DE68907772T2

DE68907772T2 - Hybridisationssonden zum nachweis von neisseria-staemme.

Info

Publication number: DE68907772T2
Application number: DE89401045T
Authority: DE
Inventors: Rudi Rossau; Heuverswijn Hugo Van
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1988-04-15
Filing date: 1989-04-14
Publication date: 1993-11-04
Anticipated expiration: 2009-04-15
Also published as: AU3300489A; ES2058566T3; EP0337896B1; CA1339261C; DE68907772D1; AU615286B2; EP0337896A1; JPH02203800A

Description

Die Erfindung betrifft Hybridisierungssonden zum Nachweis von Neisseria-Stämmen und Isolaten, die zur Gattung Neisseria und verwandten Taxa gehören. Im Folgenden umfaßt das Wort Stämme auch Isolate oder Organismen, die in einer biologischen Probe enthalten sind.
Die meisten bis jetzt bekannten Sonden, die entweder die gesamte genomische Deoxyribonucleinsäure (DNA), natürliche Plasmide, geklonte DNA-Fragmente oder synthetische Oligonucleotide sein können, sind auf die DNA des zu detektierenden Organismus gerichtet.
In wenigen Fällen wurde vorgeschlagen, auf die ribosomale Ribonucleinsäure (rRNA) abzustellen, und zwar mittels einer von rRNA- abgeleiteten Sonde. Das Abstellen auf die ribosomale Ribonucleinsäure würde die Empfindlichkeit eines diagnostischen Test erhöhen, da Ribosomen in einer Zelle sehr reichlich vorliegen.
Dennoch und im Gegensatz dazu sind die hohe Sequenzkonservierung die unter rRNA Cistrons beobachtet wird und dementsprechend das Fehlen von Spezifität einer aus rRNA-abgeleiteten Sonde wichtige Nachteile, welche der Verwendung einer aus rRNA-abgeleiteten Sonde zur Selektion verwandter Taxa entgegenstehen. In der Tat werden bis jetzt bekannte, von rRNA-abgeleitete Sonden hauptsächlich verwendet, um große Gruppen von Organismen nachzuweisen wie Legionella (Wilkinson et al., 1986, Edelstein, 1986) oder die Pseudonomas fluorescens Gruppe (Festl et al. 1986) oder um relativ entfernt verwandte Speczies wie Mycoplasma (Goebel et. al 1987) und Chlamydia (Palmer et al, 1986) voneinander zu unterscheiden. Ein Bericht beschrieb die Differenzierung zwischen der Species Proteus vulgarus und Proteus mirabilis (Haun und Goebel, 1987). Beide Species haben einen DNA Homologiewert von etwa 50 %; gegenwärtig ist dies die höchste Spezifität, die unter Verwendung von rRNA-abgeleiteten Sonden ohne die Verwendung der Southern-blot Analyse erreicht werden konnte.
EP 0 272 009 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Sonden ebenso wie einige Sonden zur Verwendung in qualitativen oder quantitativen Hybridisierungs-Assays. Das Verfahren umfaßt die Konstruktion eines Oligonucleotids, das hinreichend komplementär ist, um mit einer rRNA Region zu hybridisieren, die so ausgewählt ist, daß sie für einen nichtviralen Organismus oder eine Gruppe nichtviraler Organismen, die detektiert werden sollen, spezifisch ist, wobei diese rRNA Region ausgewählt wird durch Vergleich von einer oder mehreren variablen Regionen der rRNA Sequenzen dieses nichtviralen Organismus oder der Gruppe von nichtviralen Organismen mit einer oder mehreren variablen Regionen von rRNA Sequenzen von einem oder mehreren nichtviralen Organismen, von denen man eine Unterscheidung wünscht. Eine Sequenz, die im Zusammenhang mit Neisseria offenbart ist, ist TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC.
Daher war es unerwartet, wie von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, daß spezifische von rRNA-abgeleitete Sonden erreicht werden konnten, die nicht nur zwischen stark verwandten bakteriellen Spezies differenzieren konnten, sondern auch zwischen Taxa, die auf dem Subspezies-Level verwandt sind, wobei eine einfache direkte Hybridisationsvorgehensweise verwendet wurde. Insbesondere konnten Neisseria gonorrhoeae-Stämme von anderen Neisseria-Stämmen, einschließlich N. meningitidis-Stämmen, mittels eines Punkt-Fleck- Hybridisierungstests durch einige der hierin beschriebenen Sonden unterschieden werden.
Somit ist ein Ziel der Erfindung, rRNA-verwandte Sonden zum Nachweis von einem oder mehrerer Neisseria-Stämme zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, rRNA-verwandte Sonden zur Differenzierung von Neisseria-gonorrhoeae von anderen bakteriellen Species und insbesondere von anderen Neisseria-Species und von Neisseria meningitidis zur Verfügung zu stellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Sonden zum Nachweis von einem oder mehreren Neisseria-Stämmen durch einen einfachen Hybridisierungstest, wie einem Punkt-Fleck-Hybridisierungstest ("dotspot-hybridization test") zur Verfügung zu stellen, ohne Einsatz einer komplementären Analyse, wie einer Southern-blot Analyse. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Sonde und ein einfaches Verfahren zur in vitro Diagnose von einem oder mehreren Neisseria-Stämmen zur Verfügung zu stellen.
"rRNA-verwandt" wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Tatsache, daß die betreffenden Sonden mit Sequenzen hybridisieren, die normalerweise in ribosomalen RNAs vorhanden sind, unabhängig davon, ob diese Sonden selbst aus den DNA- oder RNA- Fragmenten gebildet werden, oder ob sie aus klonierten Fragmenten (im Fall von DNA) oder aus synthetischen Oligonucleotiden bestehen.
Das Wort "Neisseria" wie hierin verwendet bezieht sich nicht nur auf Bakterien mit dem Namen Neisseria sondern auch auf benannte oder unbenannte Taxa wie Kingella, Eikenella, Simonsiella, Alysiella und die CDC Gruppen EF-4 und M-5, die mit Bakterien, die zur Gattung Neisseria gehören, stark verwandt sind. Diese Taxa werden in einem Tm(e) Bereich von etwa 6ºC gegen ribosomale RNA von Flavescens ATCC 13120 gefunden. Tm(e) ist definiert in Rossau, R., A. van Landschoot, W. Mannheim und J. de Ley 1986, Inter- and intrageneric similarities of ribosomal ribonucleic acid cistrons of the Neisseriaceae, Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 323-332.
Bemerkt werden sollte, daß falsch benannte Bakterien, die nicht innerhalb des angegebenen ΔTm(e)-Bereichs gefunden werden, wie Neisseria caviae, Neisseria cuniculi, Neisseria ovis, Neisseria catarrhalis (Branhamella (Moraxella) catarrhalis), Kingella indologenes und Alysiella sp., nicht zur Neisseria-Gruppe gehören.
Eine Hybridisierungssonde der Erfindung zum Nachweis von einem oder mehreren Neisseria-Stämmen enthält:
entweder eine Sequenz, die zu einer Nucleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nucleinsäuren ausgewählt ist und selbst 10 bis die Maximalzahl an Nucleotiden der ausgewählten Nucleinsäure einschließt: Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe
worin die Buchstaben die folgenden Nucleotide bedeuten:
A: Adenylrest
C: Cytidylrest
G: Guanidylrest
T: Thymidylrest
U: Uracylrest
unter der Voraussetzung, daß die Sonde nicht aus der folgenden Sequenz besteht:
TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC
- oder eine Sequenzvariante, die sich von einer der vorhergehenden Sequenzen (4) bis (18)
entweder durch Hinzufügung oder Entfernung eines oder mehrerer Nucleotide an einem ihrer jeweiligen Enden,
oder durch Ändern eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb irgendeiner der Sequenzen, oder durch beides unterscheidet, doch unter der Voraussetzung, daß in jedem der oben beschriebenen Fälle diese Probe immer noch mit derselben Ziel-RNA oder -DNA hybridisiert wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
Unter dem Ausdruck "Ziel" (target) wird eine Sequenz verstanden, die komplementär zur einer der Sequenzen der Gruppen 4 bis 18 ist, wie sie hierin zuvor definiert wurden. Dies bedeutet im Fall, daß die erfindungsgemäße Sonde Nucleinsäureverlängerungen an einem Ende der oben definierten Sequenzen oder beiden enthalten würde - z.B. Nucleinsäurefragmente eines Klonierungsvektors oder Linkerfragmente, die von der Spaltung dieser Probe aus diesem Klonierungsvektor herrühren - daß solche Verlängerungen so ausgewählt sein sollten, daß die Möglichkeit vermieden wird, daß sie selbst mit irgendeiner weiteren entsprechenden komplementären Nucleinsäuresequenz außerhalb des obigen Ziels in einer DNA eines beliebigen Mikroorganismus, der wahrscheinlich durch das Verfahren dieser Erfindung, wie es später definiert wird, getestet werden könnte, hybridisieren könnten. Eine solche Hybridisierung wäre von parasitärer Natur und wurde die Spezifität der Sonde verringern.
Bevorzugte Sonden bestehen aus Nucleinsäurefragmenten, die aus einer beliebigen der Sequenzen (4) bis (18) gebildet werden, wobei diese Fragmente 10 bis die Maximalzahl an Nucleotiden der relevanten Nucleinsäuresequenz enthalten.
In den obigen Nucleotidsequenzen (und in den weiteren, auf die im Folgenden bezug genommen wird), soll das linke Ende der Formel immer einem 5'-Ende und das rechte Ende einem 3'-Ende der betreffenden Sequenz entsprechen.
Wenn weiterhin Bezug genommen wird auf eine "Sonde der Gruppe "x"" mit "x" von 1 bis 18 - soll dies bedeuten, daß eine solche Sonde eine Sequenz hat, die in einer der Nucleinsäuren enthalten ist, die zu dieser Gruppe, wie sie oben definiert wurde oder im Folgenden definiert werden wird, gehört.
Das Wort "Nucleotid", wie hierin verwendet, soll sich unterscheidungslos auf Ribonucleotide und Deoxyribonucleotide und modifizierte Nucleotide wie Inosin beziehen, soweit nichts anders angegeben wird. Der Ausdruck "Nucleotide" umfaßt auch solche, welche außerdem Modifizierungsgruppen enthalten, z.B. chemische Modifizierungsgruppen, die nicht ihre Hybridisierungsfähigkeit beeinträchtigen. Solche Modifizierungsgruppen zielen beispielsweise darauf ab, ihre Kopplung mit geeigneten Markern oder Markierungen zur nachfolgenden Detektion der so markierten Sonden direkt oder indirekt zu erleichtern, insbesondere bei ihren Hybridisierungsprodukten mit dem relevanten rRNA- oder DNA- Strang, wie z.B. dem oder denen, die ursprünglich in einer biologischen Probe zusammen mit anderen DNA(s) und/oder RNA(s) enthalten waren.
Beispielsweise können solche Modifizierungsgruppen durch Antikörper erkennbar sein, welche wiederum spezifisch durch andere Antikörper, die eine geeignete enzymatische oder fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierung enthalten, detektiert werden können. Mögliche Markierungsverfahren werden später hier beispielhaft aufgezählt.
Die Erfindung betrifft auch Sonden mit einer der oben definierten Sequenzen, bei denen einige Nucleotide verschieden sind, vorausgesetzt daß das verschiedene Nucleotid oder die verschiedenen Nucleotide nicht die Spezifität der oben definierten Sonden verändern. Solche Sonden können aus einer der Nucleinsäuren bestehen, die zu irgendeiner der Gruppen 4 bis 10 gehören, die oben angeführt wurden, oder aus einem Teil davon, wobei diese Sonden jedoch eine Nucleotidverlängerung auf ihren beiden Seiten in dem Ausmaß einschließen, daß solche Verlängerungen nicht die Spezifität dieser Sonden für das genetische Material von Neisseria, wie nachfolgend diskutiert, verändern.
Die meisten dieser Sonden können mit einer großen Anzahl, wenn nicht sogar mit allen Neisseria, zur Hybridisierung gebracht werden. Die Sonden der Gruppe 4, 5, 9, 11, 13 und 18 sind jedoch in der Lage, selektiver mit entsprechenden Regionen der RNAs oder DNAs von Neisseria gonorrhoeae zu hybridisieren und in einigen Fällen unter kontrollierten Hybridisierungsbedingungen nicht mit anderen Neisseria.
Dies trifft insbesondere auf Subgruppen zu, die aus Sonden der Gruppe 4 ausgewählt werden, wobei diese Subgruppen nachfolgend allgemein als Gruppen 1 bis 3 bezeichnet werden, wobei jede dieser Gruppen spezifischere Sonden umfaßt (die immer noch normalerweise mindestens 10 Nucleotide enthalten), welche enthalten:
entweder eine Sequenz, die zu einer Nucleinsäure gehört, die aus der folgenden Gruppe von Nucleinsäuren ausgewählt ist und selbst 10 bis die Maximalzahl an Nucleotiden der ausgewählten Nucleinsäure einschließt: Gruppe
unter der Voraussetzung, daß die Sonde nicht aus der folgenden Sequenz besteht: TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC,
oder eine Sequenzvariante, die sich von einer der vorhergehenden Sequenzen (1) bis (3)
entweder durch Hinzufügung oder durch Entfernung von einem oder mehreren Nucleotiden an einem ihrer jeweiligen Enden,
oder durch Veränderung eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb irgendeiner dieser Sequenzen, oder durch beides unterscheidet,
doch unter der Voraussetzung, daß in jedem der obigen Fälle diese Sonde immer noch mit derselben Ziel-RNA oder -DNA hybridisiert wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz.
Die Erfindung stellt somit Sonden zur Verfügung, die entweder Replicas (solche, die mit Zahlen bezeichnet werden, denen "ter" oder "quater" folgt), ausgedrückt als Nucleotidsequenz, von Sequenzen, die in den rRNAs der meisten Neisseria enthalten sind, mit gelegentlich einigen unbedeutenden Unterschieden in den Nucleotidsequenzen sind oder - und zwar diejenigen, die durch einfache Zahlen oder durch Zahlen, denen ein "bis" folgt bezeichnet werden - aus Sequenzen gebildet werden, die komplementär zu Sequenzen sind, die in den natürlichen rRNAs von Neisseria eingeschlossen sind. Insbesondere sollte vermerkt werden, daß die Zielsequenzen in den betreffenden rRNAs aus einer beliebigen der folgenden sukzessiven Sequenzen bestehen, die in den meisten, wenn nicht in allen, Neisseria vorliegen, wobei mögliche unbedeutende natürliche Unterschiede von einer Neisseria zur anderen existieren können und wobei solche natürlichen Unterschiede die Hybridisierungsspezifität der Sonden dieser Erfindung mit solchen Zielsequenzen wahrscheinlich nicht beeinträchtigen:
Der Unterschied in der Hybridisierungsfähigkeit der Nucleotidsequenzen der verschiedenen Sonden (oder von (8quater), (9quater), (10quater) die verwandten rRNA-Sequenzen) von einer Sonde zur anderen sind von hinreichend geringerer Größenordnung, um die Selektivität der Sequenzen der Gruppen (4) bis (18) bezüglich der Detektion und Identifikation von Neisseria (wie N. lactamica, N. mucosa, N. subflava, N. flavescens, N. elongata etc...) in einer biologischen Probe sicherzustellen, von der man vermutet, daß sie diese enthält, jedoch sie von anderen Taxa zu unterscheiden. Jedoch werden in der Gruppe (4) (und um so mehr in den Gruppen 3, 2 und 1) und auch in Gruppe 5, 9, 11, 13 und 18 diese Unterschiede hinreichend groß daß es möglich wird, Neisseria gonorrhoeae Stämme von anderen Neisseria-Stämmen zu differenzieren, in einigen Fällen sogar unter weniger strengen Hybridisierungsbedingungen (welche hier an späterer Stelle genauer aufgeführt werden) und in Gegenwart anderer DNAs oder RNAs oder beider, die in der untersuchten Probe vorliegen, z.B. einer Probe, die von Säugetieren, insbesondere Menschen, stammt. Es wird später erwähnt, daß die Hybridisierungen z.B. unter Verwendung eines Punkt-Fleck-Verfahrens ausgeführt werden können, falls nötig unter geeigneter Einstellung der Hybridisierungsbedingungen und nachfolgenden Waschbedingungen der gebildeten Hybride.
Vermerkt werden soll, daß die oben erwähnten Spezifitäten, sei es für das gesamte Neisseria Taxon oder für das Neisseria gonorrhoeae Subtaxon, dazu tendieren, verlorenzugehen, wenn die Nucleotidzahl in den verwendeten Sonden unter 10 fällt. Nichtsdestoweniger und insbesondere in den Gruppen 1, 2, 3, 4, 5, 9, 11, 13 und 18 werden die besten Ergebnisse erhalten, wenn die Nucleotidzahl nicht auf zu große Zahlen anwächst (unter Beachtung der Maximalzahl, die in den Gruppen 4 bis 18 durch die Maximallängen der betreffenden Sequenzen festgelegt ist). Zur selektiven Identifikation von Neisseria gonorrhoeae gegen andere Neisseria haben die am stärksten bevorzugten Sonden Sequenzen, die 15 bis 27 Nucleotide umfassen, wobei diese Sequenzen vollständig in einer der Sequenzen von Gruppe 1 eingeschlossen sind. Selektivität für N. gonorrhoeae wird immer noch mit Sonden erhalten, deren Sequenzen mit Regionen der entsprechenden Nucleinsäuren der Gruppen 1 oder entweder 2 oder 3 überlappen (oder speziell in Sequenzen, die nur zu den Nucleinsäuren der Gruppen 2 oder 3 gehören, enthalten sind), (oder speziell in Sequenzen enthalten sind, die nur in den Nucleinsäuren der Gruppe 3 enthalten sind), doch müssen dabei die Hybridisierungs- und Waschbedingungen strenger eingestellt werden.
Bevorzugte Sonden sind solche, die komplementär zu den entsprechenden natürlichen rRNAs sind, da sie sowohl mit diesen rRNAs wie auch mit der entsprechenden DNA hybridisieren.
Dennoch sind solche mit Sequenzen, die in diesen rRNAs eingeschlossen sind, und daher nur mit den relevanten natürlichen DNAs hybridisieren werden und daher weniger empfindlich sind als die vorhergehenden, ebenfalls Teil der Erfindung.
Andere Gruppen von Sonden der Erfindung bestehen aus solchen, die spezifisch für Neisseria-Stämme sind, doch global betrachtet (wie oben spezifiziert) aus den Gruppen 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 und 17, wie oben definiert, bestehen, falls nötig unter geeigneter Einstellung der Hybridisierungs- und Waschbedingungen des möglicherweise gebildeten Hybrids.
Die erfindungsgemäßen Sonden können durch Klonierung recombinanter Plasmide, die Inserts unter Einschluß der entsprechenden Nucleotidsequenzen enthalten, hergestellt werden, falls nötig durch Spaltung der letzteren aus den klonierten Plasmiden unter Verwendung der adäquaten Nucleasen und ihre Gewinnung, z.B. durch Fraktionierung nach Molekulargewichten.
Die erfindungsgemäßen Sonden können auch chemisch synthetisiert werden, beispielsweise nach dem konventionellen Phosphotriester- Verfahren.
In die oben definierten Varianten sind Hybridisierungssonden zum Nachweis von einem oder mehreren Neisseria-Stämmen eingeschlossen, die auf eine der nachfolgend definierten Sequenzen oder der entsprechenden Komplementärsequenz abzielen, wenn das Hybridisierungsmedium oder Waschmedium oder beides so geeignet sind wie die folgenden:
Hybridisierungsmedium: enthält etwa 3 x SSC, (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), etwa 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1, 20 % entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerschnittene denaturierte Lachssperma DNA,
Waschmedium: enthält etwa 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1 und 20 % entionisiertes Formamid,
wobei die Zielsequenzen und die entsprechenden relevanten Hybridisierungstemperaturen (HT) und Waschtemperaturen (WT) jeweils wie folgt sind:
AAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA
HT und/oder WT : etwa 55ºC
CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA
HT und/oder WT : etwa 60ºC
CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC
HT und/oder WT : etwa 60ºC
GGACUUUUGUCAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC
HT und/oder WT : etwa 65ºC
UUAGCUGUUGGGCAACUUGAUUGCUUGGUAGCGU
HT und/oder WT : etwa 55.C bis etwa 60ºC
GUGGGGGAUACCAGAAGUAGGUAGGGUAACCGCAAGGAGUCCGCUUACCACGGUAU
HT und/oder WT : etwa 65ºC bis etwa 70ºC
ACCUAGGUCCGGCGGAAAUCGGACUGA
HT und/oder WT : etwa 55ºC
ACCUAGGUCCGGUCGGAAAUCGGACUGA
HT und/oder WT : etwa 55ºC bis etwa 60ºC
GCAGCACAGGGAAGCUUGCUUCUCGGGUGGCG
HT und/oder WT : etwa 55ºC bis etwa 60ºC
UAUGCCCUCUAAGGUUAAGGACUUGCUCCGUAAGCCCCG
HT und/oder WT : etwa 60ºC bis etwa 65ºC
GCGGGGGAGCUGGCAAUAAAGCUAUGAUUCCGC
HT und/oder WT : etwa 55ºC
GUUCUGAACUGGGUGACUCGAGUGUGUC
HT und/oder WT : etwa 55ºC bis etwa 60ºC
GCAUACGUCUUGAGAGGGAAAGCA
HT und/oder WT : etwa 45ºC
UGUACGUAAUAACUGUCGAGA
HT und/oder WT : etwa 40ºC bis etwa 45ºC
UCUCAACAGCGGUACUAAGCGUACGAAA
HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 55ºC
UGUCUACGGACACGAAGCAACCGAUACCAC
HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 60ºC
UUAGGUUGGCAAGCUGUUGGAAUAGCUU
HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 55ºC
AGCUGGUUGGCGGGGUAAAGGCCCACCA
HT und/oder WT : etwa 45ºC
Betont werden soll, daß die angegebenen Temperaturen nur unter den oben angegebenen Bedingungen gültig sind. Andere Hybridisierungs- oder Waschmedien können ebenfalls verwendet werden. Wenn jedoch Modifikationen eingeführt werden, sei es entweder bei den Sonden oder bei den Medien, sollten die Temperaturen, bei denen die Sonden unter Erhalt der gewünschten Spezifität verwendet werden können, nach bekannten Beziehungen geändert werden, wie solchen, die in der folgenden Referenz beschrieben sind: B.D. Hames und S.J. Higgins (Herausgeber), Nucleic acid hybridization. A practical approach, IRL Press, Oxford, U.K., 1985.
Unter den zuvor definierten Varianten sind Hybridisierungssonden zum Nachweis von einem oder mehreren Neisseria gonorrhoeae-Stämmen eingeschlossen, welche auf eine der nachfolgend definierten Sequenzen oder die entsprechende Komplementärsequenz zielen, wenn das Hybridisierungsmedium oder das Waschmedium oder beide geeigneterweise die folgenden sind:
Hybridisierungsmedium: enthält etwa 3 x SSC, (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), ungefähr 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1, 20 % entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerschnittene denaturierte Lachssperma DNA,
Waschmedium: enthält etwa 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1 und 20 % entionisiertes Formamid,
worin die Zielsequenzen und die entsprechenden relevanten Hybridisierungstemperaturen (HT) und Waschtemperaturen (WT) jeweils wie folgt sind:
AAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA
HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 65ºC
CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA
HT und/oder WT : etwa 60ºC bis etwa 70ºC
CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC
HT und/oder WT : etwa 65ºC bis etwa 70ºC
GGACUUUUGUCAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC
HT und/oder WT : etwa 70ºC bis etwa 75ºC
UUAGCUGUUGGGCAACUUGAUUGCUUGGUAGCGU
HT und/oder WT : etwa 65ºC
GCAGCACAGGGAAGCUUGCUUCUCGGGUGGCG
HT und/oder WT : etwa 65ºC
GCGGGGGAGCUGGCAAUAAAGCUAUGAUUCCGC
HT und/oder WT : etwa 65ºC
GCAUACGUCUUGAGAGGGAAAGCA
HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 55ºC
AGCUGGUUGGCCGGGUAAAGGCCCACCA
HT und/oder WT : etwa 60ºC.
Bevorzugte Sonden der Erfindung zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae-Stämmen sind solche der Gruppen 1 bis 4, vorausgesetzt daß die Sonde nicht aus der folgenden Sequenz besteht:
TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC
Die Erfindung betrifft auch Sonden der oben erwähnten Sequenzen, die zwischen Organismen mit DNA : DNA Hybridisierungshomologiewerten zwischen etwa 55 % bis etwa 75 % differenzieren können.
Im Hinblick auf die Evolution der rRNA-Moleküle scheint es vernünftig, daß rRNA-abgeleitete Hybridisierungssonden, die eine Unterscheidung zwischen hochverwandten Taxa (mehr als 55 % DNA Homologie) erlauben und verschieden sind von solchen, die in der Neisseriagruppe gefunden werden (z.B. in Bordetella), ebenfalls konstruiert werden können.
Es ist verständlich, daß diese hochspezifischen Sonden aus den Sequenzen erhalten werden können, die in denselben Regionen der rRNA- Moleküle gefunden werden, wie die, bei denen spezifische Sequenzen für Neisseria gonorrhoeae gefunden wurden (z.B. Regionen I, II und III in Figur 1, im Fall von 16S rRNA). Diese Regionen können nach geeignetem Vergleich (alignment) der gesamten oder Teil-rRNA-Sequenz des betreffenden Organismus mit der rRNA Sequenz von E. coli lokalisiert werden. Diese Regionen werden den Regionen entsprechen, die zwischen den folgenden Nucleotiden gefunden werden:
(i) 69 bis 99 für Region I
(ii) 432 bis 488 für Region II
(iii) 825 bis 858 für Region III
im 16S rRNA Molekül von E. coli, wobei sich die Numerierung auf die 16S rRNA Sequenz von E. coli, die in Figur 8 gezeigt wird, bezieht, und zwischen den Nucleotiden 77 bis 109 im 23S rRNA Molekül von E. coli, wobei sich die Numerierung auf die 23S rRNA Teilsequenz von E. coli, die in Figur 9 gezeigt wird, bezieht.
Jedoch sollte betont werden, daß:
(i) hochspezifische Sonden auch aus anderen Regionen konstruiert werden können und
(ii) einige dieser Regionen in den rRNA Molekülen gewisser Taxa (aufgrund von Mutation während der Evolution) fehlen können.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von Neisseria-Stämmen in einer biologischen Probe, wobei dieses Verfahren umfaßt: die Kontaktierung dieser biologischen Probe, in der die Nucleinsäuren (DNAs und RNAs) der Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, falls nötig unter geeigneten Denaturierungsbedingungen, mit einer Sonde der Erfindung unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und komplementären Nucleinsäuren der Neisseria- Stämme ermöglichen, die in der Probe vorliegen können, und Nachweis der eventuell gebildeten Hybride.
Das Verfahren betrifft den Nachweis von Neisseria-Stämmen, die direkt in der Probe sind, oder nachdem der Stamm kultiviert wurde.
Der Nachweis eines Hybrids kann als Anzeichen gewertet werden, daß eine Neisseriainfektion in der biologischen Probe vorlag, wenn eine der Sonden der Gruppen 1 bis 18 verwendet wird, und sogar noch spezifischer, daß eine Neisseria gonorrhoeae Infektion vorlag, wenn die verwendete Sonde eine Sequenz hatte, die zu einer Nucleinsäure der Gruppen 4, 5, 9, 11, 13 oder 18 gehört, eventuell unter geeigneten Hybridisierungbedingungen, und dies insbesondere dann, wenn die Sonde eine Sequenz hatte, die zu einer Sequenz der Gruppen 3, 2 oder noch bevorzugter Gruppe 1 gehört.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind beim Verfahren zum Nachweis von Neisseria-Stämmen die verwendeten Sonden solche, die sowohl mit DNA global wie auch mit RNA der Neisseria- Stämme hybridisieren, die in der biologischen Probe vorliegen können.
Die Hybridisierungsbedingungen können durch Kontrolle verschiedener Parameter mitverfolgt werden, z.B. der Hybridisierungstemperatur, der Natur und Konzentration der Komponenten der Medien und der Temperatur, unter der die gebildeten Hybride gewaschen werden.
Die Hybridisierungstemperatur ist in ihrem oberen Wert je nach der Sonde (ihrer Nucleinsäurezusammensetzung, -art und -länge) beschränkt, und die maximale Hybridisierungstemperatur der hier beschriebenen Sonden beträgt etwa 55ºC bis 75ºC. Bei höheren Temperaturen konkurriert die Doppelstrangbildung mit der Dissoziation (oder Denaturierung) des zwischen Sonde und Zielmolekül gebildeten Hybrids.
Die Hybridisierungstemperatur beträgt vorzugsweise etwa 45ºC bis etwa 70ºC, insbesondere etwa 45ºC bis etwa 65ºC.
Ein bevorzugtes Hybridisierungsmedium enthält etwa 3 x SSC, (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), ungefähr 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1 und 20 % entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerschnittene denaturierte Lachssperma DNA.
Die Waschtemperatur liegt im Bereich von etwa 50ºC bis etwa 75ºC.
Das Verfahren zum Nachweis von Neisseria-Stämmen kann erfindungsgemäß im allgemeinen durch geeignete Einstellung der Hybridisierungstemperatur auf einen Wert, bei dem die Hybridisierung spezifisch ist, ausgeführt werden, und in einem solchen Fall ist ein Waschen unter strengeren Bedingungen nicht notwendig.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung muß die Hybridisierungstemperatur nicht notwendigerweise auf den Wert eingestellt werden, bei dem die Hybridisierung spezifisch ist, und kann insbesondere niedriger sein als die Temperatur, bei der die Hybridisierung spezifisch ist, unter der Voraussetzung, daß dann das Waschen bei einer Temperatur ausgeführt wird, die dem Wert entspricht, bei dem die Hybridisierung spezifisch ist.
In einer Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria- Stämmen im allgemeinen (und zu ihrer Unterscheidung von anderen bakteriellen Taxa) mit einer Sonde der Gruppe 6 wird die Hybridisierungstemperatur geeigneterweise auf einen Bereich von etwa 65ºC eingestellt und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 65ºC auf etwa 70ºC eingestellt, wobei die Medien die oben definierten sind.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 7, und die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 55ºC eingestellt.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 1.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC eingestellt, vorzugsweise etwa 53ºC, und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 55ºC, vorzugsweise etwa 53ºC, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 2.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC eingestellt und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 60º, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 3.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC eingestellt und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 60º eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 4.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeigneterweise auf einen Bereich von etwa 65ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 65ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 5.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 55ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 8.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von zwischen etwa 55º bis 60ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 9.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 60ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 10.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 55ºC bis etwa 60ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 11.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 55ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 12.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC bis etwa 60ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 55º bis etwa 60ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 13.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 45ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 45ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausfünrungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 14.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 40ºC bis etwa 45ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 40ºC bis etwa 45ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 15.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 16.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 50ºC bis etwa 60ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 50ºC bis etwa 60ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 17.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrensausführungsform zum Nachweis von Neisseria-Stämmen im allgemeinen ist die verwendete Sonde eine beliebige aus der oben definierten Gruppe 18.
Die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 45ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 45º eingestellt, wobei das Hybridisierungsmedium das oben definierte ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin auch ein Verfahren zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae-Stämmen aus anderen Neisseria-Stämmen in einer biologischen Probe und vorteilhafterweise zur Differenzierung von Neisseria gonorrhoeae-Stämmen von hochverwandten Taxa wie N. meningitidis, wobei dieses Verfahren die Kontaktierung dieser biologischen Probe, worin die Nucleinsäuren (DNAs und RNAs) der Hybridisierung zugänglich gemacht wurden, falls nötig unter geeigneten Denaturierungsbedingungen, mit einer erfindungsgemäßen Sonde, die spezifisch für Neisseria gonorrhoeae-Stämme ist und ausgewählt wird aus den Gruppen 1 bis 5, 9, 11, 13 und 18, falls nötig unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen, die so eingestellt werden, daß eine spezifische Hybridisierung mit komplementären Nucleinsäuren der Neisseria gonorrhoeae-Stämme, welche in der Probe vorliegen können, jedoch nicht mit komplementärer DNA oder RNA anderer Neisseria-Species sichergestellt wird, und die Detektion der eventuell gebildeten Hybride umfaßt.
Die anderen Neisseria-Stämme, von denen die N. gonorrhoeae Stämme spezifisch differenziert werden können sind beispielsweise N. lactamica, N. mucosa, N. subflava, N. flavescens und N. elongata.
In diesem Zusammenhang liegt die Hybridisierungstemperatur vorzugsweise bei etwa 50ºC bis etwa 75ºC.
Ein bevorzugtes Hybridisierungmedium: enthält etwa 3 x SSC, (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), ungefähr 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1, 20 % entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerschnittene denaturierte Lachssperma DNA,
und ein bevorzugtes Waschmedium enthält etwa 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1 und 20 % entionisiertes Formamid.
Die Waschtemperatur liegt im Bereich von etwa 50ºC bis etwa 70ºC.
In einer Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 2, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 65ºC bis etwa 70ºC, vorzugsweise etwa 65ºC eingestellt, wobei das Medium das oben definierte ist.
In einer Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 3, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 65 bis etwa 70ºC, vorzugsweise etwa 65ºC eingestellt, wobei das Medium das oben definierte ist.
In einer weiteren Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 4, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 65ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 70 bis etwa 75ºC, vorzugsweise etwa 70ºC, eingestellt.
In einer weiteren Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 5, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 65ºC, eingestellt.
In einer weiteren Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 9, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC bis etwa 65ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 65ºC, eingestellt.
In einer weiteren Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 11, die Hybridisierungstemperatur und/oder die Waschtemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 65ºC eingestellt.
In einer weiteren Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 13, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 50 bis 55ºC eingestellt, wobei das Medium wie oben definiert ist.
In einer Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 18, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 60ºC und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 60ºC, eingestellt, wobei das Medium wie oben definiert ist.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Verfahrenausführungsform zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zur oben definierten Gruppe 1, die Hybridisierungstemperatur wird geeignet auf einen Bereich von etwa 55ºC, vorzugsweise etwa 53ºC, und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich von etwa 55ºC bis etwa 65ºC, vorzugsweise von etwa 53ºC bis etwa 65ºC, besonders bevorzugt auf etwa 53ºC eingestellt.
In einem bevorzugten Verfahren der Erfindung zum Nachweis von N. gonorrhoeae gehört die verwendete Sonde zu den Gruppen 1 bis 4, vorausgesetzt, daß die Sonde nicht aus der vorliegenden Sequenz besteht:
TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC
Die Erfindung betrifft auch einen Reagenziensatz (Kit) zum in vitro Nachweis einer großen Zahl, vorzugsweise aller Neisseria-Stämme in einer biologischen Probe, enthaltend:
mindestens eine Sonde, ausgewählt aus denen, die oben definiert wurden;
die Puffer oder Komponenten, die zur Herstellung des Puffers notwendig sind, der eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs eines Stamms von Neisseria, die durchgeführt werden soll, ermöglicht,
falls angebracht, Mittel zum Nachweis der Hybride, die aus der vorhergehenden Hybridisierung resultieren.
Die Erfindung betrifft ferner einen Reagenziensatz (Kit) zum spezifischen Nachweis von N. gonorrhoeae-Stämmen enthaltend: mindestens eine Sonde, ausgewählt aus solchen, die spezifisch für N. gonorrhoeae sind, wie oben definiert, z.B. eine Sonde der Gruppen (2), (3), (4), (5), (9), (11), (13) oder (18), vorzugsweise eine Sonde der Gruppe (1);
die Puffer oder Komponenten, die zur Herstellung des Puffers notwendig sind, der die Ausführung einer Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stamms von Neisseria gonorrhoeae ermöglicht.
In einem bevorzugten Kit zum Nachweis von N. gonorrhoeae-Stämmen gehört die Sonde zu den Gruppen (1) bis (4), vorausgesetzt daß die Sonde nicht aus der folgenden Sequenz besteht:
TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC
Die Erfindung betrifft einen Kit zum Nachweis einer großen Zahl, vorzugsweise aller Neisseria-Stämme und spezifisch Neisseria gonorrhoeae-Stämmen, enthaltend: mindestens eine Sonde, ausgewählt aus denen, die oben definiert wurden, z.B. eine Sonde der Gruppen (1) bis (18), bevorzugt eine Sonde der Gruppen (6), (7), (8), (10), (12), (14), (15), (16) oder (17),
den verwendungsfertigen Puffer oder die Komponenten in geeigneten Teilen, die zur Herstellung des Puffers notwendig sind, der die Ausführung einer Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs einer großen Zahl, vorzugsweise aller Stämme von Neisseria, ermöglicht;
mindestens eine Sonde, ausgewählt aus solchen, die spezifisch für Neisseria gonorrhoeae sind, wie oben definiert, z.B. eine Sonde der Gruppen (2), (3), (4), (5), (9), (11), (13) oder (18) oder besonders bevorzugt eine Sonde der Gruppe (1);
den verwendungsfertigen Puffer oder die Komponenten, die in geeigneten Anteilen zur Herstellung des Puffers notwendig sind, der die Ausführung einer Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und nur den DNAs und/oder RNAs eines Stamms von Neisseria gonorrhoeae ermöglicht.
In einem bevorzugten Kit zum Nachweis von Neisseria-Stämmen und spezifisch N. gonorrhoeae-Stämmen gehört die zur Detektion von N. gonorrhoeae-Stämmen verwendete Sonde zu den Gruppen (1) bis (4), vorausgesetzt daß die Sonde nicht aus der folgenden Sequenz besteht:
TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC

Verwendungsbedingungen der Sonden:

Die erfindungsgemaßen Sonden sind vorteilhafterweise markiert. Eine beliebige herkömmliche Markierung kann verwendet werden. Die Sonden können mittels radioaktiver Tracer markiert sein wie ³²p, ³&sup5;S, ¹²&sup5;I, ³H und ¹&sup4;C.
Die radioaktive Markierung kann nach einem beliebigen herkömmlichen Verfahren ausgeführt werden, wie einer terminalen Markierung an der 3' oder 5' Positon unter Verwendung eines radiomarkierten Nucleotids, einer Polynucleotidkinase (mit oder ohne Dephosphorylierung durch eine Phosphatase) oder einer Ligase (je nach dem zu markierenden Ende). Eine der Sonden der Erfindung kann die Matrix für eine Synthese einer Kette sein, die aus mehreren radioaktiven Nucleotiden oder aus mehreren radioaktiven und nichtradioaktiven Nucleotiden besteht. Die erfindungsgemäßen Sonden können auch durch chemische Synthese unter Verwendung von einem oder mehreren radioaktiven Nucleotiden hergestellt werden. Ein weiteres Verfahren zur radioaktiven Markierung ist eine chemische Iodierung der erfindungsgemäßen Sonden, die zur Bindung von mehreren ¹²&sup5;I Atomen an den Sonden führt.
Wenn eine der erfindungsgemäßen Sonden radioaktiv gemacht wird, um zur Hybridisierung mit einer nichtradioaktiven RNA oder DNA verwendet zu werden, wird das Verfahren des Nachweises der Hybridisierung vom verwendeten radioaktiven Tracer abhängen. Im allgemeinen können Autoradiographie, Flüssigszintillationsszählung, Gammazählung oder ein beliebiges anderes herkömmliches Verfahren, das die Detektion einer ionisierenden Strahlung, die vom radioaktiven Tracer emittiert wird, ermöglicht, verwendet werden.
Eine nichtradioaktive Markierung kann auch verwendet werden, indem die erfindungsgemäßen Sonden mit Resten verbunden werden, die aufweisen: immunologische Eigenschaften (z.B. Antigen oder Hapten), eine spezifische Affinität für ein Reagenz (z.B. einen Liganden), Eigenschaften, die eine detektierbare enzymatische Reaktion gestatten (z.B. Enzym, Co-Enzym, Enzym-Substrat oder Substrat, das an einer enzymatischen Reaktion teilnimmt) oder physikalische Eigenschaften wie Fluoreszenz oder Emission oder Absorption von Licht bei einer beliebigen Wellenlänge. Anitkörper, die die durch die Sonde und das Zielmolekül gebildeten Hybride spezifisch detektieren, können ebenfalls verwendet werden.
Eine nichtradioaktive Markierung kann vorgesehen werden, wenn eine Sonde der Erfindung chemisch sythetisiert wird, wobei ihre Adenosin-, Guanosin-, Cytidin, Thymidin- und Uracilreste an andere chemische Reste gekoppelt werden, die die Detektion der Sonde oder der zwischen der Sonde und einem komplementären DNA- oder RNA-Fragment gebildeten Hybride ermöglichen. Jedoch wäre die Nucleotidsequenz der Sonde, wenn sie durch Koppeln eines oder mehrerer Nucleotide an andere chemische Reste modifiziert wird, dieselbe wie die Nucleotidsequenz einer der Sonden der Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweis von RNA und/oder DNA durch Hybridisierung mit den Sonden der Erfindung, welche markiert wurden und wie oben beschrieben detektiert werden können. In dieser Beziehung können herkömmliche Hybridisierungsmethoden verwendet werden.
Zum Nachweis von Zellen, die aus lebenden Organismen stammen oder selbst lebende Organismen sind, wird die RNA und/oder DNA dieser Zellen, falls nötig, durch teilweise oder vollständige Lyse der Zellen zugänglich gemacht, wobei chemische oder physikalische Verfahren verwendet werden, und mit einer oder mehreren Sonden der Erfindung kontaktiert, welche detektiert werden können. Dieser Kontakt kann auf einem geeigneten Träger wie Nitrocellulose, Cellulose oder einem Nylonfilter in einem flüssigen Medium oder in Lösung durchgeführt werden. Dieser Kontakt kann unter suboptimalen und optimalen Bedingungen oder unter restriktiven Bedingungen (d.h. Bedingungen, die Hybridbildung nur ermöglichen, falls die Sequenzen über die Länge des Moleküls perfekt homolog sind). Solche Bedingungen schließen Temperatur, die Konzentration der Reaktanten, das Vorliegen von Substanzen, die die Optimaltemperatur der Paarbildung von Nucleinsäuren herabsetzen (z.B. Formamid, Dimethylsulfoxid und Harnstoff) und das Vorliegen von Substanzen, die scheinbar das Reaktionsvolumen erniedrigen und/oder die Hybridbildung beschleunigen (z.B. Dextransulfat, Polyethylenglycol oder Phenol) ein.
Die Entfernung der nichthybridisierten erfindungsgemäßen Sonde kann durch Waschen mit einer Pufferlösung einer geeigneten Ionenstärke und bei einer geeigneten Temperatur, mit oder ohne Behandlung mit S1 Nuclease oder einem beliebigen anderen Enzym, das einzelstrangige DNA oder RNA verdaut, aber DNA-RNA Hybride oder doppelsträngige DNA nicht verdaut, durchgeführt werden.
In einem flüssigen Medium können die Hybride der erfindungsgemäßen Sonden, die mit den zellulären DNA- oder RNA-Fragmenten gepaart wurden, vom Rest des Flüssigmediums auf verschiedene Weisen abgetrennt werden, z.B. durch Chromatographie über Hydroxapatit.
Dann werden die hybridisierten Sonden mittels der Markierung an der Sonde detektiert.
Um auf die Neisseria chromosomalen DNA-Fragmente, die die Gene tragen, die die RNA-Fragmente codieren, von denen die markierten Sonden der Erfindung abgeleitet sind, abzuzielen, wird nach Behandlung der DNA durch ein oder mehrere Enzyme und Denaturierung der DNA- Fragmente (d.h. Trennung beider Ketten), eine der Sonden der Erfindung mit den DNA-Fragmenten unter solchen Bedingungen kontaktiert, die Hybridisierung gestatten, und nach der notwendigen Zeit, zur Vervollständigung der Hybridisierung, werden die nichthybridisierten Fragmente von den hybridisierten Fragmenten abgetrennt und die Markierung detektiert, wie oben für die Detektion der Zellen beschrieben wurde.
Im allgemeinen können die verschiedenen erfindungsgemäßen Sonden auch in rekombinanter DNA enthalten sein, was ihre Klonierung ermöglicht, falls das Vorliegen einer heterologen DNA nicht ein Hindernis für die Spezifität der Sonden bei den betrachteten Verwendungen ist.
Insbesondere betreffen die folgenden Beispiele die Herstellung der erfindungsgemäßen Sonden, die jeweils den Sequenzen (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), und (18), die oben beschrieben wurden, entsprechen und nachfolgend jeweils als die Sonden Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4, Nr. 5, Nr. 6, Nr. 7, Nr. 8, Nr. 9, Nr. 10, Nr. 11, Nr. 12, Nr. 13, Nr. 14, Nr. 15, Nr. 16, Nr. 17 und Nr. 18 bezeichnet werden.

Materialien und Methoden

1.) Verwendete Organismen und Medien

Die folgenden Stämme wurden gezüchtet, wie beschrieben von Rossau et al. (1986): Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375T, Neisseria meningitidis NCTC 10025T, Neisseria lactamica NCTC 10617T, Neisseria mucosa CIP 59,51T, Neisseria subflava ATCC 10555, Neisseria flavescens ATCC 13120T, Neisseria elongata ssp. elongata NCTC 10660T und Moraxella (Branhamella) catarrhalis NCTC 4103. Acht statistisch gewählte N. gonorrhoeae-Stämme und neun N. meningitidis-Stämme (aus verschiedenen Serotypen) wurden über Nacht auf Blutagarplatten im Insitut für Tropenmedizin, Antwerpen, Belgien, kultiviert. Die Identität der Stämme wurde durch herkömmliche Verfahren überprüft. Gereinigte genomische DNA der übrigen Stämme wurde von J. De Ley (Lab. Microbiology, Staatliche Universität Gent, Belgien) zur Verfügung gestellt.

2.) DNA-Präparate:

Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht wurde im wesentlichen nach dem Verfahren, das von Marmur (1961) beschrieben wurde, hergestellt. Plasmid-DNA wurde durch das Verfahren isoliert, das von Kahn et al. (1979) beschrieben wurde, und durch CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt.

3.) Fixierung von denaturierter DNA auf Nitrocellulosemembranen:

Die DNA Lösung wurde 10 min auf 95ºC erhitzt, auf Eis gestellt und mit 6 x SSC eingestellt (SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0). Die geeignete Lösungsmenge wurde auf eine BA85 Membran (Schleicher & Schuell, Westdeutschland) in mehrfachen Punkt-Flecken aufgebracht. Nach Trocknen an Luft wurde die Membran 2 h auf 80ºC erhitzt.

4.) Konstruktion von pNGD1 und pNGK3:

Die Plasmide pNGD1 und pNGK3 enthalten die Sonden Nr. 3 bzw. Nr. 6 als Insert. Sie wurden aus pNG 4 bzw. pNG3 konstruiert, welche pTZ18R (Pharmacia, Schweden)-abgeleitete rekombinante Plasmide sind, welche einen Teil des 16S rRNA-Gens von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375T enthalten. Im Fall von pNGD1 wurde ein 71 Basenpaar StuI-KpnI- Fragment subkloniert und 25 Basenpaare, beginnend mit der StuI-Stelle wurden nachfolgend durch Exonuclease III (Stratagene, USA) und Mungobohnennuclease-(Stratagene, USA) Behandlung entfernt. Zur Konstruktion von pNGK3 wurden in gleicher Weise 63 Basenpaare vom 3'- Ende des Inserts von pNG3 entfernt. Das resultierende Plasmid wurde mit SphI und BstXI gespalten, gefolgt von Abschneiden der Sticky-ends und intramolekularer Ligierung. Die Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim (Westdeutschland) oder Bio Labs (USA) gekauft und wie von den Herstellern empfohlen verwendet.

5.) Bestimmung der DNA-Sequenz:

Die Inserts von pNGD1 und pNGK3 wurden nach der Dideoxyketten- Abbruchmethode auf supergeknäulter Plasmid DNA sequenziert, wie beschrieben im technischen Handbuch des GemSeq K/RT Sequenziersystems (Promega, USA)

6.) Oligonucleotid-Synthese und -Reinigung:

Die Oligonucleotide wurden nach der Phosphit-triester-Methode auf einem Gene-Assembler 18-5800-01 (Pharmacia, Schweden) oder einem Cyclon 8400 (New Brunswick, USA) synthetisiert. Die von Schutzgruppen befreiten Oligonucleotide wurden auf einem 15 % Polyacrylamidgel in 7M Harnstoff gereinigt. Nach Eluierung über Nacht wurden sie auf einer Sephadex G-25 (Pharmacia, Schweden)-Säule entsalzt.

7.) Markierung der Sonde:

Die als Sonden verwendeten synthetischen Oligonucleotide wurden unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Pharmacia Schweden) und γ-³²P-dATP (Amersham, U.K.) (Maniatis et al., 1982) markiert.
Um Störungen aufgrund von Vektorsequenzen wahrend der Hybridisierung auszuschalten, wurden die Inserts von pNGD1 und pNGK3 unter Verwendung von Restriktionsenzymen ausgeschnitten und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Die gereinigten Inserts wurden markiert, indem sie an den einzelsträngigen Enden mit α-³²P-dATP (Amersham, U.K:) unter Verwendung von Klenow-Enzym (Boehringer Mannheim, Westdeutschland) (Maniatis et al. 1982) aufgefüllt wurden. Nichteingebaute Markierung wurde unter Verwendung einer Bio-Gel P-6DG-Drehsäule (Bio-Rad Laboratories, USA) entfernt.

8.) Hybridisierungen:

Ein allgemeines Hybridisierungsprotokoll wurde in allen Experimenten befolgt wobei lediglich die Bedingungen an die Natur der verwendeten Sonden angepaßt wurden. Eine Prähybridisierung wurde normalerweise in Plastiktaschen in 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1 (FB), 20 % entionisiertem Formamid (FA), 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalubimin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und 0,1 mg/ml zerschnittener denaturierter Lachssperma DNA bei derselben Temperatur wie die Hybridisierung während 30 min bis 4 h durchgeführt. Die Hybridisierungen wurden während 1 h bis über Nacht in derselben Lösung durchgeführt, wozu ungefähr 0,5 bis 1 x 10&sup6; cpm/ml ³²P-Sonde zugegeben wurde. Die Hybridisierungstemperatur (HT) variierte von Experiment zu Experiment. Nach einer kurzen Spülung in 3 x SSC, 25 mM FB und 20 % FA bei Raumtemperatur wurden die Membranen 15 bis 30 min in 3 x SSC, 25 mM FB und 20 % FA bei der Waschtemperatur (WT), die in den Zahlen angegeben ist, gewaschen. Danach wurden die Membranen in 1,5 x SSC bei Raumtemperatur ungefähr 10 min abgespült, getrocknet und autoradiographiert.

Ergebnisse:

1.) Verwendete Sonden

Um Neisseria gonorrhoeae-spezifische Sonden zu selektieren, wurde eines der rRNA Cistrons des Stammtyps von N. gonorrhoeae kloniert und sequenziert. Evolutionär weniger konservierte Regionen innerhalb des Cistrons wurden durch Vergleich mit bekannten Sequenzen identifiziert. Einige der Regionen wurden subkloniert (Sonden Nrn. 3 und 6) oder chemisch synthetisiert (Sonden Nrn. 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 und 18) und als Hybridisierungssonden verwendet. Figur 1 stellt die Anordnungen der Regionen dar, für die DNA-Sonden konstruiert und auf der 16S rRNA-Sekundärstruktur von Escherichia coli verwendet wurden (Woese et al., 1983). Diese Regionen werden durch einen fetten Strich gekennzeichnet und mit römischen Zahlen numeriert. Sonde Nr. 9 wurde von der Region I entnommen, Sonden Nrn. 1 bis 4 wurden von der Region Nr. II abgeleitet und Sonden Nrn. 5 und 6 von den Regionen III bzw. IV.
In Figur 2 werden die Komplementärsequenzen der erfindungsgemäßen Sonden Nrn. 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 9 verglichen mit den entsprechenden Sequenzen von Pseudomonas testosteroni ATCC 11996 (Yang et al., 1985), dem engsten phylogenetischen Nachbarn von Neisseria, von dem die 16S rRNA-Sequenz veröffentlicht ist, und mit den entsprechenden Sequenzen von Escherichia coli (Brosius et al., 1978).
In Figur 3 werden die Komplementärsequenzen der Sonden Nr. 7, Nr. 8, Nr. 10 und Nr. 11, die vom 23S rRNA-Gen abgeleitet wurden, verglichen mit den entsprechenden Escherichia coli Sequenzen (Brosius et al., 1980).
Von Region II (in Figur 1) der 16S rRNA wurden 4 Sonden mit verschiedenen Längen (27, 37, 47 und 57 Basen für die Sonden Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3 bzw. Nr. 4) getestet. Die Sonden Nrn. 7 und 8 wurden von derselben Region in der 23S rRNA-abgeleitet. Die Sequenz von Sonde Nr. 8 ist der Sequenz von Sonde Nr. 7 identisch, mit der Ausnahme daß in Sonde Nr. 8 ein Adenosinrest eingefügt war (siehe Figur 3). Von allen anderen Regionen wurde nur eine Sonde in den Experimenten verwendet.
Figur 11 stellt die Lage der Regionen, von denen die erfindungsgemäßen Sonden konstruiert wurden, auf der vermutlichen 16S rRNA rekombinanten Struktur von Neisseria gonorrhoeae dar.
Diese Regionen werden durch fette Striche gekennzeichnet und mit römischen Zahlen numeriert. Die entsprechende Sonden-Nr. ist in Klammern angezeigt.
Figur 12 stellt die Lage der Regionen, von denen erfindungsgemäße Sonden konstruiert wurden, auf der 23S rRNA-Sekundärstruktur von Escherichia coli dar (Noller, Ann. Rev. Biochem, 53: 119-192, 1984).
Diese Regionen werden durch fette Striche bezeichnet und durch römische Zahlen numeriert. Die entsprechende Sonden-Nr. ist in Klammern angegeben.

2.) Spezifität der Sonden:

a.1) Untersuchung der Sonden Nr. 1 bis Nr. 11:

Das Kriterium für Spezifität war die Fähigkeit, zwischen Neisseria gonorrhoeae und N. meningitidis-Stäminen zu differenzieren. Verschiedene unabhängige Untersuchungen (Kingsbury, 1967; Elwell und Falkow, 1977; Hoke und Vedros, 1982; Riou et al., 1983; Guibourdenche et al., 1986) haben gezeigt, daß trotz ihres unterschiedlichen pathogenen Charakters beide Spezies genotypisch äußerst stark verwandt sind. Die DNA : DNA Hybridisierungshomologiewerte, die zwischen Vertretern beider Spezies berichtet wurden, liegen zwischen 64 und 93 %. Diese Werte werden äußerst häufig unter Vertretern der gleichen Spezies gefunden, wobei in Erinnerung gerufen wird, daß ein Konsens über die Definition einer Spezies erreicht wurde (Wayne et al., 1987), der festlegt, daß "eine Spezies im allgemeinen Stämme mit etwa 70 % oder höherer DNA-DNA-Verwandtschaft und mit 5ºC oder weniger Δ Tm einschließen wird". Gemäß dieser Definition sollten N. gonorrhoeae und N. meningitidis als Subspezies einer und derselben Spezies angesehen werden (Guibourdenche et al., 1986).
In einer ersten Reihe von Experimenten wurde 1 ug denaturierte DNA von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375T (NG), Neisseria meningitidis NCTC 10025T (NM) und Escherichia coli B (EC) auf Membranen aufgetüpfelt und bei der Temperatur hybridisiert (HT: Hybridisierungstemperatur) und mit den Sonden hybridisiert, die in Figur 4 angegeben sind. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen 15 min bei verschiedenen Waschtemperaturen (WT) gewaschen, getrocknet und 24 h mit einem verstärkenden Film bei -70ºC autoradiographiert. Aus den Autoradiographen in Figur 4 wird klar, daß alle Sonden, die von den Regionen I, II und III (Figur 1) der 16S rRNA (Sonden Nr. 1 bis 5 und Sonde Nr. 9) abgeleitet waren, und eine Sonde (Nr. 11) der 23S rRNA spezifisch auf N. gonorrhoeae bei der geeigneten Waschtemperatur sind, d.h.
bei einer Waschtemperatur von 55, 60 und 65ºC für Sonde Nr. 1,
bei einer Waschtemperatur von 60, 65 und 70ºC für Sonde Nr. 2,
bei einer Waschtemperatur von 65ºC für Sonde Nr. 3,
bei einer Waschtemperatur von 70 und 75ºC für Sonde Nr. 4,
bei einer Waschtemperatur von 65ºC für Sonde Nr. 5,
bei einer Waschtemperatur von 65ºC für Sonde Nr. 9,
bei einer Waschtemperatur von 65ºC für Sonde Nr. 11.
Im Vergleich dazu zeigen die Autoradiographen in Figur 4, daß die Sonden Nrn. 6, 7, 8 und Nr. 10 nicht spezifisch für N. gonorrhoeae sind.
Die Hybridisierungsergebnisse der Sonden Nr. 1, Nr. 5 und Nr. 9 mit genomischer DNA aus statistisch ausgewählten N. gonorrhoeae- und N. meningitidis-Stämmen werden in Figur 5 dargestellt. 1 ug denaturierte DNA aus neun Neisseria gonorrhoeae-Stämmen (Reihe A, B und C, 1 bis 3), zehn Neisseria meningitidis-Stämme (Reihe D, E und F, 1 bis 3 und Reihe G, 1), und ein Stamm jeweils von Pseudomonas testosteroni (Reihe G, 2) und Escherichia coli (Reihe G, 3) wurden auf Nitrocellulose aufgetupft, hybridisiert mit Sonde Nr. 1 (Tafel A), Sonde Nr. 5 (Tafel B) und Sonde Nr. 9 (Tafel C) bei 50ºC, 55ºC bzw. 60ºC und bei der angegebenen Temperatur gewaschen. Die Autoradiographen von Figur 5 zeigen, daß die Sonden Nr. 1, Nr. 5 und Nr. 9 mit der DNA aus allen getesteten N. gonorrhoeae-Stammen paaren. Sonden Nr. 5 und Nr. 9 waren spezifisch auf N. gonorrhoeae-Stämme nur unter starken Restriktionen (beispielsweise einer Hybridisierungstemperatur von 55ºC und einer Waschtemperatur von 65ºC im Fall von Sonde Nr. 5), wohingegen Sonde Nr. 1 spezifisch bei wenig strengen Bedingungen blieb (Hybridisierungstemperatur von 50ºC, Waschtemperatur von 50 oder 55ºC). Im Hinblick auf die Sequenzkonserservierung in den rRNA Cistronen scheint es unwahrscheinlich, daß die letztere Sonde keine stabilen Doppelstränge mit der Nucleinsäure von anderen N. gonorrhoeae-Stämmen unter diesen nicht-stringenten Bedingungen bildet.
Wenn eine taxon-spezifische rRNA-abgeleitete DNA-Sonde keine Nucleinsäuren von engverwandten Organismen detektiert, kann die Wahrscheinlichkeit, daß sie Nucleinsäuren aus entfernter verwandten Organismen detektieren wird, als sehr klein betrachtet werden. Dies wird durch Figur 6 gezeigt, die einem Experiment entspricht, woin die Sonden Nrn. 3, 5, 6 und 7 mit genomischer DNA von sieben Neisseriaspecies und einigen anderen gramnegativen Bakterien hybridisiert wurden. Präziser stellt Figur 6 Hybridisierungsergebnisse ausgewählter rRNA-abgeleiteter DNA-Sonden mit 1 ug denaturierter DNA von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375T (Reihe A, 1), N. meningitidis NCTC 10025T (Reihe B, 1), N. lactamica NCTC 10617T (Reihe C, 1), N. mucosa CIP 59,51T (Reihe D, 1), N. subflava ATCC 10555 (Reihe E, 1), N. flavescens ATCC 13120T (Reihe F, 1), N. elongata ssp. elongata NCTC 10660T (Reihe A, 2), Chromobacterium vilaceum NCTC 9757T (Reihe B,2), Pseudomonas testosteroni ATCC 17407 (Reihe C, 2), Haemophilus ducreyi CIP 542 (Reihe D, 2), Moraxella (Branhamella) catarrhalis NCTC 4103 (Reihe E, 2) und Escherichia coli B (Reihe F, 2), aufgebracht auf Nitrocellulose, hybridisiert bei der angegebenen Temperatur und mit der angegebenen Sonde und gewaschen bei der jeweils angegebenen Temperatur. Unter den verwendeten Bedingungen bildeten die Sonden 3 und 5 keine stabilen Doppelstränge mit beliebigen der getesteten DNAs, mit Ausnahme von N. gonorrhoeae DNA. Selbst die weniger spezifischen Sonden (Nr. 6 und 7) erzeugten kein detektierbares Signal mit nichtneisserialer DNA. Es sollte erwahnt werden, daß Sonde Nr. 6 mit DNA aus dem Stammtyp von Simonsiella crassa bei 60ºC in 3SSC und 20 % FA hybridisierte.
Aus den in Figuren 4, 5 und 6 gezeigten Ergebnissen ist offensichtlich, daß die Spezifität der Sonden stark abhängig ist von den verwendeten Hybridisierungs- und Waschbedingungen. Beispielsweise kann durch einfache Änderung der Waschtemperatur der Detektionsbereich der Sonden ausgedehnt werden, so daß ein und dieselbe Sonde verwendet werden kann, um N. gonorrhoeae spezifisch zu detektieren oder eine größere Gruppe von Organismen zu detektieren. Dies wird in Figur 7 dargestellt, worin 1 ug aufgetupfte denaturierte DNA von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375T (NG), N. meningitidis NCTC 10025T (NM), N. elongata ssp. elongata NCTC 10660 (NE), Chromobacterium violaceum NCTC 9575T (CV), Pseudomonas testosteroni ATCC 17407 (PT) und Escherichia coli B (EC) bei 50ºC mit der ³²P-markierten Sonde Nr. 3 in Abwesenheit von Formamid hybridisiert wurde. Danach wurden die Membranen bei 50, 60, 70 bzw. 80ºC in 3SSC und 25 mM FB gewaschen. Die Membranen wurden getrocknet und über Nacht bei -70ºC mit einem intensivierenden Film autoradiographiert. Aus dieser Figur ergibt sich, daß die Spezifität der Sonde abnimmt, wenn die Waschtemperaturen erniedrigt werden. Bei 80ºC ist die Sonde Nr. 3 spezifisch für N. gonorrhoeae DNA. Bei 70ºC bildet diese Sonde Doppelstränge mit N. gonorrhoeae und N. meningitidis DNA und bei 60ºC mit DNA von allen drei untersuchten Neisseria-Species. Jedoch selbst nicht-neisseriale DNA konnte detektiert werden, wenn die Waschtemperatur 50ºC betrug. Die nachstehende Tabelle I faßt den Temperaturbereich, bei der die Sonden der Erfindung spezifisch für N. gonorrhoeae sind, zusammen. Für jede Sonde liegt dieser Temperaturbereich zwischen Ts und Td. Ts ist die niedrigste Temperatur, bei der Sonde immer noch spezifisch auf N. gonorrhoeae ist und Td ist die Temperatur, bei dem der Sonde- Zielmolekül-Doppelstrang vollständig dissoziert ist. Diese Werte wurden unter den folgenden Bedingungen erhalten: 3 SSC, 25 mM FB pH 7,1 und 20 % FA. Falls diese Bedingungen, die Natur der Sonde oder das Zielmolekül geändert werden, werden sich die Temperaturen entsprechend verändern. Die Temperaturen wurden experimentell unter Verwendung von Abständen von 5ºC bestimmt, daher ergibt sich der Δ 5ºC-Bereich von Ts und Td. Angemerkt werden sollte, daß Sonde Nr. 1 auch bei einer Temperatur von weniger als 45 bis 50ºC spezifisch sein kann und daß die Sonden Nr. 6, Nr. 7, Nr. 8 und Nr. 10 nicht spezifisch für Neisseria gonorrhoeae sind. Tabelle 1 Sonde

a.2.) Ergebnisse in Betreff Sonde Nr. 1:

Sonde Nr. 1 wurde unter Verwendung von 202 N. gonorrhoeae-Stämmen und 84 N. meningitidis-Stämmen ausführlich getestet.
Das folgende Verfahren wurde verwendet:
Ein paar Kolonien eines jeden Stamms wurden auf Biodyne A Membranen aufgebracht, welche 3min auf ein Whatman 3 MM-Papier, das mit 10 % SDS gesättigt war, gelegt wurden. Nach dem Trocknen wurden die Membranen 2 h auf 80ºC erhitzt und eine bis zwei Stunden bei 53ºC in einer Hybridisierungsmischung hybridisiert, zu welcher 10&sup6; cpm/ml ³²P-markierte Sonde (Nr. 1) zugegeben wurden.
Die Ergebnisse werden in Figur 15 dargestellt. In Figur 15 bedeutet jede Zahl entweder einen Neisseria gonorrhoeae- oder einen N. meningitidis-Stamm. Die N. meningitidis-Stämme sind eingerahmt.
Alle N. gonorrhoeae-Stämme ergaben ein eindeutig positives Signal nach einer 3 h Exposition (bei -80ºC mit einem intensivierenden Film). Keiner der N. meningitidis-Stämme ergab positive Ergebnisse, selbst nach Exposition über Nacht. Das Vorliegen einer detektierbaren rRNA- Menge in den N. meningitidis-Flecken wurde nachher bestätigt, wobei eine nichtspezifische rRNA-abgeleitete Sonde verwendet wurde.
Andere Experimente zeigten, daß die Sonde Nr. 1 auch mit DNA des Neisseria-Species-Stamm ATCC 43831 hybridisierte (siehe Figur 16). In Figur 16 werden die Hybridisierungsergebnisse mit Sonde Nr. 1 und DNA des Neisseria-Speciesstamm ATCC 43831 dargestellt: die Hybridisierungs- und Waschtemperatur betrug 52,5ºC (in 3SSC, 25 mM PB, pH 7,1 und 20 % FA).
Dieser ATTC 43831-Stamm ist ein nichtklassifizierter Stamm mit Zwischencharakteristika zwischen N. gonorrhoeae und N. meningitidis.
Wie in Figur 17 gezeigt, hybridisierte Sonde Nr. 1 nicht über Kreuz mit DNA einer Abart eines anderen Bakteriums.
In Figur 17 werden die Hybridisierungsergebnisse der Sonde Nr. 1 mit 1 ug aufgetupfter ("dot-spotted") genomischer DNA einer Vielzahl von Bakterienstämmen dargestellt: Der Ort der Stamme wird in der nachfolgenden Tabelle II angegeben und die Hybridisierungs- und Waschtemperatur betrug 52,5ºC (in 3SSC, 25 mM PB, pH 7,1 und 20 % FA). Tabelle II Stamm-Nr. Name Hinterlegungs-Nr. Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Neisseria polysaccharea Neisseria lactamica Neisseria cinera Neisseria mucosa Neisseria macacae Tabelle II (Fortsetzung) Stamm-Nr. Name Hinterlegungs-Nr. Neisseria flavescens Neisseria subflava Neisseria sicca Neisseria elongata subsp. elongata Neisseria elongata subsp. glycolytica Neisseria canis Neisseria animalis Neisseria denitrificana CDC Gruppe M-5 CDC-Gruppe EF-4a Kingella denitrificana Kingella kingae Simonsiella muelleri Simonsiella crassa Simonsiella steedae Simonsiella species Alysiella filiformis Eikenella corrodens Ohromobacterium violaceum Ohromobacterium fluviatile Aquaspirillum dispar Pseudomonas testosteroni Oligella urethralis Haemophilus ducrevi Kingella indologenes Moraxella (Branhamella) catarrhelis Escherichia coli Anordnung der Stämme auf Filter I und II Filter I Filter II
Als Schlußfolgerung zeigte sich die Sonde Nr. 1 unter den verwendeten Bedingungen zu 100 % spezifisch und 100 % verläßlich für N. gonorrhoeae im Vergleich zu herkömmlichen Identifikationstechniken. Die Sonde erwies sich auch als verläßlicher als die Kryptische Plasmidsonde, die anfänglich von Totten et al. beschrieben wurde, J. Infect. Dis. 148: 462 bis 471, 1983 (Ergebnisse nicht gezeigt).

a.3) Ergebnisse in Betreff Sonde Nr. 10:

Sonde Nr. 10 wurde mit einer großen Vielzahl bakterieller DNAs hybridisiert. Die Ergebnisse werden in Figur 18 gezeigt.
In Figur 18 werden die Hybridisierungergebnisse der Sonde Nr. 10 mit 1 ug aufgetupfter genomischer DNA aus einer Vielzahl bakterieller Stämme dargestellt.
Die Hybridisierungstemperatur betrug 55ºC (in 3SSC, 25 mM PB, pH 7,1 und 20 % FA). Die Waschtemperaturen werden angegeben (dasselbe Medium wurde verwendet). Die Anordnung der Stämme wird in Tabelle II angegeben.
Sonde Nr. 10 hybridisiert mit DNA von beinahe allen Neisseria- Stämmen. Bei 60ºC werden schwache Kreuzreaktionen auch mit DNA von Simonsiella- und Alysiella-Stämmen beobachtet, welche enge Verwandte der Neisseriae sind (Rossau et al., IJSB, 1989 in Druck).
b) Untersuchungen von Sonden Nr. 12 bis Nr. 18:
Die Spezifität der Sonden Nr. 12 bis Nr. 18 wurde wie zuvor beschrieben getestet (selbes Verfahren, selbe Medien).
Die Hybridisierung- (HT) und Waschtemperatur (WT), die verwendet wurden, werden in Figur 13 angegeben.
In Figur 13 wurde die Spezifität der Sonden bei verschiedenen Waschtemperaturen wie folgt bestimmt:
Nach Hybridisierung bei der angegebenen Temperatur (HT) und mit der angegebenen Sonde wurden die Membranen, auf die 1ug denaturierte DNA von Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375T (NG), Neisseria meningitidis NCTC 10025T (NM), Escherichia coli B (EC) und Branhamella catarrhalis ITG 4197 (BC) aufgetupft worden waren, 15 min bei der angegebenen Waschtemperatur gewaschen, getrocknet und 24 h mit einem intensivierenden Film bei 70ºC autoradiographiert.
Aus den in Figur 13 gezeigten Ergebnissen ist klar, daß die Sonden Nr. 12, 14 und 17 nicht spezifisch für Neisseria gonorrhoeae sind. Sie können verwendet werden, um einen oder mehrere Neisseria- Stämme bei den folgenden Hybridisierungstemperaturen (HT) und Waschtemperaturen (WT) zu detektieren:
Sonde Nr. 12: HT und WT zwischen etwa 55ºC und etwa 60ºC.
Sonde Nr. 14: HT und WT zwischen 40ºC und etwa 45ºC.
Sonde Nr. 17: HT und WT zwischen etwa 50ºC und etwa 55ºC.
Obwohl die Sonden Nrn. 15 und 16 mit DNA des Stammtyps von N. meningitidis unter strengen Bedingungen (siehe Figur 13) nicht hybridisieren, zeigten weitere Experimente, daß sie nicht hinreichend spezifisch für N. gonorrhoeae sind, da sie mit einigen anderen Neisseria-Stämmen kreuzhybridisieren, hauptsächlich N. meningitidis- Stämmen. Beide Sonden können somit nur verwendet werden, um einen oder mehrere Neisseria-Stämme bei den folgenden HT und WT zu detektieren:
Sonde Nr. 15: HT und WT zwischen etwa 50ºC und etwa 55ºC,
Sonde Nr. 16: HT und WT zwischen etwa 50ºC und etwa 60ºC.
Unter streng kontrollierten Bedingungen hybridisierten die Sonden Nr. 13 und 18 mit allen getesteten N. gonorrhoeae-Stämmen und mit keinem der getesteten N. meningitidis-Stämmen bei den folgenden HT und WT:
Sonde Nr. 13: HT und WT von etwa 50 bis etwa 55ºC
Sonde Nr. 18: etwa 60ºC.
Ein Beispiel bezüglich der Hybridisierungsergebnisse mit Sonde Nr. 18 ist in Figur 14 angegeben.
Sonde Nr. 18 wurde mit 1 ug aufgetupfter DNA aus 9 N. gonorrhoeae-Stämmen (Reihe A, B und 0, 1 bis 3), 10 N meningitidis- Stämmen (Reihe D, E und F, 1 bis 3 und Reihe G, 1) und zwei Referenzstämmen, die mit Neisseria nicht verwandt waren (Reihe G, 2 und 3), hybridisiert. Die Hybridisierungs- und Waschtemperatur betrug 60ºC.
Die nachfolgende Tabelle III faßt die Temperaturbereiche zusammen, bei denen die Sonden Nr. 12 und Nr. 18 der vorliegenden Erfindung spezifisch für N. gonorrhoeae sind. In dieser Tabelle haben Ts und Td die oben erläuterten Bedeutungen unter den zuvor detailierten Bedingungen (vergleiche Tabelle I). Tabelle III Sonde
Die Sonden der Erfindung können in einem sandwichartigen Hybridisierungssystem verwendet werden, das die Spezifität eines Assays of Basis einer Nucleinsäuresonde erhöht.
Das Prinzip und die Verwendung der Sandwichhybridisierungen bei einem Assay auf Basis von Nucleinsäuresonden wurde bereits beschrieben (z.B. Dunn und Hassel, Cell, 12, 23 bis 36 1977, Ranki et al., Gene 21, 77 bis 85, 1983). Obwohl direkte Hybridisierung-Assays eine günstige Kinetik haben, sind Sandwichhybridisierungen vorteilhaft durch ein höheres Signal-Rauschverhältnis. Außerdem können Sandwichhybridisierungen die Spezifität eines Tests auf Basis von Nucleinsäuresonden erhöhen. Falls er richtig konzipiert wird, maximiert ein Sandwichhybridisierungs-Assay in der Tat die Spezifität eines Tests auf Basis von Nucleinsäuresonden, wenn zwei Sonden, die zwei verschiedene Nucleinsäureteile eines und desselben Organismus erkennen, verwendet werden. Die einzigen Anforderungen, die erfüllt werden müssen, sind, daß beide Sonden (i) mit einer Nucleinsäure des Zielorganismus hybridisieren und (ii) nicht mit denselben Nicht-Zielorganismen hybridisieren.
Für zwei gegebene Sonden I und II kann das Sandwichhybridisierungssytem wie folgt beschrieben werden:
Sonde Nr. I hybridisiert mit Nucleinsäure aus den Organismen A und B (nicht mit C),
Sonde Nr. II hybridisiert mit Nucleinsäure aus den Organismen A und C (nicht mit B).
Da es absolut erforderlich ist, daß beide Sonden mit der Zielnucleinsäure hybridisieren, wird ein detektierbares Signal nur erzeugt, wenn Nucleinsäure aus Organismus A in der Probe vorliegt.
In Figur 10 wird ein Sandwichhybridisierungs-Assay mit erhöhter Spezifität dargestellt:
Sonde I hybridisiert mit Nucleinsäure aus Organismen A und B und ist an den festen Träger fixiert.
Sonde II hybridisiert mit Nucleinsäure aus den Organismen A und C und ist markiert.
Der Test wird nur positiv sein, wenn die markierte Sonde (Sonde II) indirekt an den Träger fixiert werden wird, das heißt wenn Nucleinsäure aus dem Organismus A vorliegt.
Insbesondere hybridisieren in der ersten Abbildung von Figur 10 die Sonde I und Sonde II mit der Zielnucleinsäure A. Die markierte Sonde wird fixiert. Der Test ist positiv.
In der zweiten Zeichnung von Figur 10 hybridisiert Sonde I mit den Nucleinsäure von Organismus B, doch Sonde II nicht. Die markierte Sonde wird nicht fixiert. Es wird kein Signal geben; der Test ist negativ.
In der dritten Zeichnung von Figur 10 wird Nucleinsäure aus Organismus C nicht fixiert. Infolgedessen wird die markierte Sonde nicht fixiert werden. Es wird kein Signal geben: Der Test ist negativ.
Einige Sonden der vorliegenden Erfindung können in einem Sandwichhybridisierungs-Assay, der hochspezifisch für Neisseria gonorrhoeae ist, kombiniert werden. Vorteilhafte Kombinationen von erfindungsgemäßen Sonden, die die Spezifität für N. gonorrhoeae maximieren, sind:
- Sonde der Gruppe 9 und eine beliebige Sonde der folgenden Gruppen: 1, 2, 3, 5 und 13
- Sonde der Gruppe 13 und eine beliebige der Sonden der folgenden Gruppen: 1, 2, 3 und 5.
Sonde der Gruppe 18 und eine beliebige Sonde aus den folgenden Gruppen: 1, 2, 3, 5, 9 und 13.
Sonde der Gruppe 5 und eine beliebige Sonde der folgenden Gruppen: 1, 2 und 3.
Vorteilhafte Kombinationen von Sonden der vorliegenden Erfindung, die spezifisch für N. gonorrhoeae sind, sind die folgenden:
- Sonde der Gruppe 13 und eine beliebige Sonde der folgenden Gruppen: 5, 9 und 18.
Bevorzugte Kombinationen von erfindungsgemaßen Sonden, die spezifisch für N. gonorrhoeae sind, sind die folgenden:
Sonde der Gruppe 9 und der Gruppe 5.
Sonde der Gruppe 18 und eine Sonde der folgenden Gruppen 5 und 9.
Diese Kombinationen haben das 16S rRNA-Molekül als Zielmolekül. Kombinationen zwischen 16S rRNA- und 23S rRNA-abgeleiteten Sonden (z.B. Sonde der Gruppe 11 und Sonde der Gruppe 13 oder Gruppe 18) sind nur möglich, falls die genomische DNA das Zielmolekül ist. Im Sandwichhybridisierungs-Verfahren zum Nachweis von N. gonorrhoeae können die Proben gleichzeitig oder nicht gleichzeitig zu der biologischen Probe zugegeben werden, worin die Ziel-DNA oder -RNA gesucht wird.
Die vorteilhaften ungefähren Hybridisierungstemperaturen und Waschtemperaturen für die obenerwähnten Kombinationen werden in der folgenden Tabelle IV angegeben: Tabelle IV Nr. der Sonde
Diese Tabelle stellt bevorzugte ungefähre Hybridisierungs- und Waschtemperaturen (in ºC) für die verschiedenen Kombinationen von Sonden in einem Sandwichhybridisierungs-Assay dar. Die mit einem "-" gekennzeichneten Kombinationen sollten nicht verwendet werden.
Beispielsweise sollte
- ein Assay, worin die Sonden Nr. 1 und Nr. 5 kombiniert sind, bei etwa 53ºC durchgeführt werden und
- ein Assay, bei dem Sonden Nr. 18 und 9 kombiniert sind, sollte bei etwa 60ºC durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Reagenzienset (Kit) für einen Sandwichhybridisierungs-Assay, zum Nachweis von Neisseria gonorrhoeae- Stämmen in einer biologischen Probe in vitro, wobei dieser Kit enthält:
- Mindestens zwei Sonden, die spezifisch für N. gonorrhoeae sind, wie oben ausgewählt aus den folgenden Kombinationen:
- Sonde der Gruppe 9 und eine beliebige Sonde der folgenden Gruppen: 1, 2, 3, 5 und 13.
- Sonde der Gruppe 13 und eine beliebige Sonde der folgenden Gruppen: 1, 2, 3 und 5.
- Sonde der Gruppe 18 und eine beliebige Sonde der folgenden Gruppen: 1, 2, 3, 5, 9 und 13.
- Sonde der Gruppe 5 und eine beliebige Sonde der folgenden Gruppen: 1, 2 und 3
und insbesondere aus der folgenden Kombination:
- Sonde der Gruppe 13 und einer beliebigen Sonde der folgenden Gruppen: 5, 9 und 18
- und ganz besonders von den folgenden Kombinationen:
- Sonde der Gruppe 9 und der Gruppe 5.
- Sonde der Gruppe 18 und einer der Sonden der folgenden Gruppen 5 und 9
- den Puffer oder die Komponenten, die zur Herstellung des Puffers notwendig sind, der die Ausführung einer Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs eines Stamms von Neisseria gonorrhoeae ermöglicht,
- unter gegebenen Umständen Mittel zum Nachweis der Hybride, die aus der vorhergehenden Hybridisierung resultieren.
Die Tatsache, daß Neisseria gonorrhoeae- und Neisseria meningitidis-Stämme voneinander durch einige Sonden dieser Erfindung unterschieden werden können, hat einige weitreichende Implikationen für die Verwendung von rRNA-abgeleiteten Sonden im allgemeinen, da beide Taxa genotypisch auf dem Subspeciesniveau verwandt sind. Daher können die Sonden gemäß der Erfindung nicht ausschließlich dazu verwendet werden, große Gruppen von Organismen zu entdecken, sondern können auch verwendet werden, um zwischen Organismen auf dem Subpeciesniveau zu unterscheiden. Es gibt keinen Grund für die Annahme, daß dies nur bei Neisseria der Fall sein sollte und nicht in anderen Taxa. Vorausgesetzt, daß die Sondensequenz und die Hybridisierungsbedingungen sorgfältig gewählt werden, kann die Differenzierung auf dem Subspeciesniveau mit einem einfachen direkten Hybridisierungstest erreicht werden, was die komplizierte Southern- Blot-Analyse obsolet macht.
Die speziellen Sonden der Erfindung, insbesondere Sonden Nrn. 1 bis 5, Nr. 9, Nr. 11, Nr. 13 und Nr. 18 sollten eine Anwendung bei der Kultur-Verifizierung von Neisseria gonorrhoeae und der Diagnose von N. gonorrhoeae in allen Arten von klinischen Proben finden, da unter geeigneten Bedingungen keine Störung durch andere Mikroorganismen zu erwarten ist.
Außerdem können die Sonden der Erfindung für taxonomische oder epidemiologische Untersuchungen verwendet werden, die auf Restriktionsfragmenten-Längenpolymorphismusanalyse beruhen (Grimont und Grimont 1986) oder um verwandte Mikroorganismen zu identifizieren und klassifizieren.
Es folgt eine Bibliographie von Artikeln, die zum Stand der Technik dieser Erfindung gehören.

Bibliographie

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Claims

1.Sonde zum Nachweisen eines oder mehrerer Neisseria-Stämme, umfassend:

entweder eine Sequenz, die zu einer Nucleinsäure aus den folgenden Gruppen von Nucleinsäuren gehört, und welche 10 bis zur maximalen Anzahl von Nucleotiden der ausgewählten Nucleinsäure umfasst:

unter der Voraussetzung, dass die Sonde nicht aus der folgenden Sequenz: TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC besteht, oder eine Sequenzvariante, die sich von irgendeiner der vorhergehenden Sequenzen (4) bis (18) entweder durch Hinzufügung oder Entfernung eines oder mehrerer Nucleotide von einem ihrer entsprechenden Enden oder durch Ändern eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb irgendeiner der Sequenzen oder durch beides unterscheidet, jedoch unter der Voraussetzung, dass bei jeder der zuvor beschriebenen Tatsachen die Sonde noch mit der gleichen Ziel-RNA- oder -DNA wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz hybridisiert.

2. Sonde nach Anspruch 1, umfassend:

entweder eine Sequenz, die zu einer Nucleinsäure aus den folgenden Gruppen von Nucleinsäuren gehört, und die 10 bis zur maximalen Anzahl von Nucleotiden der ausgewählten Nucleinsäure umfasst:

TCGGCCGCCGATATTGGCAACAGCCTT (1)

UCGGCCGCCGAUAUUGGCAACAGCCUU (1bis)

AAGGCTGTTGCCAATATCGGCGGCCGA (1ter)

AAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA (1quater)

TCGGCCGCCGATATTGGCAACAGCCTTTTCTTCCCTG (2)

UCGGCCGCCGAUAUUGGCAACAGCCUUUUCUUCCCUG (2bis)

CAGGGAAGAAAAGGCTGTTGCCAATATCGGCGGCCGA (2 ter)

CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA (2quater)

GGTACCGTCATCGGCCGCCGATATTGGCAACAGCCTTTTCTTCCCTG (3)

GGUACCGUCAUCGGCCGCCGAUAUUGGCAACAGCCUUUUCUUCCCUG (3bis)

CAGGGAAGAAAAGGCTGTTGCCAATATCGGCGGCCGATGACGGTACC (3 ter)

CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC (3 quater)

unter der Voraussetzung, dass die Sonde nicht aus der nachfolgenden Sequenz: TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC besteht,

oder eine Sequenzvariante, die sich von irgendeiner der vorhergehenden Sequenzen (1) bis (18) entweder durch Hinzufügung oder Entfernung eines oder mehrerer Nucleotide von einem ihrer entsprechenden Extremitäten oder durch Ändern eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb irgendeiner der Sequenzen oder durch beides unterscheidet, jedoch unter der Voraussetzung, dass bei jedem der zuvor beschriebenen Sachverhalte die Sonde noch mit der gleichen Ziel-RNA oder -DNA wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz hybridisiert.

3. Sonde zum Nachweisen eines oder mehrerer Neisseria-Stämme, welche eine der im nachfolgenden definierten Sequenzen oder die entsprechende Komplementärsequenz zum Ziel hat, wenn das Hybridisierungsmedium oder das Waschmedium oder beides, wenn angemessen, folgende sind:

Hybridisierungsmedium: enthält etwa 3 x SSC, (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), etwa 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1, 20 % entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerkleinerte, denaturierte Lachsspermium-DNA,

Waschnedium: enthält etwa 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer pH 7,1, und 20 % entionisiertes Formamid, wobei die Zielsequenzen und die entsprechenden relevanten Hybridisierungstemperaturen (HT) und Waschtemperaturen (WT) folgende sind:

AAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA

HT und/oder WT : etwa 55ºC

CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA

HT und/oder WT : etwa 60ºC

CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC

HT und/oder WT : etwa 60ºC

GGACUUUUGUCAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC

HT und/oder WT : etwa 65ºC

UUAGCUGUUGGGCAACUUGAUUGCUUGGUAGCGU

HT und/oder WT : etwa 55ºC bis etwa 60ºC

GUGGGGGAUACCAGAAGUAGGUAGGGUAACCGCAAGGAGUCCGCUUACCACGGUAU

HT und/oder WT : etwa 65ºC bis etwa 70ºC

ACCUAGGUCCGGCGGAAAUCGGACUGA

HT und/oder WT : etwa 55ºC

ACCUAGGUCCGGUCGGAAAUCGGACUGA

HT und/oder WT : etwa 55ºC bis etwa 60ºC

GCAGCACAGGGAAGCUUGCUUCUCGGGUGGCG

HT und/oder WT : etwa 55ºC bis etwa 60ºC

UAUGCCCUCUAAGGUUAAGGACUUGCUCCGUAAGCCCCG

HT und/oder WT : etwa 60ºC bis etwa 65ºC

GCGGGGGAGCUGGCAAUAAAGCUAUGAUUCCGC

HT und/oder WT : etwa 55ºC

GUUCUGAACUGGGUGACUCGAGUGUGUC

HT und/oder WT : etwa 55ºC bis etwa 60ºC

GCAUACGUCUUGAGAGGGAAAGCA

HT und/oder WT : etwa 45ºC

UGUACGUAAUAACUGUCGAGA

HT und/oder WT : etwa 40ºC bis etwa 45ºC

UCUCAACAGCGGUACUAAGCGUACGAAA

HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 55ºC

UGUCUACGGACACGAAGCAACCGAUACCAC

HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 60ºC

UUAGGUUGGCAAGCUGUUGGAAUAGCUU

HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 55ºC

AGCUGGUUGGCGGGGUAAAGGCCCACCA

HT und/oder WT : etwa 45ºC

4. Sonde zum Nachweisen eines oder mehrerer Neisseria ghonorrhoeae-Stämme aus anderen Bakterienstämmen und insbesondere aus anderen Neisseria-Stämmen, enthaltend

entweder eine Sequenz, die zu einer Nucleinsäure aus den folgenden Gruppen von Nucleinsäuren gehört und welche 10 bis zur maximalen Anzahl an Nucleotiden der ausgewählten Nucleinsäure umfasst:

unter der Voraussetzung, dass die Sonde nicht aus der folgenden Sequenz: TCA TCG GCC GCC GAT ATT GGC besteht,

oder eine Sequenzvariante, die sich von irgendeiner der vorhergehenden Sequenzen (1) bis (18) entweder durch Hinzufügung oder Entfernung eines oder mehrerer Nucleotide von einem ihrer entsprechenden Enden oder durch Ändern eines oder mehrerer Nucleotide innerhalb irgendeiner der Sequenzen oder durch beides unterscheidet, jedoch unter der Voraussetzung, dass bei jedem der vorher beschriebenen Sachverhalte die Sonde noch mit der gleichen Ziel-RNA oder -DNA wie die entsprechende unmodifizierte Sequenz hybridisert.

5. Sonde zum Nachweisen eines oder mehrerer Neisseria gonorrhoeae-Stämme aus anderen Bakterienstämmen und insbesondere aus anderen Neisseria-Stämmen, welche eine der im nachfolgenden definierten Sequenzen oder die entsprechende Komplementärsequenz zum Ziel hat, wenn das Hybridisierungsmedium oder das Waschmedium oder beides, wenn angemessen, folgende sind:

Hybridisierungsmedium: enthält etwa 3 x SSC, (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), etwa 25 mM Phosphatpuffer mit pH 7,1, 20 % entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerkleinerte, denaturierte Lachspermium-DNA,

Waschmedium: enthält etwa 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer mit pH 7,1 und 20 % entionisiertes Formamid, wobei die Zielsequenzen und die entsprechenden relevanten Hybridisierungstemperaturen (HT) und Waschtemperaturen (WT) folgende sind:

AAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA

HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 65ºC

CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGA

HT und/oder WT : etwa 60ºC bis etwa 70ºC

CAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC

HT und/oder WT : etwa 65ºC bis etwa 70ºC

GGACUUUUGUCAGGGAAGAAAAGGCUGUUGCAAUAUCGGCGGCCGAUGACGGUACC

HT und/oder WT : etwa 70ºC bis etwa 75ºC

UUAGCUGUUGGGCAACUUGAUUGCUUGGUAGCGU

HT und/oder WT : etwa 65ºC

GCAGCACAGGGAAGCUUGCUUCUCGGGUGGCG

HT und/oder WT : etwa 65ºC

GCGGGGGAGCUGGCAAUAAAGCUAUGAUUCCGC

HT und/oder WT : etwa 65ºC

GCAUACGUCUUGAGAGGGAAAGCA

HT und/oder WT : etwa 50ºC bis etwa 55ºC

AGCUGGUUGGCGGGGUAAAGGCCCACCA

HT und/oder WT : etwa 60ºC.

6. Verfahren zum Nachweisen von Neisseria-Stämmen in einer biologischen Probe aus anderen Bakterienstämmen, wobei das Verfahren Inkontaktbringen der biologischen Probe, in der die Nucleinsäuren (DNAs und RNAs) der Stämme, erforderlichenfalls unter geeigneten Denaturierungsbedingungen der Hybridisierung zugänglich gemacht worden sind, mit einer Sonde gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Bedingungen, die Hybridisierung zwischen der Sonde und komplementären Nucleinsäuren der Neisseria-Stämme, die in der Probe vorhanden sein können, ermöglicht, und Nachweisen der möglicherweise gebildeten Hybride umfasst.

7. Verfahren zum Nachweisen von Neisseria-Stämmen aus anderen Bakterienstämmen in einer biologischen Probe gemäss Anspruch 6, wobei die verwendeten Sonden derartige sind, die sowohl mit DNA wie auch mit RNA von Neisseria-Stämmen, welche in der biologischen Probe vorhanden sein können, hybridisieren.

8. Verfahren zum Nachweisen von Neisseria-Stämmen aus anderen Bakterienstämmen gemäss einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei das Hybridisierungsmedium etwa 3 x SSC (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), etwa 25 mM Phosphatpuffer mit pH 7,1, 20 % entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerkleinerte denaturierte Lachsspermium-DNA enthält, oder das Waschmedium etwa 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer mit pH 7,1, und 20 % entionisiertes Formamid enthält, und wobei die verwendete Sonde folgende ist: irgendeine der Sonden (1), (1bis), (1ter) oder (1quater) des Anspruchs 2, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 55ºC, vorzugsweise um etwa 53ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 55ºC, vorzugsweise etwa 53ºC, eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (2), (2bis), (2ter) oder (2quater) des Anspruchs 2, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (3), (3bis), (3ter) oder (3quater) des Anspruchs 2, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (4), (4bis), (4ter) oder (4quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 65ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 65ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (5), (5bis), (5ter) oder (5quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 55ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 55ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (9), (9bis), (9ter) oder (9quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (6), (6bis), (6ter) oder (6quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 65ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 65ºC bis etwa 70ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (7), (7bis), (7ter) oder (7quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf etwa 55ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 55ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (8), (8bis), (8ter) oder (8quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 55ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 55ºC bis etwa 60ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (10), (10bis), (10ter) oder (10quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 55ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 55ºC bis etwa 60ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (11), (11bis), (11ter) oder (11quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 55ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf etwa 55ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (12), (12bis), (12ter) oder (12quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 55ºC bis etwa 60ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 55ºC bis etwa 60ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (13), (13bis), (13ter) oder (13quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 45ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 45ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (14), (14bis), (14ter) oder (14quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 40ºC bis etwa 45ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 40ºC bis etwa 45ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (15), (15bis), (15ter) oder (15quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (16), (16bis), (16ter) oder (16quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 60ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 60ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (17), (17bis), (17ter) oder (17quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt wird, oder irgendeine der Sonden (18), (18bis), (18ter) oder (18quater) des Anspruchs 1, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 45ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 45ºC eingestellt wird.

9.Verfahren zum Nachweisen von Neisseria gonorrhoeae-Stämmen aus anderen Bakterienstämmen und insbesondere aus anderen Neisseria-Stämmen, wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen der biologischen Probe, in der die Nucleinsäuren (DNAs und RNAs), erforderlichenfalls unter geeigneten Denaturierungsbedingungen der Hybridisierung zugänglich gemacht worden sind, mit einer Sonde gemäss der Erfindung, die spezifisch für Neisseria gonorrhoeae-Stämme ist und aus den Sonden (1), (1bis), (1ter), (1quater), (2), (2bis), (2ter), (2quater), (3), (3bis), (3ter), (3quater), (4), (4bis), (4ter), (4quater), (5), (5bis), (5ter), (5quater), (9), (9bis), (9ter), (9quater), (11), (11bis), (11ter), (11quater), (13), (13bis), (13ter), (13quater), (18), (18bis), (18ter) und (18quater) der Ansprüche 1 oder 2 ausgewählt ist, wann immer erforderlich, unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen, die so eingestellt sind, dass sie spezifische Hybridisierung mit komplementären Nucleinsäuren der Neisseria gonorrhoeae- Stämme, die in der Probe vorhanden sein können, jedoch nicht mit komplementärer DNA oder RNA anderer Neisseria-Arten gewährleisten, und Nachweisen der möglicherweise gebildeten Hybride.

10. Verfahren zum Nachweisen von N. gonorrhoeae-Stämmen aus anderen Bakterienstämmen und insbesondere aus anderen Neisseria- Stämmen gemäss Anspruch 9, wobei das Hybridisierungsmedium etwa 3 x SSC (SSC = 0,15 M NaCl, 0,015M Natriumcitrat, pH 7,0), etwa 25 mM Phosphatpuffer mit pH 7,1, 20 %-iges entionisiertes Formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % Rinderserumalbumin, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml zerkleinerte denaturierte Lachsspermium-DNA enthält, oder das Waschmedium etwa 3 x SSC, 25 mM Phosphatpuffer mit pH 7,1, und 20 %-iges entionisiertes Formamid enthält, und wobei die verwendete Sonde irgendeine der Sonden (1), (1bis), (1ter) oder (1quater) des Anspruchs 2 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 55ºC, vorzugsweise um etwa 53ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 55ºC bis etwa 65ºC, vorzugsweise etwa 53ºC bis etwa 65ºC und bevorzugter etwa 53ºC, eingestellt ist, und wobei die verwendete Sonde irgendeine der Sonden (2), (2bis), (2ter) oder (2quater) des Anspruchs 2 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 65ºC bis etwa 70ºC eingestellt ist, oder irgendeine der Sonden (3), (3bis), (3ter) oder (3quater) des Anspruchs 2 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 60ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 65ºC bis etwa 70ºC eingestellt ist, oder irgendeine der Sonden (4), (4bis), (4ter) oder (4quater) des Anspruchs 1 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 65ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 70ºC bis etwa 75ºC eingestellt ist, oder irgendeine der Sonden (5), (5bis), (5ter) oder (5quater) des Anspruchs 1 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich um etwa 60ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich um etwa 65ºC eingestellt ist, oder irgendeine der Sonden (9), (9bis), (9ter) oder (9quater) des Anspruchs 1 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 60ºC bis etwa 65ºC eingestellt wird, und/oder die Waschtemperatur auf einen Bereich um etwa 65ºC eingestellt ist, oder bevorzugter irgendeine der Sonden (1), (1bis), (1ter) oder (1quater) des Anspruchs 2 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf einen Bereich um etwa 55ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich um etwa 55ºC bis etwa 65ºC eingestellt ist, oder irgendeine der Sonden (11), (11bis), (11ter) oder (11quater) des Anspruchs 1 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf etwa 65ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf etwa 65ºC eingestellt ist, oder irgendeine der Sonden (13), (13bis), (13ter) oder (13quater) des Anspruchs 1 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf den Bereich von etwa 50ºC bis etwa 55ºC eingestellt ist, oder irgendeine der Sonden (18), (18bis), (18ter) oder (18quater) des Anspruchs 1 ist, wobei die Hybridisierungstemperatur geeignetermassen auf etwa 60ºC eingestellt ist, und/oder die Waschtemperatur auf etwa 60ºC eingestellt ist.

11. Kit zum in vitro-Nachweis von Neisseria-Stämmen in einer biologischen Probe, wobei das Kit umfasst:

mindestens eine Sonde, ausgewählt aus denjenigen gemäss Ansprüchen 1 bis 4;

den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind, um den Puffer herzustellen, der die Durchführung der Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs einer grossen Anzahl vorzugsweise sämtlicher Stämme von Neisseria ermöglicht;

wenn angemessen, Mittel zum Nachweisen der aus der vorhergehenden Hybridisierung stammenden Hybride.

12. Kit zum in vitro-Nachweis von Neisseria gonorrhoeae-Stämmen in einer biologischen Probe, wobei das Kit enthält:

mindestens eine im Hinblick auf N. gonorrhoeae spezifische Sonde, wie zuvor definiert, d.h. eine Sonde aus den Sonden (2), (2bis), (2ter), (2quater), (3), (3bis), (3ter), (3quater), (4), (4bis), (4ter), (4quater), (5), (5bis), (5ter), (5quater), (9), (9bis), (9ter), (9quater), (11), (11bis), (11ter), (11quater), (13), (13bis), (13ter), (13quater), (18), (18bis), (18ter) und (18quater) gemäss Ansprüchen 1 oder 2, oder bevorzugter eine Sonde aus irgendeiner der Sonden (1), (1bis), (1ter) oder (1quater) gemäss Anspruch 2;

den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind, um den Puffer herzustellen, der die Durchführung der Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs eines Stammes von Neisseria gonorrhoeae ermöglicht,

13. Verfahren zum Nachweisen von N. gonorrhoeae-Stämmen aus anderen Bakterienstämmen und insbesondere aus anderen Neisseria-Stämmen, wobei das Verfahren umfasst: Inberührungbringen der biologischen Probe, in der die Nucleinsäuren (DNA und RNAs), erforderlichenfalls unter geeigneten Denaturierungsbedingungen der Hybridisierung zugänglich gemacht worden sind, mit zwei Sonden gemäss irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, die im Hinblick auf Neisseria gonorrhoeae-Stämme spezifisch sind und dementsprechend nicht dazu geeignet sind, an die gleichen Nicht-Ziel-Stämme zu hybridisieren, und die insbesondere aus den folgenden Kombinationen ausgewählt sind:

Sonde der Gruppe 9 und irgendeine der Sonden der folgenden Gruppen: 1, 2, 3, 5 und 13;

Sonde der Gruppe 13 und irgendeine der Sonden der folgenden Gruppen: 1, 2, 3 und 5;

Sonde der Gruppe 18 und irgendeine der Sonden der folgenden Gruppen: 1, 2, 3, 5, 9 und 13;

Sonde der Gruppe 5 und irgendeine der Sonden der folgenden Gruppen: 1, 2 und 3;

und die bevorzugter aus den folgenden Kombinationen ausgewählt sind:

Sonde der Gruppe 9 und eine der Gruppe 5;

Sonde der Gruppe 18 und eine der Sonden der folgenden Gruppen: 5 und 9;

wann immer erforderlich, unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen, die so eingestellt sind, dass sie spezifische Hybridisierung mit komplementären Nucleinsäuren der Neisseria gonorrhoeae-Stämme, die in der Probe vorhanden sein können, jedoch nicht mit komplementärer DNA oder RNA anderer Neisseria-Arten ermöglichen, und Nachweisen der möglicherweise geformten Hybride.

14. Kit für Sandwich-Hybridisierungs-Assay für den in vitro- Nachweis von Neisseria gonorrhoeae-Stämmen in einer biologischen Probe, wobei das Kit enthält:

mindestens zwei für N. gonorrhoeae spezifische Sonden aus den folgenden Kombinationen:

Sonde der Gruppe 5 und irgendeine der Sonden der folgenden Gruppen: 1, 2 und 3;

und bevorzugter aus den folgenden Kombinationen:

Sonde der Gruppe 9 und eine der Gruppe 5;

Sonde der Gruppe 18 und eine der Sonden der folgenden Gruppen: 5 und 9;

den Puffer oder die Komponenten, die erforderlich sind, um den Puffer herzustellen, der die Durchführung der Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den DNAs und/oder RNAs eines Neisseria gonorrhoeae-Stammes ermöglicht,