DE69334050T2

DE69334050T2 - Nukleinsäure-Sonden für Chlamydia Pneumoniae

Info

Publication number: DE69334050T2
Application number: DE69334050T
Authority: DE
Inventors: Philip San Diego Hammond; Anthony San Diego Endozo
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1992-08-26
Filing date: 1993-08-19
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2013-08-20
Also published as: ES2264121T3; AU5002993A; DE69334050D1; US5683870A; CA2148468A1; EP0587331B1; WO1994004549A1; ATE334224T1; US5374718A; CA2148468C; EP0587331A1; AU687752B2; DK0587331T3

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindungen betreffen das Design und die Konstruktion von Nukleinsäure-Sonden für Chlamydia pneumoniae, die zum Detektieren des Organismus in Testproben von z.B. Sputum, Urin, Blut und Gewebesektionen, Nahrungsmitteln, Erde und Wasser in der Lage sind.
Hintergrund der Erfindung
Zwei Einzelstränge der Desoxyribo- („DNA") oder Ribo- („RNA") -Nukleinsäure, die aus Nukleotiden (einschließlich der Basen Adenin (A), Cytosin (C), Thymidin (T), Guanin (G), Uracil (U) oder Inosin (E) gebildet sind, können assoziieren („hybridisieren") und dadurch eine doppelsträngige Struktur bilden, in welcher die beiden Stränge durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Paaren von komplementären Basen zusammengehalten werden. Generell wird A an T oder U durch die Wasserstoffbrücke gebunden, wohingegen G an C Wasserstoffbrücken – gebunden wird. An jeglichem Punkt entlang der Kette sind daher die klassischen Basenpaare AT oder AU, TA oder UA, GC oder CG zu finden. Außerdem sind möglicherweise AG, GU oder andere „Wobble"- oder fehlgepaarte Basenpaare zu finden.
Enthält ein erster Einzelstrang der Nukleinsäure genügend angrenzende komplementäre Basen zu einem zweiten Strang, und werden diese beiden Stränge unter Bedingungen zusammengebracht, die ihre Hybridisation fördern werden, so wird eine doppelsträngige Nukleinsäure das Resultat sein. Unter geeigneten Bedingungen können DNA/DNA-, RNA/DNA- oder RNA/RNA-Hybride entstehen.
Eine Sonde besteht allgemein aus einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, die in einem gewissen Grade zu einer Nukleinsäuresequenz komplementär ist, die nachgewiesen werden soll („Zielsequenz"). Sie kann mit einer nachweisbaren Komponente markiert sein, wie etwa einem Radioisotop, einem Antigen oder chemilumineszierenden Komponente. Eine Hintergrundbeschreibung der Anwendung der Nukleinsäure-Hybridisation als einer Verfahrensweise für die Detektion bestimmter Nukleinsäuresequenzen ist beschrieben bei Kohne, US-Patent Nr. 4 851 330, und Hogan et al, EPA-Patentanmeldung Nr. PCT/US87/03009, mit dem Titel „Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms".
Hogan et al., supra, beschreiben auch Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins RNA-enthaltender Organismen in einer Probe, die solche Organismen enthalten könnte. Diese Verfahren erfordern Sonden, die ausreichend komplementär sind, um an die ribosomale RNA (rRNA) eines oder mehrer nicht-viraler Organismen oder Gruppen von nicht-viralen Organismen zu hybridisieren. Das Gemisch wird dann unter spezifizierten Hybridisationsbedingungen inkubiert und auf die Hybridisierung der Sonde und einer Testproben-rRNA analysiert.
Hogan et al. beschreiben außerdem Sonden, die lediglich spezifisch angezielte rRNA-Untereinheit-Subsequenzen in bestimmten Organismen oder Gruppen von Organismen in einer Probe, selbst in Gegenwart vieler nicht-verwandter Organismen oder in Gegenwart der engsten bekannten phylogenetischen Nachbarn, detektieren. Spezifische Beispiele der Hybridisierungsassay-Sonden sind angegeben für Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti, die Gattung Mycobacterium, Mycoplasma pneumoniae, die Gattung Legionella, Chlamydia trachomatis, die Gattung Campylobacter, Enterococcus, die Gattung Pseudomonas Gruppe I, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, die Gattung Salmonella, Escherichia coli, Bakterium, Fungus, und Neisseria gonorrhoeae. Diese Sondensequenzen kreuzreagieren nicht mit den Nukleinsäuren aus den oben aufgelisteten Gruppen, oder jeglicher anderen bakteriellen Spezies oder infektiösem Agens, unter geeignet stringenten Hybridisationsbedingungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung beschreibt und beansprucht neuartige Sonden für den Nachweis von Chlamydia pneumoniae. Diese Sonden sind zur Unterscheidung zwischen Chlamydia pneumoniae und ihren engsten bekannten phylogenetischen Nachbarn in der Lage. Diese Sonden detektieren einmalig vorkommende rRNA und Gensequenzen, die rRNA kodieren, und können in einem Assay für den Nachweis und/oder die Quantifizierung von Chlamydia pneumoniae verwendet werden.
Chlamydia pneumoniae ist als ein Erreger sowohl oberer als auch unterer Atemwegsinfektionen identifiziert worden. Er wurde als Lungenentzündung bei Neugeborenen und Säuglingen als auch bei Erwachsenen verursachend nachgewiesen. Er kann auch Bronchitis, Pharyngitis und Sinusitis verursachen und kann der Erreger einer chronischen Sinusinfektion bei Kindern sein. Die Erkrankung setzt nach und nach ein, woran oftmals Halsschmerzen, Husten und Heiserkeit beteiligt sind. Diese Symptome sind ähnlich denen bei einer anderen atypischen Lungenentzündung, weshalb die klinische Diagnose schwierig ist.
C. pneumoniae ist ein obligat intrazellulärer Organismus. Zwei Typen von intrazellulären Einschlüssen sind beobachtet worden: ein Elementarkörperchen, welches gewöhnlich birnenförmig ist, doch pleomorph sein kann, und ein Retikulärkörperchen. Sowohl gattungsspezifische als auch spezifische Antigene sind auf den Elementarkörperchen vorhanden. Die Labordiagnose von C. pneumoniae ist schwierig. Eine definitive Identifizierung erfordert die Kultivierung in HELA 299-Zellen oder in Dottersack, wobei oftmals vielfache Passagen erforderlich sind. Ein Fluoreszein-markierter Spezies-spezifischer monoklonaler Antikörper wird dann zur Färbung der Einschlusskörperchen verwendet. Die Diagnose mittels serologischer Techniken erfordert im Allgemeinen zwei Serumproben, von denen eine Wochen bis Monate nach der anfänglichen Probe genommen wird. Zwei Proben sind aufgrund der großen Zahl von Menschen (40-50%) erforderlich, die Antikörper gegen C. pneumoniae aufweisen. Die Bestätigung einer aktuellen Infektion erfordert den Nachweis eines Anstiegs des IgG-Titers.
Die Anwendung eines direkten DNA-Sonden-Tests dieser Erfindung für C. pneumoniae-rRNA ermöglicht die abschließende Identifizierung des Vorhandenseins des Organismus in einer klinischen Probe innerhalb von zwei Stunden nach Probenentnahme.
Daher stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt Hybridisierungsassay-Sonden bereit, die zur Unterscheidung von Chlamydia pneumoniae von anderen Chlamydia-Spezies in der Lage sind.
Die Sonde ist komplementär zu rRNA oder rDNA, z.B. zu einer variablen Region der rRNA.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay von bis zu 100 Basen Länge und enthaltend eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 1711-1733 der Escherichia coli 23S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, bereit, wobei die Sonde an diese Basenregion von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und wobei die Sonde nicht an Nukleinsäure von Chlamydia psittaci oder Chlamydia trachomatis unter diesen Bedingungen hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay von bis zu 100 Basen Länge und enthaltend eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 175-188, 224-247 oder 623-647 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, bereit, wobei die Sonde an diese Basenregion von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und wobei die Sonde nicht an Nukleinsäure von Chlamydia psittaci oder Chlamydia trachomatis unter diesen Bedingungen hybridisiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay von bis zu 100 Basen Länge und umfassend die Basensequenz der SEQ ID NR. 11 oder die dazu perfekt komplementäre Sequenz bereit, wobei die Sonde an Chlamydia pneumoniae 16S-rRNA, oder die codierende DNA, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und wobei die Sonde nicht an Nukleinsäure von Chlamydia psittaci oder Chlamydia trachomatis unter diesen Bedingungen hybridisiert.
Das Oligonukleotid umfasst vorzugsweise, besteht im Wesentlichen aus, oder besteht zumindest aus einem Abschnitt von zumindest 10 aufeinander folgenden Basen der Sequenz
(SEQ ID NR. 2) GCCTAATTACACTACATTCGG oder
(SEQ ID NR. 4) CTGATATCGCATAAACTCTTCCTG oder
(SEQ ID NR. 7) GATAGTTTTAAATGCTGACTTGGGG oder
(SEQ ID NR. 11) GCGGAAAGCTGTATTTCTACAG oder
(SEQ ID NR. 14) CGCTGGGTAATCACCTTAAG oder Oligonukleotide, die dazu komplementär oder homolog sind (z.B. die dadurch kodierte RNA), mit oder ohne einer Helfersonde, wie nachstehend beschrieben.
Mit „besteht im Wesentlichen aus" ist gemeint, dass die Sonde als eine gereinigte Nukleinsäure bereit gestellt wird, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit dem gewünschten Organismus und nicht mit anderen verwandten Organismen hybridisiert. Solch eine Sonde kann an andere Nukleinsäuren geknüpft sein, die diese Hybridisierung nicht beinträchtigen. Allgemein ist es bevorzugt, dass die Sonde zwischen 15 und 100 (am bevorzugtesten zwischen 20 und 50) Basen in der Größe beträgt. Sie kann jedoch in einem Vektor bereit gestellt sein.
Bei verwandten Aspekten stellt die Erfindung ein Nukleotid-Polymer bereit, das zum Hybridisieren an die obigen Oligonukleotide in der Lage ist, ein Nukleinsäure-Hybrid, das mit den obigen Oligonukleotiden gebildet wird (sinnvoll für den Nachweis des Vorhandenseins einer spezifischen Oligonukleotidsequenz), und eine Nukleinsäuresequenz, die im wesentlichen dazu komplementär ist.
Die Sonden dieser Erfindung bieten eine schnelle, objektive Methode zum Identifizieren und Quantifizieren einer Bakterienkolonie oder Probe von biologisch relevantem Gewebe auf das Vorhandensein spezifischer rRNA-Sequenzen, die für alle Stämmen von Chlamydia pneumoniae einzigartig sind.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen erkennbar werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Sonden
Wir haben DNA-Sonden entdeckt, die zu einer bestimmten rRNA-Sequenz komplementär sind, die von Chlamydia pneumoniae erhalten wird. Weiterhin haben wir diese Sonden in einem spezifischen Assay für den Nachweis von Chlamydia pneumoniae erfolgreich angewendet, um C. pneumoniae von ihren bekannten und vermutlich am engsten verwandten taxonomischen und phylogenetischen Nachbarn zu unterscheiden.
Mit Ausnahme der Viren enthalten alle prokaryotischen Organismen rRNA-Gene, die 5S rRNA, 16S rRNA und ein größeres RNA-Molekül, bekannt als 23S rRNA, kodieren. Unter Anwendung von den Fachleuten des Gebiets bekannten Methoden wurden variable Regionen der rRNA-Sequenzen aus der 16S rRNA von Chlamydia pneumoniae identifiziert, wie nachstehend beschrieben. Andere solcher Sequenzen können unter Anwendung ähnlicher Techniken identifiziert werden. Zu diesen Methoden zählen das teilweise oder vollständige Sequenzieren der rRNA von Chlamydia pneumoniae und eng verwandter phylogenetischer Nachbarn, das im Alignment Anordnen der Sequenzen zur Erkennung von Bereichen einer maximalen Homologie und das Untersuchen des Alignments auf Regionen mit Sequenzvariation. Die unten angegebenen Beispiele stellen daher bei dieser Erfindung keine Beschränkung dar.
Für die Sequenzierung wurden komplementäre Oligonukleotid-Primer von etwa 10-100 Basen Länge an konservierte Regionen in gereinigter rRNA hybridisiert, die für die 5S-, 16S- oder 23S-Untereinheiten spezifisch sind, und mit dem Enzym Reverse Transkriptase verlängert. Chemische Abbau- oder Didesoxynukleotid-terminierte Sequenzierungsreaktionen wurden zur Bestimmung der Nukleotidsequenz des verlängerten Produkts angewendet. Lane et al., 82 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 6955, 1985. Bei einer weniger bevorzugten Methode können genomische ribosomale RNA-Sequenzen auch mittels standardmäßiger Verfahrensweisen bestimmt werden.
Es ist nicht immer notwendig, die gesamte Nukleinsäuresequenz zu bestimmen, um eine Sondensequenz zu erhalten. Die Verlängerung aus irgendeinem einzelnen Oligonukleotid-Primer kann bis zu 300-400 Basen an Sequenz erbringen. Wird ein einzelner Primer zur teilweisen Sequenzierung der rRNA des Zielorganismus oder von dem Ziel eng verwandten Organismen verwendet, so kann ein Alignment vorgenommen werden, wie unten skizziert. Wird eine nützliche Sondensequenz gefunden, so ist es erforderlich, die rRNA-Sequenzierung unter Anwendung anderer Primer fortzusetzen. Wird dagegen keine nützliche Sondensequenz aus der Sequenzierung mit einem ersten Primer erhalten, oder ist eine höhere Empfindlichkeit erwünscht, so können andere Primer zum Erhalt von mehr Sequenzen verwendet werden. In solchen Fällen, bei denen die Variationsmuster für ein Molekül nicht gut verstanden sind, sind möglicherweise mehr Sequenzdaten vor dem Sondendesign erforderlich.
Nach der Sequenzierung werden die Sequenzen zur Maximierung der Homologie im Alignment angeordnet. Das rRNA-Molekül weist eine enge Beziehung der Sekundärstruktur zur Funktion auf. Dies erlegt den evolutionären Veränderungen in der Primärsequenz Beschränkungen auf, so dass die Sekundärstruktur erhalten wird. Ist z. B. eine Base auf einer Seite einer Helix ausgetauscht, so wird ein kompensatorischer Austausch auf der anderen Seite vorgenommen, um die Komplementarität zu erhalten (dies bezeichnet man als Covarianz). Dies erlaubt das Alignment zweier sehr verschiedener Sequenzen auf der Grundlage der konservierten Primärsequenz und ebenso der konservierten Sekundärstruktur-Elemente. Sind die Sequenzen einmal angeordnet, so ist es möglich, die Regionen zu finden, in denen die Primärsequenz variabel ist.
Wir haben variable Regionen durch vergleichende Analyse von rRNA-Sequenzen, die in der Literatur veröffentlicht sind, als auch der von uns bestimmten Sequenzen identifiziert. Computer und Computerprogramme, die für die hierin beschriebenen Zwecke verwendet oder adaptiert werden können, sind kommerziell verfügbar. Da die Sequenzevolution an jeder der variablen Regionen (die z.B. ein Minimum von 10 Nukleotiden durchspannt) zum größten Teil divergent und nicht konvergent ist, können wir gewiss Sonden auf der Grundlage einiger weniger rRNA-Sequenzen konstruieren, die sich zwischen dem Zielorganismus und seinen phylogenetisch engsten Verwandten unterscheiden. Wir haben eine ausreichende Variation zwischen dem Zielorganismus und dem engsten phylogenetischen Verwandten, der in derselben Probe zu finden ist, festgestellt, um die Sonde von Interesse zu konstruieren.
Wir haben die folgenden nützlichen Richtlinien für das Design von Sonden mit den gewünschten Eigenschaften identifiziert. Da der Umfang und die Spezifität der Hybridisierungsreaktionen wie den hierin beschriebenen durch eine Anzahl von Faktoren beeinflusst werden, wird die Manipulation eines oder mehrer dieser Faktoren die exakte Empfindlichkeit und Spezifität einer bestimmten Sonde bestimmen, ob diese nun perfekt komplementär zu ihrem Ziel ist oder nicht. Die Bedeutung und Auswirkung der verschiedenen Assay-Bedingungen, wie hierin weiter erläutert, sind den Fachleuten des Gebiets bekannt.
Zunächst sollte die Stabilität des Sonden:Zielnukleinsäure-Hybrids so gewählt sein, dass sie mit den Assay-Bedingungen kompatibel ist. Dies kann durch Vermeidung langer A- und T-reicher Sequenzen, indem die Hybride mit G:C-Basenpaaren beendet werden, und durch das Design der Sonde mit einer geeigneten Tm erreicht werden. Die Anfangs- und Endpunkte der Sonde sollten so gewählt werden, dass die Länge und %G und %C zu einer Tm von etwa 2-10°C höher als der Temperatur führen, bei der der abschließende Assay durchgeführt werden wird. Die Basenzusammensetzung der Sonde ist signifikant, da G-C-Basenpaare eine größere Wärmestabilität im Vergleich zu A-T-Basenpaaren aufgrund zusätzlicher Wasserstoffbrückenbindung zeigen. Somit wird die Hybridisierung unter Beteiligung komplementärer Nukleinsäuren von höherem G-C-Gehalt bei höheren Temperaturen stabil sein.
Bedingungen wie die Ionenstärke und die Inkubationstemperatur, unter denen eine Sonde verwendet werden wird, sollten beim Konstruieren einer Sonde ebenfalls in Betracht gezogen werden. Es ist bekannt, dass die Hybridisierung mit zunehmender Ionenstärke des Reaktionsgemischs zunehmen wird, und dass die Wärmestabilität der Hybride mit zunehmender Ionenstärke zunehmen wird. Dagegen werden chemische Reagenzien, wie z.B. Formamid, Harnstoff, Dimethylsulfoxid und Alkohole, die Wasserstoffbrückenbindungen zerstören, die Stringenz der Hybridisation erhöhen. Eine Destabilisierung der Wasserstoffbrückenbindungen durch solche Reagenzien kann die Tm stark herabsetzen. Allgemein erfolgt eine optimale Hybridisation für synthetische Oligonukleotid-Sonden von etwa 10-50 Basen Länge etwa 5°C unterhalb der Schmelztemperatur für eine gegebene Doppelhelix. Eine Inkubation bei Temperaturen unterhalb des Optimums kann die Hybridisierung von fehlgepaarten Basensequenzen ermöglichen und daher zu einer verminderten Spezifität führen.
Es ist wünschenswert, Sonden zur Verfügung zu haben, die lediglich unter Bedingungen von hoher Stringenz hybridisieren. Unter hoch stringenten Bedingungen werden sich nur die hochgradig komplementären Nukleinsäure-Hybride bilden (d.h. solche, bei denen mindestens etwa 14 von 17 Basen in einer fortlaufenden Basenreihe komplementär sind); Hybride ohne einen ausreichenden Grad an Komplementarität bilden sich nicht. Demgemäß bestimmt die Stringenz der Assay-Bedingungen den Grad der Komplementarität, der zwischen zwei Nukleinsäure-Strängen erforderlich ist, um ein Hybrid zu bilden. Die Stringenz wird so gewählt, dass die Differenz in der Stabilität zwischen dem Hybrid, das mit der Ziel-Nukleinsäure gebildet wird, und dem, das mit der Nicht-Ziel-Nukleinsäure gebildet wird, maximiert wird.
Zweitens sollten Sonden so positioniert werden, dass sie die Stabilität des Sonden:Nicht-Ziel-Nukleinsäure-Hybrids minimieren. Dies kann durch Minimierung der Länge der perfekten Komplementarität zu Nicht-Zielorganismen erreicht werden, wobei G- und C-reiche Regionen von Homologie zu Nicht-Zielsequenzen vermieden werden, und durch derartige Positionierung der Sonde, dass sie so viele destabilisierende Fehlpaarungen wie möglich überspannt. Ob eine Sondensequenz zur Detektierung lediglich eines spezifischen Typs von Organismus nützlich ist, hängt großteils von der Differenz in der Wärmestabilität zwischen Sonde:Ziel-Hybriden und Sonde:Nicht-Ziel-Hybriden ab. Beim Design von Sonden sollten die Differenzen bei die sen Tm-Werten so groß wie möglich sein (z.B. mindestens 2°C, und vorzugsweise 5°C).
Die Länge der Ziel-Nukleinsäuresequenz, und dementsprechend die Länge der Sondensequenz, kann ebenfalls von Bedeutung sein. In einigen Fällen können mehrere Sequenzen aus einer bestimmten Region vorliegen, die in Lokalisation und Länge variieren, was Sonden mit den gewünschten Hybridisationseigenschaften ergeben wird. In anderen Fällen kann eine Sequenz signifikant besser als eine andere sein, die lediglich in einer einzigen Base abweicht. Zwar ist es Nukleinsäuren, die nicht perfekt komplementär sind, möglich, zu hybridisieren, doch wird die längste Strecke der perfekt homologen Basensequenz normalerweise primär die Hybridstabilität bestimmen. Zwar können Oligonukleotid-Sonden von verschiedenen Längen und Basenzusammensetzungen verwendet werden, doch sind die bei dieser Erfindung bevorzugten Oligonukleotid-Sonden zwischen etwa 10 und 50 Basen lang und ausreichend homolog zur Ziel-Nukleinsäure.
Drittens sind Regionen der rRNA, die für die Bildung starker interner, die Hybridisation hemmender Strukturen bekannt sind, weniger bevorzugt. Entsprechend sollten Sonden mit ausgedehnter Selbstkomplementarität vermieden werden.
Wie oben erläutert, stellt die Hybridisation die Assoziation zweier Einzelstränge von komplementären Nukleinsäuren dar, um einen Wasserstoffbrücken-gebundenen Doppelstrang zu bilden. Es versteht sich von selbst, dass dann, wenn einer der beiden Stränge vollständig oder teilweise an einem Hybrid beteiligt ist, er weniger an der Bildung eines neuen Hybrids beteiligt sein kann. Im Falle der rRNA ist das Molekül für die Bildung sehr stabiler intramolekularer Hybride bekannt. Indem eine Sonde so gestattet wird, dass ein wesentlicher Abschnitt der Sequenz von Interesse einzelsträngig ist, kann die Rate und der Umfang der Hybridisierung stark erhöht werden. Ist das Ziel die genomische Sequenz entsprechend der rRNA, so wird dieses natürlicherweise in einer doppelsträngigen Form vorliegen; dies ist auch für das Produkt der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der Fall. Diese doppelsträngigen Ziele sind natürlicherweise gegenüber der Hybridisierung mit einer Sonde inhibitorisch. Schließlich können intramolekulare und intermolekulare Hybride innerhalb einer Sonde ge bildet werden, wenn eine ausreichende Selbstkomplementarität vorliegt. Solche Strukturen können durch sorgfältiges Sonden-Design vermieden werden. Computerprogramme stehen zur Suche nach dieser Art von Interaktion zur Verfügung.
Ist einmal eine vermutlich einmalig vorkommende Sequenz identifiziert worden, so wird ein komplementäres DNA-Oligonukletid erzeugt. Dieses einzelsträngige Oligonukleotid wird als der Sonde in der Hybridisierungsreaktion dienen. Definierte Oligonukleotide können mittels irgendeiner aus mehreren wohl bekannten Methoden erzeugt werden, einschließlich automatisierter chemischer Festphasen-Synthese unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramidit-Vorläufern. Barone et al., 12 Nucleic Acids Research 4051, 1984. Natürlich können auch andere wohl bekannte Methoden für die Konstruktion synthetischer Oligonukleotide angewendet werden. 2 J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning 11 (2. Aufl. 1989).
Einmal synthetisiert, können ausgewählte Oligonukleotid-Sonden auch mittels irgendeiner aus mehreren wohl bekannten Methoden markiert werden. 2 J. Sambrook E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning 11 (2. Aufl.1989). Zu nützlichen Markierungen zählen Radioisotope als auch nicht-radioaktive Reportergruppen. Zu Isotopen Markierungen zählen ³H, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I, ⁵⁷Kobalt und¹⁴C. Die meisten Methoden der Isotopen Markierung beziehen die Verwendung von Enzymen ein und umfassen die bekannten Methoden der Nick-Translation, Endmarkierung, Zweitstrang-Synthese und reversen Transkription. Werden radiomarkierte Sonden verwendet, so kann die Hybridisation durch Autoradiographie, Szintillationszählung oder Gammazählung nachgewiesen werden. Die gewählte Nachweismethode wird von den Hybridisationsbedingungen und dem speziell für die Markierung verwendeten Radioisotop abhängen.
Nicht-Isotope Materialien können ebenfalls für die Markierung verwendet werden, und können intern in die Sequenz oder an das Ende der Sequenz eingeführt werden. Modifizierte Nukleotide können enzymatisch oder chemisch eingebaut werden, und chemische Modifikationen der Sonde können während oder nach der Synthese der Sonde, zum Beispiel durch die Verwendung von Nicht-Nukleotid-Linkergruppen, vorgenommen werden. Zu nicht-Isotopen Markierungen zählen fluoreszierende Molekü- le, chemilumineszierende Moleküle, Enzyme, Cofaktoren, Enzymsubstrate, Haptene oder andere Liganden. Wir bevorzugen derzeit die Verwendung von Acridinestern.
Nach der Synthese und Reinigung einer bestimmten Oligonukleotidsequenz können mehrere Verfahrensweise zur Bestimmung der Annehmbarkeit des Endprodukts ausgenützt werden. Die erste ist die Polyacrylamid-Gelelektrophorese, die zur Bestimmung der Größe angewendet wird. 2 J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, 11.51 (2. Aufl. 1989). Diese Verfahrensweisen sind im Fachgebiet bekannt. Über die Polyacrylamid-Gelelektrophorese hinaus können auch Verfahren der Hochleistungs-Flüssigchromatografie („HPLC") zur Bestimmung von Größe und Reinheit des Oligonukleotid-Produkts angewendet werden. Diese Verfahrensweisen sind den Fachleuten des Gebiets bekannt.
Es wird für Fachleute das Gebiets erkennbar sein, dass Faktoren, die die Wärmestabilität beeinträchtigen, die Sondenspezifizität beeinflussen können und somit kontrolliert werden müssen. Daher sollte das Schmelzprofil, einschließlich der Schmelztemperatur (Tm), des Oligonukleotid/Ziel-Hybrids bestimmt werden. Das bevorzugte Verfahren ist beschrieben bei Arnold et al., US-Patent Nr. 5283174.
Für die Tm-Messung unter Anwendung eines Hybridization Protection Assay (HPA) wird die folgende Technik angewendet. Ein Sonde/Ziel-Hybrid wird bei einem Überschuss an Ziel in einer Lithiumsuccinat-gepufferten Lösung, die Lithiumlaurylsulfat enthält, hergestellt. Aliquots dieses Hybrids werden in dem Hybridisationspuffer verdünnt und für 5 Minuten bei verschiedenen Temperaturen, beginnend unterhalb der angenommenen Tm (typischerweise 55°C) und steigend in 2-5 Grad-Zunahmen, inkubiert. Diese Lösung wird dann mit einem mild alkalischen Borat-Puffer verdünnt und bei einer niedrigeren Temperatur (z.B. 50°C) für 10 Minuten inkubiert. Unter diesen Bedingungen wird der an eine einzelsträngige Sonde gebundene Acridinester hydrolysiert, wohingegen der an eine hybridisierte Sonde gebundene Acridinester relativ geschützt vor der Hydrolyse ist. Die Menge an verbliebener Chemilumineszenz ist zur Menge an Hybrid proportional und wird in einem Luminometer durch Zugabe von Wasserstoffperoxid, gefolgt von Alkali, gemessen. Die Daten werden als Prozent an maximalem Signal (gewöhnlich von der niedrigsten Temperatur aus) ge genüber der Temperatur aufgetragen. Die Tm ist als die Temperatur definiert, bei der 50% des maximalen Signals verbleiben.
Über die obige Methode hinaus kann die Schmelztemperatur des Oligonukleotid/Ziel-Hybrids auch durch Isotope Methoden bestimmt werden, wie den Fachleuten des Gebiets wohl bekannt. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass die Tm für ein gegebenes Hybrid in Abhängigkeit von der zu verwendenden Hybridisationslösung variieren wird, da die Wärmestabilität von der Konzentration verschiedener Salze, Detergentien und anderer Solute abhängt, die die relative Hybridstabilität während der Wärmedenaturierung beeinflussen. 2 J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, 9.51 (2. Aufl. 1989).
Die Hybridisationsrate kann durch Bestimmen der C_ot_1/2 gemessen werden. Die Rate, bei der eine Sonde an ihr Ziel hybridisiert, stellt ein Maß der Wärmestabilität der Ziel-Sekundärstruktur in der Sondenregion dar. Das standardmäßige Maß der Hybridisationsrate ist die C_ot_1/2, welche als Mol Nukleotid pro Liter mal Sekunden gemessen wird. Somit ist es die Konzentration der Sonde mal der Zeit, bei der 50% der maximalen Hybridisierung bei jener Konzentration erfolgt sind. Dieser Wert wird durch Hybridisieren verschiedener Mengen an Sonde an eine Konstantmenge an Ziel für eine fixierte Zeitdauer bestimmt. Z.B. werden 0,05 pmol Ziel mit 0,012, 0,025, 0,05, 0,1 und 0,2 pmol Sonde für 30 Minuten inkubiert. Die Menge an Hybrid nach 30 Minuten wird mittels HPA gemessen, wie oben beschrieben. Das Signal wird dann als ein log der Prozent an maximalen Relativen Lichteinheiten (RLU) (von der höchsten Sondenkonzentration) gegenüber der Sondenkonzentration (Mol Nukleotid pro Liter) aufgetragen. Die RLU stellen ein Maß der Menge an Photonen dar, die durch die markierte Sonde ausgestrahlt werden, wie mittels des Luminometers gemessen. Die C_ot_1/2 wird graphisch anhand der Konzentration festgestellt, die 50% der maximalen Hybridisation, multipliziert mit der Hybridisationszeit in Sekunden, entspricht. Diese Werte liegen im Bereich von 9,0 × 10^- ⁶ bis 9 × 10^-5, wobei die bevorzugten Werte weniger als 3,5 × 10^- ⁵ betragen.
Wie von Kohne und Kacian, US-Patent Nr. 5132207, beschrieben, können andere Methoden der Nukleinsäure-Reassoziation angewendet werden.
Das folgende Beispiel zeigt synthetische Sonden, die komplementär zu einer einmalig vorkommenden RNA-Sequenz, oder dem entsprechenden Gen, aus einem Zielorganismus, Chlamydia pneumoniae, sind, und deren Verwendung in einem Hybridisierungsassay.
Beispiel:
Für C. pneumoniae spezifische Sonden wurden durch Sequenzierung mit Primern identifiziert, die zu der 16S- und 23S-rRNA komplementär sind. Die oben aufgelisteten Sequenzen wurden charakterisiert und als für Chlamydia pneumoniae spezifisch gezeigt. Die phylogenetisch nahen Nachbarn C. trachomatis und C. psittaci wurden als Vergleiche mit der Sequenz von C. pneumoniae verwendet.
Um die Reaktivität und Spezifität der Sonden für C. pneumoniae nachzuweisen, wurden sie in einem Hybridisierungsassay verwendet. Die Sonden wurden zunächst mit einem Nicht-Nukleotid-Linker synthetisiert, dann mit einem chemilumineszierenden Acridinester markiert, wie beschrieben in EP-Patentanmeldung Nr. PCT/US88/ 03361, mit dem Titel „Acridinum Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes", eingereicht am 5.Oktober 1988. Der an unhybridisierte Sonde gebundene Acridinester wird unter mild-alkalischen Bedingungen nicht-chemilumeszierend gemacht, wohingegen der an hybridisierte Sonde gebundene Acridinester relativ resistent ist. Somit ist es möglich, auf die Hybridisierung von Acridinester-markierter Sonde durch Inkubation mit einem alkalischen Puffer, gefolgt vom Nachweis der Chemilumineszens in einem Luminometer, zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in RLU angegeben, der Menge an Photonen, die durch die markierte Sonde ausgestrahlt wird, wie mittels des Luminometers gemessen.
Die Nukleinsäure-Hybridisation wurde durch die Verwendung von „Helfersonden" unter Anwendung von Techniken erhöht, wie beschrieben bei Hogan et al., US-A-5030557. Diese Veröffentlichung beschreibt ein Verfahren zur Förderung der Bindung zwischen einer Nukleotid-Sonde und einer komplementären Nukleotidsequenz in einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure, umfassend das Hinzugeben zur Ziel-Nukleinsäure eines Helfer-Oligonukleotids, welches mit der Ziel-Nukleinsäure in einer anderen Region als die Sonde hybridisiert, wobei das Helfer-Oligonukleotid in einer Menge hinzugegeben wird, die in der Förderung der Bindung der Sonde an die Ziel-Nukleinsäure wirksam ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die RNA an die Acridinester-markierten Sonden in Gegenwart einer oder mehrerer unmarkierter Helfersonden mit den folgenden Oligonukleotidsequenzen hybridisiert (geschrieben 5'->3'):
Im folgenden Experiment wurde RNA, die aus >10⁷ Organismen erhalten war, untersucht. Ein Beispiel dieser Methode ist angegeben bei Murphy et al, US-Patent Nr. 5374522. Nach der Hybridisierung bei 60°C für 1 Stunde in 0,19 M Lithiumsuccinat, pH 5, 0,62 M Lithiumlaurylsulfat, 3mM Ethylendiamintetraessigsäure, 3mM Ethylenglycol-bis(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure wurden die Hybride an magnetische Partikel in einer Lösung, enthaltend 0,76 M Natriumborat, pH 7,5, gebunden und einmal in einer Lösung, enthaltend 80 mM Natriumborat, pH 10,4, gewaschen. Die mit den Partikeln assoziierte Chemilumiszenz wurde in einem Luminometer gemessen. Die RLU aus einer Hybridisierungsreaktion, enthaltend 1 ng an Nicht-Ziel-RNA, wurden von den gezeigten Werten subtrahiert. Ein Netto-RLU-Wert von mehr als +300 RLU war eine positive Reaktion, von weniger als + 300 dagegen eine negative Reaktion.
Die folgenden Daten zeigen, dass die fünf oben beschriebenen Sonden, die als ein Gemisch getestet wurden, nicht mit Organismen aus einem breiten phylogenetischen Querschnitt kreuzreagierten. Natürlich kann auch jede Sonde einzeln in einem Hybridisierungsassay verwendet werden.

1) Experimenteller Wert – der Wert, der mit 1 ng Nicht-Ziel-rRNA erhalten wurde.
2) 10 ng an extrahierter rRNA wurden untersucht.

Die obigen Daten zeigen, dass die hierin beschriebenen und beanspruchten neuen Sonden zur Unterscheidung von Chlamydia pneumoniae von ihren bekannten nächsten phylogenetischen Nachbarn in der Lage ist.
Weitere Anwendungsformen finden sich innerhalb der folgenden Ansprüche.
SEQUENZLISTE

Claims

Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay von bis zu 100 Basen Länge und enthaltend eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 1711-1733 der Escherichia coli 23S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, wobei die Sonde an diese Basenregion von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und wobei die Sonde nicht an Nukleinsäure von Chlamydia psittaci oder Chlamydia trachomatis unter diesen Bedingungen hybridisiert.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay von bis zu 100 Basen Länge und enthaltend eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 175-188, 224-247 oder 623-647 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DANN, ist, wobei die Sonde an diese Basenregion von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und wobei die Sonde nicht an Nukleinsäure von Chlamydia psittaci oder Chlamydia trachomatis unter diesen Bedingungen hybridisiert.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 2, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 175-188 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, umfasst.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 2, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 224-247 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, umfasst.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 2, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 623-647 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, umfasst.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Sonde mindestens 15 Basen lang ist.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Sonde 20 bis 50 Basen lang ist.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 2, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 2 oder die dazu perfekt komplementäre Sequenz umfasst.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 8, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 2 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 2, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 4 oder die dazu perfekt komplementä re Sequenz umfasst.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 10, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 4 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 2, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 7 oder die dazu perfekt komplementäre Sequenz umfasst.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 12, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID Nr. 7 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay von bis zu 100 Basen Länge und umfassend die Basensequenz der SEQ ID NR. 11 oder die dazu perfekt komplementäre Sequenz, wobei die Sonde an Chlamydia pneumoniae 16S-rRNA, oder die codierende DNA, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, und wobei die Sonde nicht an Nukleinsäure von Chlamydia psittaci oder Chlamydia trachomatis unter diesen Bedingungen hybridisiert.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 14, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 11 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 1, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 14 oder die dazu perfekt komplementäre Sequenz umfasst.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 16, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 14 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Sonde mit einer isotopischen oder nicht-isotopischen Markierung markiert ist.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach Anspruch 18, wobei die Markierung ein Acridinester ist.
Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die stringenten Hybridisierungsbedingungen einen 60°C-Puffer, umfassend 0,19 M Lithiumsuccinat, 0,62 M Lithiumlaurylsulfat, 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure und 3 mM Ethylenglykol-bis(beta-aminoethylether)-N,N,N',N'tetraessigsäure, beinhalten.
Nukleinsäure-Hybrid, gebildet zwischen einer Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay, wie in einem der Ansprüche 1 bis 20 definiert, und Nukleinsäure von Chlamydia pneumoniae.
Sonden-Mix, umfassend eine Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay, wie in einem der Ansprüche 1 bis 20 definiert, und eine Nukleinsäure-Helfersonde.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 175-188 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 2 oder die dazu perfekt komplementäre Sequenz umfasst, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 2 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 224-247 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 3, SEQ ID NR. 5 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 4 oder die dazu perfekt komplementäre Sequenz umfasst, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 3, SEQ ID NR. 5 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 4 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 3, SEQ ID NR. 5 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 623-647 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 6, SEQ ID NR. 8 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 7 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz umfasst, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 6, SEQ ID NR. 8 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 7 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 6, SEQ ID NR. 8 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 1008-1030 der Escherichia coli 16S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10, SEQ ID NR. 12 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 11 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz umfasst, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10, SEQ ID NR. 12 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 11 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10, SEQ ID NR. 12 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde eine Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen, welche perfekt komplementär zu einer Region von mindestens 10 aufeinander folgenden Basen von Chlamydia pneumoniae-rRNA, oder der codierenden DNA, entsprechend den Basen 1711-1733 der Escherichia coli 23S rRNA, oder der codierenden DNA, ist, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 13, SEQ ID NR. 15 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Sonde die Basensequenz der SEQ ID NR. 14 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz umfasst, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 13, SEQ ID NRr. 15 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Sonden-Mix nach Anspruch 22, wobei die Basensequenz der Sonde aus der Basensequenz der SEQ ID NR. 14 oder der dazu perfekt komplementären Sequenz besteht, und wobei die Helfersonde eine Basensequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 13, SEQ ID NR. 15 und den dazu perfekt komplementären Sequenzen.
Verfahren zum Nachweisen von Chlamydia pneumoniae in einer Probe, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren dieser Probe mit einer Sonde für einen Nukleinsäure-Hybridisierungsassay, wie in einem der Ansprüche 1 bis 20 definiert; und (b) Nachweisen des Vorhandenseins eines Nukleinsäure-Hybrids, umfassend die Sonde als einen Hinweis auf das Vorhandensein von Chlamydia pneumoniae in der Probe.