DE19941359C2 - Schneller, hochspezifischer Nachweis von Pseudomonas aeruginosa durch Mehrfachsondendetektion - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt einen schnellen, hochspezifischen molekularen Nachweis von Pseudomonas aeruginosa.

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zum Nachweis von Pseudomonas aeruginosa, Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa sowie die Verwendung des erfindungsgemäß offenbarten Mittels.

Vertreter der Bakterienart Pseudomonas aeruginosa sind in der Umwelt (z. B. in Oberflächengewässern) weit verbreitete Keime. Sie sind Gram-negativ, benötigen Sauerstoff zum Wachstum (aerob) und sind Oxidase positiv. In der Regel wachsen sie bei 41°C unter Anwesenheit von Cetyl-trimethylammoniumbromid (Ce­ trimide) im Nährmedium, bilden die Pigmente Pyocyanin und Pyo­ verdin (fluoreszieren unter UV-Anregung schwach blau-grün), bilden Nitrat und Nitrit und sind sensitiv gegenüber Po­ lymyxin. Sie sind in der Lage, ein breites Nährstoffspektrum zu verwerten und können sich selbst bei einem sehr geringen Angebot an verwertbaren Kohlenstoff-Quellen vermehren. Nur ein kleiner Teil aller Keime der Bakterienart Pseudomonas aeru­ ginosa ist pathogen. Diese ubiquitäre Bakterienart hat aller­ dings erhebliche sekundäre pathogene Bedeutung als opportuni­ stischer Keim im Zusammenhang mit Hospitalismus.

Im Rahmen sogenannter nosokomialer (= im Krankenhaus erworbe­ ner) Infektionen kann Pseudomonas aeruginosa Wundinfektionen, Sepsis, Endokarditis, Entzündungen des Urogenitaltraktes, ins­ besondere aber Infektionen des Respirationstraktes ein­ schliesslich Lungenentzündungen verursachen. Insbesondere im­ mun-supprimierte Patienten sind häufig davon betroffen. Pati­ enten mit Neutropenie oder zystischer Fibrose haben in der Re­ gel bei Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa sehr schlechte Prognosen. Eine schnelle und spezifische Früherkennung dieses Keims ist deshalb in der Medizin, insbesondere in der medizi­ nischen Diagnostik, von großer Bedeutung.

In der Getränkeindustrie ist dieser Keim zudem ein wertvoller Indikator für Kontaminationen mit Oberflächenwasser und unhy­ gienischer Produktion. Daher müssen laut gesetzlicher Verord­ nungen in Deutschland und Europa, z. B. der Verordnung über Mineral-, Quell- und Tafelwasser, abgefüllte Produkte, die Mine­ ral-, Quell-, oder Tafelwasser enthalten, auf das Vorhanden­ sein dieses Keims überprüft werden.

Konventionelle Verfahren, die auf der Anzucht dieser Keime in Reinkultur und nachfolgender Identifizierung des Phänotyps be­ ruhen, sind langwierig und nicht immer eindeutig. Dies beruht auf der Eigenschaft dieses Keims und nahe verwandter Organis­ men (Pseudomonaden), genetisches Material von anderen Keimen aufzunehmen und auch den zugehörigen Phänotyp auszubilden. Ferner sind Beispiele bekannt in denen einige Stämme von Ps. aeruginosa sonst typische Eigenschaften (wie z. B. Bildung des Pigmentes Pyocyanin) nicht mehr zeigen, gelegentlich auch vollständig verloren haben.

Eine Aufgabe der Erfindung ist die Beschreibung eines schnell durchführbaren, hochspezifischen Verfahrens zum Nachweis von Pseudomonas aeruginosa sowie die Nennung der hierfür notwendi­ gen Materialien.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Mittel zum Nach­ weis von Ps. aeruginosa gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zumindest zwei Sonden mit je zumindest zehn auf­ einanderfolgenden Nukleotiden der nachfolgenden zwei Sequenzen enthält:
PAE1: 5'-tca ctc cgt ggt aac cgt ccc cct tgc ggt tag act agc tac ttc tg-3'
PAE2: 5'-tct cct tag agt gcc cac ccg agg tgc tgg taa cta ag - 3'
und/oder zumindest ein oder zwei Derivate dieser Sequenzen, die je in Kombination von zumindest zwei dieser Sequenzen zum spezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa geeignet sind.

Weiterhin wird ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa mit den nachfolgenden Verfahrensschritten offen­ bart:
Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer auf die Anwesen­ heit von Ps. aeruginosa zu untersuchenden Probe mit zumindest den zwei Sonden PAE1 und PAE2 und/oder ihren Derivaten und Nachweis der Hybridisierung der Sonden mit der RNA oder der DNA der Probe, um das Vorliegen von Ps. aeruginosa spezifi­ scher DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen.

Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung und den Ausführungsbeispielen. Die Erfindung ist nicht auf die nach­ folgend genannten bevorzugten Ausgestaltungen beschränkt, son­ dern umfaßt sämtliche, unter die Patentansprüche fallenden Ausführungsformen, auch wenn sie nachfolgend nicht speziell genannt sind.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren basiert auf dem Nach­ weis definierter Nukleinsäureabschnitte von Ps. aeruginosa, wobei hochspezifisch Sequenzen der 16S ribosomalen Ribonu­ kleinsäure (16S rRNS) von Pseudomonas aeruginosa sowie hiervon abgeleiteter Stämme selektiv erkannt werden. Das erfindungsge­ mäß bereitgestellte Mittel kann zur schnellen Identifizierung von Ps. aeruginosa eingesetzt werden, da weder eine selektive Anzucht von Ps. aeruginosa zu Reinkulturen noch die Ausbildung eines definierten Phänotyps notwendig sind. Es differenziert sicher und reproduzierbar Ps. aeruginosa von anderen, nahe verwandten Pseudomonas-Arten, beispielsweise Pseudomonas alca­ ligenes, Pseudomonas mendocina und Pseudomonas fluorescens.

Das erfindungsgemäße Mittel zeichnet sich dadurch aus, daß es eine Kombination aus zwei Sonden umfaßt, die durch die Nukleo­ tidsequenzen PAE1 und PAE2 gekennzeichnet sind. Erst die kom­ binierte Anwendung beider Sonden bewirkt einen sicher diskri­ minierenden Nachweis von Ps. aeruginosa und seiner Stämme von anderen Pseudomonas-Arten und deren Stämmen.

Die hier offenbarten Sonden binden spezifisch an Sequenzen der 16S rRNS an Ps. aeruginosa. Ein Keim, der mit beiden Sonden positiv reagiert, wird als Ps. aeruginosa identifiziert. Eine einzelne Identifizierungssonde kann die Identität von Ps. aeruginosa nicht garantieren. Nur die erfindungsgemäße Kombi­ nation aus beiden Sonden erlaubt die spezifische Identifizie­ rung von Ps. aeruginosa.

Aus dem Stand der Technik sind bereits verschiedenen Lösungs­ ansätze bekannt, um Ps. aeruginosa zu identifizieren. Im Ver­ gleich zur vorliegenden Erfindung weisen die bekannten Verfah­ ren jedoch gravierende Nachteile auf, die erfindungsgemäß ver­ mieden werden. Der Stand der Technik wird nachfolgend disku­ tiert:

• 1. Standardnachweis in der Getränkebranche: Inkubation der Pro­ be auf Cetrimide (US-Patent No. 4072573, Aldridge et al., 1978) - Agar bei 41°C für 48 h. Beleuchten der Agarplatten mit ultraviolettem Licht. Identifizierung von blaugrün fluo­ reszierenden Kolonien als Pseudomonas aeruginosa.
• 2. Sonde zur Diagnose von Pseudomonas aeruginosa (US-Patent No. 5798211, Appl. No. 921177, Ohno et al., 1998).
• 3. Isolierung verdächtiger Keime und Anzucht in Reinkultur. Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa durch Fourier- Transformations Infra-Rot Spektroskopie (Helm et al., 1991; Naumann et al., 1991).
• 4. Nukleinsäure-Sonden und Methoden zur Detektion von Pseudomo­ naden der Gruppe I (US-Patent No. 5677127, Hogan et al., 1997; Gen-Probe Incorporated, Appl. No. 453439).

Die Nachteile der oben genannten Nachweisverfahren sind wie folgt:

Zu 1. Der Nachweis dauert zu lange (2 Tage). Bei zweifelhaften Resultaten (nur etwa 75% aller Pseudomonas aeruginosa Stämme bilden das Pigment Pyocyanin) müssen zur Prüfung langwierige Bestätigungstests (auf physiologische Eigenschaften) durchge­ führt werden. Geschädigte und ausgehungerte Keime wachsen auf dem Selektivmedium nur noch schlecht oder nicht mehr an.

Zu 2. Die Bindungsstellen dieser "Sonden" sind nicht bekannt, da es sich um HINDIII-Fragmente der DNS handelt, die in E.coli kloniert wurden. Dadurch ist die Produktion der Sonde aufwendig und teuer im Vergleich zu Oligonukleotiden. Ein Nachweis auf Einzelzellebene ist nicht möglich, da die Sonde gegen die DNS gerichtet ist und demnach zu wenige molekulare Zielstellen pro Zelle vorhanden sind. Die Sonde kann vermut­ lich nur für einen Nachweis in Nukleinsäureextrakten angewen­ det werden. Ferner ist nicht ersichtlich, ob mit der Sonde zwischen Ps. aeruginosa und nahe verwandten Pseudomonaden un­ terschieden werden kann.

Zu 3. Mischkulturen können mit der FT-IR Spektroskopie nicht analysiert werden. Daher ist die Gewinnung von Reinkulturen und deren Anzucht auf standardisierten Medien die Grundvor­ raussetzung für deren FT-IR Analyse. Dementsprechend dauert die gesamte Nachweisprozedur mit mindestens 48 h zu lange.

Zu 4. Die entwickelte Sonde ist gegen die 23S rRNS gerichtet. Sie detektiert zwar Ps. aeruginosa, allerdings auch andere fluoreszierende Pseudomonaden, wie z. B. Ps. stutzeri, Ps. men­ docina, Ps fluorescens, Ps putida u. v. a.. Eine Unterscheidung zwischen Ps. aeruginosa und anderen Pseudomonaden der Gruppe I ist nicht möglich. Desweiteren kann diese Sonde nicht für den Einzelzellnachweis von Pseudomonas aeruginosa mittels FISH verwendet werden, sondern nur für den Nachweis in Nukleinsäu­ reextrakten.

Der erfindungsgemäß vorgeschlagene Weg, durch den Einsatz von mindestens zwei Sonden Ps, aeruginosa sicher von nahe verwand­ ten Arten zu diskriminieren und hierbei Sonden auszuwählen, die spezifisch die 16S rRNS erkennen, ist neu und weist gegen­ über dem genannten Stand der Technik auch eine erfinderische Leistung auf.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mittel zum Nachweis von Ps. aeruginosa umfaßt zumindest zwei Sonden mit den im Anspruch 1 genannten Sequenzen PAE1 und PAE2 sowie Derivate hiervon. Beim erfindungsgemäßen Nachweisverfahren werden zumindest 10 auf­ einander folgende Nukleotide aus PAE1 und PAE2 in Kombination eingesetzt. Unter "Kombination" ist erfindungsgemäß sowohl der nacheinander erfolgende Einsatz von PAE1 und PAE2 als auch der Einsatz von PAE1 und PAE2 in einem Schritt zu verstehen.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Sonden mehr als 10 aufeinanderfolgende Nukleotide, bevorzugt 12 bis 26 Nukleotide, weiterhin bevorzugt 14 bis 22 Nukleoti­ de, noch bevorzugter 16 bis 20 Nukleotide und insbesondere be­ vorzugt 18 Nukleotide. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß auch Sonden mit anderen Längen als die hier konkret be­ schriebenen eingesetzt werden können, soweit sie im Bereich von 12 bis 26 aufeinander folgenden Nukleotiden der Sequenzen PAE1 und PAE2 liegen. Insbesondere bevorzugt werden erfin­ dungsgemäß Sonden mit den nachfolgenden Sequenzen in Kombina­ tion eingesetzt:
gt aac cgt ccc cct tgc g
gt gcc cac ccg agg tgc t.

Es ist für den Fachmann auch naheliegend, ausgehend von den hier offenbarten Sequenzen auch Abwandlungen dieser Sequenzen zur Detektion von Ps. aeruginosa einzusetzen. Unter "Abwand­ lungen" sind erfindungsgemäß Derivate der Sequenzen zu verste­ hen, bei denen ein, zwei oder drei Nukleotide an einem oder beiden Rändern der Sonde durch andere Nukleotide ersetzt wur­ den. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an die 16 rRNS an Ps. aeruginosa beibehalten bleibt, so daß die erfindungsgemäß gestellte Aufgabe gelöst wird. Un­ ter "Derivate" sind erfindungsgemäß aber auch solche Sonden zu verstehen, die sich von den Sonden PAE1 und PAE2 ableiten und bei denen im Inneren der Sonde ein oder zwei Nukleotide dele­ tiert oder durch ein anderes Nukleotid ersetzt sind, wobei auch hier selbstverständlich nur solche Abwandlungen zu be­ rücksichtigen sind, bei denen die spezifische Bindung an Ps. aeruginosa-Nukleotidsequenzen beibehalten bleibt. Ausgehend von den Nukleotidsequenzen der hier offenbarten Sonden kann der Fachmann durch einfaches Ausprobieren feststellen, welche Abwandlungen der Sequenzen zum hochspezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa geeignet sind und welche nicht.

Von der Erfindung umfaßt werden auch die zu PAE1 und PAE2 und ihren Derivaten reversen Sequenzen und revers-komplementären Sequenzen.

Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Sonden wer­ den in Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa eingesetzt. Verfahren, bei denen DNA-Sonden zum spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus eingesetzt werden, sind an sich bekannt. Der Fachmann kann diese an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Sonden zur Anwendung bringen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit von Ps. aeruginosa zu untersuchenden Probe mit zumindest den zwei Son­ den PAE1 und PAE2 oder Derivaten dieser Sonden, wie sie vor­ stehend näher beschrieben wurden, in Kontakt gebracht. An­ schließend erfolgt der Nachweis der Hybridisierung der Sonden mit der RNA oder der DNA der Probe, um das Vorliegen von Ps. aeruginosa spezifischer DNA und/oder RNA-Sequenzen aufzuzei­ gen.

Erfindungsgemäß sind vielfältige Abwandlungen möglich, um die Sonden einzusetzen. So können die Sonden mit einer Markierung versehen werden, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, Digoxigenin-, Peroxidase- oder Biotin-Markierung, oder einer fluoreszierenden Markierung, um eine spezifische Hybridisie­ rung mit Ps. aeruginosa spezifischer DNA oder RNA nachzuwei­ sen.

Weitere Abwandlungen bzw. Derivatisierungen der Sonden sind z. B. PNAs, bei denen die Basen an PNA und nicht an ein Zucker- Phosphat-Rückgrat gebunden sind.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Son­ den an eine Matrix gebunden (reverse Hybridisierungen), und es wird mit fluoreszenzmarkierter DNA oder einem PCR-Amplifikat hybridisiert. Beispiele für derartige Matrizes sind Mikrochips und Mikrotiterplatten.

Vorstehend wurden bestimmte Derivatisierungen der Sonden be­ schrieben. Von der Erfindung umfaßt werden aber auch hier nicht gesondert beschriebene Derivate der Sonden bzw. der ein­ zelnen Nukleotide der Sonden, beispielsweise chemische Ände­ rungen an den Sonden, die das Nachweisverfahren erleichtern. Derartige Derivate sind dem Fachmann bekannt, und sie können auf die erfindungsgemäß bereitgestellten Sonden angewandt wer­ den.

Die vorliegende Erfindung dient zum hochspezifischen Nachweis von Pseudomonas aeruginosa mit Hilfe einer Kombination von mindestens zwei Sonden. Es ist bekannt, daß eine Art wie Ps. aeruginosa natürlicherweise uneinheitlich ist, d. h. sich in einzelne Stämme aufspaltet. Unter einem "Stamm" wird taxono­ misch meist ein durch eine Stammnummer definierter Bakteri­ enklon und dessen Nachkommen verstanden. Es gibt einen soge­ nannten Typstamm, der die Art und damit die Eigenschaften der Art repräsentiert. Da alle Stämme einer Art, wie beispielswei­ se Ps. aeruginosa, eng miteinander verwandt sind, können die erfindungsgemäß bereitgestellten Nachweisverfahren und Sonden selbstverständlich auch auf alle Stämme von Ps. aeruginosa an­ gewandt werden.

Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe wird entweder aus den Probenorganismen isoliert oder die Organismen werden in geeigneter Weise aufgeschlossen, so daß ein direkter Kontakt der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen.

Die Hybridisierung der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen erfolgt unter stringenten Bedingungen, bevor­ zugt hoch-stringenten Bedingungen. Diese Bedingungen werden nachfolgend näher ausgeführt.

Bei der Hybridisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt:

• a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH- Wertes zwischen 7 und 8 (z. B. Tris/HCl)
• b) Wasser als "Lösungsmittel"
• c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationen (z. B. Ca²⁺), die als Verunreinigung in Chemikalien enthalten sein können, verhindern. Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt
• d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflächenspannung von wäß­ rigen Lösungen
• e) Nichtionische, aprotische Detergenzien (z. B. Formamid) schwächen die Bindungsenergie von Nukleinsäure- Duplexmolekülen
• f) Salz (funktionelle Einheit sind Kationen, die die negativen Ladungen der Nukleinsäure-Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei einzelsträngigen Nu­ kleinsäuren erleichtern (z. B. Na⁺ in NaCl).

Vier Faktoren haben Einfluß auf das Zustandekommen von spezi­ fischen Hybriden aus Sonde und Zielmolekül:
Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungsstärken von Nukleinsäure-Duplexmolekülen. Erhöhung der monovalenten Katio­ nen in der Reaktions- bzw. Waschlösung stabilisiert die gebil­ deten Duplexmoleküle, während mit zunehmendem Gehalt an z. B. Formamid die Duplexbindungen geschwächt werden.

Eine geeignete Sondenkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride.

Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ver­ steht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren), unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Sonde und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.

Unter stringenten Reaktionsbedingungen wird beispielsweise ei­ ne Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweili­ gen Primerschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA oder RNA/DNA-Hybriden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentra­ tionen entsprechend 0,1 × SSC/0,5% SDS gewährleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Spezies verhindert werden. Die jeweiligen Temperatur­ bedingungen können jedoch in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersu­ chenden DNA-Probe unterschiedlich sein und müssen dann ent­ sprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungs­ produkts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Primermoleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden er­ folgen.

Weitere Beispiele für stringente Bedingungen sind in den nach­ folgenden Beispielen aufgeführt. Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungs­ verfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermögli­ chen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielswei­ se anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln, bei denen DNA oder RNA von Ps. aeruginosa mit Proben weiterer Pseudomo­ nas-Arten mit den erfindungsgemäß bereitgestellten Proben un­ tersucht und verglichen wird.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Sonden als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR- Reaktion eingesetzt.

Die obengenannten Sonden sind komplementär zu Bereichen der rRNS. Deshalb können diese Sonden an die rRNS binden. Sie kön­ nen allerdings auch an den Anti-Sinn DNS-Strang des rRNS-Gens (der ja sequenzgleich zur rRNS ist) binden. Zur Vervielfältigung des rRNS-Gen-Bereichs zwischen den beiden Sondenregionen mittels PCR muß ein Primer an den Anti-Sinn Strang binden, der zweite Primer an den Sinn-Strang.

Als "Vorwärtsprimer" (PAE_vorwärts) bietet sich der Bereich kom­ plementär zu PAE2 (5'-ctt agt tac cag cac ctc ggg tgg gca ctc taa gga ga-3') an, als "Rückwärtsprimer" (PAE_rückwärts) der Bereich PAE1 (5'-tca ctc cgt ggt aac cgt ccc cct tgc ggt tag act agc tac ttc tg-3').

Die oben beschriebenen Derivate und bevorzugten Abwandlungen können analog angewandt werden.

Bei Anwendung dieser Primer in der PCR sollte bei geeigneter Annealing-Temperatur nur bei Stämmen von Ps. aeruginosa ein spezifisches Amplifikat von 337 bp erzeugt werden. Als zu un­ tersuchende Probe kann extrahierte DNS aus Reinkulturen oder Anreicherungen, bzw. ganze Zellen aus Reinkulturen oder Anrei­ cherungen, bzw. Wasserproben vor und nach Anreicherungen, bzw. klinisches Material in die PCR eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Sonden ermöglichen somit einen hochspe­ zifischen und schnellen Nachweis von Vertretern der Bakterien­ art Ps. aeruginosa. Beispielsweise kann durch die Markierung der Sonden mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen und deren Einsatz bei der FISH in fixierten Proben Ps. aeruginosa auf Einzelzellebene identifiziert werden, wenn eine Zelle zweifarbig fluoresziert. Hierdurch kann Ps. aeruginosa auch in Mischkulturen spezifisch nachgewiesen werden. Eine Anzucht auf selektiven Nährmedien und die Gewinnung von Reinkulturen ist nicht mehr notwendig. Die Identifizierung kann, da sie auf der optischen Wahrnehmung bzw. Messung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen beruht, auch von Laien vorgenommen wer­ den.

Das PCR-Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Ma­ terial sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt wer­ den. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:

• - Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C min­ destens 3 Minuten lang;
• - Bindung der Sondenpaare 1 Minute lang bei 60°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA;
• - zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer ent­ lang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxy­ ribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA- Polymerase;
• - 30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA- Denaturierung bei 94°C (30 Sekunden lang), gefolgt von Pri­ merbindung bei 60°C (1 Minute lang), und Primerverlängerung bei 72°C (2 Minuten lang);
• - Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3'-Enden am Reaktions­ produkt bei 72°C (ca. 5-8 Minuten lang).

Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, spezies­ spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gel­ elektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluo­ reszenz-markierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher dargestellt. Die Abbildungen zeigen:

Abb. 1 Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa Referenz­ stämmen und klinischen Isolaten mit rRNS-gerichteten Sonden,

Abb. 2 25 Isolate aus abgefülltem nichtkarboniertem natürli­ chem Mineralwasser.

Die Abk. "M" bzw. "mM" stehen für die Einheiten "mol/l" bzw. "mmol/l".

Beispiel 1 Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von fixiertem Ps. aeruginosa in Wasserproben (abgefülltes Mineralwasser, Quell- oder Tafelwasser) oder Flüssiganreicherungen daraus

250 ml Mineralwasser oder Bakterienanreicherung aus 250 ml in Flüssigmedium wird durch bakteriendichte, weiße Membranfilter (z. B. Polycarbonatfilter, Millipore GTTP02500, Eschborn) mit Standard-Filtrationsanlagen filtriert. Anschließend werden die Filter in 5 ml 3% Paraformaldehydlösung (3% PFA) für 15 Minu­ ten inkubiert (= fixiert). Nach Absaugen der Fixierungslösung wird 5 ml steriles Wasser auf den Filter gegeben und abge­ saugt. Die Filter werden auf Glasobjektträger gelegt und mit 50 µl Hybridisierungslösung betropft (= 62,5 ng PAE1-CY3 und 250 ng PAE2-Fluorescein in Hybridisierungspuffer (0.9 M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2-8.0), 0.01% SDS, 60% Formamid) und für 90 Minuten in einer geschlossenen Kammer unter äquimolarer Atmosphäre (z. B. Kammer enthält Tissue, das mit 2 ml des Hy­ bridisierungspuffers getränkt ist) bei 46°C inkubiert. Dar­ aufhin wird das Filter in 50 ml Waschlösung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5 mM EDTA (pH 8.0) für 15 Minuten bei 48°C inkubiert, um ungebundene Sonde zu entfernen. Nach dem Trocknen wird das Filter auf eine Trägeroberfläche (z. B. Glas­ objektträger) gelegt und mit Antifading-Medium betropft (z. B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit einem Deckglas bedeckt. Zur Detektion der Signale wird das Filter im Epifluoreszenzmikroskop unter Anregung mit blauem und grünem Licht (ausgestattet mit Fluoreszenzfiltern für Fluorescein und Rhodamin) bei 400- bis 1000facher Vergrösserung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer An­ regung grün und bei grüner Anregung rot.

Beispiel 2 Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa in Flüssiganreiche­ rungen aus klinischen Proben in selektivem oder nichtselekti­ vem Nährmedium auf Objektträgern

1 ml schwach trübe Flüssiganreicherung wird mit 1 ml absolutem Ethanol gemischt und mindestens 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Zentrifugation bei 5000 g 3 Minuten. Verwerfen des Überstandes. Resuspendieren des Pellets in 500 µl phosphatgepufferter NaCl- Lösung (PBS-Puffer), Zugabe von 500 µl 100% Ethanol. Gut mi­ schen. 10 µl der so präparierten Anreicherung in einem Reakti­ onsfeld des Hybridisierungs-Objektträgers verteilen (z. B. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Deutschland; Art. Nr. 1215130 - Objektträger mit 6 Reaktionsfeldern) und 10 min bei 46°C auftrocknen lassen. 6 unterschiedliche Proben können auf einem der oben genannten Objektträger aufgebracht und gleichzeitig untersucht werden.

Der Objektträger muß für je 3 Minuten in 50%, 70% und 100% Et­ hanol inkubiert werden. Nach dem Trocknen wird auf jedes der mit einer Probe versehene Reaktionsfeld mit je 10 µl Hybridi­ sierungslösung (= 12.5 ng PAE1-CY3 und 50 ng PAE2-Fluorescein in in Hybridisierungspuffer (0.9 M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2-8.0), 0.01% SDS, 60% Formamid)) überschichtet und für 90 Minuten in einer geschlossenen Kammer unter äquimolarer Atmo­ sphäre (z. B. Kammer enthält Tissue, das mit 2 ml des Hybridi­ sierungspuffers getränkt ist) bei 46°C inkubiert. Daraufhin wird die Hybridisierungslösung mit auf 48°C vorgewärmter Waschlösung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5 mM EDTA (pH 8.0)) vom Objektträger gespült und dieser in 50 ml Waschlösung für 15 Minuten bei 48°C inkubiert, um ungebundene Sonde zu entfernen. Objektträger kurz vorsichtig mit destilliertem Wasser abspülen und trocknen lassen. Den Objektträger mit An­ tifading-Medium betropfen (z. B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit Deckglas bedecken. Zur Detektion der Si­ gnale werden die einzelnen Reaktionsfelder im Epifluoreszenz­ mikroskop unter Anregung mit blauem und grünem Licht (ausge­ stattet mit Fluoreszenzfiltern für Fluorescein und Rhodamin) bei 400- bis 1000facher Vergrößerung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer Anregung grün und bei grüner Anregung rot.

Beispiel 3 Schnellscreening von auf selektiven oder nichtselektiven Nähragarplatten gewachsenen Kolonien aus klinischen Proben, Umweltproben oder Mineral-, Quell-, und Tafelwasserproben bzw. deren Produkten zur Identifizierung von Pseudomonas aerugino­ sa

Vertiefungen einer sterilen Mikrotiterplatte werden mit je 50 µl PBS-Puffer gefüllt. Mit sterilen Zahnstochern werden nun Proben der Bakterienkolonien von der Agarplatte in den Vertie­ fungen suspendiert. Zugabe von je 50 µl 100% Ethanol in die Vertiefungen, die suspendierte Kolonienproben enthalten. Mi­ schen. Je 10 µl der so fixierten Proben pro Reaktionsfeld des Hybridisierungs-Objektträgers verteilen (z. B. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Deutschland; Art. Nr. 1215130 - Objekt­ träger mit 6 Reaktionsfeldern) und 10 min bei 46°C auftrock­ nen lassen. 6 verschiedene fixierte Kolonien können auf einem der oben genannten Objektträger aufgebracht und gleichzeitig untersucht werden.

Nach Auftrocknung der Proben muß der Objektträger für je 3 Mi­ nuten in 50%, 70% und 100% Ethanol inkubiert werden. Nach dem Trocknen wird jedes der mit einer Probe einer fixierten Kolo­ nie versehenen Reaktionsfelder mit je 10 µl Hybridisierungslösung (= 12.5 ng PAE1-CY3 und 50 ng PAE2-Fluorescein in in Hy­ bridisierungspuffer (0.9 M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2-8.0), 0.01% SDS, 60% Formamid)) überschichtet und für 90 Minu­ ten in einer geschlossenen Kammer unter äquimolarer Atmosphäre (z. B. Kammer enthält Tissue, das mit 2 ml des Hybridisierungs­ puffers getränkt ist) bei 46°C inkubiert. Daraufhin wird die Hybridisierungslösung mit auf 48°C vorgewärmter Waschlösung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5 mM EDTA (pH 8.0)) vom Objektträger gespült und dieser in 50 ml Waschlösung für 15 Minuten bei 48°C inkubiert, um ungebundene Sonde zu entfer­ nen. Objektträger kurz vorsichtig mit destilliertem Wasser ab­ spülen und trocknen lassen. Objektträger mit Antifading-Me­ dium betropfen (z. B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit Deckglas bedecken. Zur Detektion der Signale werden die einzelnen Reaktionsfelder im Epifluoreszenzmikroskop unter Anregung mit blauem und grünem Licht (ausgestattet mit Fluo­ reszenzfiltern für Fluorescein und Rhodamin) bei 400- bis 1000facher Vergrößerung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer Anregung grün und bei grü­ ner Anregung rot.

Beispiel 4 Eventuelle Anwendung: Direkte in situ Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa im Mucus von Patienten mit cystischer Fibrose (= Mukoviszidose-Patienten)

Mucusprobe wird in 100-1000 µl PBS-Puffer (pH 7,2-7,4) eingebracht und mit 100-1000 µl absolutem Ethanol gemischt und mindestens 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Fixierte Mucus­ probe auf Reaktionsfeld des Hybridisierungs-Objektträgers ver­ teilen (z. B. Paul Marienfeld KG, Bad Mergentheim, Deutschland; Art. Nr. 1215130 - Objektträger mit 6 Reaktionsfeldern) und 10 min bei 46°C auftrocknen lassen. 6 unterschiedliche Proben können auf einem der oben genannten Objektträger aufgebracht und gleichzeitig untersucht werden.

Der Objektträger muß für je 3 Minuten in 50%, 70% und 100% Et­ hanol inkubiert werden. Nach dem Trocknen wird jedes der mit einer Probe versehenen Reaktionsfelder mit je 10 µl Hybridi­ sierungslösung (= 12.5 ng PAE1-CY3 und 50 ng PAE2-Fluorescein in in Hybridisierungspuffer (0.9 M NaCl, 0.01 M Tris/HCl (pH 7.2-8.0), 0.01% SDS, 60% Formamid)) überschichtet und für 90 Minuten in einer geschlossenen Kammer unter äquimolarer Atmo­ sphäre (z. B. Kammer enthält Tissue, das mit 2 ml des Hybridi­ sierungspuffers getränkt ist) bei 46°C inkubiert. Daraufhin wird die Hybridisierungslösung mit auf 48°C vorgewärmter Waschlösung (14 mM NaCl, 0.01 M Tris/HCl, 0.01% SDS, 5 mM EDTA (pH 8.0)) vom Objektträger gespült und dieser in 50 ml Waschlö­ sung für 15 Minuten bei 48°C inkubiert, um ungebundene Sonde zu entfernen. Objektträger kurz vorsichtig mit destilliertem Wasser abspülen und trocknen lassen. Objektträger mit Antifa­ ding-Medium betropfen (z. B. Citifluor AF1, Citifluor Ltd., London) und mit Deckglas bedecken. Zur Detektion der Signale werden die einzelnen Reaktionsfelder im Epi­ fluoreszenzmikroskop unter Anregung mit blauem und grünem Licht (ausgestattet mit Fluoreszenzfiltern für Fluorescein und Rhodamin) bei 400- bis 1000facher Vergrößerung untersucht. Zellen von Pseudomonas aeruginosa fluoreszieren bei blauer An­ regung grün und bei grüner Anregung rot.

Claims (17)

1. Mittel zum Nachweis von Pseudomonas aeruginosa, dadurch gekennzeichnet, daß
es zumindest zwei Sonden mit je zumindest zehn aufeinanderfolgenden Nukleotiden der nachfolgenden zwei Sequenzen ent­ hält:
PAE1: 5'-tca ctc cgt ggt aac cgt ccc cct tgc ggt tag act agc tac ttc tg-3'
PAE2: 5'-tct cct tag agt gcc cac ccg agg tgc tgg taa cta ag-3'
die je in Kombination von zumindest zwei dieser Sequenzen zum spezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa geeignet sind und/oder zumindest ein oder zwei Derivate dieser Sequenzen, bei denen ein, zwei oder drei der Nukleotide an einem oder beiden Rändern der Sonde und/oder ein oder zwei Nukleotide im Inneren der Sonde deletiert oder durch ein anderes Nukleotid ersetzt sind, wobei die spezifische Bindung an die DNA oder RNA von Ps. aeruginosa beibehalten bleibt.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat eine Sonde mit zumindest 12-26 aufeinander­ folgenden Nukleotiden ist.

3. Mittel nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat eine Sonde mit 14-22, bevorzugt 18 aufeinan­ derfolgenden Nukleotiden ist.

4. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß
als Sonde eine Kombination der nachfolgenden zwei Nukleo­ tidsequenzen eingesetzt wird:
gt aac cgt ccc cct tgc g
gt gcc cac ccg agg tgc t.

5. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß es die komplementäre Sequenz der Sonden umfaßt.

6. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß es spezifisch zu Sequenzen der 16S rRNA von Ps. aeruginosa komplementär ist.

7. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden eine Markierung aufweisen.

8. Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmar­ kierung, Digoxigeninmarkierung, Peroxidasemarkierung oder Biotin-Markierung ist.

9. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt.

10. Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden chemisch modifiziert vorliegen.

11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Basen an PNA gebunden vorliegen.

12. Verwendung eines Mittels nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, welches zumindest die zwei Sonden PAE1 und PAE2 oder Derivate hiervon nach einem oder mehre­ ren der vorhergehenden Ansprüche enthält, zum spezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa.

13. Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ps. aeruginosa mit den nachfolgenden Verfahrensschritten:
Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer auf die Anwe­ senheit von Ps. aeruginosa zu untersuchenden Probe mit zu­ mindest den zwei Sonden PAE1 und PAE2 und/oder ihren Deri­ vaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche und Nachweis der Hybridisierung der Sonden mit der RNA oder der DNA der Probe, um das Vorliegen von Ps. aeruginosa spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR- Reaktion eingesetzt werden, um den Bereich zwischen den Son­ den auf dem Gen für die rRNA zu vervielfältigen, und nach­ folgender Nachweis des vervielfältigten, für Ps. aeruginosa spezifischen Bereichs der rRNA.

16. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest ein Mittel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche aufweist.

17. Festphasenmatrix, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eine der Sonden, wie sie in einem der Ansprüche 1-7 definiert sind, an die Matrix gebunden aufweist.