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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation und Identifikation von Nukleinsäurese- quenzen, Oligonukleotidprimer, einen Chip zur Analyse von zumindest einer Nukleinsäuresequenz, und einen Analysekit entsprechend den Merkmalen in den Oberbegriffen der Ansprüche 1,4, 6,7 und 17 sowie die Verwendung des Chip bzw. des Analysekits entsprechend den Ansprüchen 18 bis 21.
Eine Vielzahl von Krankheiten wird durch bakterielle Infektionen verursacht, so unter anderem auch Parodontitis, insbesondere Periodontitis, eine entzündliche, durch bakterielle Beläge verur- sachte, Erkrankung aller Anteile des Parodontiums mit fortschreitendem Verlust von Stützgewebe.
Parodontitis ist ein häufiges Problem, dass einen grossen Prozentsatz der Bevölkerung betrifft.
Durch den Einsatz von Antibiotika ist die Erkrankung in der Regel gut therapierbar. Allerdings führt gerade in letzter Zeit die häufige und teilweise ungezielte Verwendung von Antibiotika zur Behand- lung diverser Erkrankungen zu einer Zunahme von Resistenzbildungen vieler Bakterien. Weiters erfordert ein verzögerter bakteriologischer Befund zunächst eine Breitspektrum-antibiotische The- rapie, die für den Patienten mehr Nebenwirkungen bedeutet und teuerer ist. Ausserdem können über den Umweg einer unspezifischen antibiotischen Therapie weitere therapeutische Massnahmen erforderlich werden was demzufolge eine verringerte Effektivität, einen protrahierten Krankheitsve r- lauf und eine ineffiziente Ausnützung der ohnehin im Gesundheitssystem begrenzt zur Verfügung stehenden Ressourcen bedeutet.
Aus diesen Gründen ist der richtige bakteriologische Befund für die zielführende Therapie massgebend. Die Identifikation der pathogenen Bakteriengattung bzw.
-art führt sowohl zur Optimierung der Diagnose als auch zum gezielten Einsatz des entsprechen- den Antibiotikums. Auch der Zeitfaktor in der Diagnoseerstellung spielt für den Krankheitsverlauf eine wichtige Rolle. Aufwendige diagnostische Tests, die nur in speziell ausgestatteten Labors durchgeführt werden können, und eine langsame und ungenaue Diagnoseerstellung führen einer- seits durch den Aufwand von hochqualifiziertem Personal für das Labor zu hohen Kosten anderer- seits durch die ungezielte Therapie der Erkrankung zu volkswirtschaftlichem Schaden. Es wird daher versucht die Methoden zur Identifikation von Bakteriengattungen und-arten so einfach und so rasch wie möglich zu gestalten und trotzdem die Korrektheit der Ergebnisse zu gewährleisten.
Undeutliche und somit nicht aussagekräftige Analyseergebnisse erfordern schlimmstenfalls die Wiederholung der Probenentnahme einschliesslich deren erneute Analyse und steigern somit die Kosten und den Zeitaufwand. Um diese Vorkommnisse zu vermeiden, wurden im Stand der Tech- nik bislang verschiedenste Lösungen vorgeschlagen.
So dienen z. B. mikroskopische Untersuchungen zur schnellen Analyse. Sie lassen eine Beur- teilung nach morphologischen Merkmalen wie Form, Grösse, Pseudozellverbänden, Färbeverhal- ten, Vorhandensein von Flagellen bzw. einer Kapsel und Sporenbildung zu. Eine Anwendung zur Beurteilung morphologischer Merkmale besteht darin, dass, wie beispielsweise in der WO 93/25903 A aufgezeigt, morphologische Veränderungen von polymorphonuklären Leukozyten von Zahnpatienten nach Inkubation mit Porphyromonas gingivalis mit polymorphonuklären Leuko- zyten von gesunden Personen verglichen und analysiert werden. Diesen Untersuchungsmethoden haftet jedoch der Nachteil an, dass Bakterienarten mit ähnlichen morphologischen Merkmalen nur ungefähr klassifiziert werden können.
Die Zuordnung der Bakterien mit ähnlichen morphologischen Merkmalen hängt auch vom jeweiligen Laboranten ab und dadurch wird nur eine sehr ungenaue Analyse der Bakterienarten ermöglicht.
Mikrobiologische Untersuchungen ermöglichen durch den Nachweis physiologischer Merkmale mit Indikatormedien, die z. B. eine Änderung des pH-Werts anzeigen, eine genaue Bestimmung der Bakteriengattung bzw.-art. Der Nachteil, der in mikrobiologischen Analysesystemen zu sehen ist, ist dass nur Lebendkeime nachzuweisen sind, was eine sorgfältige Probenentnahme und einen entsprechenden Probentransport erfordert, und weiters, dass die Analyse mehrere Tage bis Wo- chen dauert.
Serologische Untersuchungen können Proteinbestandteile von Bakterien, welche mit Antikör- pern reagieren, nachweisen. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern ermöglicht den Nachweis von einzelnen Bakteriengattungen und-arten. Antikörper gekoppelte Enzym-Reaktionen ermöglichen die Detektion. Ein derartiges Identifikationssystem besteht darin, dass, wie beispiels- weise in der US 4,741,999 A aufgezeigt, die Verwendung von monoklonalen Antikörpern zur De- tektion und Konzentrationsbestimmung bestimmter Mikroorganismen betreffend die Etiologie von humanen periodontalen Erkrankungen dient. Im speziellen wird ein monoklonaler Antikörper spezi-
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fisch zu einem Antigen von Actinobacillus actinomycetemcomitans beschrieben. Actinobacillus actinomycetemcomitans kommt meist bei juveniler Parodontitis vor.
Den serologischen Systemen haftet jedoch der Nachteil an, dass mit monoklonalen Antikörpern nur einige wenige Epitope eines Antigens nachgewiesen werden können. Die Anzahl der verfügbaren Antikörper ist daher auf bestimmte Bakterienarten beschränkt.
Um diesen Nachteil auszuräumen wurden im Stand der Technik verschiedenste Systeme vor- geschlagen. Nukleinsäureuntersuchungen sind die modernsten und sichersten Methoden um speziesspezifische Bakterien DNA Moleküle zu analysieren. Man unterscheidet zwischen Nach- weismethoden direkt aus dem Untersuchungsmaterial und Methoden mit vorheriger Amplifikation.
Die dazwischengeschaltete Amplifikation erhöht die Sensitivität der Methode und ermöglicht auch den Nachweis von geringen Bakterien DNA Mengen unabhängig von deren Vitalität. Beispielswei- se beschreibt die Publikation von Kroes, 1., Lepp, P. W., and Relman D. A. 1999. Bacterial diversity within the human subgingival crevice. PNAS 96 : eine Möglichkeit zum Nachweis der Bakterienvielfalt im Mundraum. Es wird nachgewiesen, dass durch die direkte Amplifikation der 16S rDNA eine grössere Diversität der Bakterienflora im Mundbereich des Menschen erhalten wird, als dies durch eine Kultivierung erzielt werden kann. Es werden Oligonukleotidprimer und Proben beschrieben, die zur Amplifikation und zur Detektion der Bakterienarten dienen.
Es zeigte sich auch, dass die analysierte Artenvielfalt durch direkte Amplifikation der rDNA direkt von subgingiva- len Plaques deutlich höher war als dies durch die Kultivierung derselben Arten erzielt werden konnte. Weiters zeigte sich, dass viele der divergenten Phylotypen im Menschen bisher noch nicht detektiert worden waren.
So ist zum Beispiel in der WO 00/52203 A eine Methode zur Identifikation von Bakterien be- schrieben, welche die Amplifikation eines Teils der 23S-rDNA unter Verwendung des Primers 5' GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3' und des Primers 5' - TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT- 3' beschreibt. Das Amplifikat wird mit verschiedenen Oligonukleotiden auf einer Nylonmembran hybridisiert. Diese Methode erlaubt die Identifikation von mindestens 8 Bakterienarten in einem Test, wobei die Bakterien aus einer Gruppe ausgewählt sind, die Bakterien wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterokokkus spp., Klebsiella spp., Enterobac- ter spp., Proteus spp., Pneumococci und Koagulase negative Staphylokokken umfassen.
Diesem System haftet jedoch der Nachteil an, dass die 23S-rDNA variabel ist und zur Identifizierung der Bakteriengattungen und-arten daher in wenigen Konsensusbereichen geeignete Primersequenzen für die zu analysierenden Bakteriengattungen und-arten gefunden werden müssen. Dies schränkt wiederum die Anzahl der analysierbaren Bakterienarten ein.
Weiters werden in der JP 20000 83699 A und der JP 3175987 A speziesspezifische Primerse- quenzen einerseits zum Nachweis vom Treponema socranskii und andererseits zum Nachweis von Actinobacillus actinomycetemcomitans beschrieben. Diese Primersequenzen können allerdings nur zur Amplifikation und Hybridsierung dieser beiden Bakterienarten verwendet werden.
Um diesen Nachteil auszuräumen, wird im Stand der Technik folgendes System vorgeschla- gen. So ist z. B. aus der DE 199 44 168 A1 eine Methode bekannt, welche ein Verfahren zum Genus-spezifischen Nachweis und der Speziesidentifizierung von Bakterien der Gattungen Helico- bacter und Wolinella, welches auf Vermehrung eines speziellen Genfragmentes der für die Kodie- rung der 16S-rRNA und dessen weiterer Analyse basiert, beschreibt. Indem spezielle neue Oligo- nukleotidprimer von etwa 18 Basenpaaren Länge für das Verfahren verwendet werden, welche dadurch charakterisiert sind, dass sie in zwei neu beschriebenen Konsensussequenzen für das 16S-rRNA Gen hybridisieren, entstehen Amplifikationsprodukte nur dann, wenn Bakterien der Gattungen Helicobacter oder Wolinella in der Probe enthalten sind.
Im Falle eines positiven Nach- weises wird das resultierende Amplifikationsprodukt durch DNA-Sequenzierung analysiert. Durch Sequenzvergleich erfolgt die Identifizierung der vorliegenden Spezies. Alternativ kann für die Speziesidentifikation eine Restriktionsanalyse des Amplifikationsproduktes im Sinne eines RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) verwendet werden. Aus dem Bandenmuster wird auf vorliegende Spezies geschlossen. Der Nachteil der in diesem System zu sehen ist, liegt vor allem darin, dass die direkte Sequenzierung lange dauert und teuer ist und mit RFLP zwar Sequenzvaria- tionen identifiziert werden können aber nicht viele Bakterienarten unterschieden werden können.
Ein weiterer Nachteil ist, dass die Oligonukleotidprimer nur komplementäre Sequenzen in den Gattungen Helicobacter und Wolinella finden, und daher nur diese beiden Gattungen nachweisen
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Auch in der WO 89/06704 A1 werden eine Reihe von Oligonukleotiden zur Detektion von Bak- terien, die mit Erkrankungen des Mund- und Rachenraumes verbunden sind, beschrieben. Seg- mente der beschriebenen Oligonukleotide hybridisieren mit hypervariablen Regionen der ribo- somalen RNA von Bakterien unter der Bedingung, dass jedes zusätzliche Nukleotid, welches kova- lent an dieses Segment gebunden ist, nicht mit Nukleinsäuren von Bakterien, welche im Mund vorkommen, hybridisieren.
Folgende Bakterienarten werden mit diesen Oligonukleotiden detektiert : Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides gingivalis, Bacteroides intermedius Typ 1 und Typ 2, Eikenella corrodens, Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium periodonticum, Streptococcus intermedius und Wolinella recta. Es wird entweder die extrahierte mikrobielle Nukleinsäure an Nytranmembranen immobilisiert oder es werden Zelllysate direkt auf Nitrozellulosemembranen gebunden. Universelle Primersequenzen der 16S rRNA werden für die Sequenzierung verwendet. Es werden auch Oligonukleotidsequenzen von hypervariablen Regio- nen der 16S rRNA und Oligonukleotidsequenzen von konservierten Regionen der 16S rRNA beschrieben, die frei von sekundären und tertiären Interaktionen sind.
Die EP 0199439 A1 beschreibt ebenfalls eine Methode und eine Probe zur Detektion von Zel- len, die sowohl im gesunden als auch in kranken menschlichen Mundraum vorkommen. Die Pro- ben bestehen aus einem Segment von DNA oder RNA, die selektiv an einzelsträngige DNA dieser Zellen hybridisieren. Die Proben können mit Actinobacillus actinomycetemcomitans, Streptococcus mutans, Bacteroides intermedius, Bacteroides gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Wolinella recta, Capnocytophaga ochracea, Selenomonas sputigena oder menschli- chen, weissen Blutzellen hybridisieren.
Ein weiterer Nachteil, der in all diesen Systemen zu sehen ist, liegt vor allem darin, dass Kon- trollen zum Qualitätsnachweis der verschiedenen Analysen fehlen.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Möglichkeit zur reproduzierbaren, schnellen und ein- fachen Analyse von Nukleinsäuresequenzen anzugeben. Es ist weiters eine Teilaufgabe der Erfi n- dung die Identifikation von mit Parodontitis assoziierten Bakterienarten zu ermöglichen.
Die Aufgabe der Erfindung wird jeweils eigenständig durch ein Verfahren entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil der Ansprüche 1 und 4 gelöst. Von Vorteil ist dabei, dass durch die Verwendung nur eines Primerpaares Sequenzen unterschiedlicher Bakterienarten amplifiziert werden können. Die Gensequenz für die 16S-rRNA besitzt nämlich einerseits hochkonservierte Konsensusregionen, an die die Oligonukleotidprimer binden und andererseits dazwischenliegende genus- oder artenspezifische Regionen. Durch die Amplifikation von Teilsequenzen der Gene, welche die 16S-rRNA kodieren, erübrigt sich die Verwendung vieler verschiedener Oligonukleotid- primersequenzen und die Optimierung der Amplifikationsbedingungen für die jeweilige Oligonukle- otidprimersequenz.
Weiters ist daran vorteilhaft, dass mehrere Zielnukleinsäuresequenzen mit nur einer Primersequenz, insbesondere von mit Parodontitis assoziierten Bakteriengattungen bzw. - arten, gleichzeitig amplifiziert bzw. identifiziert werden können. Damit können in der Folge die Verfahrenskosten für das Labor gesenkt und die Durchführbarkeit des Verfahrens vereinfacht werden, da die Verwechslungsgefahr betreffend unterschiedliche Oligonukleotidprimer für unter- schiedliche Zielnukleinsäuresequenzen minimiert werden. Das Verfahren kann damit auch von weniger erfahrenen Personen durchgeführt werden. Von Vorteil ist dabei weiters, dass die Lager- haltung vereinfacht sowie die dadurch verursachten Kosten für ein Labor gesenkt werden können, indem die Anzahl unterschiedlicher Reagenzien gesenkt werden kann.
Durch den grösseren Verbrauch an einem Primer können weiters auch die Anschaffungskosten für Chemikalien gesenkt werden und kann durch den grösseren Umsatz dieses Primers die Lagerdauer und damit die Gefahr der Unbrauchbarkeit desselben verringert werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens zur Amplifikation von zumindest einer Zielnuklein- säuresequenz sind in den Ansprüchen 2 und 3 gekennzeichnet.
So ist bei einer Weiterbildung nach Anspruch 2 von Vorteil, dass mehrere Bakterienarten gleichzeitig amplifiziert werden können und dadurch sowohl Kosten, Zeit als auch Material einge- spart werden können.
Durch die Weiterbildung nach Anspruch 3 kann erreicht werden, dass die Hybridisierungspro- dukte, d. h. das Amplifikat gebunden an das komplementäre Oligonukleotid, ein Signal erzeugen können. Dadurch wird die Erhöhung des Automatisierungsgrads und somit eine Verringerung der
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Personalkosten erzielt.
Vorteilhaft ist weiters eine Ausführung des Verfahrens zur Identifikation von zumindest einer Zielnukleinsäuresequenz nach Anspruch 5, weil die Kontrolle und die Analyse auf nur einer Analy- sevorrichtung durchgeführt wird und sich daher aufwendige zusätzliche Kontrollen in womöglich einer anderen Analysevorrichtung erübrigen.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch einen Oligonukleotidprimer entspre- chend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 6 gelöst. Vorteilhaft daran ist, dass Amplifikationsprodukte, entstanden durch die Amplifikation mit diesem Primer bzw. einem aus diesen gebildeten Primerpaar, mit einer komplementären Oligonukleotidsequenz für zumindest eine Positivkontrolle und/oder Zielnukleinsäuresequenz an einen Träger hybridisieren und durch das entstandene Signal eine Qualitätsüberprüfung des Verfahrens und/oder eine Identifikation der Bakterienarten ermöglicht wird.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch den Chip entsprechend den Merkma- len im Kennzeichenteil des Anspruches 7 gelöst. Der Vorteil dieses Chip liegt darin, dass für die Analyse von Nukleinsäuresequenzen Kontrollsysteme auf dem Chip vorhanden sind, welche dieselben Verfahrensschritte wie die Oligonukleotide für die Zielnukleinsäuresequenzen durchlau- fen und damit dem Anwender ohne zusätzlichen Zeitaufwand eine Möglichkeit zur Verfügung steht, die Qualität des Analyseergebnisses über diese Kontrollsysteme zu beurteilen bzw. zu verbessern.
Dies ist insbesonders dann von Vorteil, wenn die einzelnen Verfahrensschritte zur Analyse von mehreren Personen, womöglich an verschiedenen Orten durchgeführt werden und diese nicht miteinander kommunizieren. Unklare Ergebnisse können dadurch auf mögliche Fehlerquellen zurückverfolgt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Verfahrenskosten unter Anwendung des Chip im Vergleich zu Verfahren ohne Kontrollen kaum bis nicht erhöht sind. Es ist weiters von Vorteil, dass für den Fall, dass der Chip für Nachkontrollen oder spätere Auswertungen archiviert wird, die speziesspezifischen, amplifizierten und hybridisierten Zielnukleinsäuresequenzen zu- sammen mit den Qualitätskontrollen archiviert werden können, sodass jederzeit der Verfahrensab- lauf nachkontrollierbar ist und die Auswertung mit gleichbleibender Qualität wiederholt werden kann.
Von Vorteil ist dabei auch, dass eine Kontrollmöglichkeit für de Ausrichtung des Chip sowohl während der Auswertung als auch nach der Auswertung gegeben ist. Die falsche Orientierung des Trägers kann bereits vom Auswertegerät erkannt werden. Die Auswertung kann sofort abgebro- chen werden und somit können die Kosten für diesen und/oder nachfolgende Verfahrensschritte eingespart werden. Es ist weiters von Vorteil, dass die Verfahrensschritte, wie z. B. Hybridisierung und Amplifizierung, denen der Chip unterzogen wird, nachprüfbar und nachvollziehbar sind.
Gemäss Anspruch 8 kann die Oberfläche des Chip auf unspezifische Anlagerungen von DNA- Amplifikaten bzw. von Nukleinsäuresequenzen überprüft und somit ein Signal, welches durch eine unspezifische Bindung einer Zielnukleinsäuresequenz entsteht, und zu einem falschen Ergebnis betreffend die Identifikation der Nukleinsäuresequenz führen würde, erkannt werden.
Von Vorteil sind auch die Weiterbildungen des Chip nach den Ansprüchen 9 bzw. 10, womit die Intensität der durch die Auswertung entstandenen Signale in diversen Abstufungen vorliegt, da eine zu hohe Konzentrationen der Positivkontrollen eine Überlagerung der Signale verursachen würde, wodurch die Klarheit der Analyseergebnisse gefährdet ist. Damit kann der Chip unabhängig von einer zu erwartenden Konzentration der Zielnukleinsäuresequenz universell angewandt wer- den. Weiters ist von Vorteil, dass die unterschiedlichen Konzentrationen der Oligonukleotide eine Quantifizierung der Zielnukleinsäuresequenzen, wie z. B. der Genexpression, ermöglichen.
Vorteilhaft ist weiters eine Ausgestaltung nach Anspruch 11, wonach durch die Anordnung identischer Oligonukleotidsequenzen auf dem Träger in mehreren Analyse- und/oder Kontrollberei- chen die Analyse mit grösserer Sicherheit erfolgen kann. Zweifelhafte Ergebnisse in einem be- stimmten Analyse- und/oder Kontrollbereich können durch das Ergebnis in zumindest einem weite- ren Analyse- und/oder Kontrollbereich bestätigt oder widerlegt werden. Weiters ist von Vorteil, dass durch die mehrfache Anordnung der gleichen Positivkontrollen, sowohl in unterschiedlichen als auch in gleichen Konzentrationen, eine Normierung innerhalb einer bzw. auch zwischen verschie- denen Messungen durchgeführt werden kann. So können z.
B. durch Berechnung eines Korrektur- faktors die Messungen in den Analysebereichen eines Chip mit der auf einer bzw. mehreren ande- ren Chips miteinander verglichen werden. Es können selbstverständlich auch die Messungen in den Analysebereichen auf demselben Chip durch Berechnung eines Korrekturfaktors normiert
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werden.
Dabei erweist sich eine Ausgestaltung nach Anspruch 12 vorteilhaft, wonach z. B. während der Herstellung des Chip nicht erkannte, schadhafte Stellen am Träger und/oder ungleichmässige Auswertebedingungen über zumindest einen weiteren Analyse- und/oder Kontrollbereich auf dem Chip durch die nicht benachbarte Anordnung des gleichen Oligonukleotids in zumindest einem weiteren Analyse- und/oder Kontrollbereich des Trägers erkannt bzw. kompensiert werden können.
Gemäss den Ausgestaltungen in den Ansprüchen 13 und 14, können Nukleinsäuresequenzen vieler verschiedener Bakteriengattungen und-arten in beliebiger Kombination gleichzeitig analy- siert und damit ein entsprechender Zeitgewinn bzw. ein erhöhter Durchsatz im Labor realisiert werden.
Von Vorteil ist dabei eine Weiterbildung des Chip nach Anspruch 15, womit mit nur einem Oli- gonukleotidprimer bzw.-primerpaar eine Qualitätskontrolle für verschiedene Verfahrensschritte, insbesondere der Amplifikation, zur Verfügung steht. Weiters können durch die Verwendung zu- mindest einer dieser Oligonukleotidsequenzen die erforderlichen Schritte für die Optimierung der erfolgreichen Amplifizierung minimiert werden.
Gemäss Anspruch 16 können auf vorteilhafte Weise unterschiedliche Zielnukleinsäuresequen- zen unter Verwendung von nur einem Oligonukleotidprimer bzw.-primerpaar analysiert werden, weil durch die entsprechende Auswahl der Oligonukleotidsequenzen am Träger gleichzeitig am- plifizierte Zielnukleinsäuresequenzen komplementäre Bereiche aufweisen und daher hybridisieren können.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch einen Analysekit entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 17 gelöst. Vorteilhaft ist daran, dass der Analysekit sowohl der Chip als auch die Oligonukleotidprimer für die gleichzeitige Amplifikation verschiedener Bakterienarten enthält. Das Analyseergebnis enthält parallel auch Ergebnisse über die durchge- führten Kontrollen während der Analyse, sodass allfällige Fehler vor bzw. mit der Auswertung der Zielnukleinsäuresequenzen erkannt werden können und damit eine langwierige Ursachenfor- schung und gegebenenfalls ein erforderlicher Optimierungsaufwand verringert werden kann.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch die Verwendung des Chip entspre- chend den Merkmalen im Kennzeichenteil der Ansprüche 18 und 19 gelöst. Vorteilhaft daran ist, dass Nukleinsäuresequenzen von mit Parodontitis assoziierten Bakterienarten identifiziert werden können und somit eine genaue Analyse der assoziierten Keime erreicht werden kann.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch die Verwendung des Analysekits ent- sprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil der Ansprüche 20 und 21 gelöst. Von Vorteil erweist sich, dass durch die Verwendung des Analysekits bereits ein komplettes Set zur Identifikation diverser Bakterienarten zur Verfügung steht und die Komponenten nicht einzeln gekauft und auf- einander abgestimmt werden müssen. Weiters ist von Vorteil, dass dadurch rasch der Nachweis von mit Parodontitis, insbesondere Periodontitis, assoziierten Keimen erfolgen kann und daher die Folgekosten einer primär ungezielten antibiotischen Therapie verhindert werden können.
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird diese anhand der nachfolgenden Fig. 1 näher erläutert, wobei diese in schematisch vereinfachter Darstellung einen Chip mit Oligonukleotiden, angeordnet in Analyse- bzw. Kontrollbereichen zeigt.
Die Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Analyse von zumindest einer Zielnukleinsäuresequenz.
Diese Vorrichtung umfasst einen Träger 1, vorzugsweise plättchenförmig, mit ener Oberfläche 2 auf der mehrere Analysebereiche 3 und mehrere Kontrollbereiche 4, angeordnet sind. Es ist aber selbstverständlich möglich, dass in einer Minimalausführung nur jeweils ein Analyse- bzw. Kon- trollbereich 3,4 oder aber, dass ein Analysebereich 3 und mehrere Kontrollbereiche 4 bzw. umge- kehrt angeordnet sind.
Der bzw. die Analysebereich(e) 3 und/oder der bzw. die Kontrollbereich(e) 4 können auf der Oberfläche 2 des Trägers 1 an jeder beliebigen, vordefinierbaren Stelle angeordnet sein.
Als Träger 1 kann vorzugsweise ein silanisierter Glasträger verwendet werden. Es ist aber auch möglich den Träger 1 aus Kunststoff, Stein, Metall, etc. zu bilden bzw. können mit Aldehyd, Aminosilan, Streptavidin, Biotin, Thiol, magnetischen Materialien oberflächenbehandelte Träger ebenfalls verwendet werden.
Es sei an dieser Stelle erwähnt, dass Fig. 1 nur ein Beispiel der erfindungsgemässen Vorrich- tung zeigt. Es können auch andere Formen, wie z. B. ein Würfel, eine Kugel, bzw. andere Quer-
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schnitte der plättchenförmigen Ausbildung, wie z. B. quadratische, runde, etc., für die Vorrichtung verwendet werden.
So ist z. B. möglich zumindest annähernd kugelförmige Vorrichtungen mit mehreren Analyse bzw. Kontrollbereichen 3,4 oberflächlich zu versehen, wobei diese Vorrichtungen in der Folge in eine zu analysierende flüssige Probelösung gegeben werden. Gegebenenfalls können diese derart ausgebildeten Vorrichtungen mit einer Schicht aus einem magnetischen Material versehen sein, sodass die Entfernung der Vorrichtungen nach Anbindung der Zielnukleinsäuren aus der Probelö- sung einfach möglich ist.
Vorzugsweise ist die Vorrichtung jedoch plättchenförmig ausgebildet und wird bzw. werden die zu untersuchenden Probe(n) auf diese Vorrichtung aufgebracht.
Weiters ist es möglich die Vorrichtung mit zumindest einer Deckschicht auf zumindest einer der Oberflächen 2 des Trägers 1 zu versehen, um damit die darunter liegende Oberfläche 2 vor unbe- absichtigten, äusseren Einwirkungen zu schützen, z. B. vor Zerkratzungen und damit Zerstörungen von Oberflächenbereichen. Diese Deckschicht kann auch zumindest teilweise entfernbar angeord- net sein.
Die erfindungsgemässe Vorrichtung wird vorzugsweise in der Analyse von Nukleinsäuren von Bakterienarten eingesetzt, insbesondere von mit Parodontitis assoziierten. Obwohl die folgende Beschreibung auf diese Ausführung der Vorrichtung beschränkt wird, sei jedoch bemerkt, dass die Vorrichtung auch für andere Nukleinsäuresequenzen verwendbar ist, und sind daher die folgenden Ausführungen für den Schutzumfang nicht limitierend zu verstehen.
Die Erfindung umfasst auch die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz mit Hilfe eines Pri- mers bzw. Primerpaares und deren Hybridisierung an Oligonukleotide in den Analyse- bzw. Kon- trollbereichen 3,4.
Weiters kann die Vorrichtung durch verschiedene Vorkehrungen, wie z. B. Ausnehmungen in der Oberfläche auch direkt für die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. In diesem Fall kann die Vorrichtung zumindest bereichsweise eine Einrichtung zur Temperaturerhö- hung, z. B. eine Heizschicht umfassen, um z.B. Temperaturwechselprogramme zu ermöglichen.
Die, insbesondere verschiedenen, zur Zielnukleinsäuresequenz und/oder zu den Positivkontrol- len komplementären Oligonukleotide können bevorzugt mit einem Nanoplotter durch pezoelektri- sche kontaktlose Probenübertragung auf dem Träger 1 in den Analyse- bzw. Kontrollbereichen 3,4 angebracht werden. Es können aber auch andere Verfahren zur Oligonukleotidverteilung verwen- det werden wie Nadelprinter, Ring and Pinprinter, Elektro addressing Printer, Topspoter, etc. bzw. können diese auch manuell aufgetragen werden. Andere Verfahren sind selbstverständlich möglich und sind dem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann bekannt.
Die Oligonukleotide können für die Identifizierung verschiedener Nukleinsäuresequenzen, ins- besondere von Nukleinsäuresequenzen verschiedener Bakterienarten, verwendet werden. Idealer- weise soll die jeweilige Oligonukleotidsequenz mit nur einer Bakterienspezies und deren Stämmen hybridisieren. Wie aus der WO 00/52203 A hervorgeht, sind für die Identifizierung der in diesem Dokument angegebenen Spezien manchmal mehrere Oligonukleotidsequenzen für die Unterschei- dung einzelner Bakterienspezien notwendig.
Wie bereits erwähnt, kann die Erfindung vorzugsweise zur Identifikation von mit Parodontitis assoziierten Bakterien verwendet werden. Derzeit sind an die 100 verschiedene, diese Erkrankung des Mundraumes, verursachende Bakterienarten bekannt. Um eine möglichst effiziente Analyse derartiger Bakterien zu ermöglichen weist die erfindungsgemässe Vorrichtung vorzugsweise meh- rere, beispielsweise 20 verschiedene, Oligonukleotide dafür auf.
So können in den Analyseberei- chen 3 Oligonukleotide für die Identifizierung von Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actino- myces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacteroides forsythus, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis (Bacteroides gracilis), Campylobacter rectus, Capnocytophaga gingivalis, Eikenella corrodens, Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus constellatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Treponema denticola und Veillonella parvula verwendet werden.
Die Oligonukleotide bestehen bevorzugt aus 10 bis 120 Nukleotiden, können aber auch aus 15 bis 100 Nukleotiden, insbesondere aber aus 20 bis 50 Nukleotide, beispielsweise 33 Nukleotiden bestehen.
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Die Detektion von kurzen Nukleinsäuresequenzen amplifizierter DNA ist eine einfache Methode und kann daher auch in viel grösserem Umfang, z. B. zur Identifikation von viralen Nukleinsäurese- quenzen oder von Genvariationen, etc., als hier beschrieben durchgeführt werden.
Die Oligonukleotidsequenzen werden de novo synthetisiert. Die Oligonukleotide sind an zu- mindest einem Ende derart modifiziert, dass sie am Träger 1 in den Analyse- bzw. Kontrollberei- chen 3,4 anhaften, insbesondere chemisch über dieses modifizierte Ende binden. So kann vor- zugsweise das 5'-Ende mit dem Amino-Modifier C6 MMT (6-(4-Monomethoxytritylamino)hexyl-(2- cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite mit folgender Strukturformel modifiziert werden.
EMI7.1
Darin bedeutet MMT Monomethoxytrityl und Pr Isopropyl.
Selbstverständlich können auch andere Modifier verwendet werden, wie z.B. Succinyl, DNP (2,4-Dinitrophenyl), etc.
Es ist aber auch möglich das 3'-Ende bzw. sowohl das 5'- als auch das 3'-Ende der Oligo- nukleotidsequenzen derart zu modifizieren, dass die Anhaftung auf dem Träger 1 möglich wird.
Um die Oligonukleotide auf die Analyse- bzw. Kontrollbereiche 3,4 aufbringen zu können, wer- den diese in Lösung verwendet. Als Lösungsmittel können z. B. ein Tris-EDTA Puffer, oder Wasser verwendet werden. Andere verwendbare Lösungsmittel sind z. B. physiologische Natriumchlorid- lösung (0,9 % NaCI), PBS, Alkoholverdünnungen, Tris-Puffer, DMSO in einer Konzentration aus- gewählt aus einem Bereich mit einer oberen Grenze von 30 %, vorzugsweise 25 %, insbesondere 20% und einer unteren Grenze von 1 %, vorzugsweise 2 %, insbesondere 5 %etc.
Die Oligonukleotide werden dem Lösungsmittel in einer Menge zugesetzt, dass sie in einer Konzentration im Bereich zwischen 1 nM bis 1 mM, beispielsweise 10 nM bis 500 uM, vorzugswei- se 100 nM bis 500 uM vorliegen. Als vorteilhaft haben sich auch Konzentrationen im Bereich zwischen 0,5 uM bis 100 uM, insbesondere 1 uM bis 50 uM erwiesen.
Die Oligonukleotide können in gleichen oder verschiedenen Konzentrationen in den Kontrollbe- reichen 4 vorgelegt werden. Dabei können Oligonukleotide aufgebracht werden, die eine Orientie- rungskontrolle des Trägers 1, z. B. in einer Auswertevorrichtung, wie z. B. einem Scanner, ermögli- chen. Weiters können Oligonukleotide für die Kontrollbereiche 4 verwendet werden, die eine Beur- teilung der Qualität einer Amplifikation, wie z. B. einer PCR und/oder einer erfolgten Hybridisierung der Zielnukleinsäuresequenzen verwendet werden.
Die Oligonukleotide für die Orientierungskontrolle können in Konzentrationen im Bereich von 1 uM bis 100 uM, insbesondere im Bereich von 1 uM bis 50 uM, vorzugsweise in einer Konzentra- tion von 10 uM vorliegen. Die Oligonukleotide für die Amplifikationskontrolle können in Konzentrati- on im Bereich zwischen 0,1 nM bis 0,5 mM, beispielsweise 1 nM bis 100 uM, vorliegen. Als vorteil- haft haben sich auch Konzentrationen im Bereich zwischen 5 nM bis 50 uM, insbesondere 10 nM bis 10 uM erwiesen. Die Oligonukleotide für die Hybridisierungskontrolle können in Konzentratio- nen im Bereich zwischen 0,1 nM bis 500 uM, beispielsweise im Konzentrationsbereich von 1 nM bis 100 uM, insbesondere von 10 nM bis 50 uM vorliegen.
Als vorteilhaft haben sich auch Konzent- rationen im Bereich zwischen 25 nM bis 25 uM, insbesondere 40 nM bis 10 uM, erwiesen.
Es können weiters noch andere als die oben angegebenen Oligonukleotide für die Kontrollbe- reiche 4 verwendet werden, wie z.B. Oligonukleotide als Positivkontrolle mit einer Sequenz kom- plementär zur Oligonukleotidprimersequenz, welche für die Amplifikation der Zielnukleinsäure- sequenz verwendet wird oder Oligonukleotide als Negativkontrolle mit einer Sequenz von anderen Organsimen, die das Gen für die Kodierung der 16S-rRNA nicht besitzen.
Die Oligonukleotide können in den Kontrollbereichen 4 in Verdünnungsreihen vorliegen, wobei jeweils eine Konzentration pro Kontrollbereich 4 verwendet wird. Dazu hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Konzentration der Oligonukleotide mit einem Faktor ausgewählt aus einem Bereich
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mit einer unteren Grenze von 1,5, insbesondere 1,75, und einer oberen Grenze von 10, insbeson- dere 5, vorzugsweise mit einem Faktor 3 für die Hybridisierungskontrolle und/oder einem Faktor ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1,25, insbesondere 1,5, und einer oberen Grenze von 10, insbesondere 5, vorzugsweise mit einem Faktor 2 für die PCR-Kontrolle zwischen aufeinanderfolgenden Konzentrationen zu verringern.
Die höchste Konzentration der Oligonukleotide kann 500 uM, beispielsweise 250 uM, insbesondere 100 uM und vorzugsweise 10 uM betragen. Eine Verdünnungsreihe kann 2 bis 24 Konzentrationen umfassen, wobei bei- spielsweise 3 bis 20 Konzentrationen, insbesondere 4 bis 18 Konzentrationen vorliegen. Als vor- teilhaft haben sich auch 5 bis 15, insbesondere 6 bis 11, Konzentrationen erwiesen. Die Positiv- kontrollen können auch in logarithmischen Verdünnungsreihen vorliegen.
Die Ausführungen zu den Oligonukleotiden für die Kontrollbereiche 4 können selbstverständlich auf die Oligonukleotide für die Analysebereiche 3 entsprechend übertragen werden, sodass hier nur mehr die entsprechenden Konzentrationen bzw. Konzentrationsbereiche angegeben werden.
Die Konzentration der Oligonukleotide in den Analysebereichen 3 liegen im Bereich von 100 nM bis 1 mM, beispielsweise von 1 uM bis 500 uM, insbesondere von 10 uM bis 100 uM und vorzugswei- se von 25 uM bis 45 uM.
Die Oligonukleotide werden vorzugsweise in Volumina ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1 pl, insbesondere 10 pl, vorzugsweise 200 pl und mit einer oberen Grenze von 5 ul, insbesondere 1 ul, vorzugsweise 0,3 ul, pro Analysebereich 3 und/oder Kontrollbereich 4 aufgetragen.
Die Anordnung der Oligonukleotide auf dem Träger 1 ist vordefinierbar. Jedes Oligonukleotid kann eine Fläche von 50 bis 500 um Durchmesser einnehmen, insbesondere von 200-250 um.
Vorzugsweise weist die für die Analyse verwendete Oberfläche 2 der Vorrichtung, die z. B. als Objektträger für die Mikroskopie ausgebildet sein kann, eine Fläche von 0,1cm2 bis 50 cm2 bei- spielsweise 0,5 cm2 bis 40 cm2, vorzugsweise 1 cm2bis 30 cm2auf. Als vorteilhaft haben sich auch Flächen im Bereich zwischen 1,5 cm2 bis 20 cm2, insbesondere 2 cm2 bis 15 cm2 erwiesen.
Eine bevorzugte Anordnung der Oligonukleotide mit einer geringen Dichte ermöglicht einfache Hybridisierungsbedingungen, wie z. B. geringe Temperaturschwankungen, homogene Puffervertei- lung, etc. und unkomplizierte Auswertemethoden, weil eine Überlappungen von Signalen norma- lerweise nicht zu erwarten ist.
Die Oligonukleotide bestehen aus Sequenzen die komplementär zu bestimmten Teilsequenzen der Zielsequenz sind und/oder komplementär zu zumindest einer Positivkontrolle sind.
Das Oligonukleotid für die Hybridiserungskontrolle dient als Qualitätsnachweis für die Hybridi- sierung. Beispielsweise ist eine Teilsequenz des Bakteriophagengenoms als Linkersequenz am 3'- Ende insertiert und das 5'- Ende mit dem erwähnten Amino-Modifler C6 MMT modifiziert. Als Linkersequenz kann aber auch jede beliebige chemische Verbindung, die den notwendigen räumli- chen Abstand erzeugt und somit eventuell auftretende sterische Hinderungen vermeidet.
Das Oligonukleotid für die Orientierungskontrolle kann für die Bestimmung bzw. Festlegung der Ausrichtung des Trägers 1 während der Herststellung der Vorrichtung bzw. in späteren Analyse- schritten dienen. Weiters kann die Orientierungskontrolle zur Bestimmung bzw. Festlegung der Grenzen des auszuwertenden Feldes, insbesondere durch die Analyse- und Kontrollbereiche 3,4 definiert, am Träger 1 und zur Überprüfung der Lokalisation des Lesefeldes dienen. Es kann vor- zugsweise sequenzidentisch mit dem Oligonukleotid der Hybridisierungskontrolle sein und trägt zusätzlich beispielsweise eine Markierung am 3' - Ende, z. B. Digoxigenin, Biotin, radioaktive Mar- kierungen,wie z. B. 33p, oder Floureszenzfarbstoffe, um auch ohne erfolgter Hybridisierung ein gut auswertbares Signal zu liefern.
Die Orientierungskontrolle ist vorzugsweise in zwei Kontrollberei- chen 4 angeordnet, die an bestimmten, z. B. während der Auftragung dieser Oligonukleotide, vorde- finierbaren Stellen des Trägers 1 angeordnet sein können.
Die Oligonukleotide für die Kontrollbereiche 4 und für die Analysebereiche 3 können in mehre- ren Bereichen der Vorrichtung angeordnet sein, beispielsweise an zumindest 2 Bereichen, aber auch an 3,4, 5,6, 7,8, 9 oder 10 Bereichen.
Es können Oligonukleotide, wie z. B. die Orientierungskontrolle und/oder die PCR-Kontrolle und/oder Orientierungskontrolle im selben Analyse- bzw. Kontrollbereich 3,4, wie die Zielnuklein- säuresequenz vorliegen und durch ihre unterschiedliche Markierung wie z. B. verschiedene Farb- stoffderivate, während der Detektion unterschieden werden.
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Die Oligonukleotide werden mit Nukleinsäuresequenzen der Zielsequenz hybridisiert und er- zeugen in der Folge ein Signal. Da vorzugsweise eine Oligonukleotidsequenz in mehreren Berei- chen auf der Vorrichtung angeordnet ist, werden vorzugsweise und nur jene hybridisierten Oligo- nukleotide als positiv gewertet, für die mehr als ein Signal beobachtet werden kann, wodurch die Sicherheit und die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses verbessert werden kann.
Die Negativkontrolle ist ein Kontrollbereich 4 auf der Oberfläche 2 des Trägers 1, an den kein Oligonukleotid gebunden ist. Dies ermöglicht unspezifische Adhäsionen diverser Nukleinsäurese- quenzen zu detektieren.
Die Oligonukleotide der Analysebereiche 3 und/oder Kontrollbereiche 4 werden vor dem Auf- tragen auf den Träger 1 mit der Hybridisierungskontrolle in einem bestimmten Verhältnis vermischt.
Das Verhältnis der Oligonukleotide zu der Hybridierungskontrolle kann in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:100 liegen. Vorteilhaft hat sich das Mischungsverhältnis von 1:10 erwiesen. Die Hybridisie- rungskontrolle dient als Kontrolle der erfolgten Hybridisierung für jeden einzelnen Analyse- und/oder Kontrollbereich 4. Falsch negative Ergebnisse können mittels der Hybridisierungskontrol- le ausgeschlossen werden. Zur Unterscheidung bei der späteren Detektion kann beispielsweise die Zielnukleinsäuresequenz mit einem anderen Farbstoffderivat markiert sein als die Hybridisierungs- sondensequenz, und daher kann bei der Auswertung das Signal der Zielnukleinsäuresequenz vom Signal der Hybridisierungssonde durch z. B. eine andere Farbe unterschieden werden.
Die Hybri- disierungssonde ist eine Nukleinsäuresequenz komplementär zur Hybridisierungskontrolle und kann beispielsweise mit verschiedenen Farbstoffderivaten wie beispielsweise Cy 1, Cy 2, Cy 3, Cy 4 und/oder Cy 5 markiert sein. Von Vorteil ist dabei auch, dass bei fehlender Hybridisierung mit einer komplementären Zielnukleinsäuresequenz ein Signal, nämlich das der Hybridisierungssonde detektiert werden kann, wodurch festgestellt werden kann, dass das fehlende Signal nicht aufgrund eines Analyseverfahrensfehlers zustande gekommen ist.
Nach erfolgter Anbringung der Oligonukleotide in den Kontroll- bzw. Analysebereichen 3,4 werden die nicht gebundenen Oligonukleotide vom Träger 1 entfernt. Die nicht gebundenen Oligo- nukleotide können durch Waschen des Trägers 1 in einer SDS-Lösung mit einer Konzentrationen im Bereich von 0,01 % bis 2 %, insbesondere im Bereich von 0,1 % bis 1 %, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,2 %, entfernt werden. Das auf der Oberfläche 2 des Trägers 1 verbleibende Detergens wird mit einer Waschflüssigkeit, wie z. B. Wasser, PBS, TE, etc. entfernt. Der Träger 1 wird mit Luft getrocknet und in eine Flüssigkeit, wie z. B. Wasser, NaCI, vorzugsweise Ethanol und/oder PBS, getaucht. Wasserstoffabgebende Reagenzien wie z.B.
LiAIH4, Na BH4, etc. werden der Lösung in einer Menge von 0,001 g bis 0,5 g, insbesondere 0,01 g bis 0,25 g, vorzugsweise 0,01 g bis 0,1 g in einem Volumen von 500 ml, vorzugsweise 100 ml, insbesondere 50 ml, zuge- setzt. Als vorteilhaft hat sich ein Volumen von 40 ml, insbesondere 30 ml, erwiesen. Die unter- schiedlichen Waschschritte laufen bei einer Temperatur in einem Bereich von 0 C bis 100 C, insbesondere von 10 C bis 98 C, vorzugsweise von 20 C bis 95 C, ab.
Im folgenden sind DNA Sequenzen von möglichen Oligonukleotiden der Zielnukleinsäurese- quenzen bzw. der Positivkontrollen von 5' nach 3' aufgelistet:
Zielorganismus: Actinobacillus actinomycetemcomitans
SEQ ID No 3 TCGATTTGGGGATTGGGGTTTAGCCCTGGTGCC
Zielorganismus: Actinomyces odontolyticus
SEQ ID No 4 GGCACTAGGTGTGGGGGCCACCCGTGGTTTCTG
Zielorganismus: Actinomyces viscosus
SEQ ID No 5 GGCACTAGGTGTGGGGGGCCTTTTCCGGGTCTT
Zielorganismus: Bacteroides forsythus
SEQ ID No 6 ATTACTAGGAGTTTGCGATATAGTGTAAGCTCT
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Zielorganismus: Campylobacter concisus SEQ ID No 7 TATACTAGTTGTTGCTAAGCTAGTCTTGGCAGT Zielorganismus: Campylobacter gracilis (Bacteroides gracilis) SEQ ID No 8 TATACCGGTTGTTGCTGTGCTAGTCACGGCAGT Zielorganismus: Campylobacter rectus SEQ ID No 9 TATACTAGTTGTTGCTTCGCTAGTCGAGGCAGT Zielorganismus:
Capnocytophaga gingivalis SEQ ID No 10 GATACTAGCTGTTTGGCGCAAGCTGAGTGGCTA Zielorganismus: Eikenella corrodens SEQ ID No 11 TCGATTAGCTGTTGGGCAACTTGATTGCTTAGT Zielorganismus: Eubacterium nodatum SEQ ID No 12 AGCACTAGGTGTCGGGCTCGCAAGAGTTCGGTG Zielorganismus: Fusobacterium nucleatum SEQ ID No 13 ATTACTAGGTGTTGGGGGTCGAACCTCAGCGCC Zielorganismus: Peptostreptococcus micros SEQ ID No 14 AGTGCTAGGTGTTGGGAGTCAAATCTCGGTGCC Zielorganismus: Porphyromonas gingivalis SEQ ID No 15 ATTACTAGGAGTTTGCGATATACCGTCAAGCTT Zielorganismus: Prevotella intermedia SEQ ID No 16 GATGCCCGCTGTTAGCGCCTHGCGCTAGCGGCT Zielorganismus: Prevotella nigrescens SEQ ID No 17 GATGCCCGCCGTTGGCCCTGCCTGCGGCCAAGC Zielorganismus: Streptococcus constellatus SEQ ID No 18 AGTGCTAGGTGTTAGGTCCTTTCCGGGACTTAG Zielorganismus: Streptococcus gordonii SEQ ID No 19 AGTGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAG Zielorganismus:
Streptococcus mitis SEQ ID No 20 AGTGCTAGGTGTTAGACCCTTTCCGGGGTTTAG
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Zielorganismus: Treponema denticola
SEQ ID No 21 TACACTAGGTGTCGGGGCAAGAGCTTCGGTGCC
Zielorganismus: Veillonella parvula
SEQ ID No 22 GGTACTAGGTGTAGGAGGTATCGACCCCTTCTG
PCR-Kontrolle
SEQ ID No 23 TCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCT
Hybridisierungs- und Orientierungskontrolle
SEQ ID No 24 ACGTCAGCCACCATTACATCCGGTGAGCAGTCA
Hybridisierungssonde
SEQ ID No 25 GACTGCTCACCGGATGTAATGG
Zur Hybridisierung können einzelsträngige Nukleinsäuren verwendet werden, die entweder durch Denaturierung aus doppelsträngigen Nukleinsäuresequenzen gewonnen werden oder be- reits einzelsträngig vorliegende Nukleinsäuresequenzen, vorteilhafterweise durch Amplifikation mit einem Primergradienten, entstanden sind.
Der Primergradient kann ein Verhältnis des Vorwärts- primers zum Rückwärtsprimer von 1:100, vorzugsweise 1:50, insbesondere 1:10, darstellen und führt zu einer asymmetrischen PCR. Ist nämlich während der Amplifikation der Zielnukleinsäurese- quenz nur mehr ein Primer vorhanden kommt es zur Herstellung einzelsträngiger DNA Moleküle, die dann für die Hybridisierung am DNA Chip zur Verfügung stehen.
Die Zielnukleinsäuresequenz ist DNA oder RNA isoliert aus einer biologischen Probe, wie z. B.
Bakterienzellen, Viren oder auch Eukaryontenzellen. Es können sowohl Gewebsproben (Blutzellen, Biopsien, etc.) als auch Flüssigkeitsproben (Blut, Speichel, Harn, Pleura- oder Peritonealflüssigkeit, etc. ) verwendet werden. Zur Isolierung der Nukleinsäure können sämtliche zur Verfügung stehende Methoden verwendet werden. Es ist oft wünschenswert die Zielnukleinsäuresequenz vor der Hybri- disierung zu amplifizieren.
Zur Analyse bzw. Identifikation von oben angeführten Bakterienarten wurden nach der Erfin- dung spezielle, neue Oligonukleotidprimer von zumindest 15 Basenpaaren Länge, welche dadurch charakterisiert sind, dass sie in neu definierten Konsensussequenzen für das 16S-rRNA Gen der amplifizierten Zielnukleinsäuresequenzen hybridisieren, verwendet.
Die DNA Sequenzen dieser Primer umfassen zumindest 15 Nukleotide der unten von 5' nach 3' aufgelisteten Sequenzen.
Vorwärtsprimer
SEQ ID No 1 GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG
Rückwärtsprimer
SEQ ID No 2 CCCAACAYYTCACGACACGAGCTGACGACAGCCAT
Die Sequenzen der Primer und Oligonukleotide, welche hier angeführt werden, sind im Stan- dard IUB/IUPC Nukleinsäurecode angegeben. Der oben angeführte Rückwärtsprimer enthält das Symbol Y. In Übereinstimmung mit der Standardterminologie für die Verwendung von degenerier- ten Sequenzen steht Y für C und T. Y zeigt Nukleotidpermutationen in "Wobble" Regionen der Sequenzen an. Der Rückwärtsprimer wird daher als degeneriertes Primerset mit C und T als geeignete Nukleotide für die Inkorporation in den Woobleregionen zur Verfügung gestellt.
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Die Primer, insbesondere der Rückwärtsprimer, sind für die Signaldetektion markiert. Diese
Markierungen können z. B. Digoxigenin, Biotin, radioaktive Markierungen, wie z.B. 33p, Flour- eszenzfarbstoffe wie Cy 1, Cy 2, Cy 3, Cy 4, und/oder Cy 5, etc. oder Kombination daraus sein.
Auch jedes andere Markierungssystem kann verwendet werden. Dies trifft selbstverständlich auch für sämtliche in dieser Beschreibung genannten Markierungen zu. Es können beispielsweise auch die für die Amplifikation verwendeten Nukleotide bereits markiert sein. Selbstverständlich können auch die Oligonukleotide am Träger 1 mit Digoxigenin, Biotin, radioaktiven Markierungen, wie z.B.
33P, Floureszenzfarbstoffen, etc. markiert werden. Der markierte Rückwärtsprimer ist somit Be- standteil jedes doppelsträngigen als auch durch die asymmetrische PCR entstandenen einzel- strängigen Amplifikate.
Mit diesen Primern können sowohl Nukleotidsequenzen gramnegativer als auch grampositiver Bakterien amplifiziert werden. Die amplifizierten Nukleinsäuresequenzen können direkt für die Hybridisierung verwendet werden, wodurch Reinigungsschritte eingespart werden können.
Die Oligonukleotide am Träger 1 bilden mit der, insbesondere amplifizierten, Zielsequenz stabi- le Hybridduplex durch komplementäre Basenpaarung. Um eine gleichmässige und spezifische Hybridisierung am Träger 1 zu erzielen, kann der Träger 1 über eine Zeitperiode ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1 Minute, insbesondere 2 Minuten, und einer oberen Grenze von 30 Minuten, insbesondere 20 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, bei einer Temperatur, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 20 C, insbesondere 30 C, und einer oberen Grenze von 95 C, insbesondere 75 C, vorzugsweise bei 60 C, vorinkubiert werden.
Die markierten Amplifikationsprodukte können in verschiedenen Volumina ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 ul, insbesondere 1 ul, und einer oberen Grenze von 20 ul, insbesondere 15 ul, vorzugsweise in einem Volumen von 5 ul für die Hybridisierung in einer Lösung, bestehend aus Natriumcitrat und/oder NaCI, verwendet werden. Die auf den Träger 1 aufgebrachte Lösung mit den Amplifikaten kann, z. B. mit Wachs, Öl, Glasplättchen etc., über- schichtet werden um gleichmässige Bedingungen, wie beispielsweise eine konstante Temperatur und/oder eine konstante Luftfeuchtigkeit, aufrecht zu erhalten.
Die Inkubation kann bei Temperatu- ren in einem Bereich von 20 C bis 75 C, insbesondere von 30 C bis 70 C, und vorzugsweise bei 50 C bis 60 C für eine Zeitperiode von 1 Minute bis 4 Stunden, beispielsweise 3 Minuten bis 3 Stunden, vorzugsweise von 5 Minuten bis 1 Stunde, und insbesondere von 10 Minuten bis 15 Minuten, durchgeführt werden. Die Nukleinsäuresequenzen, die keine Hybridduplex bilden werden unter stringenten Bedingungen weggewaschen und die hybridisierten Nukleinsäurese- quenzen, die analysiert werden, bleiben auf dem Träger 1.
Nukleinsäuren werden durch Erhöhung der Temperatur oder Erniedrigung der Salzkonzentrati- on des Puffers denaturiert. Unter niedrig stringenten Bedingungen, wie niedrige Temperatur und hohe Salzkonzentration, bilden sich sogar Duplex, welche keine exakt komplementäre Sequenz haben. Dadurch wird die Spezifität der Hybridisierung unter niedrig stringenten Bedingungen reduziert. Unter hoch stringenten Bedingungen, wie hoher Temperatur und niedriger Salzkonzent- ration im Puffer, wird die Spezifität der Hybridisierung erhöht. Das Entfernen der nicht gebundenen Zielsequenzen kann mit einer Lösung, bestehend aus Natriumcitrat und/oder NaCI in einem ersten Schritt bei Temperaturen von 40 C bis 75 C, insbesondere von 45 C bis 70 C und vorzugsweise bei 50 C bis 60 C erfolgen.
In einem weiteren Schritt wird mit der gleichen Lösung bei Tempera- turen ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 4 C, insbesondere 8 C, und einer oberen Grenze von 30 C, insbesondere 20 C gewaschen. Es können sowohl die Hybridisie- rung als auch die anschliessenden Waschschritte unter gleichen, hoch stringenten Bedingungen erfolgen um eine hohe Spezifität und somit eindeutige Auswertbarkeit zu erzielen.
Die hybridisierten Nukleinäuresequenzen können mittels der Markierung, die in die Zielnuklein- säuesequenzen und/oder in die Oligonukleotide eingebracht werden, detektiert werden. Vorzugs- weise werden die Marker bereits während der Amplifikation in die Zielsequenz inkorperiert. Es können z. B. während der PCR markierte Primer oder markierte Nukleotide verwendet werden.
Alternativ kann der Marker aber auch direkt an die Zielsequenz oder nach der Amplifikation ange- bracht werden, z. B. durch Nick-Translation oder End-Markierung, wie z. B. Kinasierung der Nukle- insäuresequenz und anschliessende Ligation eines Linkers, der die Nukleinsäuresequenz mit dem Marker verbindet. Markierungen können mit spektroskopischen, photochemischen, biochemischen, immunchemischen, elektrischen, optischen, chemischen oder dgl. Methoden detektiert werden.
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Die Auswertung des Trägers 1 kann, z.B. durch Intensitätsmessung einer bestimmten Lichtwel- lenlänge nach Anregung eines fluoreszierenden Moleküls mit zumindest annähernd, bevorzugt mittels eines Lasers erzeugten, monochromatischem Licht erfolgen. Bei dieser Messung können die Ortsdaten (Koordinaten), wie die Lokalisation und die Grenzen des Lesefeldes auch mittels der Oligonukleotide für die Orientierungskontrolle am eingelesenen Träger 1 mit den gemessenen Intensitäten je nach Wellenlänge koordiniert werden. Das verwendete Lesegerät ist mit zwei unter- schiedlichen Lasern ausgerüstet. Die Laser und die Photomultiplier sind für die verwendeten Farb- stoffderivate Cy3 und Cy5 abgestimmt. Die Bedienung und softwaremässige Erfassung ist Teil der Gerätebedienung.
Das Ergebnis der Hybridisierung ergibt sich durch die Abfrage der mit dem Lesegerät gemessenen Lichtintensitäten in den Analyse- bzw. Kontrollbereichen 3,4.
Ausführungsbeispiel
Im folgenden wird die Herstellung einer erfindungsgemässen Vorrichtung in Form eines DNA- Chips beschrieben. Die Präparation des DNA-Chip-Rohlings des Trägers 1 erfolgt bei Raumtempe- ratur. Alle aufzubringenden Oligonukleotide werden in einer Masterplatte in 150 ul Portionen für den Nanoplotter bereitgestellt. Gleichzeitig dient diese Masterplatte der Lagerung. Alle DNA Oligo- nukleotide sind in 10 % DMSO gelöst. Es werden pro Spot (Ort der Sonden Platzierung am DNA Chip) 350 pl je Oligonukleotid aufgebracht. Der dabei entstandene Spot formt eine Kreisfläche mit 300 um Durchmesser und enthält etwa 10 fmol Oligonukleotid für die Analysebereiche 3 bzw. die 1 fmol Oligonukleotid für die Kontrollbereiche 4.
Die Orientierungskontrolle wird in einer Konzentra- tion von 100 uM, die Hybridisierungskontrolle in einer Konzentration von 0,8 uM bis 80 uM und die PCR Kontrolle in einer Konzentration von 0,1 nM bis 100 uM aufgebracht. In die Analysebereiche 3 werden der Oligonukleotide komplementär zu den Zielsequenzen in der Konzentration von 100 uM des entsprechenden Oligonukleotids und 0,5 uM der Hybridisierungskontrolle aufgetragen. Über- schüssige Oligonukleotide werden vom DNA Chip durch 5 Minuten Waschen (eintauchen gefolgt von kurzem Schwenken) in 0,1 % SDS bei 60 C. Unmittelbar danach wird der DNA Chip für 5 Minuten in 94 C warmes H2O getaucht. Nach Entfernen von etwaigen Wassertropfen mittels Luftspray wird der DNA Chip bei Raumtemperatur vollständig getrocknet.
Ein 5 Minuten lang dauerndes Tauchbad in 0,01 g NaBH4 pro 40 ml PBS und 20 ml Ethanol vervollständigt den Vor- gang der kovalenten Bindung der Oligonukleotide am Chip und deaktiviert unbenutzte reaktive Gruppen. Der DNA Chip wird vor der Lagerung nochmals für 10 Sekunden in 95 C warmes H2O getaucht und mit Druckluft getrocknet. Die Lagerung erfolgt lichtgeschützt bei 4 C.
Im folgenden wird ein Beispiel für eine mögliche Anordnung der Oligonukleotide aufgezeigt. Es können aber auch beliebig anders gewählte Anordnungsvarianten für das Design des DNA Chips verwendet werden.
Die Oligonukleotide für die Postivkontrolle zur Bestimmung der Orientierung des Trägers 1 können beispielsweise an den Kreuzungspunkten der ersten Spalte mit der ersten und letzten Reihe und am Kreuzungspunkt der letzten Spalte mit der letzten Reihe angeordnet sein. Die Oligo- nukleotide für Positivkontrollen zur Hybridisierung können beispielsweise in absteigender Konzent- ration in der ersten Spalte am Kreuzungspunkt mit der zweiten Reihe beginnend bis zur vorletzten Reihe, angeordnet sein. Die Oligonukleotide für die Positivkontrolle zur Bestimmung der Qualität der PCR können beispielsweise in aufsteigender Konzentration am Kreuzungspunkt der ersten Reihe mit der zweiten Spalte beginnend bis zur letzten Spalte, angeordnet sein.
Die Negativkon- trolle kann, beispielsweise beginnend am dem Kreuzungspunkt der letzten Reihe mit der zweiten Spalte bis zur letzten Spalte, angeordnet sein. Die Oligonukleotide komplementär zur Zielsequenz sind beispielsweise alternierend in jedem zweiten Analysebereich 3 angeordnet. Die Analyseberei- che 3 erstrecken sich beispielsweise vom Kreuzungspunkt der zweiten Reihe mit der zweiten Spalte bis zum Kreuzungspunkt der vorletzten Reihe mit der letzten Spalte. Die Oligonukleotide gleicher Nukleotidsequenz, welche komplementär zur Zielsequenz sind, kommen mit bis zu drei Wiederholungen in verschiedenen Analysebereichen 3 vor.
DNA Extraktion
Aus klinischen Proben wird die totale DNA isoliert. Dies geschieht unter Verwendung von
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kommerziell angebotenen Kits (z. B. QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstelleranweisungen folgend.
PCR Amplifikation
Die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenzen kann wie folgend als Durchführungsbeispiel beschrieben, durchgeführt werden. 1/10 bis 1/1000 der total präparierten DNA werden amplifiziert.
Dazu werden 2 u 10fach PCR Puffer (100 mM Tris-HCI; pH 8,3 ; 500mMKCI; 15 mM MgCI2 und 0,01% Gelatine; Sigma), 2 ul 25 mM MgCI2 (Sigma); 0,2 ul dNTP's Mix (25 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Vorwärtsprimer zu einer Endkonzentration von 0,05 uM und Rückwärtsprimer zu 0,5 uM zugegeben. Zusätzlich wird Escherichia coli DNA mit einer Endkonzentration von 10000 Kopien/20 ul und 1 Unit Taq Polymerase (Sigma) zugesetzt und mit H2O auf ein Endvolu- men von 19,5 ul aufgefüllt. Die DNA, gelöst in einem Volumen von 0,5 ul wird zuletzt dem Reakti- onsmix zugesetzt. Die Amplifikation erfolgt in einem Thermocycler der Firma Perkin Eimer (Gene Amp PCR System 9700). Es werden 0,2 ml MicroAmp Reaktionsröhrchen verwendet.
Die für die Amplifikation nötigen Temperaturschritte laufen wie folgt ab. Der erste Schritt ist eine 5 Minuten lange Denaturierungsphase mit 94 C, dann folgen 30 Zyklen mit 40 Sekunden bei 94 C, 60 Sekunden bei 62 C und 40 Sekunden bei 72 C. Den Zyklen folgt eine Extensionsphase mit 5 Minuten bei 72 C. Es entsteht ein Amplifikationsprodukt von ungefähr 300 Basenpaaren, abhän- gig von der Sequenz der jeweilig amplifizierten Bakterienart. Die Amplifikationsbeschreibung ist nicht beschränkend zu sehen, und es können selbstverständlich auch alternative Amplifikationsbe- dingungen gewählt werden. Das Amplifikat wird direkt zur Hybridisierung eingesetzt oder vorher unter Verwendung von kommerziell angebotenen Kits (z. B. QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstelleranweisungen folgend, gereinigt.
Hybridisierung
Um eine gleichmässige und spezifische Hybridisierung am DNA Chip zu gewährleisten wird der DNA Chip für die Hybridisierung wie folgt vorbehandelt. Es erfolgt 10 Minuten eine Vorinkubation bei 80 C und gesättigter Luftfeuchtigkeit. Bei Raumtemperatur werden innerhalb dieser Zeit 10 ul der Hybridisierungslösung (1fach SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7) und 10 fmol/ul Hybridisierungssonde) mit 10 ul PCR Amplifikat in einem DNAse-freien Reaktionsgefäss gemischt. Nach Ablauf der Vorinkubationszeit wird das Hybridisierungsgemisch in das Hybridisie- rungsareal am Chip pipettiert und unverzüglich mit einem Deckglas bedeckt. Die Hybridisierung erfolgt während einer 20 Minuten langen Inkubation bei 50 C und gesättigter Luftfeuchtigkeit.
Detektion
Nach erfolgter Hybridisierung wird das Deckglas entfernt und der DNA Chip unverzüglich in eine Waschlösung (1x SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7) getaucht. Nach kurzem Schwenken folgt 2 Minuten die Inkubation bei 40 C. Der Waschvorgang erfolgt weitere 3 Mal bei Raumtemperatur. Mit Druckluft werden etwaige Flüssigkeitsrückstände von der Chip Oberfläche 2 entfernt. Der trockene DNA Chip kann lichtgeschützt bei Raumtemperatur einige Tage bis zur Auswertung mit dem Lesegerät gelagert werden. Der DNA Chip wird in den Scanner (Genepix 4000A von Axon Instrument) eingelegt und durch Anregung der Cy3 und Cy5 Farbstoff- moleküle mit monochromatischem Licht gemessen.
Dieses Ausführungsbeispiel ist nicht beschränkend zu sehen und es können selbstverständlich die darin angegebenen Reagenzien in Konzentrationen, ausgewählt aus den jeweiligen in der Beschreibung genannten Bereichen bzw. alternative Reagenzien hierzu, enthalten sein.
Der Ordnung halber sei abschliessend darauf hingewiesen, dass zum besseren Verständnis des Aufbaus der Vorrichtung zur Analyse von Zielnukleinsäuresequenzen, diese bzw. deren Be- standteile teilweise unmassstäblich und/oder vergrössert und/oder verkleinert dargestellt wurden.
Die den eigenständigen erfinderischen Lösungen zugrundeliegende Aufgabe kann der Be- schreibung entnommen werden.
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Weiteres Ausführungsbeispiel
Im folgenden wird die Herstellung einer erfindungsgemässen Vorrichtung in Form eines DNA- Chip beschrieben. Die Präparation des DNA-Chip-Rohlings erfolgt bei Raumtemperatur. Alle aufzubringenden Oligonukleotide (SEQ ID NO 3 bis 24) werden in einer Masterplatte in 150 ul Portionen für den Nanoplotter bereitgestellt. Gleichzeitig dient diese Masterplatte der Lagerung.
Alle DNA Oligonukleotide sind in 10 % DMSO gelöst. Es werden pro Spot (Ort der Sonden Platzie- rung am DNA Chip) 350 pl je Oligonukleotid aufgebracht. Der dabei entstandene Spot formt eine Kreisfläche mit 300 um Durchmesser und enthält je 10 fmol von jeweils einem der Oligonukleotide SEQ ID NO 3 bis 22 für die Analysebereiche 3 bzw. 1 fmol Oligonukleotid SEQ ID NO 23 oder 24 für die Kontrollbereiche 4. Die Orientierungskontrolle SEQ ID NO 24 wird in einer Konzentration von 100 uM, die Hybridisierungskontrolle SEQ ID NO 24 in einer Konzentration von 10 uM und die PCR Kontrolle SEQ ID NO 23 in einer Konzentration von 5 uM auf den Träger 1 aufgebracht.
In die Analysebereiche 3 werden die Oligonukleotide SEQ ID NO 3 bis 22, die komplementär zu den Zielsequenzen sind, in der Konzentration von 100 uM des entsprechenden Oligonukleotids und 0,5 uM der Hybridisierungskontrolle (SEQ ID NO 24) aufgetragen. Überschüssige Oligonukleotide werden vom DNA Chip durch 5 Minuten Waschen (eintauchen gefolgt von kurzem Schwenken) in 0,1 % SDS bei 60 C entfernt. Unmittelbar danach wird der DNA Chip für 5 Minuten in 94 C war- mes H29 getaucht. Nach Entfernen von etwaigen Wassertropfen mittels Luftspray wird der DNA Chip bei Raumtemperatur vollständig getrocknet. Ein 5 Minuten lang dauerndes Tauchbad in 0,01 g NaBH4 pro 40 ml PBS und 20 ml Ethanol vervollständigt den Vorgang der kovalenten Bin- dung der Oligonukleotide am Chip und deaktiviert unbenutzte reaktive Gruppen.
Der DNA Chip wird vor der Lagerung nochmals für 10 Sekunden in 95 C warmes H29 getaucht und mit Druckluft getrocknet. Die Lagerung erfolgt lichtgeschützt bei 4 C.
Im folgenden wird ein Beispiel für eine mögliche Anordnung der Oligonukleotide aufgezeigt und schematisch in der nachfolgenden Skizze dargestellt. Es können aber auch beliebig anders ge- wählte Anordnungsvarianten für das Design des DNA Chips verwendet werden.
Die Oligonukleotide (SEQ ID NO 24) für die Positivkontrolle zur Bestimmung der Orientierung des Trägers 1 sind an den Kreuzungspunkten der ersten Spalte mit der ersten und letzten Reihe und am Kreuzungspunkt der letzten Spalte mit der letzten Reihe angeordnet. Die Oligonukleotide (SEQ ID NO 24) für Positivkontrollen zur Hybridisierung in absteigender Konzentration in der ersten Spalte am Kreuzungspunkt mit der zweiten Reihe beginnend bis zur vorletzten Reihe, angeordnet. Die Oligonukleotide (SEQ ID NO 23) für die Positivkontrolle zur Bestimmung der Qualität der PCR sind in absteigender Konzentration am Kreuzungspunkt der ersten Reihe mit der zweiten Spalte beginnend bis zur letzten Spalte, angeordnet. Die Negativkontrolle ist, beginnend am Kreuzungspunkt der letzten Reihe mit der zweiten Spalte bis zur vorletzten Spalte, angeordnet.
Die Oligonukleotide (SEQ ID NO 3 bis 22) komplementär zur Zielsequenz sind alternierend in jedem zweiten Analysebereich 3 angeordnet. Die Analysebereiche 3 erstrecken sich vom Kreu- zungspunkt der zweiten Reihe mit der zweiten Spalte bis zum Kreuzungspunkt der vorletzten Reihe mit der letzten Spalte. Die Oligonukleotide gleicher Nukleotidsequenz, welche komplementär zur Zielsequenz sind, kommen mit drei Wiederholungen in verschiedenen Analysebereichen 3 vor.
In der nachfolgenden Skizze ist die Anordnung der verschiedenen Oligonukleotide schematisch dargestellt, wobei jedes Feld der Skizze einem Spot des Chip entspricht.
EMI15.1
<tb>
1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12
<tb>
<tb>
<tb> a <SEP> OC <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos <SEP> Pos
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<tb> /1 <SEP> /2 <SEP> /4 <SEP> /8/16 <SEP> /32/64 <SEP> /128/256 <SEP> /521/1024
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<tb> b <SEP> L/1 <SEP> Pos <SEP> A. <SEP> a <SEP> E. <SEP> c <SEP> F.n <SEP> S. <SEP> c <SEP> S. <SEP> g <SEP> S. <SEP> m <SEP> V.p <SEP> A. <SEP> o <SEP> A.v <SEP> E. <SEP> n
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<tb> d <SEP> L/9 <SEP> Pos <SEP> A. <SEP> a <SEP> E.c <SEP> F.n <SEP> S. <SEP> c <SEP> S. <SEP> g <SEP> S.m <SEP> V.p <SEP> A.o <SEP> A.v <SEP> E.
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<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12
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<tb> f <SEP> L/81 <SEP> Pos <SEP> A. <SEP> a <SEP> E.c <SEP> F.n <SEP> S.c <SEP> S.g <SEP> S.m <SEP> V.p <SEP> A.o <SEP> A.v <SEP> E. <SEP> n
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<tb> g <SEP> L/243 <SEP> P.m <SEP> C.c <SEP> C.r <SEP> C.g <SEP> T.d <SEP> B.f <SEP> P.g <SEP> P.i <SEP> P.n <SEP> Cap. <SEP> g <SEP> Pos
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<tb> h <SEP> OC <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> neg <SEP> OC
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Legende :
0: Oligonukleotide für Orientierungskontrolle
H : Oligonukleotide für Hybridisierungskontrolle
Pos :
Oligonukleotide für PCR Kontrolle neg : Negativkontrolle
A.a.... Oligonukleotide für die verschiedenen Bakterienarten
DNA Extraktion
Aus klinischen Proben wird die totale DNA isoliert. Dies geschieht unter Verwendung von kom- merziell angebotenen Kits (z. B. QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstel- leranweisungen folgend.
PCR Amplifikation
Die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenzen kann wie folgend als Durchführungsbeispiel beschrieben, durchgeführt werden. 1/50 der total präparierten DNA wird amplifiziert. Dazu werden 2 ul 10-fach PCR Puffer (100 mM Tris-HCI; pH 8,3 ; 500mMKCI; 15 mM MgCI2 und 0,01% Gelati- ne ; Sigma), 2 ul 25 mM MgCI2 (Sigma); 0,2 ul dNTP's Mix (25 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Vorwärtsprimer (5' - AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC - 3') zu einer Endkonzentration von 0,05 uM und Rückwärtsprimer (5' - CAYYTCACGACACGAGCTGACGACA - 3') zu 0,5 uM zugege- ben. Zusätzlich wird Escherichia coli DNA mit einer Endkonzentration von 10000 Kopien/20 ul und 1 Unit Taq Polymerase (Sigma) zugesetzt und mit H20 auf ein Endvolumen von 19,5 ul aufgefüllt.
Die DNA, gelöst in einem Volumen von 0,5 ul wird zuletzt dem Reaktionsmix zugesetzt. Die Ampli- fikation erfolgt in einem Thermocycler der Firma Perkin Eimer (Gene AmpR PCR System 9700). Es werden 0,2 ml MicroAmp Reaktionsröhrchen verwendet. Die für die Amplifikation nötigen Tempe- raturschritte laufen wie folgt ab. Der erste Schritt ist eine 5 Minuten lange Denaturierungsphase mit 94 C, dann folgen 30 Zyklen mit 40 Sekunden bei 94 C, 60 Sekunden bei 62 C und 40 Sekunden bei 72 C. Den Zyklen folgt eine Extensionsphase mit 5 Minuten bei 72 C. Es entsteht ein Amplii- kationsprodukt von ungefähr 300 Basenpaaren, abhängig von der Sequenz der jeweilig amplifizier- ten Bakterienart. Das Amplifikat wird unter Verwendung von kommerziell angebotenen Kits (z. B.
QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) entsprechend den Herstelleranweisungen folgend vor der Hybridisierung, gereinigt.
Hybridisierung
Um eine gleichmässige und spezifische Hybridisierung am DNA Chip zu gewährleisten wird der DNA Chip für die Hybridisierung wie folgt vorbehandelt. Es erfolgt 10 Minuten eine Vorinkubation bei 80 C und gesättigter Luftfeuchtigkeit. Bei Raumtemperatur werden innerhalb dieser Zeit 10 ul der Hybridisierungslösung (1-fach SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7) und 10 fmol/ul Hybridisierungssonde (SEQ ID NO 25)) mit 10 ul PCR Amplifikat in einem DNAse-freien Reaktionsgefäss gemischt. Nach Ablauf der Vorinkubationszeit wird das Hybridisierungsgemisch in
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das Hybridisierungsareal am Chip pipettiert und unverzüglich mit einem Deckglas bedeckt. Die Hybridisierung erfolgt während einer 20 Minuten langen Inkubation bei 50 C und gesättigter Luft- feuchtigkeit.
Detektion
Nach erfolgter Hybridisierung wird das Deckglas entfernt und der DNA Chip unverzüglich in ei- ne Waschlösung (1x SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7) getaucht. Nach kurzem Schwenken folgt 2 Minuten die Inkubation bei 40 C. Der Waschvorgang erfolgt weitere 3 Mal bei Raumtemperatur. Mit Druckluft werden etwaige Flüssigkeitsrückstände von der Chipober- fläche entfernt. Der trockene DNA Chip kann lichtgeschützt bei Raumtemperatur einige Tage bis zur Auswertung mit dem Lesegerät gelagert werden. Der DNA Chip wird in den Scanner (Genepix 4000A von Axon Instrument) eingelegt und durch Anregung der Cy3 und Cy5 Farbstoffmoleküle mit monochromatischem Licht gemessen.
Dieses Ausführungsbeispiel ist nicht beschränkend zu sehen und es können selbstverständlich die darin angegebenen Reagenzien in Konzentrationen, ausgewählt aus den jeweiligen in der Beschreibung genannten Bereichen bzw. alternative Reagenzien hierzu, enthalten sein.
Bezugszeichenaufstellung für die Figur 1
1 Träger
2 Oberfläche
3 Analysebereich
4 Kontrollbereich
Sequenzprotokoll < 110 > Lambda GmbH
Labor für molekularbiologische DNA-Analysen GmbH
Industriestrasse 6
4240 Freistadt < 120 > Vorrichtung zur Analyse von Nukleinsäuren < 160 > 25 < 210 > 1 < 211 > 37 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : < 400 > 1 ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacg < 210 > 2 < 211 > 35 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz: Primer < 400 > 2 cccaacayyt cacgacacga gctgacgaca gccat
<Desc/Clms Page number 18>
< 210 > 3 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Oligonukleotid < 400 > 3 tcgatttggg gattggggtt tagccctggt gcc < 210 > 4 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 4 ggcactaggt gtgggggcca cccgtggttt ctg < 210 > 5 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid < 400 > 5 ggcactaggt gtggggggcc ttttccgggt ctt < 210 > 6 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid < 400 > 6 attactagga gtttgcgata tagtgtaagc tct < 210 > 7 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Oligonukleotid < 400 > 7 tatactagtt gttgctaagc tagtcttggc agt
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< 210 > 8 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 8 tataccggtt gttgctgtgc tagtcacggc agt < 210 > 9 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 9 tatactagtt gttgcttcgc tagtcgaggc agt < 210 > 10 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid < 400 > 10 gatactagct gtttggcgca agctgagtgg cta < 210 > 11 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz:
Oligonukleotid < 400 > 11 tcgattagct gttgggcaac ttgattgctt agt < 210 > 12 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid < 400 > 12 agcactaggt gtcgggctcg caagagttcg gtg
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< 210 > 13 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 13 attactaggt gttgggggtc gaacctcagc gcc < 210 > 14 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 14 agtgctaggt gttgggagtc aaatctcggt gcc < 210 > 15 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz :
Oligonukleotid < 400 > 15 attactagga gtttgcgata taccgtcaag ctt < 210 > 16 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 16 gatgcccgct gttagcgcct hgcgctagcg gct < 210 > 17 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 17 gatgcccgcc gttggccctg cctgcggcca agc
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< 210 > 18 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 18 agtgctaggt gttaggtcct ttccgggact tag < 210 > 19 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz :
Oligonukleotid < 400 > 19 agtgctaggt gttaggccct ttccggggct tag < 210 > 20 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 20 agtgctaggt gttagaccct ttccggggtt tag < 210 > 21 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 21 tacactaggt gtcggggcaa gagcttcggt gcc < 210 > 22 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 22 ggtactaggt gtaggaggta tcgacccctt ctg
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< 210 > 23 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz :
Oligonukleotid < 400 > 23 tcgacttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gct < 210 > 24 < 211 > 33 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz : Oligonukleotid < 400 > 24 acgtcagcca ccattacatc cggtgagcag tca < 210 > 25 < 211 > 22 < 212 > DNA < 213 > künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz: Oligonukleotid < 400 > 25 gactgctcac cggatgtaat gg
PATENTANSPRÜCHE: 1.
Verfahren zur Amplifikation von zumindest einer Zielnukleinsäuresequenz und einer Se- quenz zumindest einer Positivkontrolle, insbesondere mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Transkription vermittelte Amplifikation (TMA), Rever- se Transkriptase PCR (RT-PCR), Q-beta Replikase Amplifizierung, Einzelstrang-
Displacement Amplifizierung oder Amplicon-Vektoren, dadurch gekennzeichnet,
dass zur
Amplifikation zumindest ein Oligonukleotidprimer bestehend aus der DNA-Sequenz 5' -AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC - 3' und/oder ein Oligonukleotidprimer beste- hend aus der DNA-Sequenz 5' - CAYYTCACGACACGAGCTGACGACA - 3' und/oder ein
Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der
DNA-Sequenz 5' - GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG - 3' und/ oder ein Oligonukleotidprimer bestehend aus zumindest 15 aufeinanderfolgenden Nukleo- tiden der DNA-Sequenz 5' - CCCAACAYYTCACGACACGAGCTGACGACAGCCAT - 3' verwendet wird.