in der Probe und im Leerwert wird durch die Nachweisvorrichtungen 8a und 8b in ein elektrisches Signal umgewandelt, und dann wird das elektrische Signal durch die Signalverstärker 9a und 9b verstärkt und in den Computer 10 übertragen. Die mathematische Verarbeitung des elektrischen Signals erfolgt durch den Computer 10, und die Intensität des hindurchgelassenen Lichts vom Leerwert wird von der Intensität des hindurchgelassenen Lichts der Probe abgezogen. Das Ergebnis wird auf der Anzeige 11 angezeigt. Auf diese Weise kann die Wirkung der Absorption durch andere Materialien durch die Differenzspektren beseitigt werden, wodurch ein genaueres Ergebnis erhalten werden kann.
In der vorstehenden Beschreibung ist das Polynucleotid doppelsträngige DNA, die durch PCR amplifiziert wurde. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht auf das Beispiel beschränkt sein. Die vorliegende Erfindung kann ebenso auf doppelsträngige DNA angewendet werden, die durch das SDA-Verfahren oder das LCR-Verfahren amplifiziert wurde, auf RNA, auf mit dem Qβ-Verfahren amplifizierte RNA, auf einzelsträngige DNA oder einen Komplex aus RNA und DNA. Die gleichen Schritte, wie vorstehend erwähnt, können unter Verwendung eines Förderers durchgeführt werden, der gemäß der Art des zu analysierenden Polynucleotids ausgewählt wird, was die schnelle und leichte Bestimmung der Konzentration an Polynucleotid, wie RNA, ermöglicht.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung auf nicht beschränkende Weise veranschaulichen:
Beispiel A
Zunächst wurde ein PCR-Puffer hergestellt, indem die nachstehend gezeigten Reagenzien in gereinigtem Wasser (1 l) gelöst wurden. PCR-Pufferzusammensetzung

Tris-HCl (pH 8,3) 100 mM

KCl 500 mM

MgCl₂ 15 mM
Die PCR-Reaktionslösung wurde hergestellt, indem die nachstehend gezeigten Materialien zu 10 μl PCR-Puffer hinzugefügt wurden. Die nachstehend gezeigten Primer 1 und 2 sind so gestaltet, daß ein Abschnitt von 6012 Basenpaaren (bp) der folgenden λ-DNA amplifiziert wird.
Gemischte Materialien

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2,5 mM): 8 μl
Primer 1 (20 pmol/μl): 1 μl
Sequenz: 5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3'
Primer 2 (20 pmol/μl): 1 μl
Sequenz: 5'-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3'
Taq-DNA-Polymerase (50 U/μl): 0,5 μl
DNA (λ-DNA, 1 μg/ml): 1 μl
destilliertes Wasser: 78,5 μl

Unter Verwendung dieser PCR-Reaktionslösung wurde eine PCR mit dem folgenden Zyklus durchgeführt.
PCR-Zyklus

Schritt a (94°C, 10 Minuten): 1 Zyklus
Schritt b (94°C, 1 Minute) → Schritt c (68°C, 4 Minuten): 30 Zyklen
Schritt d (68°C, 7 Minuten): 1 Zyklus

Eine DNA-Reinigung wurde durchgeführt, d. h. zunächst wurde das PCR-Produkt unter Verwendung eines Agarosegels elektrophoretisch aufgetrennt (150 mA, 2 Stunden), wodurch die Ziel-DNA-Fraktion abgetrennt wurde. Der Gelabschnitt mit der Bande der Ziel-DNA wurde ausgeschnitten und entnommen. Das Gel wurde in einen Dialyseschlauch mit Tris-Acetat-(TAE-)Puffer gegeben, und beide Enden des Schlauchs wurden mit Klemmen verschlossen. Der Dialyseschlauch wurde im Elektrophoresebad so untergebracht, daß die Hauptachse des Dialyseschlauchs sich im rechten Winkel zur Richtung des elektrischen Felds befand. Das Bad wurde mit TAE-Puffer gefüllt und Strom ausgesetzt (150 mA, 3 Stunden). Nach dem Aussetzen gegenüber Strom wurde der aus dem Dialyseschlauch entnommene TAE-Puffer in ein Zentrifugenröhrchen überführt und eine Fällung mit Ethanol durchgeführt. Der Niederschlag wurde in destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung war die gereinigte DNA-Probe.
Als nächstes wurden 10 μl wässrige DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 mol/l) mit 40 μl der DNA-Probe gemischt. 360 μl wässrige Silberkolloidlösung (Konzentration 0,17 mg/ml) wurden mit der Mischlösung gemischt, wobei die Testprobe hergestellt wurde. In der Testprobe wurde der Grad der Agglutination durch Betrachtung mit bloßem Auge und durch Messung der Extinktion (390 nm) unter Verwendung eines Spektralphotometers gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
Als Kontrolle wurden PCR und Reinigung auf die gleiche Weise wie vorstehend durchgeführt, wobei aber 1 μl destilliertes Wasser anstelle von DNA-Lösung eingesetzt wurde. Nach der Zugabe von DAPI und Silberkolloid wurde der Grad der Agglutination wie vorstehend gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde ein Unterschied im Aussehen und in der gemessenen Extinktion zwischen dem Fall, in dem der 6012-bp-Abschnitt der λ-DNA mittels PCR amplifiziert wurde, und dem Fall, in dem der 6012-bp-Abschnitt der λ-DNA mittels PCR nicht amplifiziert wurde (der Kontrolle), eindeutig gefunden. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden kann, um schnell und leicht zu beurteilen, ob DNA mit dem PCR-Verfahren repliziert worden ist oder nicht.
Beispiel B
5 μl DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 M) wurde zu 40 μl λ-DNA (48502 bp) (400 μg (8 OD))) hinzugegeben, gefolgt von 360 μl Silberkolloid. Der Grad der Agglutination wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt.
Als Kontrolle wurden 5 μl DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 M) zu 40 μl gereinigtem Wasser hinzugegeben, und anschließend wurden 360 μl Silberkolloid hinzugefügt. Der Grad der Agglutination wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde ein Unterschied im Aussehen und in der gemessenen Extinktion zwischen dem Fall, in dem λ-DNA vorlag, und dem Fall, in dem keine λ-DNA vorlag (der Kontrolle), eindeutig gefunden.
Beispiel C
Einzelsträngige Oligo-DNA (Toua Synthetic Chemistry Corporation, Basenanzahl: 30mer) wurde hergestellt, deren Basensequenz lautet:
Als nächster Schritt wurden 10 μl DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 M) zu 30 μl der Oligo-DNA (400 μg (10 OD)) gegeben, und dann wurden 360 μl Silberkolloid hinzugefügt. Der Grad der Agglutination wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt.
Als Kontrolle wurden 10 μl DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 M) zu 30 μl gereinigtem Wasser hinzugegeben, und dann wurden 360 μl Silberkolloid hinzugefügt. Der Grad der Agglutination wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde ein Unterschied im Aussehen und in der gemessenen Extinktion zwischen dem Fall, in dem in dem einzelsträngige Oligo-DNA vorlag, und dem Fall, in dem keine einzelsträngige Oligo-DNA vorlag (der Kontrolle), eindeutig gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, daß unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens schnell und leicht beurteilt werden kann, ob einzelsträngige Oligo-DNA vorliegt oder nicht.
Beispiel D
5 μl DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 M) wurde zu 40 μl λ-DNA (48502 bp) (400 μg (8 OD))) hinzugegeben, und anschließend wurden 360 μl Goldkolloid hinzugefügt. Der Grad der Agglutination wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 4 gezeigt.
Als Kontrolle wurden 5 μl DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 M) zu 40 μl gereinigtem Wasser hinzugegeben, und dann wurden 360 μl Goldkolloid hinzugefügt. Der Grad der Agglutination wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde ein Unterschied im Aussehen und in der gemessenen Extinktion zwischen dem Fall, in dem λ-DNA vorlag, und dem Fall, in dem keine λ-DNA vorlag (der Kontrolle), eindeutig gefunden.
Beispiel E
Eine PCR wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A durchgeführt, wobei ein PCR-Produkt erhalten wurde. Der Grad der Agglutination im PCR-Produkt wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel A gemessen, ohne die DNA zu reinigen. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 gezeigt.
Als Kontrolle wurde die PCR auf die gleiche Weise wie vorstehend durchgeführt, wobei aber 1 μl destilliertes Wasser anstelle von DNA-Lösung eingesetzt wurde. Außerdem wurde der Grad der Agglutination auf die gleiche Weise wie vorstehend gemessen. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Wie in Tabelle 5 dargestellt ist, wurde ein Unterschied im Aussehen und in der gemessenen Extinktion zwischen dem Fall, in dem der 6012-bp-Abschnitt der λ-DNA mittels PCR amplifiziert wurde, und dem Fall, in dem der 6012-bp-Abschnitt der λ-DNA mittels PCR nicht amplifiziert wurde (der Kontrolle), eindeutig gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, daß es unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sogar in einem nicht gereinigten PCR-Produkt möglich ist, schnell und leicht zu beurteilen, ob DNA repliziert worden ist oder nicht.
Beispiel F
10 μl DAPI-Lösung (Konzentration: 10^–4 M) wurde zu 80 μl λ-DNA (48502 bp) mit verschiedenen Konzentrationen (33,5 mg/ml, 27 mg/ml, 16,75 mg/ml, 3,35 mg/ml) hinzugegeben, und dann wurden 720 μl Silberkolloid hinzugefügt. Die Extinktion bei 390 nm wurde gemessen, und die Beziehung zwischen der DNA-Konzentration und der Extinktion wurde untersucht. Das Ergebnis ist in 4 gezeigt.
4 zeigt, daß mit steigender DNA-Konzentration die Extinktion linear anstieg. Der Graph kann als Kalibrierungskurve verwendet werden, die zur Messung der DNA-Konzentration in einer unbekannten Probe eingesetzt werden kann.

Claims

Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Polynucleotiden in einer Probe, mit den folgenden Schritten: (a) Herstellen einer Probe, eines agglutinierenden Mittels und eines Agglutinationsförderers, der an die Polynucleotide binden kann, (b) Mischen der Probe, des agglutinierenden Mittels und des Agglutinationsförderers und (c) Messen des Grads der Agglutination des Mittels, dadurch gekennzeichnet, daß der Agglutinationsförderer die Agglutination des agglutinierenden Mittels nicht fördern kann, wenn er an die Polynucleotide gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Konzentration der Polynucleotide gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem die Polynucleotide doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure (DNA) sind.
Verfahren nach Anspruch 3, in dem die Probe eine oder mehrere der Proben ist, die aus der Gruppe bestehend aus einer durch das Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Verfahren behandelten Probe, einer durch das Strangdisplacement-Amplifikations- (SDA-) Verfahren behandelten Probe und einer durch das Ligase-Kettenreaktions- (LCR) Verfahren behandelten Probe ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem die Polynucleotide Ribonucleinsäure (RNA) sind.
Verfahren nach Anspruch 5, in dem die Probe nach dem Qβ-Verfahren mit Qβ-Replicase behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem die Polynucleotide einzelsträngige DNA sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem die Polynucleotide ein Komplex aus RNA und DNA sind.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, in dem der Förderer einer oder mehrere aus der aus 4',6-Diamidino-2-phenylindol, Ethidiumbromid, Bisbenzimid und Acridinorange bestehenden Gruppe ausgewählten Förderer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 5 oder 6, in dem der Förderer einer oder mehrere aus der aus Ethidiumbromid, Thiazolorange, Bisbenzimid und Acridinorange bestehenden Gruppe ausgewählten Förderer ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, in dem das Mittel eines oder mehrere aus der aus Silberkolloid, einem Goldkolloid, einem Kupferkolloid und einem Latex bestehenden Gruppe ausgewählten Mittel ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, in dem Schritt (c) mittels visueller Betrachtung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, in dem Schritt (c) mittels Messen der Extinktion von Strahlung unter Verwendung eines Spektralphotometers durchgeführt wird.
Kit zur Bestimmung der Konzentration von Polynucleotiden in einer Probe, mit einem Reagenz R1, das einen Agglutinationsförderer umfaßt, der an die Polynucleotide binden kann, und einem Reagenz R2, das ein agglutinierendes Mittel umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der Agglutinierungsförderer die Agglutination des agglutinierenden Mittels nicht fördern kann, wenn er an die Polynucleotide gebunden ist.