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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen,
insbesondere den Nachweis von Bakterien, die mit der Erkrankung einer
Parodontitis beziehungsweise Karies assoziiert sind. Die Erfindung
betrifft gekoppelte Amplifikations-/Hybridisierungsverfahren mit
sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.
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Der
Nachweis von Bakterien und ihre genaue Identifizierung spielen eine
sehr wichtige Rolle in der Parodontologie, damit eine entsprechende
Behandlung eingeleitet werden kann. Die Parodontitis ist eine Infektionserkrankung
des Zahnhalteapparats. Im Übergang
von den Hartgeweben des Zahns zu den Weichgeweben des Parodontiums
ergeben sich ideale Voraussetzungen für mikrobielle Infektionen. Die
funktionierende Immunabwehr schützt
das Parodontium gegen die schädigende
Wirkung pathogener Substanzen, die von Mikroorganismen ausgeschieden
werden. Der immunkompetente Wirt ist in der Lage, die alltäglichen
mikrobiellen Angriffe erfolgreich abzuwehren. Somit wird eine Infektion,
d. h. eine Vermehrung im Parodontium, verhindert. Die parodontale
Entzündung
ist die örtliche
Reaktion auf durch Mikroorganismen freigesetzte Toxine. In der ersten Phase
der Infektion verändern
Enzyme und zytotoxische Metaboliten aus der mikrobiellen Plaque
und der Mundflüssigkeit
das Gewebe. Die Gewebeimmunantwort erfolgt mit einer Anzahl von
Mechanismen, die, obwohl sie in erster Linie eine Abwehr gegen gewebszerstörende Stoffe
darstellen, zur Destruktion der gingivalen Gewebsanteile führen. Eine
große
Bedeutung für
die Entstehung der Parodontitis wird den drei mit Parodontitis hochassoziierten
Bakterienspezies Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis und Bacteroides forsythus zuerkannt. Andere Bakterien
wie Campylobacter rectus, Fusobakterium nucleatum, Prevotella intermedius, Eikonella
corrodens, Streptococcus intermedius-Komplex und Treponema denticola
werden als weniger Parodontitis hochassoziierte Bakterien betrachtet.
Parodontopathogene Mikroorganismen kommen in hohen Keimzahlen in
den progressiven Taschen, nicht aber oder nur in geringen Mengen
im gesunden Gewebe vor. Die Eliminierung der Keime oder deren Toxine
(z. B. Proteasen, Kollagenasen u. ä.) führt zu einer klinischen Verbesserung
des Krankheitsbildes. Deshalb besitzt die mikrobiologische Diagnostik
einen hohen Stellenwert für
die Therapieplanung, insbesondere dann, wenn eine Antibiotikagabe
vorgesehen ist. Auch für
die Therapiekontrolle kann der Nachweis parodontopathogener Bakterien mitunter
der einzige Indiz für
den Behandlungserfolg sein.
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Eine
weitere medizinisch bedeutsame Infektion der Zähne wird durch Zucker vergärende Bakterien
hervorgerufen. Hier sind insbesondere wichtig die Streptokokken
mit den Spezies Streptococcus mutans und Streptococcus sobrinus.
Beide Organismen können
sich durch Ausbildung von klebrigen Zuckerpolymeren gut auf den
glatten Zahnoberflächen festsetzen
und dort durch Säurebildung
den Dentinschmelz zerstören.
Dieser Prozess wird zusätzlich durch
den hohen Saccharosekonsum in den Industrieländern gefordert.
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In
den letzten Jahren sind wichtige Erfindungen gemacht worden, um
mit sehr speziesspezifische Primern in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion
Organismen nachzuweisen. Die Detektion erfolgt dabei meist über Gelelektrophorese
oder analog der ELISA-Technik über
immobilisierte Sonden in Mikrotiterplatten. Unglücklicherweise eignen sich diese Methoden
nicht, wenn es darum geht aus vielen möglichen pathogenen Organismen
einen oder mehrere nachzuweisen. Gerade Bakteriengruppen von hoher Komplexität, großer Diversität und schwierigen Wachstumsbedingungen
(z. B. strikt anaerobe Bakterien) sind der klassischen Kulturdifferenzierung schwer
zugänglich
und/oder verzögern
durch ihr langsames Wachstum die Diagnostik erheblich. Revolutionierend
sind hier nukleinsäurebasierende
Verfahren, die sich durch hohe Spezifität und Sensitivität auszeichnen.
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Die
DE 198 19 889 A1 beschreibt
Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer Probe, wobei
eine aus Zufallssequenzen bestehende DNA-Mischung zur Isolierung
eingesetzt wird.
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Die
DE 101 06 370 A1 offenbart
Oligonukleotidsonden zur Detektion von paradonto-pathogenen Bakterien
mittels in situ-Hybridisierung.
- Slots et al., Clin. Infect.
Dis., 20 (1995) (Suppl 2): S. 304–307 beschreiben den Nachweis
von pathogenen Mikroorganismen bei pathogenen periodontischen Erkrankungen
mit Hilfe der Amplifikation von Genen für die 16S ribosomale RNA.
- Ashimoto et al., Oral Microbiol. Immunol. 1996, 11(4), S. 266–273 offenbaren
eine 16S rRNA basierte Polymerase Kettenreaktion, um verschiedene
pathogene Mikroorganismen im Mundraum nachzuweisen.
- Garcia et al, J. Periodont. Res. 1998, 33(1), S. 59–64 beschreiben
ein schnelles Nachweisverfahren für verschiedene, mit Parodontitis
assoziierte Bakterien mit Hilfe einer PCR.
- Watanabe et al., J. Clin. Periodontal 1996, 23(3Pt1), S. 212–219 beschreiben
den Nachweis von potenziell pathogenen Mikroorganismen mit Hilfe
der PCR-Reaktion.
- Watanabe et al., J. Dent. Rest. (1993), 72(6), S. 1040–1044 beschreiben
den Nachweis von Porphyromonas gingivalis in Plaque-Proben aus dem
Mundbereich.
- Hiratsuka et al., FEMS Microbiology Letters (1996), 138(2–3), S.
167–172
beschreiben die Polymerase Kettenreaktion und eine Genprobe eines äußeren Membranproteins
zum Nachweis von Porphyromonas gingivalis.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung eines hoch
spezifischen und hoch sensitiven Verfahrens zum Nachweis Parodontitis
beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien.
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Diese
Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zum Nachweis Parodontitis oder Karies assoziierter
Bakterien gemäß den Patentansprüchen.
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Der
Begriff Nukleinsäure
und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfindung
auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert
werden. Der Begriff Nukleinsäure und
Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden
(enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend
D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein
N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyrimidinbase ist, beziehungsweise
einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyrimidinbase. Eingeschlossen
sind erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide
mit Purin-/Pyrimidin-Basen.
Die Begriffe Nukleinsäure
und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht
als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der
Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe
schließen
sowohl doppel- beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel-
beziehungsweise einzelsträngige
RNA ein.
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Erfindungsgemäß wird eine
Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen
Teil davon enthält,
zunächst
amplifiziert, wobei geeignete Amplifikationsprimer eingesetzt werden, und
anschließend
mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert.
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Prinzipiell
ist es möglich,
durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende
Nukleinsäure
und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen. Es ist aber
auch möglich,
die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder
einen Teil davon enthält,
mit mehr als einer Sonde zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft
des Verfahrens erhöht.
Man erhält
dann ein genaues Profil und kann die nachzuweisende Nukleinsäure und
damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.
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Dem
Fachmann ist bewußt,
daß ausgehend von
der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden
können,
die geringfügig
von den erfindungsgemäßen Sonden
abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Sonden denkbar,
die gegenüber
den erfindungsgemäßen Sonden mit
den Sequenzen SEQ ID No. 14–28
am 5'- und/oder
3'-Ende Verlängerungen
oder Verkürzungen
um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Eben so
ist denkbar, daß einzelne
oder wenige Nukleotide einer Sonde durch andere Nukleotide austauschbar sind,
solange die Spezifität
der Sonde und der Schmelzpunkt der Sonde nicht zu stark verändert werden.
Das schließt
ein, daß bei
Abwandlung die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde nicht zu
stark von der Schmelztemperatur der ursprünglichen Sonde abweicht. Die
Schmelztemperatur wird dabei nach der G (= 4°C) + C (= 2°C) Regel ermittelt. Dem Fachmann
ist klar, daß neben den üblichen
Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw.
zur Anwendung kommen können.
Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen,
ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.
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Der
Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen
durch zwei einzelsträngige
Nukleinsäuren
aufgrund von komplementärer
Basenpaarung. Hybridisierung kann zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder
zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen,
welche kleinere Regionen an Fehlpaarung aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäuren-Duplexes
wird gemessen durch die Schmelztemperatur Tm.
Die Schmelztemperatur Tm ist die Temperatur
(unter definierter Ionenstärke
und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dissoziiert sind.
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Bedingungen,
bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren,
werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente
Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt (z. B. Sambrook
et al., 1085, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen,
werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß die Schmelztemperatur 5°C niedriger
ist als die Tm für die spezifische Sequenz bei einer
definierten Innenstärke
und pH. Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird,
dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen
kann durch Veränderung
der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
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Die
Durchführung
des Hybridisierungsverfahrens ist dem Fachmann an sich bekannt.
So werden üblicherweise
die festen Phasen nach Inkubation mit der Lösung, die den Hybridisierungspartner
enthalten kann, stringenten Bedingungen ausgesetzt, um unspezifisch
gebundene Nukleinsäuremoleküle zu entfernen.
Die Hybridisierung kann in herkömmlicher
Weise auf einer Nylon- oder Nitrocellulosemembran durchgeführt werden
(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
1989). Die darin genannten Prinzipien lassen sich vom Fachmann auf
weitere Ausführungsformen übertragen.
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Die
Durchführung
der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist besonders wichtig
für das
erfindungsgemäße Verfahren.
Stringent im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß das Detektionsverfahren
eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion
und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zuläßt. Die Stringenz
der Hybridisierung kann durch folgende Maßnahmen verbessert werden:
- Struktur der Sonde: Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur
der Sonde; bevorzugt sind 15 bis 20mere.
- Laufpuffer: Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflußt. Die
Innenstärke
liegt bevorzugt zwischen 100–500
mmol/l, insbesondere bevorzugt bei 250 mmol/l.
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Weiterhin
kann durch mild denaturierende Substanzen im Laufpuffer (DMSO, Formamid,
Harnstoff) die Stringenz individuell eingestellt und optimiert werden.
Die Stringenz wird auch durch den pH-Wert des Laufpuffers beeinflußt.
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Auch
die Länge
der Zielnukleinsäure
spielt eine wichtige Rolle für
die Sensitivität
der Hybridisierung. Bevorzugt sind Nukleinsäurenstränge mit einer Länge von
100–500
Basenpaaren. Bevorzugt muß die
Doppelstrang-Zielnukleinsäure
vor der Hybridisierung denaturiert werden. Dies geschieht in der
Regel durch basische Chemikalien oder Erwärmung, wobei die für die Doppelstrangstruktur
verantwortlichen Wasserstoffbrückenbindungen
aufgeschmolzen werden. Bevorzugt als basische Chemikalie ist NaOH
in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 mol/l. Besonders bevorzugt
ist eine Konzentration von 0,25 mol/l NaOH. Durch Erhitzen einer
wäßrigen Nukleinsäurelösung auf
mindestens 95°C
und anschließendem
raschen Abkühlen
auf 4°C
können
ebenfalls Einzelstrangstrukturen erreicht werden. Einzelstrangamplifikate
z. B. als Produkte der NASBA-Reaktion sollten vor der Hybridisierung
ebenfalls denaturiert werden, um intramolekulare Strukturen aufzulösen. Dies
kann wegen der Empfindlichkeit der RNS gegenüber hohen pH-Werten bevorzugt
durch mild denaturierende Chemikalien wie z. B. DMSO oder Formamid
erfolgen.
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Die
gewünschte
Stringenz der Hybridisierung wird neben der Struktur von Zielsequenz
und Sonde durch die Zusammensetzung von Hybridisierungs- und Stringenzwaschpuffer
bestimmt. Als Hybridisierungspuffer werden in der Regel wäßrige Puffer mit
einem Salzgehalt zwischen 0,1 und 0,5 mol/l, und einem pH-Wert von
7,5–8,0
verwendet. Für
eine gute Benetzung der sondentragenden Phase werden Detergenzien
verwendet. Bevorzugt ist Natriumlaurylsulfat (SDS) in einer Konzentration
von 0,1–7%.
In der besonders bevorzugten hohen Konzentration von 7% wirkt SDS
zudem günstig
auf Signal-/Hintergrundverhältnisse,
indem unspezifische Bindungen des Enzymkomplexes unterdrückt werden.
Bevorzugt wird nach erfolgter Hybridisierung mit einem Stringenzwaschpuffer
inkubiert. Dieser destabilisiert durch eine geringere Innenstärke den
Doppelstrang. So werden nicht 100% komplementäre Hybride wieder getrennt.
Durch Zusätze
von Chemikalien (z. B. Tetramethylammoniumchlorid), welche die Wasserstoffbrückenbindungen
des Hybrids beeinflussen, lassen sich die Bindungsstarke von G/C
und A/T Paarungen angleichen, was bei Multiplexsondensystemen vorteilhaft
sein kann.
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Erfindungsgemäß wird nach
der Hybridisierung das Ausmaß der
Hybridisierung bestimmt. Das erfolgt üblicherweise dadurch, daß die Menge
der Markierung bestimmt wird, die an eine feste Phase gebunden ist,
wobei die Markierung entweder an die Sonden oder die nachzuweisende
Nukleinsäure
gebunden ist. Derartige Nachweisreaktionen und Detektionsverfahren
sind dem Fachmann an sich bekannt.
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In
dem Verfahren ist die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde
ausgewählt
aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 14–28 beziehungsweise komplementär zu diesen
Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon beziehungsweise komplementär zu diesem
Fragment oder enthält
eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz.
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Die
nachzuweisende Nukleinsäure
ist ein Amplifikationsprodukt, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen
Amplifikationsprimern durchgeführt
wurde. Es wird wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt aus
den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1–13 oder der komplementär zu diesen
Sequenzen ist, oder ein Fragment davon darstellt oder komplementär zu diesem
Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz
enthält.
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Die
Amplifikationsprimer sollten so ausgewählt sein, daß das Amplifikationsprodukt
gute sterische Verhältnisse
in Kombination mit der immobilisiserten Sonde aufweist. Pallindromstrukturen,
die zu intramolekularen Faltungen führen, können durch geeignete Primerauswahl
vermieden werden. Im Falle der Markierung mit Hapten ist die räumliche
Anordnung des Haptens (z. B. Biotin) im Hybrid Sonde/Zielnukleinsäure wichtig.
Das Hapten sollte für
den Antikörper-Enzymkomplex
gut zugänglich
sein.
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Eine
Ausführungsform
des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresonden immobilisiert
sind. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende
Nukleinsäure
markiert ist. In einer anderen Form des Verfahrens sind die Nukleinsäuresonden
markiert. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende
Nukleinsäure
immobilisiert ist.
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Gegenstand
der Erfindung ist daher des weiteren ein Verfahren zum Nachweis
Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien,
- – bei
welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus
dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums
beziehungsweise komplementär
zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern
durchgeführt,
von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen
eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt,
- – und
bei welchem anschließend
die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird,
dadurch
gekennzeichnet, daß die
Sequenz dieses Primer ausgewählt
ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1–13 beziehungsweise komplementär zu diesen
Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise
komplementär
zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise
die komplementäre
Sequenz enthält.
Diese Ausführungsform
der Erfindung wird im folgenden kurz Amplifikationsverfahren genannt. Der
Begriff Amplifikationsverfahren schließt alle bevorzugten Ausführungsformen
ein.
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Dem
Fachmann ist bewußt,
daß ausgehend von
der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Primer entworfen werden
können,
die geringfügig
von den erfindungsgemäßen Primern
abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Primer denkbar, die
gegenüber
den erfindungsgemäßen Primern
am 5'- und/oder
3'-Ende Verlängerungen
oder Verkürzungen
um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Insbesondere
Verlängerungen
oder Verkürzungen
am 5'-Ende der Primer
können
immer noch funktionsfähige
Primer liefern, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Ebenso
ist denkbar, daß einzelne
oder wenige Nukleotide eines Primers durch andere Nukleotide austauschbar
sind, solange die Spezifität
der Primer nicht zu stark verändert
wird und der Schmelzpunkt der Primer nicht zu stark verändert wird.
Dem Fachmann ist klar, daß neben
den üblichen
Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw.
zur Anwendung kommen können.
Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen,
ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.
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Beim
erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren
weist der bzw. die Primer eine Sequenz auf, die im wesentlichen
eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser
Primer ausgewählt
sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1–13 beziehungsweise komplementär zu diesen
Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise
komplementär
zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise
die komplementäre Sequenz
enthält.
Erfindungsgemäß bevorzugt
ist, dass die Primer markiert sind.
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Die
folgenden Ausführungen
gelten für
das erfindungsgemäße gekoppelte
Amplifikations-/Hybridisierungsverfahren. Die Amplifikation wird
mit den erfindungsgemäßen sequenzspezifischen
Primern durchgeführt
und das so erhaltene Amplifikationsprodukt mit den erfindungsgemäßen sequenzspezifischen
Sonden detektiert. Gerade für
die Identifizierung und Differenzierung von Bakterien ist dieser
sogenannte „Multiplexansatz” von großem Nutzen.
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Als
Nukleinsäureamplifikationsreaktion
können
verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion
(PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik
sind dem Fachmann bekannt, siehe z. B. Mullis (1990) Target amplification
for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris)
48(8), 579–582.
Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind ”nucleic
acid strand-based amplification” (NASBA), ”transcriptase
mediated amplification” (TMA), ”reverse transcriptase
polymerase chain reaction” (RT-PCR), ”Q-β replicase
amplification” (β-Q-Replicase)
und die ”single
strand displacement amplification” (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte
Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical
Microbiology (1999), 10(4), 185–196
erläutert.
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In
der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäure wird
das Amplifikat z. B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch
geschnitten und die entstandenen ethidiumbromidgefärbten Fragmente
auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme.
Die Hybridisierung findet üblicherweise so
statt, daß entweder
die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil
davon enthält,
oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit
dem jeweils anderen Hybridisierungspartner in Kontakt gebracht wird.
Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise
Nylon, Nitrocellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw.
Es ist auch denkbar, daß als feste
Phase eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann
dabei auch in Lösung
zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde
an eine feste Phase gebunden.
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In
der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei
der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure markiert.
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In
einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden die Nukleinsäuresonden auf
der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase
mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder
einen Teil davon enthält,
in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei Sonden
auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf Sonden,
noch bevorzugter wenigstens zehn Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen
Zonen immobilisiert sein. Durch Inkubation des Amplifikationsprodukts
beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder
eines Teils davon mit einer derart vorbereiteten festen Phase mit
immobilisierten Sonden kann durch einen einzigen Hybridisierungsschritt eine
Aussage über
die Hybridisierung des Amplifikationsprodukts mit allen immobilisierten
Sonden gewonnen werden. Die feste Phase ist daher bevorzugt ein
Mikroarray von immobilisierten Sonden auf einer festen Phase. Derartige ”DNA-Chips” erlauben
es, daß auf
einem kleinen Bereich eine hohe Anzahl verschiedener Oligonukleotide
immobilisiert werden. Die festen Phasen, die für DNA-Chips geeignet sind,
bestehen vorzugsweise aus silikatischen Materialien wie Glas usw.
Die Markierung der Primer ist in dieser Ausführungsform vorzugsweise eine
Fluoreszenzmarkierung. Der DNA-Chip kann nach Inkubation mit dem
Amplifikationsprodukt beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende
Nukleinsäure oder
eines Teils davon durch eine Scanvorrichtung rasch analysiert werden.
Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Eine Übersicht über die
Chip-Technologie gibt McGlennen (2001) Miniaturization technologies
for molecular diagnostics. Clin Chem 47(3), 393–402.
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In
dieser Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die nachzuweisende Nukleinsäure
markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.
B. Fluoreszenz-Farbstoffe,
Biotin oder Digoxigenin.
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Bekannte
Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe,
Rhodamine, Rhodamin600R-phycoerythrin, Texas
Red usw.
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Vorstellbar
ist auch eine radioaktive Markierung, wie z. B. 125I, 35S, 32P, 35P.
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Vorstellbar
ist auch eine Partikelmarkierung wie z. B. mit Latex. Solche Partikel
sind üblicherweise trocken,
im Micron-Bereich und uniform.
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Die
Markierungen sind üblicherweise
kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung
beispielsweise direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin-
und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder
Konjugatspartnern nachgewiesen werden. Andere Bindungspartner als
beispielsweise Biotin/Streptavidin sind Antigen/Antikörper-Systeme,
Hapten/Anti-Hapten-Systeme, Biotin/Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine,
Komplementäre
Nukleinsäuren,
Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M. N. Bobrov, et al. J. Immunol.
Methods, 125, 279, (1989).
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Beispielsweise
kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem
es mit einer Lösung
in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym
enthält,
wobei das Enzym, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein
Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemolumineszenz
führt.
Mögliche
Enzyme für
diesen Verwendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen,
Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen,
Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren,
sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol
Biol 1991; (3–4):
227–59;
Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996, Jun; 5(3): 223–32). Bei
manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren,
müssen
farbändernde
Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays
in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
eds. R. H. Burton and P. H. van Knippenberg (1998).
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Ein
weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen
Antikörper
gekoppelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Weiterhin
ist üblich,
die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit einem Gold Streptavidin Konjugat,
wobei dann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden
kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente
Bindungen miteinander eingehen, wie z. B. Sulfhydryl-reaktive Gruppen
wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin-reaktive Gruppen
wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.
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Werden
die nachzuweisenden Nukleinsäuren
markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die
Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt im wesentlichen
nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (
US 6,037,127 A ).
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Das
Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsäure kann
durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte
Inkorporation von markierten Basen in die nachzuweisende Nukleinsäure. In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkorporiert haben,
durch markierte Basen oder markierte Primer während der Amplifikation der
nachzuweisenden Nukleinsäure
hergestellt. Markierte Primer können
hergestellt werden durch chemische Synthese z. B. mittels der Phosphoramidit-Methode
durch die Substitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der
Primer-Synthese. Alternativ dazu können Primer hergestellt werden
mit modifizierten Basen, an welche nach der Primer-Synthese Markierungen
chemisch gebunden werden.
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Denkbar
sind auch Verfahren zur Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure ohne
daß die
zu detektierende Nukleinsäure
amplifiziert und/oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale
RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit
einem RNS/DNS-spezifischen Antikörper
als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.
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Eine
andere Möglichkeit
ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleotide-Kinase
oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das
Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook
et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Vol. 2, 9.34–9.37
(1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem,
174, 101 (1988).
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Markierungen
können
in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden
Nukleinsäure
eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nukleinsäuresequenz
der nachzuweisenden Nukleinsäure
eingebracht werden. In eine nachzuweisen de Nukleinsäure können auch mehrere
Markierungen eingebracht werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
weist wenigstens eine der Sonden eine Markierung auf. Die Markierung
der Sonden erfolgt nach den gleichen im Stand der Technik beschriebenen
Verfahren wie schon oben für
die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure ausgeführt. Üblicherweise wird dann die
Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon
enthält,
auf einer festen Phasen immobilisiert und mit einer Zusammensetzung
in Kontakt gebracht, die wenigstens eine Sonde enthält. Auch
in dieser Ausführungsform
ist es bevorzugt, eine Hybridisierung mit mehr als einer Sonde durchzuführen. Dazu
können
mehrere feste Phasen bereitgestellt werden, auf denen das Amplifikationsprodukt
beziehungsweise die Probe enthaltend die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert
ist. Es ist aber auch möglich,
auf einer festen Phase an mehreren räumlich voneinander getrennten
Bereichen kleine Mengen des Amplifikationsprodukts zu immobilisieren.
Diese verschiedenen Spots werden dann mit jeweils verschiedenen
Sonden in Kontakt gebracht (Hybridisierung).
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zum
Nachweis Parodontitis oder Karies assoziierter Bakterien umfassend
eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenz- und/oder speziesspezifische
Nukleinsäuresonden
immobilisiert sind, bei der die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde
ausgewählt
ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 14–28 beziehungsweise komplementär zu diesen
Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise
komplementär
zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise
die komplementäre
Sequenz enthält.
Wenn mehrere Oligonukleotide immobilisiert sind, sind diese auf
der festen Phase räumlich
voneinander getrennt. Vorzugsweise ist die feste Phase als DNA-Chip
ausgebildet.
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Die
feste Phase der erfindungsgemäßen Vorrichtung
kann ein chromatographisches Material sein. Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler
Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chromatographischen
Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens. Das
chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie
silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin
umfassen synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere
wie Nitrocellulose, Zelluloseacetat, Zellulose, Polyvinylchlorid
oder -acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Agarose,
Polyacrylat u. s. w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe
wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die
Verwendung von Nitrocellulose als chromatographisches Material.
Zusätzlich kann
die Einführung
von positiv geladenen Innengruppen in z. B. Nitrocellulose oder
Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen
Materials verbessern.
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Das
chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Dieses Gehäuse ist
in der Regel Wasser unlöslich,
rigid und kann aus einer Vielzahl von organischen und anorganischen
Materialien bestehen. Wichtig ist, daß das Gehäuse nicht mit den kapillaren
Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, daß das Gehäuse Testkomponenten
nicht unspezifisch bindet, und daß das Gehäuse nicht mit dem Detektionssystem
interferiert.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
ist bevorzugt, wenn die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen
Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist. Der Linker fungiert
als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden
Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komplementären Teil
der Sonde am 5'-
oder 3'-Ende verlängern, aber
selbst nicht kodierend sind. Dies können Basenabfolgen einer nichtkodierender
Nukleinsäurestruktur
sein oder andere Polymereinheiten wie z. B. Polyether, Polyester u. ä. Der Linker
muß so
beschaffen sein, daß er
die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach
negativ beeinflußt
wird. Dies kann dadurch vermieden werden, daß keine selbstkomplementären Strukturen
vorhanden sind. Auch müssen die
chemischen Voraussetzungen für
die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine
entscheidende Voraussetzung für
ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein
stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie
der Kopplung an die Oberfläche. Es
müssen
chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwende ten Immobilisierungstechniken
eine irreversible Bindung ermöglichen.
Dies können
Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u. ä. sein.
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Dem
Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter
beziehungsweise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen.
Sondenoligonukleotide können
beispielsweise über
Proteine an die Membranoberfläche gebunden
werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren
an die poröse
Membran gebunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die
Kopplung über
homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifunktionelle
Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktionellen sind die reaktiven
Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole.
Thiole können synthetisch
direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen
Bedingungen mit z. B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren.
Für die Kopplung
Amin-Amin können Amine
als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oligonukleotide
gekoppelt werden und über
Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden
werden. Bei heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven
Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen
funktionellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen.
Mit einem heterobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl
eine Succinimidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte
Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagenz
sind die Carbodiimide, die Carbonylreste an Amine koppeln. Wichtigster
Vertreter ist hier das 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC).
Hier können
an Membranen mit Carbonylresten aminomodifizierte Oligonukleotide
gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht
in die Verbindung eingebaut.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
einer Nukleinsäure welche
ausgewählt
ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1–28 beziehungsweise komplementär zu diesen
Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise
komplementär
zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise
die komplementäre
Sequenz enthält.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Zusammensetzung
beziehungsweise ein Kit zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise
Karies assoziierter Bakterien enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Insbesondere
ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit zur Amplifikation
einer nachzuweisenden Nukleinsäure,
welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise
Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem
ist, enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.
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Zusätzlich zu
den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthält der Kit
alle für
die Amplifikation der Zielsequenz notwendigen Komponenten, wie Primer, Puffersysteme,
Enzyme.
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Am
meisten bevorzugt ist ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden
Nukleinsäure,
welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise
Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem
ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit den
SEQ ID No.: 1–13
beziehungsweise komplementär
zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise
komplementär
zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise
die komplementäre
Sequenz enthält.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beziehungsweise
des erfindungsgemäßen Kits
zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien.
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Die
nachzuweisende Nukleinsäure
kann sich in jeder Zusammensetzung befinden, die im Verdacht steht,
Bakterien zu enthalten, insbesondere parodontopathogene beziehungsweise
Karies assoziierte Bakterien. Es kann sich um Primarmaterial handeln, z.
B. Sekrete, Sulkusflüssigkeit,
Abstriche und Blut. Es kann sich um Kulturen von Mikroorganismen
handeln, die bereits in Flüssig-
oder Festmedien angezogen wurden.
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Figurenbeschreibung
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1:
SEQ ID No. 1–13
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2:
SEQ ID No: 14–28
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3:
Densitometrische Auswertung einer Dotblothybridisierung zur Bestimmung
der Spezifität der
Sonden SEQ ID No: 15, 19, 21, 22, 25, 28, 27
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Die
Abkürzungen
haben folgende Bedeutungen: Aa = Actinobacillus actinomycetemcomitans;
Pg = Porphyromonas gingivalis, Pi = Prevotella intermedia; Bf =
Bacteroides forsythus; Td = Treponema denticola; Smut = Streptococcus
mutans; Ssob = Streptococcus sobrinus; E.col = Escherichia coli;
hDNA = humane DNS; N-Kon = Negativkontrolle
(Amplifikation
ohne Zielnukleinsäure)
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Die
Amplifikationsprodukte wurden wie in Beispiel 1 beschrieben auf
eine Membran aufgebracht, gegen die Sonden SEQ ID No: 15, 19, 21,
22, 25, 28, 27 hybridisiert und autoradiographisch mit einem Densitometer
(Vilber Lourmat, Bio-Profil, Fröbel Laborgeräte, Lindau,
Deutschland) ausgewertet.
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Beispiele
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Beispiel 1
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DNA/RNA-Isolierung:
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Bakterielle
Nukleinsäure
wurde entweder von Festnährmedien,
Flüssigmedien
oder aus Primärmaterial
nach entsprechender Vorbehandlung gewonnen.
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Folgende
Bakterienspezies wurden untersucht: Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus;
Treponema denticola, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus;
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Dazu
wurde von Festmedien mit einer sterilen Impföse bakterielles Material entnommen
und in 300 μl
10 mmol/l Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde 1 ml entnommen,
5 min bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand
verworfen und in 300 μl
10 mmol/l Tris/I-ICl pH 7,5 resuspendiert. Primärmaterial wurde mit „paperpoints” aus Zahntaschen
entnommen. Die so erhaltenen Abstriche wurden 15 min bei 95°C in einem
Thermomixer (Eppendorf, Hainburg, Deutschland) inkubiert, 15 min
in einem Ultraschallbad (Bandelin) beschallt und 10 min bei 13.000
rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5 μl in die
Amplifikationsreaktion eingesetzt.
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Amplifikation:
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Alle
Primer wurden kommerziell synthetisiert (Interactiva, Ulm, Deutschland).
Als Primer zur Amplifikation von Zielsequenzen der oben angegebenen Organismen
wurden die Seq ID No. 1 bis 13 verwendet.
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Der
PCR-Ansatz enthielt 1 × Taq-Puffer
(Qiagen, Hilden, Deutschland), je 1 μmol/l Primer, 200 μmol/l dNTP
(Roche) und IU Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland).
Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocycler PE 9600 (ABI, Weiterstadt,
Deutschland) mit 15 min 95°C,
10 Zyklen mit 30 sek 95°C
und 2 min 60°C
und mit 20 Zyklen 10 sek 95°C,
50 sek 55°C
und 30 sek 70°C durchgeführt.
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Für die RNA-Amplifikation
mit der NASBA-Technik wurde das NucliSens Amplifikationskit (Organon
Technika, Boxtel, Niederlande) nach Angaben des Herstellers verwendet:
- 1. Herstellung des Amplifikationsmixes: 8 μl ”reagent
sphere” in ”reagent
dilution”-Puffer gelöst (enthält die für die Reaktion
benötigten
Enzyme), 5 μl
KCl-Lösung,
Endkonzentration 70 mmol/l KCl und 2 μl Primerlösung, Endkonzentration 0,5 μmol/l Primer;
- 2. 5 μl
RNA-Lösung
zugeben und 60 min bei 41°C im
Wasserbad inkubieren.
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DNA/RNA-Amplifikat
wurde entweder mit einem ethidiumbromidgefärbtem Agarosegel oder durch
Hybridisierung nachgewiesen.
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Defektion der Amplifikate durch Sondenhybridisierung:
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Alle
Sonden wurden am 5'-Ende
biotiniliert, um Zielsequenz/Sonden-Hybride über an Streptavidin gekoppelte
Reporterenzyme nachweisen zu können.
Als Sonden werden Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO 14
bis 28 eingesetzt. (siehe 2).
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Saugfähiges Papier
(Blotting Papier GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland), und
eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden
auf die Größe der Blotapparatur
(Minifold Schleicher & Schüll, Dassel,
Deutschland) geschnitten und mit 10 × SSC getränkt. In die Öffnungen
der zusammengebauten Apparatur wurden 250 μl Denaturierungslösung (50
mmol/l NaOH; 1,5 mol/l NaCl) vorgelegt und 20 μl Amplifikat zupipettiert. Nach
Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit
vollständig
durchgesaugt war. Anschließend
wurde mit 10 × SSC-Puffer
nachgespült. Die
Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem
UV-Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA)
bei 1200 Joule/cm2 fixiert und mit destilliertem
Wasser gewaschen und getrocknet.
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Alle
Hybridisierungen wurden bei 45°C
in einem Hybridisierungsofen (Hybaid Mini Oven MkII, MWG-Biotech,
Ebersberg, Deutschland) in Glasröhren
durchgeführt.
Die mit DNA/RNA-Amplifikat beschichtete Membran wurde in trockenem
Zustand eingerollt und in eine Glasröhre gegeben. Anschließend wurde
die Membran unter ständiger
Rotation 5 min mit vorgewärmten
Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 2 pmol biotinilierter
Sonde erfolgte für
eine Stunde die Hybridisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur
partial gebundene Sonde wurde durch 30 min Inkubation mit Stringent-Puffer bei
45°C mit
einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers
entfernt. Anschließend
wurde Blocking-Reagens zugegeben und 15 min bei 37°C weiterinkubiert.
Die Hybride wurden durch ein Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat durch
Zugabe von NBT/BCIP kolorimetrisch oder durch Aufsprühen von
Chemolumineszenzsubstrat (Lumi-Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abindon,
England) autoradiographisch detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische
Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde
die Membran zweimal 15 min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran
wurde dann entnommen, Lumi-Phos-Reagens
wurde aufgesprüht,
gefolgt von 2h Exposition eines Röntgenfilms. Alternativ dazu
wurde Substratpuffer mit NBT/BCIP zugegeben und die Farbentwicklung
abgewartet.
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Verwendete Lösungen:
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- 10 × SSC-Lösung (Standard-Saline-Citrat):
- 1,5 mol/l NaCl, 0,15 mol/l Trinatriumcitrat;
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Hybridisierungspuffer:
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- 7% SDS (Na-dodecylsulfat), 0,25 mol/l Phosphatpuffer pH
7,5;
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Stringentwaschlösung (Stringent-Puffer):
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- 3 mol/l TMCL (Tetramethylammoniumchlorid), 50 mmol/l Tris/Cl,
2 mmol/l EDTA, 0,1% SDS;
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Lösung
zur Absättigung
der Membranbindungsstellen:
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- 5 g/l Blockingreagenz (Roche) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (4,13 g NaCl
und 5,53 g Maleinsaure in 500 ml Wasser, pH mit 5 mol/l NaOH auf
7,5 eingestellt);
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Substratpuffer:
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- 274 mmol/l Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mmol/l Na3Citrat,
200 mmol/l NaCl, 27,4 mmol/l MgCl2·6 H2O;
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BCIP:
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- 50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz
in 100% Dimethylformamid;
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NBT:
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- 75 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid;
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Die
Autoradiogramme wurden densitometrisch ausgewertet. Als 100%-Wert
wurde der Amplifikatdot der Spezies, aus der die Sondensequenz abgeleitet
wurde, zugrundegelegt. Als Kontrollen wurden immer eine Probe, der
statt Nukleinsäurelösung Wasser
zugegeben wurde und eine Probe mit 100 ng isolierter humaner DNS
als Dots auf der Membran mitgeführt.
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In 3 sind
die Ergebnisse von Beispiel 1 dargestellt. Angegeben sind die %-Werte
der densitometrischen Auswertung. Der Wert der für die Spezies homologen Sonde
wurde 100% gesetzt.
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Mit
den hier beschriebenen Methoden können die entsprechenden Bakterien
entweder aus Primärmaterial
(z. B. Zahnabstrichen, Blut u. ä.)
oder aus bakteriellen Flüssig-
oder Festmedien identifiziert und differenziert werden.