JPH02203800A - ナイセリア菌株を検出するための交雑プローブ - Google Patents
ナイセリア菌株を検出するための交雑プローブInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、ナイセリア菌株及びナイセリア属及び関連す
る分類群に属する分離株を検出するための交雑プローブ
に関する。以下「菌株」という語は生物学的試料中に含
まれている生体又は分離株をも網羅する。
る分類群に属する分離株を検出するための交雑プローブ
に関する。以下「菌株」という語は生物学的試料中に含
まれている生体又は分離株をも網羅する。
〈従来の技術〉
これまで知られており、全ゲノムデオキシリボ核酸（Ｄ
ＮＡ） 、自生プラスミド、クローニングされたＤＮＡ
フラグメント（断片）又は合成オリゴヌクレオチドのい
ずれかでありうるプローブのほとんどは、検出されるべ
き生体のＤＮＡを標的とする。
ＮＡ） 、自生プラスミド、クローニングされたＤＮＡ
フラグメント（断片）又は合成オリゴヌクレオチドのい
ずれかでありうるプローブのほとんどは、検出されるべ
き生体のＤＮＡを標的とする。
ｒＲＮＡから誘導されたプローブを用いてリポソームリ
ボ核酸（ｒＲＮＡ）を標的にすることが、何度が提案さ
れてきた。リポソームリボ核酸を標的にすることは、リ
ポソームが細胞内にきわめて豊富にあることから、診断
テストの感度の増大につながる。
ボ核酸（ｒＲＮＡ）を標的にすることが、何度が提案さ
れてきた。リポソームリボ核酸を標的にすることは、リ
ポソームが細胞内にきわめて豊富にあることから、診断
テストの感度の増大につながる。
それでも反対に、ｒＲＮＡシストロンの中にみられる高
い配列保存度ひいてはｒＲＮＡにより誘導されたプロー
ブの特異性の欠如は、関係する分類群を選択するのにｒ
ＲＮＡにより誘導されたプローブを用いることに対する
障害となる重要な欠点である。実際、これまでに知られ
ているｒＲＮＡにより誘導されたプローブは、主として
レジオネラ（Ｗｉ １ｋｉｎｓｏｎ他、 １９８６年：
Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ、 １９８６年）又はシュード
モナス・フルオレッセンス類属（Ｆｅｓｔｌ他、１９８
６年）のような生体の広範なグループを検出するため又
はマイコプラズマ（Ｃｏｅｋｅｌ伯、 １９８７年）及
びクラミジア種ＩＰａ１ｍｅｒ他、 １９８６年）とい
った比較的遠い関係の種を互いに区別するために主とし
て用いられている。プロテウス・ブルガリスとプロテウ
ス・ミラビリスの識別について記した報告書もある（Ｈ
ａｎｎ及びＧｏｅｂｅｌ共著。
い配列保存度ひいてはｒＲＮＡにより誘導されたプロー
ブの特異性の欠如は、関係する分類群を選択するのにｒ
ＲＮＡにより誘導されたプローブを用いることに対する
障害となる重要な欠点である。実際、これまでに知られ
ているｒＲＮＡにより誘導されたプローブは、主として
レジオネラ（Ｗｉ １ｋｉｎｓｏｎ他、 １９８６年：
Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ、 １９８６年）又はシュード
モナス・フルオレッセンス類属（Ｆｅｓｔｌ他、１９８
６年）のような生体の広範なグループを検出するため又
はマイコプラズマ（Ｃｏｅｋｅｌ伯、 １９８７年）及
びクラミジア種ＩＰａ１ｍｅｒ他、 １９８６年）とい
った比較的遠い関係の種を互いに区別するために主とし
て用いられている。プロテウス・ブルガリスとプロテウ
ス・ミラビリスの識別について記した報告書もある（Ｈ
ａｎｎ及びＧｏｅｂｅｌ共著。
１９８７年）。両種共約５０％のＤＮＡ相同値を有する
。現在のところ、これが、サザンプロット分析法を用い
ることな（ｒＲＮＡ誘導のプローブを用いて達すること
のできる最高の特異性である。
。現在のところ、これが、サザンプロット分析法を用い
ることな（ｒＲＮＡ誘導のプローブを用いて達すること
のできる最高の特異性である。
従って、本発明の発明者によって発見されたように、高
い関連性をもつ細菌種同士のみならず亜種レベルで関係
する分類群同士をも単純な直接交雑方法を用いて識別す
ることのできる特異的ｒＤＮＡ誘導のプローブを作り出
すことができるというのは、予想外のことであった。特
に、ナイセリア・ゴル工菌株を、本書に記されているい
くつかのプローブでの・ドツト−スポット交雑検定を用
いて、ナイセリア・メニンシティディス菌株を含むその
他のナイセリア菌株から識別することができた。
い関連性をもつ細菌種同士のみならず亜種レベルで関係
する分類群同士をも単純な直接交雑方法を用いて識別す
ることのできる特異的ｒＤＮＡ誘導のプローブを作り出
すことができるというのは、予想外のことであった。特
に、ナイセリア・ゴル工菌株を、本書に記されているい
くつかのプローブでの・ドツト−スポット交雑検定を用
いて、ナイセリア・メニンシティディス菌株を含むその
他のナイセリア菌株から識別することができた。
く課題を解決するための方法〉
従って、本発明の１つの目的は、単数又は複数のナイセ
リア菌株を検出するためのｒＲＮＡに関係するプローブ
を提供することにある。
リア菌株を検出するためのｒＲＮＡに関係するプローブ
を提供することにある。
本発明のもう１つの目的は、ナイセリア・ゴル工菌株を
他の細菌株特にその他のナイセリア菌株及びナイセリア
・メニンシティディス菌株と識別するためのｒＲＮＡ関
係プローブを提供することにある。
他の細菌株特にその他のナイセリア菌株及びナイセリア
・メニンシティディス菌株と識別するためのｒＲＮＡ関
係プローブを提供することにある。
本発明のもう１つの目的は、サザンプロット分析法とい
った他のいかなる補足的分析にも頼ることなく、ドツト
スポット交雑試験といった単純な交雑試験により単数又
は複数のナイセリア菌株を検出するためのプローブを提
供することにある。
った他のいかなる補足的分析にも頼ることなく、ドツト
スポット交雑試験といった単純な交雑試験により単数又
は複数のナイセリア菌株を検出するためのプローブを提
供することにある。
本発明のさらにもう１つの目的は、単数又は複数のナイ
セリア菌株の試験管内診断のためのプローブ及び単純な
方法を提供することにある。
セリア菌株の試験管内診断のためのプローブ及び単純な
方法を提供することにある。
本書で用いられているｒｒＲＮＡ関係の」という話は、
該当するプローブが、それ自体ＤＮＡ又はＲＮＡのいず
れのフラグメントで形成されているか又それがクローニ
ングされたフラグメント（ＤＮＡの場合）又は合成オリ
ゴヌクレオチドのいずれで構成されているかにかかわら
ず、リポソームＲＮＡ内に通常存在する配列と交雑する
という事実を表わす。
該当するプローブが、それ自体ＤＮＡ又はＲＮＡのいず
れのフラグメントで形成されているか又それがクローニ
ングされたフラグメント（ＤＮＡの場合）又は合成オリ
ゴヌクレオチドのいずれで構成されているかにかかわら
ず、リポソームＲＮＡ内に通常存在する配列と交雑する
という事実を表わす。
本書で用いられている「ナイセリア」という語は、「ナ
イセリア」という名の細菌のみを表わすのではなく、「
ナイセリア」属に属する細菌と相互にきわめて関係の強
いキンゲラ（１（ｉｎｇｅ１１ａ）、エイケネラ（Ｅｉ
ｋｅｎｅ１１ａ） 、シモンシェラ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅ
１１ａ） 、アリシェラ（Ａｌｙｓｉｅ１１ａ）及びＣ
ＤＣ類属ＥＦ−４及びＭ−５のような名前のある又は名
前の無い分類群をも表わす、これらの分類群は、フラグ
メント（Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ１３１２Ｄの
リポソームＲＮＡに対して約６℃のＴｍ （ｅ）範囲内
で見られる。Ｔｍ（ｅ）は、Ｒｏｓｓａｕ、 Ｒ，、Ａ
、 Ｖａｎ Ｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ、 Ｖｌ。
イセリア」という名の細菌のみを表わすのではなく、「
ナイセリア」属に属する細菌と相互にきわめて関係の強
いキンゲラ（１（ｉｎｇｅ１１ａ）、エイケネラ（Ｅｉ
ｋｅｎｅ１１ａ） 、シモンシェラ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅ
１１ａ） 、アリシェラ（Ａｌｙｓｉｅ１１ａ）及びＣ
ＤＣ類属ＥＦ−４及びＭ−５のような名前のある又は名
前の無い分類群をも表わす、これらの分類群は、フラグ
メント（Ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ１３１２Ｄの
リポソームＲＮＡに対して約６℃のＴｍ （ｅ）範囲内
で見られる。Ｔｍ（ｅ）は、Ｒｏｓｓａｕ、 Ｒ，、Ａ
、 Ｖａｎ Ｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ、 Ｖｌ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、及びＪ、 Ｄｅ Ｌｅｙ共著（１９
８６年）の［ナイセリア科のリポソーム リボ核酸シス
トロンの居間及び翼内類似性Ｊ （Ｉｎｔ、 Ｊ、 ５
ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１３６、３２３−３３２）内
に定義されている。
８６年）の［ナイセリア科のリポソーム リボ核酸シス
トロンの居間及び翼内類似性Ｊ （Ｉｎｔ、 Ｊ、 ５
ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１３６、３２３−３３２）内
に定義されている。
指示されているデルタ Ｔｍ （ｅ） 範囲内に見
られない、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ ｃａｖｉａｅ、 Ｎｅ
１ｓｓｅｒｉａｃｕｎｉｃｕ１１、 Ｎｅ１ｓｓｅｒ
ｉａ ｏｖｉｓ、 Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａｃａｔａｒ
ｒｈａ１１ｓ （Ｂｒａｎ ｈａｍｅ１１ａ（Ｍｏｒ
ａｘｅ１１ａ）ｃａｔａｒｒｈａ１１ｓ）、 Ｋｉｎ
ｇｅ１１ａ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ及びＡｌｙｓｉｅ
１１ａ種などの誤った名をもつ細菌は、ナイセリア類属
には属していないということに留意されたい。
られない、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ ｃａｖｉａｅ、 Ｎｅ
１ｓｓｅｒｉａｃｕｎｉｃｕ１１、 Ｎｅ１ｓｓｅｒ
ｉａ ｏｖｉｓ、 Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａｃａｔａｒ
ｒｈａ１１ｓ （Ｂｒａｎ ｈａｍｅ１１ａ（Ｍｏｒ
ａｘｅ１１ａ）ｃａｔａｒｒｈａ１１ｓ）、 Ｋｉｎ
ｇｅ１１ａ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ及びＡｌｙｓｉｅ
１１ａ種などの誤った名をもつ細菌は、ナイセリア類属
には属していないということに留意されたい。
単数又は複数のナイセリア菌株を検出するための本発明
に基づく交雑プローブは、以下のものを含んでいる： 以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列 グループ４ ＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＴＡＴＴ
ＧＧＣＡ＾Ｃ＾入入入ＧＴＣＣ ＣＡＡＡＡＧＵｅＣ （４ｂｉｓ） ＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＡＣＧＯＴＡＣＣ（４
ｔ６ｒ） ＧＧＩＪＡＣＣＧＩＪＣＡｔＪＣＧＧＣＣＧＣＣＧ＾Ｕ
ＡＵＵＧＧＣＡ＾ＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧ＾＾ （４ｑｕａｔａｒ） グループ５ グループ６ ＡＴＡｌ’ＣＧ’ｒＧＧＴ グループ７ グループ８ ＡＣＣＣＴＡＣＣＴＪＬＣＴＴＣＴＧＧＴＡＴＣＣＣＣ
ＣＡＣ（６ｑｕａｔａｒ） グループ９ ｔ１１ｊＡＧＣｔｌＧＵＩＪＧＧＧＣＡＡＣ（Ｊ（ｊＧ
ＡＵＵＧｃＵＵ（１１ＧＬＩＡＧｃＧＵ（５ｑｕａｔａ
ｚ） グループ１０ グループ１５ グループ１１ 丁ＴＴＣＧＴＡＣＧＣＴＴＡＧ’ｒＡＣＣＧＣＴＯＴ’
ｒＯＡＧＡｏｕｕｃａυ＾ＣＧＣＩＪＵＡＧＵＡＣＣＧ
ＣＵＧＵＵＧＡＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＴ
ＡＡＧＣＯＴ＾ＣＧ入入ＡＵＣｔｌＣＡＡＣＡＧＣＧＧ
ＵＡＣＵＡＡＧＣ（ｉＵＡｃＯＡＡＡグループ１６ ＧＴＣＧＴＡＴＣＧＧＴＴＧＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴ
ＡＧＡＣ入ＧＩＪＧＧｔｌ＾ （１５ｂｉｓ） （１５ｔａｔ） （１５ｑｕａｔａｒ） （１６ｂｉｓ） グループ１２ ｋＣｋ グループ１３ ＴＧＣ グループ１４ ＴＣＴＣＧＡＣＡＧＴ？Ａ〒ＴＡＣＧ１’ＡＣＡｔｌＣ
ＵＣＧＡＣＡＧＵＵＡｔｌＵＡＣＯｔｌＡＣＡテＧ丁Ａ
ＣＧＴＡＡ’ｌ’ＡＡＣＴＧＴＣＧＡＯ＾ｔＪＯＵＡＣ
ＧｔｌＡＡＩＪＡＡＣＯＱＵＣＧＡＧＡ（１２ｂｉｓ） （１２ｔａｒ） （１２ｑｕａｔｓｒ） （１３ｂｉｓ） Ｃ１４】 （１４ｂ１１） （１４ｔａｒ） （１４ｑｕａｔ＠ｒ） グループ１７ ＡＡＧＣＴＡ Ａ
ＡＡＡＧＣＵＡＵＵＣＣＡＡＣＡＧＣｔｌＵＧＣＣＡＡ
ＣＣＵＡＡ丁丁
ＴＡＧＣＴＴ１１（Ｊ
ＡＧＣＵＵグループ１８ ＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＧＣＣ＾＾ＣＣＡ
ＧＣＴｕａａｕａａａｃｃｕｏｕＡｃｃｃｃｃｃｃｘＡ
ｃｃｘａｃｕＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡ ＧＧＣＣＣ＾ＣＣ＾ （１７ｂｉｇ） （１７七５ｒ） （１７ｑｕａｔｅｒ） （１Ｂ） （１８ｂｉｓ） （１８ｔｅｒ） （１１３ｑｕａｔｅｒ） （なおここにおいて、それぞれの文字は以下のようなヌ
クレオチドを意味する： Ａ：アデニル残基 Ｃ：シチジル残基 Ｇ：グアニジル残基 Ｔ：チミジル残基 Ｕ：ウラシル残基 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による、 先行する配列（４）から（１８）までのいずれとも異な
る変形配列、 （ただし、前記いずれの状況の下でもなお、かかるプロ
ーブは相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的
と交雑する）。
に基づく交雑プローブは、以下のものを含んでいる： 以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列 グループ４ ＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＴＡＴＴ
ＧＧＣＡ＾Ｃ＾入入入ＧＴＣＣ ＣＡＡＡＡＧＵｅＣ （４ｂｉｓ） ＴＡＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＡＣＧＯＴＡＣＣ（４
ｔ６ｒ） ＧＧＩＪＡＣＣＧＩＪＣＡｔＪＣＧＧＣＣＧＣＣＧ＾Ｕ
ＡＵＵＧＧＣＡ＾ＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧ＾＾ （４ｑｕａｔａｒ） グループ５ グループ６ ＡＴＡｌ’ＣＧ’ｒＧＧＴ グループ７ グループ８ ＡＣＣＣＴＡＣＣＴＪＬＣＴＴＣＴＧＧＴＡＴＣＣＣＣ
ＣＡＣ（６ｑｕａｔａｒ） グループ９ ｔ１１ｊＡＧＣｔｌＧＵＩＪＧＧＧＣＡＡＣ（Ｊ（ｊＧ
ＡＵＵＧｃＵＵ（１１ＧＬＩＡＧｃＧＵ（５ｑｕａｔａ
ｚ） グループ１０ グループ１５ グループ１１ 丁ＴＴＣＧＴＡＣＧＣＴＴＡＧ’ｒＡＣＣＧＣＴＯＴ’
ｒＯＡＧＡｏｕｕｃａυ＾ＣＧＣＩＪＵＡＧＵＡＣＣＧ
ＣＵＧＵＵＧＡＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＣＴ
ＡＡＧＣＯＴ＾ＣＧ入入ＡＵＣｔｌＣＡＡＣＡＧＣＧＧ
ＵＡＣＵＡＡＧＣ（ｉＵＡｃＯＡＡＡグループ１６ ＧＴＣＧＴＡＴＣＧＧＴＴＧＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴ
ＡＧＡＣ入ＧＩＪＧＧｔｌ＾ （１５ｂｉｓ） （１５ｔａｔ） （１５ｑｕａｔａｒ） （１６ｂｉｓ） グループ１２ ｋＣｋ グループ１３ ＴＧＣ グループ１４ ＴＣＴＣＧＡＣＡＧＴ？Ａ〒ＴＡＣＧ１’ＡＣＡｔｌＣ
ＵＣＧＡＣＡＧＵＵＡｔｌＵＡＣＯｔｌＡＣＡテＧ丁Ａ
ＣＧＴＡＡ’ｌ’ＡＡＣＴＧＴＣＧＡＯ＾ｔＪＯＵＡＣ
ＧｔｌＡＡＩＪＡＡＣＯＱＵＣＧＡＧＡ（１２ｂｉｓ） （１２ｔａｒ） （１２ｑｕａｔｓｒ） （１３ｂｉｓ） Ｃ１４】 （１４ｂ１１） （１４ｔａｒ） （１４ｑｕａｔ＠ｒ） グループ１７ ＡＡＧＣＴＡ Ａ
ＡＡＡＧＣＵＡＵＵＣＣＡＡＣＡＧＣｔｌＵＧＣＣＡＡ
ＣＣＵＡＡ丁丁
ＴＡＧＣＴＴ１１（Ｊ
ＡＧＣＵＵグループ１８ ＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＧＣＣ＾＾ＣＣＡ
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クレオチドを意味する： Ａ：アデニル残基 Ｃ：シチジル残基 Ｇ：グアニジル残基 Ｔ：チミジル残基 Ｕ：ウラシル残基 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による、 先行する配列（４）から（１８）までのいずれとも異な
る変形配列、 （ただし、前記いずれの状況の下でもなお、かかるプロ
ーブは相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的
と交雑する）。
「標的」という表現は、前述のグループ（４）から（１
８）までの配列のいずれかに対し相補的な配列を意味す
る。なお、本発明に基づくプローブに前述の配列の片側
又は両側に核酸の延長が含まれる場合（例えばクローニ
ングベクターの核酸フラグメント又は、このクローニン
グベクターからのこのプローブの開裂の結果として生じ
るリンカ−フラグメント）、このような延長は、それら
自体、以下に規定するような本発明に基づく方法により
テストされる可能性のあるいずれかの微生物のＤＮＡ内
で上述の標的の外のその他の相応する相補足核酸配列し
うる可能性を避けるように選択されるべきである。かか
る交雑は、寄生的性質のものでプローブの特異性を低下
させる。
８）までの配列のいずれかに対し相補的な配列を意味す
る。なお、本発明に基づくプローブに前述の配列の片側
又は両側に核酸の延長が含まれる場合（例えばクローニ
ングベクターの核酸フラグメント又は、このクローニン
グベクターからのこのプローブの開裂の結果として生じ
るリンカ−フラグメント）、このような延長は、それら
自体、以下に規定するような本発明に基づく方法により
テストされる可能性のあるいずれかの微生物のＤＮＡ内
で上述の標的の外のその他の相応する相補足核酸配列し
うる可能性を避けるように選択されるべきである。かか
る交雑は、寄生的性質のものでプローブの特異性を低下
させる。
好ましいプローブは、（４）〜（１８）の配列のいずれ
かで形成された核酸フラグメントから成り、かかるフラ
グメントには、関連する核酸酉ｄ列の１０個から最大数
までのヌクレオチドが含まれている。
かで形成された核酸フラグメントから成り、かかるフラ
グメントには、関連する核酸酉ｄ列の１０個から最大数
までのヌクレオチドが含まれている。
上述のヌクレオチド配列において（そして以下言及され
ている他のヌクレオチド配列において）、式の左端はつ
ねに関係する配列の５′末端に相当し、右端はその３′
末端に相当する。
ている他のヌクレオチド配列において）、式の左端はつ
ねに関係する配列の５′末端に相当し、右端はその３′
末端に相当する。
ここで「グループ゛Ｘ”のプローブＪ （” Ｘ ”は
ｌから１０まで）を参照すると、かかるプローブは、上
述の又は以下に記されているグループに属する核酸の１
つの中に含まれている配列を有することがわかる。
ｌから１０まで）を参照すると、かかるプローブは、上
述の又は以下に記されているグループに属する核酸の１
つの中に含まれている配列を有することがわかる。
同様に、本書に用いられている「ヌクレオチド」という
語は、ここでは、相反する規定の無いかぎり、リボヌク
レオチド及びデオキシリボヌクレオチドそしてイノシン
のような変更されたヌクレオチドのことを区別熱（表わ
しているということがわかる。「ヌクレオチド」という
表現も、その交雑能力に影響を与えない化学修飾基とい
った修飾基を含むものも網羅している。かかる修飾基は
例えば、直接的又は間接的に適切なマーカーつまり標識
との結合を容易にしその後特に関連するｒＲＮＡ又はＤ
ＮＡ鎖との交雑生成物例えば他のＤＮＡ及び／又はＲＮ
Ａと共に生物学的試料の中に当初台まれていたものとの
交雑生成物においてこのように標識づけされたプローブ
を検出することをその目的としている。
語は、ここでは、相反する規定の無いかぎり、リボヌク
レオチド及びデオキシリボヌクレオチドそしてイノシン
のような変更されたヌクレオチドのことを区別熱（表わ
しているということがわかる。「ヌクレオチド」という
表現も、その交雑能力に影響を与えない化学修飾基とい
った修飾基を含むものも網羅している。かかる修飾基は
例えば、直接的又は間接的に適切なマーカーつまり標識
との結合を容易にしその後特に関連するｒＲＮＡ又はＤ
ＮＡ鎖との交雑生成物例えば他のＤＮＡ及び／又はＲＮ
Ａと共に生物学的試料の中に当初台まれていたものとの
交雑生成物においてこのように標識づけされたプローブ
を検出することをその目的としている。
例えば、かかる修飾基は、それ自体適切な酵素又はけい
光又は化学発光標識を有するその他の抗体により特異的
に認識されうる抗体によって認識されうる。考えられる
標識づけ手順が本書の後の部分において例示されている
。
光又は化学発光標識を有するその他の抗体により特異的
に認識されうる抗体によって認識されうる。考えられる
標識づけ手順が本書の後の部分において例示されている
。
本発明は又、上述の配列のうちのいずれかを有し、その
ヌクレオチドが異なるものであるようなプローブ（ただ
し異なるヌクレオチドが上述のプローブの特異性を変え
ることはない）にも関する。プローブの中には、上述の
グループ４から１０までのいずれかに属する核酸の１つ
又はその一部分で構成されているものもある。ただしか
かるプローブは、それが以下に論述するようなナイセリ
アの遺伝形質とのこのプローブの特異性を変えることが
ないかぎりにおいて、そのいずれかの側にヌクレオチド
延長を含んでいる。
ヌクレオチドが異なるものであるようなプローブ（ただ
し異なるヌクレオチドが上述のプローブの特異性を変え
ることはない）にも関する。プローブの中には、上述の
グループ４から１０までのいずれかに属する核酸の１つ
又はその一部分で構成されているものもある。ただしか
かるプローブは、それが以下に論述するようなナイセリ
アの遺伝形質とのこのプローブの特異性を変えることが
ないかぎりにおいて、そのいずれかの側にヌクレオチド
延長を含んでいる。
これらのプローブの大部分は、全てのナイセリアとはい
わないまでも多数のナイセリアと交雑されうる。しかし
ながら、グループ４．５．９゜１１．１３及び１８のプ
ローブは、ナイセリア・ゴル工菌株のＲＮＡ又はＤＮＡ
の相応する領域とより選択的に（又場合によっては制御
された交雑条件の下で）交雑し、その他のナイセリア菌
株とは交雑しない。
わないまでも多数のナイセリアと交雑されうる。しかし
ながら、グループ４．５．９゜１１．１３及び１８のプ
ローブは、ナイセリア・ゴル工菌株のＲＮＡ又はＤＮＡ
の相応する領域とより選択的に（又場合によっては制御
された交雑条件の下で）交雑し、その他のナイセリア菌
株とは交雑しない。
このことは特にグループ４のプローブから選択されたサ
ブグループにあてはまる。このサブグループは以下全体
的にグループｌから３と呼ばれ、かかるグループの各々
はさらに特異的なプローブを含み（それでもなお通常少
なくとも１０個のヌクレオチドを含む）、そのプローブ
には以下のものが含まれる： 以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列ニ グループ１： ＡＡＧＧＣｔＪＧＵｔｊＧＣＣＡ入ｕｉｕｃａｃｃａｃ
ｃｃｃ入（１ｑｕａｔｅｒ） グループ２ニ グループ３： 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による。
ブグループにあてはまる。このサブグループは以下全体
的にグループｌから３と呼ばれ、かかるグループの各々
はさらに特異的なプローブを含み（それでもなお通常少
なくとも１０個のヌクレオチドを含む）、そのプローブ
には以下のものが含まれる： 以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列ニ グループ１： ＡＡＧＧＣｔＪＧＵｔｊＧＣＣＡ入ｕｉｕｃａｃｃａｃ
ｃｃｃ入（１ｑｕａｔｅｒ） グループ２ニ グループ３： 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による。
先行する配列（１）から（３）までのいずれとも異なる
変形配列。
変形配列。
（ただし、前記いずれの状況の下でもなおかかるプロー
ブは相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的と
交雑する。） このように本発明は、場合によってヌクレオチド配列に
おいていくつかの細かい差異はあるもののほとんどのナ
イセリア菌株のｒＲＮＡ内に含まれている配列のヌクレ
オチド配列に関するレプリカ（ｒｔｅｒＪ又はｒｑｕａ
ｔｅｒＪが後に続いている数字で表わされているもの）
であるか、或いは又、ナイセリア菌株の天然ＲＮＡ内に
含まれている配列に対して相補的な（何もつかない数字
又はｒｂｉｓＪがついている数字により表わされている
）配列で形成されているようなプローブを提供する。
ブは相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的と
交雑する。） このように本発明は、場合によってヌクレオチド配列に
おいていくつかの細かい差異はあるもののほとんどのナ
イセリア菌株のｒＲＮＡ内に含まれている配列のヌクレ
オチド配列に関するレプリカ（ｒｔｅｒＪ又はｒｑｕａ
ｔｅｒＪが後に続いている数字で表わされているもの）
であるか、或いは又、ナイセリア菌株の天然ＲＮＡ内に
含まれている配列に対して相補的な（何もつかない数字
又はｒｂｉｓＪがついている数字により表わされている
）配列で形成されているようなプローブを提供する。
さらに限定的に言うと、関係するｒＲＮＡ内の標的配列
は、ナイセリア菌株間の天然のわずかな差異はあるもの
の、全てのとは言わないまでもほとんどのナイセリア菌
株に存在する以下の連続的配列のいずれかから成り、こ
のため、このような自然の差異がかかる標的についての
本発明に基づくプローブの交雑特異性に影響を与えるこ
とは考えられないということがわかる： （５’）ＡＡＧＧＣｏＧｔＪＵＧＣｌ：ＡＡＩＪＡＩＪ
ＣＧＧＣＯＧＣＣＧＡ （３’） （Ｉ
ｑｕａｔａｒ）（５自）
ＵＡＵＣＣｉＧＣ
ＧＧＣＣＧ＆ （３’） （２ｑｕａｔａｒ）（５
’ ）
ＵＡＵＣＧＧＣＧＧＣＣＯＡＵＧＡＣＧＧＵＡＣ
Ｃ（３’ ）（３ｑｕａｔａｔ） ＧＧＣＵＧＵＵＧＣＣＡＡｔｊＡＩＪＣＧＧＣＧＧＣＣ
ＧＡＵＧＡＣＧＧＵＡＣＣ（５“）（３・） （４ｑｕａｔａｒ） （５’） Ｕ［１Ｍ：ＣＵ（ｉＵＩＪＧＧＯＣＡＡＣ
ＵＵＧＡＵＵＧＣＵＵＧＧＩＪＡＧＣＧＵ （３’）
（Ｓｑｕａｔｅｒ）３ＵＧＧＧＧＧＡυＡ
ＣＣＡＧＡＡＧＵＡＧＧＵＡＧＧＧＵＡＡＣＣＧＣＡＡ
ＧＧＡＧＵＣＣＧＣＵＵＡＣＣＡＣＧＧＵＡＵ（５°）
（３・）（６ｑｕａｔｅｒ） ５’） ＵＣＧ
ＧＡＣＩｊＧＡ （３’）
（７ｑｕａｔｅｒ）５’） ＡＣＣＵＡＧＧｔＪＣ
ＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＩＪＣＧＧＡＣＵＧＡ （３’
） （８ｑｕａｔｅｚ）５噛）
（コ’） （９ｑ
ｕａｔｅｒ）５’ ）
（３’ ）（１０ｑｕａｔｅｒ
）５’） Ｏ（’Ｃ０ＧＧ（ｉＡＧｃｌＸ：ＧＣＡＡ
ｔＪ入＾＾ａＣＯ＾υＧＡＩＪｔＪＣＣＧｅ （３’
） （１１ｑｕａ七ｓｒ）”’
（３’）
（１２ｑｕａｔａｒ）５′）
（コ’）
（１３ｑｕａｔａｒ）５’）
ｔｌＧＯＡＣＧＵＡＡＵＡＡＣＵＧＵＣＧＡＧＡ （
３１１（１４ｑｕａｔａｒ）ｓ’）ｏｃｏｃ＾＾ｃｋａ
ｃａａｔ＋ｘｃυ＾入ＧＣＯＵＡＣＧＡ＾＾ （３’）
（１５ｑｕａｔｅｒ）５’）
ＵＧＩＪＣＬＩＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡ＾０ＣＡＡＣＣＧ
ＡＬＩＡＣＣＡＣ（３’） （１６ｑｕａｔ
ｅｒ）５’）
（３’） （１７ｑｕａｔ＠ｒ）５’）
ＣＣＡ （３’
） （１８ｑｕａｔａｒ）さまざまなプロ
ーブのヌクレオチド配列［又は（８ｑｕａｔｅｒ）、
（９ｑｕａｔｅｒ）、 （１０ｑｕａｔｅｒ）について
は関係するｒＲＮＡ配列］相互の交雑能力の差異は、そ
れを含むと思われる生物学的試料内のナイセリア菌株（
ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイ
セリア・サブフラバ、ナイセリア・フラベツセンス、ナ
イセリア・エロンガータなど）の検出及び識別に関して
グループ（４）〜（１８）の配列の選択性を確実なもの
にししかもそれらをその他の分類群と区別するのに十分
なほど小さいものである。しかしながら、グループ（４
）内でも（又グループ３．２及びｌにおいてはさらにそ
うであるのだが）ならびにグループ５．９，１１．１３
内でも、これらの差異は、場合によってはさほど厳しく
ない交雑条件下でさえ（これについては後にさらに精密
に述べられている）又例えばホ乳動物特にヒトからとっ
た試料などの調査中の試料の中に存在するその他のＤＮ
Ａ又はＲＮＡがある状態で、ナイセリア・ゴル工は菌株
をその他のナイセリア菌株から識別できるほど充分大き
いものとなっている。後に述べるように、必要とあらば
交雑条件及びそれに続く形成された雑種の洗浄条件を適
切に調整する時点でドツト・スポット方法を用いて交雑
を行なうことも可能である。
は、ナイセリア菌株間の天然のわずかな差異はあるもの
の、全てのとは言わないまでもほとんどのナイセリア菌
株に存在する以下の連続的配列のいずれかから成り、こ
のため、このような自然の差異がかかる標的についての
本発明に基づくプローブの交雑特異性に影響を与えるこ
とは考えられないということがわかる： （５’）ＡＡＧＧＣｏＧｔＪＵＧＣｌ：ＡＡＩＪＡＩＪ
ＣＧＧＣＯＧＣＣＧＡ （３’） （Ｉ
ｑｕａｔａｒ）（５自）
ＵＡＵＣＣｉＧＣ
ＧＧＣＣＧ＆ （３’） （２ｑｕａｔａｒ）（５
’ ）
ＵＡＵＣＧＧＣＧＧＣＣＯＡＵＧＡＣＧＧＵＡＣ
Ｃ（３’ ）（３ｑｕａｔａｔ） ＧＧＣＵＧＵＵＧＣＣＡＡｔｊＡＩＪＣＧＧＣＧＧＣＣ
ＧＡＵＧＡＣＧＧＵＡＣＣ（５“）（３・） （４ｑｕａｔａｒ） （５’） Ｕ［１Ｍ：ＣＵ（ｉＵＩＪＧＧＯＣＡＡＣ
ＵＵＧＡＵＵＧＣＵＵＧＧＩＪＡＧＣＧＵ （３’）
（Ｓｑｕａｔｅｒ）３ＵＧＧＧＧＧＡυＡ
ＣＣＡＧＡＡＧＵＡＧＧＵＡＧＧＧＵＡＡＣＣＧＣＡＡ
ＧＧＡＧＵＣＣＧＣＵＵＡＣＣＡＣＧＧＵＡＵ（５°）
（３・）（６ｑｕａｔｅｒ） ５’） ＵＣＧ
ＧＡＣＩｊＧＡ （３’）
（７ｑｕａｔｅｒ）５’） ＡＣＣＵＡＧＧｔＪＣ
ＣＧＧＵＣＧＧＡＡＡＩＪＣＧＧＡＣＵＧＡ （３’
） （８ｑｕａｔｅｚ）５噛）
（コ’） （９ｑ
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）５’） Ｏ（’Ｃ０ＧＧ（ｉＡＧｃｌＸ：ＧＣＡＡ
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） （１１ｑｕａ七ｓｒ）”’
（３’）
（１２ｑｕａｔａｒ）５′）
（コ’）
（１３ｑｕａｔａｒ）５’）
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３１１（１４ｑｕａｔａｒ）ｓ’）ｏｃｏｃ＾＾ｃｋａ
ｃａａｔ＋ｘｃυ＾入ＧＣＯＵＡＣＧＡ＾＾ （３’）
（１５ｑｕａｔｅｒ）５’）
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ＡＬＩＡＣＣＡＣ（３’） （１６ｑｕａｔ
ｅｒ）５’）
（３’） （１７ｑｕａｔ＠ｒ）５’）
ＣＣＡ （３’
） （１８ｑｕａｔａｒ）さまざまなプロ
ーブのヌクレオチド配列［又は（８ｑｕａｔｅｒ）、
（９ｑｕａｔｅｒ）、 （１０ｑｕａｔｅｒ）について
は関係するｒＲＮＡ配列］相互の交雑能力の差異は、そ
れを含むと思われる生物学的試料内のナイセリア菌株（
ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイ
セリア・サブフラバ、ナイセリア・フラベツセンス、ナ
イセリア・エロンガータなど）の検出及び識別に関して
グループ（４）〜（１８）の配列の選択性を確実なもの
にししかもそれらをその他の分類群と区別するのに十分
なほど小さいものである。しかしながら、グループ（４
）内でも（又グループ３．２及びｌにおいてはさらにそ
うであるのだが）ならびにグループ５．９，１１．１３
内でも、これらの差異は、場合によってはさほど厳しく
ない交雑条件下でさえ（これについては後にさらに精密
に述べられている）又例えばホ乳動物特にヒトからとっ
た試料などの調査中の試料の中に存在するその他のＤＮ
Ａ又はＲＮＡがある状態で、ナイセリア・ゴル工は菌株
をその他のナイセリア菌株から識別できるほど充分大き
いものとなっている。後に述べるように、必要とあらば
交雑条件及びそれに続く形成された雑種の洗浄条件を適
切に調整する時点でドツト・スポット方法を用いて交雑
を行なうことも可能である。
上述の特異性は、それがティセリア分類群に対するもの
であれ、ナイセリア・ゴル工亜分類群（サブタクソン）
に対するものであれ、使用されるプローブ内のヌクレオ
チドの数が１０未満に低下したとき失われてしまうとい
うことがわかるだろう。それでも特にグループ１．２，
３．４５．９．１１．１３及び１８において、最高の結
果は、ヌクレオチドの数が大きい数を超えて（関係する
配列の最大炎によりグループ４から１８において定めら
れている最大数を念頭に置いて）大きくならない場合に
得られる。ナイセリア・ゴル工菌株とその他のナイセリ
ア菌株の選択的識別のために最も好ましいプローブは、
１５から２７のヌクレオチドを含む配列を有し、かかる
配列はグループｌの配列のいずれにも全て含まれている
。ナイセリア・ゴル工菌株に対する選択性は、なおさら
に厳しく交雑条件及び洗浄条件を調整しなければならな
いものの、グループｌと２又は３の相応する核酸の領域
と重なり合う配列をもつ（又はグループ２又は３のみの
核酸に属する配列内に特異的に含まれている配列を持つ
）（又はグループ３のみの核酸に含まれている配列内に
特異的に含まれている配列をもつ）プローブについては
なお保持される。
であれ、ナイセリア・ゴル工亜分類群（サブタクソン）
に対するものであれ、使用されるプローブ内のヌクレオ
チドの数が１０未満に低下したとき失われてしまうとい
うことがわかるだろう。それでも特にグループ１．２，
３．４５．９．１１．１３及び１８において、最高の結
果は、ヌクレオチドの数が大きい数を超えて（関係する
配列の最大炎によりグループ４から１８において定めら
れている最大数を念頭に置いて）大きくならない場合に
得られる。ナイセリア・ゴル工菌株とその他のナイセリ
ア菌株の選択的識別のために最も好ましいプローブは、
１５から２７のヌクレオチドを含む配列を有し、かかる
配列はグループｌの配列のいずれにも全て含まれている
。ナイセリア・ゴル工菌株に対する選択性は、なおさら
に厳しく交雑条件及び洗浄条件を調整しなければならな
いものの、グループｌと２又は３の相応する核酸の領域
と重なり合う配列をもつ（又はグループ２又は３のみの
核酸に属する配列内に特異的に含まれている配列を持つ
）（又はグループ３のみの核酸に含まれている配列内に
特異的に含まれている配列をもつ）プローブについては
なお保持される。
好ましいプローブは、前記ＲＮＡ及び相応するＤＮＡの
両方と交雑するため、当該天然ｒ ＲＮＡに対し相補性
であるようなプローブである。
両方と交雑するため、当該天然ｒ ＲＮＡに対し相補性
であるようなプローブである。
それでも、このｒＲＮＡ内に含まれている配列をもつ従
って関連する天然ＤＮＡとのみ交雑し前述のものに比べ
感度が低いプローブも、同様に本発明の一部である。
って関連する天然ＤＮＡとのみ交雑し前述のものに比べ
感度が低いプローブも、同様に本発明の一部である。
本発明に基づくプローブのその他のグループは、必要と
あらば交雑条件及び形成された雑種の洗浄条件の適切な
調整の下で、ナイセリア菌株に対して特異性をもつプロ
ーブにより構成され、なお全体的に考えると（上述のよ
うに）、上に規定されているようにグループ６．７．８
，１０゜１２．１４．１６及び１７から成る。
あらば交雑条件及び形成された雑種の洗浄条件の適切な
調整の下で、ナイセリア菌株に対して特異性をもつプロ
ーブにより構成され、なお全体的に考えると（上述のよ
うに）、上に規定されているようにグループ６．７．８
，１０゜１２．１４．１６及び１７から成る。
本発明に基づ（プローブは、相応するヌクレオチド配列
を含むインサートを含む組換え型プラスミドのクローニ
ングによって、必要とあらば、適当なヌクレアーゼ（核
酸分解酵素）を用いた時点でクローニングされたプラス
ミドからこのヌクレオチド配列をへき関させ、分子量に
応じての分別によりそれらを回収することによって、形
成することができる。
を含むインサートを含む組換え型プラスミドのクローニ
ングによって、必要とあらば、適当なヌクレアーゼ（核
酸分解酵素）を用いた時点でクローニングされたプラス
ミドからこのヌクレオチド配列をへき関させ、分子量に
応じての分別によりそれらを回収することによって、形
成することができる。
本発明に従ったプローブは又、例えば従来のホスホトリ
エステル方法によって化学的にも合成可能である。
エステル方法によって化学的にも合成可能である。
上述の変形態様の中には、場合によって交雑媒質又は洗
浄媒質又はその両方が以下に記すものである場合、以下
に規定される配列のうちの１つ又は相応する相補性配列
を標的とする、単数又は複数のナイセリア菌株を検出す
るための交雑プローブが含まれている： 交緒媒質：約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣ
ｊｌ！、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，
０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液、２０％の脱イオン
ホルムアミド、０．０２％のフィコール、０．０２％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニルピロリド
ンそして約０．１ｍｇ／−のせん断され変性されたサケ
精子ＤＮＡを含んでいる。
浄媒質又はその両方が以下に記すものである場合、以下
に規定される配列のうちの１つ又は相応する相補性配列
を標的とする、単数又は複数のナイセリア菌株を検出す
るための交雑プローブが含まれている： 交緒媒質：約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣ
ｊｌ！、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，
０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液、２０％の脱イオン
ホルムアミド、０．０２％のフィコール、０．０２％の
ウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニルピロリド
ンそして約０．１ｍｇ／−のせん断され変性されたサケ
精子ＤＮＡを含んでいる。
洗浄媒質：約３×ＳＳＣ１２５ｎ＋ＬＩのリン酸塩緩衝
液ｐｌｔ７．）、及び２０％の脱イオンホルムアミドを
含んでいる。
液ｐｌｔ７．）、及び２０％の脱イオンホルムアミドを
含んでいる。
なおここで、前記標的配列及び相応する関連交雑温度（
ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）はそれぞれ以下のとおりで
ある： 入ＡＧＧＣＵＧＵＵＧＣＣＡＡＵＡＵＣＧＧＣＧＧＣＣ
Ｇ＾ＨＴ及び／又はＷＴ；約５５℃ ｔｌＡＬｌｃＧＧｃＧＧｃｃＯＡ ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ ＵＡｔＪＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＵＧＡＣＧＧｔｌＡＣＣ
ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ ＣＡ ＵＡＵＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡｔｌＧＡＣ（ｉＧＵＡｃｃ
ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ ｏｔ＋ｘａｃｕａｕｕａａａｃｘＡｃｔｙｕａＡｕｏａ
ｃｕｕａａｕＡａｃａｕＨＴ及び／又はＷＴ：約り５℃
〜約６０℃ＧＯＧＯＧＧＧＡＵＡＣＣＡＧＡＡＧｔｆＡ
ＧＧＯＡＣＣＡＣＯＧＵＡυ ＨＴ及び／又はＷＴ：約り５℃〜約７０℃Ａ（ＣＵＡＧ
ＧＵＣＣＧＧＣＧＧＡＡＡＵＣＧＧＡｅＵＧＡＨＴ及び
／又はＷＴ：約５５℃ ＣＣＤ Ｆ（Ｔ及び／又はＷＴ：約り５℃〜約６０℃ＣＡＧＣＡ Ｆ（Ｔ及び／又はＷＴｚ約５５り〜約６０°Ｃｔ）Ａｔ
）ＧＣＣＣｔｌＣｌ）ＡＡＧＧｔ）ｔ）入＾ＧＧＪｌＩ
Ｃ１ｌＬＩＧＣυＣＣＧＵＡＡＧＣＣＣＣＧＨＴ及び／
又はＷＴ：約り０℃〜約６５℃ＧＣＧＯＯＧＧＡＧＣＵ
ＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＣＵＡＵＧＡＵｔｊＣＣＧＣＨＴ
及び／又はＷＴ：約５５℃ ＧＵＵＣｌｊＧＡＡＣｔ）ＧＧＧＵＧＡＣＵＣＧＡＧυ
ａｕａｕｃＨＴ及び／又はＷＴ；約り５℃〜約６０℃Ｇ
ＣＡＵＡＣ（ｉＵｃＵＵＧＡＧＡＧＧＧ＾入ＡＧＣ入Ｈ
Ｔ及び／又はＷＴ：約４５℃ ｔＴＧＵＡｃＧｔｊＡＡＵＡＡｃｔ）Ｇ（ＪＣＧＡＧＡ
）ＩＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約４５℃υＣｕＣｋ
ｋＣｋＧＣＧＧｕｋＣｕｋｋＧＣＣｍＣＧｋｋｋＨＴ及
び／又はＷＴ：約５０℃〜約５５℃ＵＧＵＣＵＡＣＧＧ
ＡＣＡＣＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＡＵＡＣＣＡＣＨＴ及び
／又はＷＴ：約り０℃〜約６０℃ｕｘａｃｕｕ ＨＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約５５℃ＡＧＣＩＪＧ
ＧｔｌＵＧＧＣＧＧＧＧＵＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＨ
Ｔ及び／又はＷＴ；約４５℃ 示されている温度は上述の条件の下でのみ有効であると
いうことを強調しておきたい、その他の交雑媒質又は洗
浄媒質も同様に使用可能である。
ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）はそれぞれ以下のとおりで
ある： 入ＡＧＧＣＵＧＵＵＧＣＣＡＡＵＡＵＣＧＧＣＧＧＣＣ
Ｇ＾ＨＴ及び／又はＷＴ；約５５℃ ｔｌＡＬｌｃＧＧｃＧＧｃｃＯＡ ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ ＵＡｔＪＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＵＧＡＣＧＧｔｌＡＣＣ
ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ ＣＡ ＵＡＵＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡｔｌＧＡＣ（ｉＧＵＡｃｃ
ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ ｏｔ＋ｘａｃｕａｕｕａａａｃｘＡｃｔｙｕａＡｕｏａ
ｃｕｕａａｕＡａｃａｕＨＴ及び／又はＷＴ：約り５℃
〜約６０℃ＧＯＧＯＧＧＧＡＵＡＣＣＡＧＡＡＧｔｆＡ
ＧＧＯＡＣＣＡＣＯＧＵＡυ ＨＴ及び／又はＷＴ：約り５℃〜約７０℃Ａ（ＣＵＡＧ
ＧＵＣＣＧＧＣＧＧＡＡＡＵＣＧＧＡｅＵＧＡＨＴ及び
／又はＷＴ：約５５℃ ＣＣＤ Ｆ（Ｔ及び／又はＷＴ：約り５℃〜約６０℃ＣＡＧＣＡ Ｆ（Ｔ及び／又はＷＴｚ約５５り〜約６０°Ｃｔ）Ａｔ
）ＧＣＣＣｔｌＣｌ）ＡＡＧＧｔ）ｔ）入＾ＧＧＪｌＩ
Ｃ１ｌＬＩＧＣυＣＣＧＵＡＡＧＣＣＣＣＧＨＴ及び／
又はＷＴ：約り０℃〜約６５℃ＧＣＧＯＯＧＧＡＧＣＵ
ＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＣＵＡＵＧＡＵｔｊＣＣＧＣＨＴ
及び／又はＷＴ：約５５℃ ＧＵＵＣｌｊＧＡＡＣｔ）ＧＧＧＵＧＡＣＵＣＧＡＧυ
ａｕａｕｃＨＴ及び／又はＷＴ；約り５℃〜約６０℃Ｇ
ＣＡＵＡＣ（ｉＵｃＵＵＧＡＧＡＧＧＧ＾入ＡＧＣ入Ｈ
Ｔ及び／又はＷＴ：約４５℃ ｔＴＧＵＡｃＧｔｊＡＡＵＡＡｃｔ）Ｇ（ＪＣＧＡＧＡ
）ＩＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約４５℃υＣｕＣｋ
ｋＣｋＧＣＧＧｕｋＣｕｋｋＧＣＣｍＣＧｋｋｋＨＴ及
び／又はＷＴ：約５０℃〜約５５℃ＵＧＵＣＵＡＣＧＧ
ＡＣＡＣＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＡＵＡＣＣＡＣＨＴ及び
／又はＷＴ：約り０℃〜約６０℃ｕｘａｃｕｕ ＨＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約５５℃ＡＧＣＩＪＧ
ＧｔｌＵＧＧＣＧＧＧＧＵＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＨ
Ｔ及び／又はＷＴ；約４５℃ 示されている温度は上述の条件の下でのみ有効であると
いうことを強調しておきたい、その他の交雑媒質又は洗
浄媒質も同様に使用可能である。
しかしながら、変更が行なわれる場合には、それがプロ
ーブについてであれ媒質についてであれ、必要とされる
特異性を得るようそのプローブを用いることができる温
度を、Ｂ Ｄ、 Ｈａｍｅｓ及びＳ、 Ｊ。
ーブについてであれ媒質についてであれ、必要とされる
特異性を得るようそのプローブを用いることができる温
度を、Ｂ Ｄ、 Ｈａｍｅｓ及びＳ、 Ｊ。
ｔ１１ｇｇｉｎｓ共著「核酸交雑、その実際的アプロー
チＪ（ＩＲＬ出版、オックスフォード、イギリス、１９
８５年）に記されているもののような既知の関係式に従
って変更すべきである。
チＪ（ＩＲＬ出版、オックスフォード、イギリス、１９
８５年）に記されているもののような既知の関係式に従
って変更すべきである。
上述の変形態様の中には、場合によって交雑媒質又は洗
浄媒質或いはその両方が以下のものであるとき、以下に
定める配列のうちの１つ又は相応する相補性配列を標的
にする、単数又は複数のナイセリア・ゴル工菌株を検出
するための交雑プローブが含まれる： 交雑媒質：約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣ
ｇ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）
、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，１，２０％の脱
イオンホルムアミド、０．０２％のフィコール、０．０
２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニルピ
ロリドンそして約０．１ｍｇ／−のせん断され変性され
たサケ精子ＤＮＡを含んでいる。
浄媒質或いはその両方が以下のものであるとき、以下に
定める配列のうちの１つ又は相応する相補性配列を標的
にする、単数又は複数のナイセリア・ゴル工菌株を検出
するための交雑プローブが含まれる： 交雑媒質：約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣ
ｇ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）
、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，１，２０％の脱
イオンホルムアミド、０．０２％のフィコール、０．０
２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニルピ
ロリドンそして約０．１ｍｇ／−のせん断され変性され
たサケ精子ＤＮＡを含んでいる。
洗浄媒質：約３×ＳＳＣｌ２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７，１、及び２０％の脱イオンホルムアミドを含んで
いる。
Ｈ７，１、及び２０％の脱イオンホルムアミドを含んで
いる。
なおここで、前記標的配列及び相応する関連交雑温度（
ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）はそれぞれ以下のとおりで
ある： ＡＡＧＧＣＵＧＵｔＪＧＣＣＡＡυＡＵＣＧＧＣＧＧＣ
ＣＧＡ）ＩＴ及び／又はＷＴ：約５０℃〜６５℃ＣＡ（
ｉＧＯＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＵＧｔＪＩＪＧＣＣＡＡＵ
ＡＯＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡ）ＩＴ及び／又はＷＴ：約り
０℃〜約７０℃Ａ （ＪＡＵＣＧＧＣＧＧＣｅＧＡＵＧＡＣＧＧＵＡＣＣＨ
Ｔ及び／又はＷＴ：約り５℃〜約７０℃ＧＧＡ
ＬＩＡｔＪＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＵＧＡＣＧＧＵ
ＡＣｅＨＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約７５℃０ＵＡ
ＧＣＵＧＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＵＧＡＵＵＧＣＵＵＧＧ
ＵＡＧＣＧｔＪＨＴ及び／又はＷＴ：約６５°Ｃ Ｃ１ＣＡＧＣ入 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５°Ｃ ＧＣＧＧＧＧＧＡＧＣＵＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＣｔＪＡ
ＵＧＡＵＵＣＣＧＣＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ ＣＡＵ ＨＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約５５℃ＣＡ トＩＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ ナイセリア・ゴル工菌株を検出するための本発明に基づ
く好ましいプローブは、そのプローブがＴＣＡ ＴＣＧ
ＧＣＣＧＣＣＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧ（：の配列で構成
されていないことを条件として、グループ（１）から（
４）までのものである。
ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）はそれぞれ以下のとおりで
ある： ＡＡＧＧＣＵＧＵｔＪＧＣＣＡＡυＡＵＣＧＧＣＧＧＣ
ＣＧＡ）ＩＴ及び／又はＷＴ：約５０℃〜６５℃ＣＡ（
ｉＧＯＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＵＧｔＪＩＪＧＣＣＡＡＵ
ＡＯＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡ）ＩＴ及び／又はＷＴ：約り
０℃〜約７０℃Ａ （ＪＡＵＣＧＧＣＧＧＣｅＧＡＵＧＡＣＧＧＵＡＣＣＨ
Ｔ及び／又はＷＴ：約り５℃〜約７０℃ＧＧＡ
ＬＩＡｔＪＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＵＧＡＣＧＧＵ
ＡＣｅＨＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約７５℃０ＵＡ
ＧＣＵＧＵＵＧＧＧＣＡＡＣＵＵＧＡＵＵＧＣＵＵＧＧ
ＵＡＧＣＧｔＪＨＴ及び／又はＷＴ：約６５°Ｃ Ｃ１ＣＡＧＣ入 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５°Ｃ ＧＣＧＧＧＧＧＡＧＣＵＧＧＣＡＡＵＡＡＡＧＣｔＪＡ
ＵＧＡＵＵＣＣＧＣＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ ＣＡＵ ＨＴ及び／又はＷＴ：約り０℃〜約５５℃ＣＡ トＩＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ ナイセリア・ゴル工菌株を検出するための本発明に基づ
く好ましいプローブは、そのプローブがＴＣＡ ＴＣＧ
ＧＣＣＧＣＣＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧ（：の配列で構成
されていないことを条件として、グループ（１）から（
４）までのものである。
本発明は又、約５５％から約７５％のＤＮＡ：ＤＮＡ交
雑相同値をもつ生体間の区別ができる上述の配列をもつ
プローブにも関係する。
雑相同値をもつ生体間の区別ができる上述の配列をもつ
プローブにも関係する。
ｒＲＮＡ分子の進化を考えると、ナイセリア類属内（例
えばボルデテラ内）にみ・られるもの以外の関係の強い
分類群（５５％以上のＤＮＡ相同）の間の識別を可能に
するｒＲＮＡ・誘導の交雑プローブも同様に作り上げる
ことができるというのは、理にかなったことと思われる
。
えばボルデテラ内）にみ・られるもの以外の関係の強い
分類群（５５％以上のＤＮＡ相同）の間の識別を可能に
するｒＲＮＡ・誘導の交雑プローブも同様に作り上げる
ことができるというのは、理にかなったことと思われる
。
これらのきわめて特異性の高いプローブが、ナイセリア
・ゴル工に対する特異的配列がみられた領域（例えば、
１６ｓ ｒＲＮＡの場合、第１図の領域Ｉ、ＩＩ及び
ＩＩＩ ）と同じｒＲＮＡ分子の領域内にみられる配列
から得られるということは、考えられることである。こ
れらの領域は、大腸菌のｒＲＮＡ配列と当該生体の全体
的又は部分的ｒＲＮＡ配列を適切に整列させた後、容易
に位置設定することができる。
・ゴル工に対する特異的配列がみられた領域（例えば、
１６ｓ ｒＲＮＡの場合、第１図の領域Ｉ、ＩＩ及び
ＩＩＩ ）と同じｒＲＮＡ分子の領域内にみられる配列
から得られるということは、考えられることである。こ
れらの領域は、大腸菌のｒＲＮＡ配列と当該生体の全体
的又は部分的ｒＲＮＡ配列を適切に整列させた後、容易
に位置設定することができる。
これらの領域は、大腸菌の１６ｓ ｒＲＮＡ分子にお
いては、 （１）領域Ｉについては６９〜９９ （ｉｉ ）領域ＩＩについては４３２〜４８８（ｉ）領
域ＩＩＩについては８２５〜８５８のヌクレオチド間（
なおここで番号は第８図に示されている大腸菌の１６ｓ
ｒＲＮＡ配列を表わす）、そして大腸菌の２３ｓ
ｒＲＮＡ分子においては７７〜１０９のヌクレオチド
間（なおここで番号は第９図に示されている大腸菌の部
分的２３ｓ ｒＲＮＡ配列を表わす）に見られる領域
に相当する。
いては、 （１）領域Ｉについては６９〜９９ （ｉｉ ）領域ＩＩについては４３２〜４８８（ｉ）領
域ＩＩＩについては８２５〜８５８のヌクレオチド間（
なおここで番号は第８図に示されている大腸菌の１６ｓ
ｒＲＮＡ配列を表わす）、そして大腸菌の２３ｓ
ｒＲＮＡ分子においては７７〜１０９のヌクレオチド
間（なおここで番号は第９図に示されている大腸菌の部
分的２３ｓ ｒＲＮＡ配列を表わす）に見られる領域
に相当する。
しかしながら、
（ｉ）きわめて特異性の高いプローブはその他の領域か
らでも作り上げることができること、及び （ｉｉ）これらの領域のうちのいくつかは、成る種の分
類群のｒＲＮＡ分子内には存在しない可能性があること
（進化中の突然変異による）も強調しておかなければな
らない。
らでも作り上げることができること、及び （ｉｉ）これらの領域のうちのいくつかは、成る種の分
類群のｒＲＮＡ分子内には存在しない可能性があること
（進化中の突然変異による）も強調しておかなければな
らない。
本発明は又、試料中に存在しうるナイセリア菌株の相補
性核酸とプローブの間の交雑を可能にする条件の下で本
発明のプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で
核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）が交雑に対してアクセス可能
な状態にされた生物学的試料と接触させる作業そして、
形成され得た雑種を検出する段階が含まれていることを
特徴とする、生物学的試料中のナイセリア菌株を検出す
るための方法にも関するものである。
性核酸とプローブの間の交雑を可能にする条件の下で本
発明のプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で
核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）が交雑に対してアクセス可能
な状態にされた生物学的試料と接触させる作業そして、
形成され得た雑種を検出する段階が含まれていることを
特徴とする、生物学的試料中のナイセリア菌株を検出す
るための方法にも関するものである。
当該方法は菌株が培養された後の試料内に直接存在する
ナイセリア菌株の検出に関わるものである。
ナイセリア菌株の検出に関わるものである。
雑種の検出は、グループ１か６１８までのプローブのい
ずれかが用いられているときナイセリア感染が生物学的
試料中に存在していたこと、そしてさらに特定的に言う
と、例えば適切な交雑条件の下でグループ４．５．９．
１１．１３又は１８の核酸に属する配列をプローブが有
している場合、さらに著しくはグループ３、グループ２
好ましくはグループ１の配列に属する１つの配列をプロ
ーブが有している場合にナイセリア・ゴル工の感染が存
在していたということを意味するものとして解釈されう
る。
ずれかが用いられているときナイセリア感染が生物学的
試料中に存在していたこと、そしてさらに特定的に言う
と、例えば適切な交雑条件の下でグループ４．５．９．
１１．１３又は１８の核酸に属する配列をプローブが有
している場合、さらに著しくはグループ３、グループ２
好ましくはグループ１の配列に属する１つの配列をプロ
ーブが有している場合にナイセリア・ゴル工の感染が存
在していたということを意味するものとして解釈されう
る。
本発明の有利な実施態様によると、ナイセリア菌株を検
出するためのプロセスにおいて、使用されるプローブは
、生物学的試料内に存在しうるナイセリア菌株のＲＮＡ
及びＤＮＡ全体の両方と交雑するものである。
出するためのプロセスにおいて、使用されるプローブは
、生物学的試料内に存在しうるナイセリア菌株のＲＮＡ
及びＤＮＡ全体の両方と交雑するものである。
交雑条件はいくつかのパラメータ、例えば交雑温度、媒
質の性質と温度及び形成された雑種の洗浄温度に依存し
て、監視されうる。
質の性質と温度及び形成された雑種の洗浄温度に依存し
て、監視されうる。
交雑温度はプローブに応じて（その核酸組成、種類及び
長さに応じて）その上限が定められており、ここで記述
されているプローブの最高交雑温度は約５５℃から７５
℃である。これ以上の温度では、二本鎖化はプローブと
標的の間で形成された雑種の解離（又は変性）と競合す
る。
長さに応じて）その上限が定められており、ここで記述
されているプローブの最高交雑温度は約５５℃から７５
℃である。これ以上の温度では、二本鎖化はプローブと
標的の間で形成された雑種の解離（又は変性）と競合す
る。
交雑温度は好ましくは約４５℃から約７０℃、特に約４
５℃から約６５℃に含まれている。
５℃から約６５℃に含まれている。
好ましい交雑媒質には、約３×ＳＳＣ，（ＳＳＣ＝０．
１５ＭのＮａＣｌ２．０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７，０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７
，１、そして２０％の脱イオンホルムアミド、０．０２
％のフィコール、０．０２％のウシ血清アルブミン、０
．０２％のポリビニルピロリドンそして約０．１ｍｇ／
Ｗｄｌのせん断され変性されたサケ精子ＤＮＡが含まれ
ている。
１５ＭのＮａＣｌ２．０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ７，０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７
，１、そして２０％の脱イオンホルムアミド、０．０２
％のフィコール、０．０２％のウシ血清アルブミン、０
．０２％のポリビニルピロリドンそして約０．１ｍｇ／
Ｗｄｌのせん断され変性されたサケ精子ＤＮＡが含まれ
ている。
洗浄温度は、約５０°Ｃから約７５°Ｃの間である。
本発明に基づくナイセリア菌株全般を検出するための方
法は、交雑が特異的である１つの値に交雑温度を適切に
調整することにより実施することができ、この場合、さ
らに厳しい条件の下での洗浄は不要である。
法は、交雑が特異的である１つの値に交雑温度を適切に
調整することにより実施することができ、この場合、さ
らに厳しい条件の下での洗浄は不要である。
本発明に基づく方法のもう１つの実施例によると、交雑
温度は必ずしも、交雑が特異的である値に調整される必
要はなく、交雑が特異的である温度より低くてもよい。
温度は必ずしも、交雑が特異的である値に調整される必
要はなく、交雑が特異的である温度より低くてもよい。
ただし、洗浄は、交雑が特異的である値に相当する温度
で行なわれる。
で行なわれる。
グループ６のプローブでナイセリア菌株全般を検出する
ため（これらをその他の細菌分類株から識別するため）
の方法の一実施態様において、交雑温度は約６５℃の範
囲にそして／又は洗浄温度は約６５℃から約７０℃の範
囲に適切に調整されている。なおここで媒質は前述のも
のである。
ため（これらをその他の細菌分類株から識別するため）
の方法の一実施態様において、交雑温度は約６５℃の範
囲にそして／又は洗浄温度は約６５℃から約７０℃の範
囲に適切に調整されている。なおここで媒質は前述のも
のである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プのいずれかであり、交雑温度は約５５℃の範囲にそし
て／又洗浄温度は約５５℃の範囲に適切に調整されてい
る。
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プのいずれかであり、交雑温度は約５５℃の範囲にそし
て／又洗浄温度は約５５℃の範囲に適切に調整されてい
る。
さらにもう１つのナイセリア菌株全般の検出方法実施態
様において、使用されるプローブは、前記グループ１の
いずれかである。
様において、使用されるプローブは、前記グループ１の
いずれかである。
交雑温度は約５５℃の範囲好ましくは約５３℃の範囲に
、そして／又洗浄温度は約５５℃の範囲好ましくは約５
３℃の範囲に適切に調整されている。なお交雑媒質は上
述のものである。
、そして／又洗浄温度は約５５℃の範囲好ましくは約５
３℃の範囲に適切に調整されている。なお交雑媒質は上
述のものである。
ナイセリア菌株全般の検出方法のさらにもう１つの実施
態様においては、使用されるプローブは、上述のグルー
プ２のいずれかである。
態様においては、使用されるプローブは、上述のグルー
プ２のいずれかである。
交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗浄温度は約６
０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プ３のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プ３のいずれかである。
交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗浄温度は約６
０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
さらにナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの
方法実施態様において、使用されているプローブは、上
述のグループ４のいずれかである。
方法実施態様において、使用されているプローブは、上
述のグループ４のいずれかである。
交雑温度は約６５℃の範囲にそして／又洗浄温度は約６
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのさらにもう１つの
方法実施態様において、用いられるプローブは、上述の
グループ５のいずれかである。
方法実施態様において、用いられるプローブは、上述の
グループ５のいずれかである。
交雑温度は約５５℃の範囲にそして／又洗浄温度は約５
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
ナイセリア菌株全般を検出するためのさらにもう１つの
方法実施態様において、使用されるプローブは、上述の
グループ８のいずれかである。
方法実施態様において、使用されるプローブは、上述の
グループ８のいずれかである。
交雑温度は約５５℃の範囲にそして／又洗浄温度は約５
５℃から約６０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
５℃から約６０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ９のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ９のいずれかである。
交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗浄温度は約６
０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１０のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１０のいずれかである。
交雑温度は約５５℃の範囲にそして／又洗浄温度は約５
５℃から約６０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
５℃から約６０℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１１のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１１のいずれかである。
交雑温度は約５５℃の範囲にそして／又洗浄温度は約５
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１２のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１２のいずれかである。
交雑温度は約５５℃から約６０℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約５５℃から約６０℃の範囲に調整され、交雑
媒質は上述のものである。
浄温度は約５５℃から約６０℃の範囲に調整され、交雑
媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１３のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１３のいずれかである。
交雑温度は約４５℃の範囲にそして／又洗浄温度は約４
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１４のいずれがである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１４のいずれがである。
交雑温度は約４０℃から約４５℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約４０℃から約４５℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約４０℃から約４５℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１５のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１５のいずれかである。
交雑温度は約５０℃から約５５℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約５０℃から約５５℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約５０℃から約５５℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１６のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１６のいずれかである。
交雑温度は約５０℃から約６０℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約５０℃から約６０℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約５０℃から約６０℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１７のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１７のいずれかである。
交雑温度は約５０℃から約５５℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約５０℃から約５５°Ｃの範囲に適切に調整さ
れ、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約５０℃から約５５°Ｃの範囲に適切に調整さ
れ、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう１つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１８のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ１８のいずれかである。
交雑温度は約４５℃の範囲にそして／又洗浄温度は約４
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
５℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
本発明はさらに、生物学的試料内でナイセリア・ゴル工
菌株をその他のナイセリア菌株から検出するためそして
好ましくはナイセリア・メニンシティディスのような関
係の強い分類群からナイセリア・ゴル工菌株を識別する
ための方法にも関するものであり、かかる方法には、必
要とされる場合にはつねにその他のナイセリア種の相補
的ＤＮＡ又はＲＮＡとではなく試料中に存在しうるナイ
セリア・ゴル工菌株の相補的核酸との特異的交雑を確実
なものとするよう調整された交雑及び洗浄条件の下で、
グループ１から５．９゜１１．１３及び１８の中から選
ばれたナイセリア・ゴル工菌株に特異的な本発明に基づ
くプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で核酸
（ＤＮＡ及びＲＮＡ）が交雑に対してアクセス可能な状
態にされている上記生物学的試料と接触させる作業、及
び形成されうる雑種を検出する作業が含まれている。
菌株をその他のナイセリア菌株から検出するためそして
好ましくはナイセリア・メニンシティディスのような関
係の強い分類群からナイセリア・ゴル工菌株を識別する
ための方法にも関するものであり、かかる方法には、必
要とされる場合にはつねにその他のナイセリア種の相補
的ＤＮＡ又はＲＮＡとではなく試料中に存在しうるナイ
セリア・ゴル工菌株の相補的核酸との特異的交雑を確実
なものとするよう調整された交雑及び洗浄条件の下で、
グループ１から５．９゜１１．１３及び１８の中から選
ばれたナイセリア・ゴル工菌株に特異的な本発明に基づ
くプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で核酸
（ＤＮＡ及びＲＮＡ）が交雑に対してアクセス可能な状
態にされている上記生物学的試料と接触させる作業、及
び形成されうる雑種を検出する作業が含まれている。
ナイセリア・ゴル工菌株を特異的に識別する対象である
その他のナイセリア菌株としては、例えば、ナイセリア
・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイセリア・サ
プフラバ、ナイセリア・フラベツセンス及びナイセリア
・エロンガータなどがある。
その他のナイセリア菌株としては、例えば、ナイセリア
・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイセリア・サ
プフラバ、ナイセリア・フラベツセンス及びナイセリア
・エロンガータなどがある。
この点において、交雑温度は約５０℃から約７５°Ｃま
でであることが好ましい。
でであることが好ましい。
好ましい交雑媒質には、約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１
５ＭのＮａＣｇ、Ｏ，０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、
ｐＨ７，０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液そして２０
％の脱イオンホルムアミド、０．０２％のフィコール、
０．０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビ
ニルピロリドンそして約０．１ｍｇ／−のせん断され変
性されたサケ精子ＤＮＡが含まれ、好ましい洗浄媒質に
は約３×ＳＳＣ１２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，１
、及び２０％の脱イオンホルムアミドが含まれている。
５ＭのＮａＣｇ、Ｏ，０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、
ｐＨ７，０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液そして２０
％の脱イオンホルムアミド、０．０２％のフィコール、
０．０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビ
ニルピロリドンそして約０．１ｍｇ／−のせん断され変
性されたサケ精子ＤＮＡが含まれ、好ましい洗浄媒質に
は約３×ＳＳＣ１２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７，１
、及び２０％の脱イオンホルムアミドが含まれている。
洗浄温度は約５０℃から約７０℃までである。
ナイセリア・ゴル工を検出するための方法の一実施態様
において、使用されるプローブは上記グループ２に属し
、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗浄温度は約
６５℃から約７０℃好ましくは約６５℃の範囲に適切に
調整されており、媒質は上述のものである。
において、使用されるプローブは上記グループ２に属し
、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗浄温度は約
６５℃から約７０℃好ましくは約６５℃の範囲に適切に
調整されており、媒質は上述のものである。
ナイセリア・ゴル工を検出するための１つの方法の実施
態様において、使用されているプローブは上述のグルー
プ３に属し、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約６５℃から約７０℃好ましくは約６５℃の範
囲に適切に調整され、媒質は上述のものである。
態様において、使用されているプローブは上述のグルー
プ３に属し、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約６５℃から約７０℃好ましくは約６５℃の範
囲に適切に調整され、媒質は上述のものである。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう１つの方法の
実施態様において、使用されているプローブは上述のグ
ループ４に属し、交雑温度は約６５℃の範囲に、そして
／又洗浄温度は約７０°Ｃから約７５°Ｃ好ましくは約
７０℃の範囲に適切に調整される。
実施態様において、使用されているプローブは上述のグ
ループ４に属し、交雑温度は約６５℃の範囲に、そして
／又洗浄温度は約７０°Ｃから約７５°Ｃ好ましくは約
７０℃の範囲に適切に調整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう１つの方法の
実施態様において、使用されるプローブは上述のグルー
プ５に属し、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約６５℃の範囲に適切に調整される。
実施態様において、使用されるプローブは上述のグルー
プ５に属し、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗
浄温度は約６５℃の範囲に適切に調整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのさらにもう１つの
方法の実施態様において、使用されるプローブは上述の
グループ９に属し、交雑温度は約６０℃から約６５℃の
範囲にそして／又洗浄温度は約６５℃の範囲に適切に調
整される。
方法の実施態様において、使用されるプローブは上述の
グループ９に属し、交雑温度は約６０℃から約６５℃の
範囲にそして／又洗浄温度は約６５℃の範囲に適切に調
整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう１つの方法の
実施態様においては、使用されるプローブはグループ１
１に属し、交雑温度及び／又は洗浄温度は約６５℃の範
囲に適切に調整されている。
実施態様においては、使用されるプローブはグループ１
１に属し、交雑温度及び／又は洗浄温度は約６５℃の範
囲に適切に調整されている。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう１つの方法実
施態様においては、使用されるプローブはグループ１３
に属し、交雑温度は約５０℃から約５５℃の範囲にそし
て／又洗浄温度は約５０℃から約５５℃の範囲に適切に
調整され、媒質は上述のものである。
施態様においては、使用されるプローブはグループ１３
に属し、交雑温度は約５０℃から約５５℃の範囲にそし
て／又洗浄温度は約５０℃から約５５℃の範囲に適切に
調整され、媒質は上述のものである。
ナイセリア・ゴル工を検出するための方法の実施態様に
おいて、使用されるプローブはグループ１８に属してお
り、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗浄温度は
約６０℃の範囲に適切に調整され、媒質は上述のもので
ある。
おいて、使用されるプローブはグループ１８に属してお
り、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又洗浄温度は
約６０℃の範囲に適切に調整され、媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう１つの特に好
ましい方法実施態様によると、使用されるプローブは上
述のグループｌに属し、交雑温度は約５５℃好ましくは
約５３℃の範囲にそして／又洗浄温度は約５５℃から約
６５℃好ましくは約５３℃の範囲に適切に調整される。
ましい方法実施態様によると、使用されるプローブは上
述のグループｌに属し、交雑温度は約５５℃好ましくは
約５３℃の範囲にそして／又洗浄温度は約５５℃から約
６５℃好ましくは約５３℃の範囲に適切に調整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するための本発明に基づく好
ましい方法において、使用されるプローブはグループ（
１）から（４）までのいずれかに属する。ただしこのプ
ローブはＴＣＡ ＴＣＧ ＧＣＣＧＣＣＧＡＴ ＡＴＴ
ＧＧＣという配列で構成されることはない。
ましい方法において、使用されるプローブはグループ（
１）から（４）までのいずれかに属する。ただしこのプ
ローブはＴＣＡ ＴＣＧ ＧＣＣＧＣＣＧＡＴ ＡＴＴ
ＧＧＣという配列で構成されることはない。
本発明は又、生物学的試料内のナイセリア菌株の多く好
ましくは全てを試験管内で検出するための、以下のもの
を含むキットにも関係する：上述のもののうちのいずれ
かから選択された少なくとも１つのプローブ、 ナイセリア菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとこれらのプ
ローブの間の交雑反応が行なえるようにする緩衝液又は
かかる緩衝液を作るのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種を
検出するための手段。
ましくは全てを試験管内で検出するための、以下のもの
を含むキットにも関係する：上述のもののうちのいずれ
かから選択された少なくとも１つのプローブ、 ナイセリア菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとこれらのプ
ローブの間の交雑反応が行なえるようにする緩衝液又は
かかる緩衝液を作るのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種を
検出するための手段。
本発明はさらにナイセリア・ゴル工菌株を特異的に検出
するための、以下のものを含むキットにも関係している
： 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも１つのプローブ、例え
ばグループ（２）。
するための、以下のものを含むキットにも関係している
： 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも１つのプローブ、例え
ばグループ（２）。
（３）、（４）、（５）、（９）、（１１）。
（１３）又は（１８）のプローブ好ましくはグループ（
１）のブローブ： ナイセリア・ゴル工の菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの
みとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえるように
する緩衝液又はかかる緩衝液を作るのに必要な構成成分
。
１）のブローブ： ナイセリア・ゴル工の菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの
みとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえるように
する緩衝液又はかかる緩衝液を作るのに必要な構成成分
。
ナイセリア・ゴル工を検出するための好ましいキットに
おいて、プローブは、それがＴＣＡ ＴＣＧＧＣＣＧＣ
ＣＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＣで構成されていないことを条
件として、グループ（１）から（４）に属している。
おいて、プローブは、それがＴＣＡ ＴＣＧＧＣＣＧＣ
ＣＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＣで構成されていないことを条
件として、グループ（１）から（４）に属している。
本発明は、多数の好ましくは全てのナイセリア菌株そし
て特異的にナイセリ・ア・ゴル工を検出するための、以
下のものを含むキットに関する： 上述のもののいずれかの中から選択された少なくとも１
つのプローブ、例えばグループ（１）から（１８）まで
のプローブ、さらに好ましくはグループ（６）、（７）
、（８）（１０）、（１２）、（１４）、（１５）。
て特異的にナイセリ・ア・ゴル工を検出するための、以
下のものを含むキットに関する： 上述のもののいずれかの中から選択された少なくとも１
つのプローブ、例えばグループ（１）から（１８）まで
のプローブ、さらに好ましくはグループ（６）、（７）
、（８）（１０）、（１２）、（１４）、（１５）。
（１６）又は（１７）のプローブ；
多数好ましくは全てのナイセリアの菌株のＤＮＡ及び／
又はＲＮＡとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえ
るようにする、いつでも使用可能な状態にある緩衝液又
はかかる緩衝液を作るために必要な適当な割合での構成
成分； 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも１つのプローブ、例え
ばグループ（２）。
又はＲＮＡとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえ
るようにする、いつでも使用可能な状態にある緩衝液又
はかかる緩衝液を作るために必要な適当な割合での構成
成分； 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも１つのプローブ、例え
ばグループ（２）。
（３）、（４）、（５）、（９）、（１１）。
（１３）又は（１８）のプローブ又さらに好ましくはグ
ループ（１）のプローブ； ナイセリア・ゴル工の菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの
みとこれらのプローブの間の交雑反応を行なえるように
する。いつでも使用可能な状態にある緩衝液又はそれを
作るのに必要な適当な割合での構成成分。
ループ（１）のプローブ； ナイセリア・ゴル工の菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの
みとこれらのプローブの間の交雑反応を行なえるように
する。いつでも使用可能な状態にある緩衝液又はそれを
作るのに必要な適当な割合での構成成分。
ナイセリア菌株及び特異的にナイセリア・ゴル工菌株を
検出するための好ましいキットにおいて、ナイセリア・
ゴル工菌株を検出するために用いられるプローブは、そ
れがＴＣＡ ＴＣＧ ＧＣＣＧＣＣＧＡＴ ＡＴＴ Ｇ
ＧＣという配列で構成されていないことを条件として、
グループ（１）から（４）に属する。
検出するための好ましいキットにおいて、ナイセリア・
ゴル工菌株を検出するために用いられるプローブは、そ
れがＴＣＡ ＴＣＧ ＧＣＣＧＣＣＧＡＴ ＡＴＴ Ｇ
ＧＣという配列で構成されていないことを条件として、
グループ（１）から（４）に属する。
プローブの
本発明に基づくプローブは、有利なことに標識付けされ
ている。従来のいかなる標識でも用いることができる。
ている。従来のいかなる標識でも用いることができる。
プローブは３２ｐ、 ３１１８．１２８Ｊ。
３Ｈ及び１４Ｃといった放射性トレーサを用いて標識づ
けすることもできる。
けすることもできる。
放射性標識づけは、放射性標識をもつヌクレオチド、ポ
リヌクリオチドキナーゼ（ホスファターゼによる脱リン
酸化を伴う又は伴わない）又はリガーゼ（標識づけすべ
き末端に従って）を用いた３′又は５′の位置における
末端標識付けといった従来のいかなる方法を用いてでも
行なうことができる０本発明に基づくプローブの１つは
、複数の放射性ヌクレオチド又は複数の放射性又は非放
射性ヌクレオチドから成る鎖の合成のためのマトリクス
である可能性もある０本発明に基づ（プローブは又、単
数又は複数の放射性ヌクレオチドを用いた化学合成によ
っても調製できる。放射性標識づけのもう１つの方法は
、プローブ上への複数の１１８工原子の結合へと導く本
発明に基づくプローブの化学的ヨウ素化である。
リヌクリオチドキナーゼ（ホスファターゼによる脱リン
酸化を伴う又は伴わない）又はリガーゼ（標識づけすべ
き末端に従って）を用いた３′又は５′の位置における
末端標識付けといった従来のいかなる方法を用いてでも
行なうことができる０本発明に基づくプローブの１つは
、複数の放射性ヌクレオチド又は複数の放射性又は非放
射性ヌクレオチドから成る鎖の合成のためのマトリクス
である可能性もある０本発明に基づ（プローブは又、単
数又は複数の放射性ヌクレオチドを用いた化学合成によ
っても調製できる。放射性標識づけのもう１つの方法は
、プローブ上への複数の１１８工原子の結合へと導く本
発明に基づくプローブの化学的ヨウ素化である。
本発明に基づくプローブの１つが非放射性ＲＮＡ又はＤ
ＮＡとの交雑のために使用すべく放射性にされる場合、
交雑検出方法は、使用される放射性トレーサによって異
なる。一般に、オートラジオグラフィ、液体シンチレー
ション、ガンマ計数又は放射性トレーサが発した電離線
を検出できるようにする従来のあらゆる方法を用いるこ
とが可能である。
ＮＡとの交雑のために使用すべく放射性にされる場合、
交雑検出方法は、使用される放射性トレーサによって異
なる。一般に、オートラジオグラフィ、液体シンチレー
ション、ガンマ計数又は放射性トレーサが発した電離線
を検出できるようにする従来のあらゆる方法を用いるこ
とが可能である。
本発明に基づくプローブを、免疫学的特異性（例えば抗
原又はハブテン）、いくつかの試薬に対する特異的親和
力（例えばリガンド）、検出可能な酵素反応を提供する
特性（例えば酵素、補酵素、酵素基質又は酵素反応に参
加する基質）或いは蛍光又は発光又はあらゆる波長にお
ける吸光といった物理的特性をもつ残基と結びつけるこ
とにより、非放射性標識づけを利用することも可能であ
る。プローブと標的により形成された雑種を特異的に検
出する抗体も又利用できる。
原又はハブテン）、いくつかの試薬に対する特異的親和
力（例えばリガンド）、検出可能な酵素反応を提供する
特性（例えば酵素、補酵素、酵素基質又は酵素反応に参
加する基質）或いは蛍光又は発光又はあらゆる波長にお
ける吸光といった物理的特性をもつ残基と結びつけるこ
とにより、非放射性標識づけを利用することも可能であ
る。プローブと標的により形成された雑種を特異的に検
出する抗体も又利用できる。
非放射性標識は、本発明のプローブを化学的に合成する
場合に与えることができる。そのアデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン及びウラシル残基が、プローブ
或いはプローブと相補的ＤＮＡ又はＲＮＡグラグメント
の間で形成された雑種の検出を可能にするその他の化学
的残基に結合しやすいのである。しかしながらプローブ
のヌクレオチド配列は、単数又は複数のヌクレオチドを
その他の化学的残基に結合することにより変更されたと
き、本発明に基づくプローブの１つのヌクレオチド配列
と同じとなる。
場合に与えることができる。そのアデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン及びウラシル残基が、プローブ
或いはプローブと相補的ＤＮＡ又はＲＮＡグラグメント
の間で形成された雑種の検出を可能にするその他の化学
的残基に結合しやすいのである。しかしながらプローブ
のヌクレオチド配列は、単数又は複数のヌクレオチドを
その他の化学的残基に結合することにより変更されたと
き、本発明に基づくプローブの１つのヌクレオチド配列
と同じとなる。
本発明は又、上述のように標識づけされており検出可能
である本発明に基づくプローブで交雑によりＲＮＡ及び
／又はＤＮＡを検出する方法にも関係する。ここにおい
て、従来の交雑方法を用いることが可能である。
である本発明に基づくプローブで交雑によりＲＮＡ及び
／又はＤＮＡを検出する方法にも関係する。ここにおい
て、従来の交雑方法を用いることが可能である。
生体組織からとった又はそれ自体生体組織である細胞を
検出するためこれらの細胞のＲＮＡ及び／又はＤＮＡは
必要とあらば、化学的又は物理的方法を用いて細胞の部
分的又は全体的溶解によりアクセス可能な状態にされ、
検出可能な本発明に基づく単数又は複数のプローブと接
触させられる。この接触は液体媒質内の又は溶液の形で
のニトロセルロース、セルロース又はナイロンフィルタ
ーのような適切な支持体の上で行なわれる。この接触は
、最適下限条件、最適条件又は制限条件（すなわち、配
列が１つの分子長で完全に相同である場合にのみ雑種形
成を可能にする条件）の下で行なわれつる。このような
条件としては、温度、反応体の温度、核酸の対合の最適
温度を低下させる物質（例えばホルムアミド、ジメチル
スルフオキシド及び尿素）の存在、及び明らかに反応体
積を低下させ及び／又は雑種形成を促進させる物質（例
えば、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール又は
フェノール）の存在などがある。
検出するためこれらの細胞のＲＮＡ及び／又はＤＮＡは
必要とあらば、化学的又は物理的方法を用いて細胞の部
分的又は全体的溶解によりアクセス可能な状態にされ、
検出可能な本発明に基づく単数又は複数のプローブと接
触させられる。この接触は液体媒質内の又は溶液の形で
のニトロセルロース、セルロース又はナイロンフィルタ
ーのような適切な支持体の上で行なわれる。この接触は
、最適下限条件、最適条件又は制限条件（すなわち、配
列が１つの分子長で完全に相同である場合にのみ雑種形
成を可能にする条件）の下で行なわれつる。このような
条件としては、温度、反応体の温度、核酸の対合の最適
温度を低下させる物質（例えばホルムアミド、ジメチル
スルフオキシド及び尿素）の存在、及び明らかに反応体
積を低下させ及び／又は雑種形成を促進させる物質（例
えば、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール又は
フェノール）の存在などがある。
交雑されなかった本発明に基づくプローブの除去は、適
切・なイオン長の緩衝溶液を用いて適切な温度で、単鎖
ＲＮＡ又はＲＮＡを消化するがＤＮＡ−ＲＮＡ雑種又は
２重鎖ＤＮＡは消化しないＳ１ヌクレアーゼ又はその他
の酵素での処理を伴って又は伴わずに、洗浄することに
よって行なうことができる。
切・なイオン長の緩衝溶液を用いて適切な温度で、単鎖
ＲＮＡ又はＲＮＡを消化するがＤＮＡ−ＲＮＡ雑種又は
２重鎖ＤＮＡは消化しないＳ１ヌクレアーゼ又はその他
の酵素での処理を伴って又は伴わずに、洗浄することに
よって行なうことができる。
液体媒質中では、細胞ＤＮＡ又はＲＮＡのフラグメント
に対合された本発明に基づくプローブの雑種は、さまざ
まな方法で、例えば水酸化リン灰石（ヒドロキシアパタ
イト）でのクロマトグラフィによって、液体媒質の残り
から分離されうる。
に対合された本発明に基づくプローブの雑種は、さまざ
まな方法で、例えば水酸化リン灰石（ヒドロキシアパタ
イト）でのクロマトグラフィによって、液体媒質の残り
から分離されうる。
次に、交雑されたプローブはプローブ上の標識を用いて
検出される。
検出される。
本発明に基づく標識づけされたプローブが誘導されたも
とであるＲＮＡフラグメントに対しコード化する遺伝子
を有するナイセリア染色体ＤＮＡフラグメントと標的に
するためには、ＤＮＡを単数又は複数の酵素により処理
しＤＮＡフラグメントを変性させた（すなわち画調の分
離）後、本発明に基づくプローブの１つは、交雑を可能
にする条件の下でＤＮＡフラグメントと接触させられ、
交雑の終りにまでたどりつくのに必要な時間の後、交雑
されなかったフラグメントは交雑されたフラグメントか
ら分離され、細胞の検出について上述されてきたように
標識が検出される。
とであるＲＮＡフラグメントに対しコード化する遺伝子
を有するナイセリア染色体ＤＮＡフラグメントと標的に
するためには、ＤＮＡを単数又は複数の酵素により処理
しＤＮＡフラグメントを変性させた（すなわち画調の分
離）後、本発明に基づくプローブの１つは、交雑を可能
にする条件の下でＤＮＡフラグメントと接触させられ、
交雑の終りにまでたどりつくのに必要な時間の後、交雑
されなかったフラグメントは交雑されたフラグメントか
ら分離され、細胞の検出について上述されてきたように
標識が検出される。
一般的に言って、本発明に基づくさまざまなプローブは
、網羅されている用途において異種ＤＮＡの存在がプロ
ーブの特異性に対する有害物でない場合、そのクローニ
ングを可能にする組換え型ＤＮＡの中にも含まれつる。
、網羅されている用途において異種ＤＮＡの存在がプロ
ーブの特異性に対する有害物でない場合、そのクローニ
ングを可能にする組換え型ＤＮＡの中にも含まれつる。
さらに厳密に言うと、以下に挙げる例は、それぞれプロ
ーブＮｏ、ｌ 、 Ｎｏ、２． Ｎｏ、３． Ｎｏ、４
．Ｎｏ、５゜Ｎｏ、６． Ｎｏ、７．Ｎｏ、８． Ｎｏ
、９． Ｎｏ、１０． Ｎｏ、１１ 、 Ｎｏ。
ーブＮｏ、ｌ 、 Ｎｏ、２． Ｎｏ、３． Ｎｏ、４
．Ｎｏ、５゜Ｎｏ、６． Ｎｏ、７．Ｎｏ、８． Ｎｏ
、９． Ｎｏ、１０． Ｎｏ、１１ 、 Ｎｏ。
１２、 Ｎｏ、１３． Ｎｏ、１４． Ｎｏ、１
５． Ｎｏ、１６． Ｎｏ、１７及びＮｏ、 １８
として上述され以下にも言及されている配列（１）、（
２）、（３）、（４）。
５． Ｎｏ、１６． Ｎｏ、１７及びＮｏ、 １８
として上述され以下にも言及されている配列（１）、（
２）、（３）、（４）。
（５）、（６）、（７）、（８）、（９）。
（１０）、（１１）、（１２）、、（１３）。
（１４）、（１５）、（１６）、（１７）及び（１８）
にぞれぞれ相当する本発明に基づくプローブの調製に関
するものである。
にぞれぞれ相当する本発明に基づくプローブの調製に関
するものである。
Ｒｏｓｓａｕ他（１９８６年）により記されているよう
に以下の菌株を培養した：ナイセリア・ゴル工ＮＣＴＣ
８３７５”、ナイセリア・メニンシティディス ＮＣＴ
Ｃ１００２５’、ナイセリア・ラククミカ ＮＣＴＣ１
０６１７”、ナイセリア・ムコーサ ＣＩＰ ５９．
５１’、ナイセリア・サブフラバ ＡＴＣＣ１０５５５
，ナイセリア・フラグメント ＡＴＣＣ１３１２０”、
ナイセリア・エロンガータ亜種エロンガータ ＮＣＴＣ
１０６６０”及びモラクセラ（ブランハメラ）カタラ−
リス ＮＣＴＣ４１０３，ランダムに選択した８つのナ
イセリア・ゴル工菌株と９つのナイセリア・メニンシテ
ィディス菌株（異なる血清型からの）を、ベルギーのア
ントワープ市の熱帯医療インスティチュートにおいて、
−晩血清寒天平板上で培養した。菌種の同定を従来の方
法でチエツクした。残りの菌株からの純化されたゲノム
ＤＮＡは、Ｊ、 Ｄｅ Ｌｅｙ （ベルギー ゲント
州立大学、微生物学研究所）により提供された。
に以下の菌株を培養した：ナイセリア・ゴル工ＮＣＴＣ
８３７５”、ナイセリア・メニンシティディス ＮＣＴ
Ｃ１００２５’、ナイセリア・ラククミカ ＮＣＴＣ１
０６１７”、ナイセリア・ムコーサ ＣＩＰ ５９．
５１’、ナイセリア・サブフラバ ＡＴＣＣ１０５５５
，ナイセリア・フラグメント ＡＴＣＣ１３１２０”、
ナイセリア・エロンガータ亜種エロンガータ ＮＣＴＣ
１０６６０”及びモラクセラ（ブランハメラ）カタラ−
リス ＮＣＴＣ４１０３，ランダムに選択した８つのナ
イセリア・ゴル工菌株と９つのナイセリア・メニンシテ
ィディス菌株（異なる血清型からの）を、ベルギーのア
ントワープ市の熱帯医療インスティチュートにおいて、
−晩血清寒天平板上で培養した。菌種の同定を従来の方
法でチエツクした。残りの菌株からの純化されたゲノム
ＤＮＡは、Ｊ、 Ｄｅ Ｌｅｙ （ベルギー ゲント
州立大学、微生物学研究所）により提供された。
２）ＤＫ八へ遷ｌ
主としてＭａｒｍｕｒが記している方法（１９６１年）
によって高分子量のゲノムＤＮＡを調製した。プラスミ
ドＤＮＡは、Ｋａｈｎ他（１９７９年）により記されて
いる方法によって分離させ、ＣｓＣβ−勾配遠心分離に
より純化させた。
によって高分子量のゲノムＤＮＡを調製した。プラスミ
ドＤＮＡは、Ｋａｈｎ他（１９７９年）により記されて
いる方法によって分離させ、ＣｓＣβ−勾配遠心分離に
より純化させた。
３）ニトロセルロース への ＤＮＡのＤＮＡ溶液を
９５℃で１０分間加熱し、氷上に置き、６×ＳＳＣ（Ｓ
ＳＣ：０．１５ＭのＮａＣｆ２、Ｏ，０１５Ｍのクエン
酸ナトリウム、ｐＨ７，０）に調整した。適量の溶液を
ドツトスポットマニホルド内でＢＡ８５膜（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ ＆５ｃｈｕｅ１１．西ドイツ）に適用した
。空気乾燥の後、膜を８０℃で２時間焼成した。
９５℃で１０分間加熱し、氷上に置き、６×ＳＳＣ（Ｓ
ＳＣ：０．１５ＭのＮａＣｆ２、Ｏ，０１５Ｍのクエン
酸ナトリウム、ｐＨ７，０）に調整した。適量の溶液を
ドツトスポットマニホルド内でＢＡ８５膜（Ｓｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ ＆５ｃｈｕｅ１１．西ドイツ）に適用した
。空気乾燥の後、膜を８０℃で２時間焼成した。
４） ＮＧＤＩ び ＮＧＫ３の
プラスミドｐＮＧＤｌ及びｐＮＧＫ３は、それぞれイン
サートとしてプローブＮ０１３及びＮ０１６を含んでい
る。これらはそれぞれ、ナイセリア・ゴルエ ＮＣＴＣ
８３７５”の１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の一部を含むｐ
Ｔ Ｚ ｌ ８ Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スエーデ
ン）により誘導された組換え型プラスミドであるｐＮＧ
４及びｐＮＧ３から作られた。
サートとしてプローブＮ０１３及びＮ０１６を含んでい
る。これらはそれぞれ、ナイセリア・ゴルエ ＮＣＴＣ
８３７５”の１６ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の一部を含むｐ
Ｔ Ｚ ｌ ８ Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スエーデ
ン）により誘導された組換え型プラスミドであるｐＮＧ
４及びｐＮＧ３から作られた。
ｐＮＧＤｌの場合、７１塩基対の５ｔｕＩ−ＫｐｎＩフ
ラグメントをサブクローニングさせ、５ｔｕＩ部位から
始まる２５の塩基対を次にＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ
ＩＩ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 ＵＳＡ ）及び緑豆
ヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 ＵＳＡ ）に
よる処理によって除去した。ｐＮＧＫ３の構成のために
は、同様にして６３の塩基対をｐＮＧ３のインサートの
３′末端から除去した。その結果得られたプラスミドは
Ｓｐｈ ｒ及びＢｓｔＸＩでへき開させ、その後接着末
端を鈍化させ分子間結紮を行なった。制限酵素は、 Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ （西ドイツ
）又はＢｉｏ Ｌａｂｓ （Ｕ、 Ｓ、 Ａ、 ）から
購入し、供給業者が推奨するとおりに使用した。
ラグメントをサブクローニングさせ、５ｔｕＩ部位から
始まる２５の塩基対を次にＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ
ＩＩ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 ＵＳＡ ）及び緑豆
ヌクレアーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 ＵＳＡ ）に
よる処理によって除去した。ｐＮＧＫ３の構成のために
は、同様にして６３の塩基対をｐＮＧ３のインサートの
３′末端から除去した。その結果得られたプラスミドは
Ｓｐｈ ｒ及びＢｓｔＸＩでへき開させ、その後接着末
端を鈍化させ分子間結紮を行なった。制限酵素は、 Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ （西ドイツ
）又はＢｉｏ Ｌａｂｓ （Ｕ、 Ｓ、 Ａ、 ）から
購入し、供給業者が推奨するとおりに使用した。
５）Ｄ凡戊配憇二鳳２
Ｇｅｍ Ｓｅｑ Ｋ／ＲＴ”の配列骨はシステム技術指
導書（Ｐｒｏｍｅｇａ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）に記されてい
るようにスーパーコイルプラスミドＤＮＡについてのジ
デオキシ鎖終結方法により、ｐＮＧＤｌ及びｐＮＧＫ３
のインサートを配列づけした。
導書（Ｐｒｏｍｅｇａ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）に記されてい
るようにスーパーコイルプラスミドＤＮＡについてのジ
デオキシ鎖終結方法により、ｐＮＧＤｌ及びｐＮＧＫ３
のインサートを配列づけした。
６）才１ゴヌクレオチドのＡ と
オリゴヌクレオチドは、遺伝子アセンブラ１８−５８０
０−０１ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）又は
サイクロン８４００ （Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、１において亜リン酸塩−トリエステルに
より合成させた。保護の除去されたオリゴヌクレオチド
を７Ｍの尿素内の１５％のポリアクリルアミドゲル上で
純化させた。−晩中溶離させた後、これらを５ｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン
）カラム上で脱塩した。
０−０１ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）又は
サイクロン８４００ （Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、１において亜リン酸塩−トリエステルに
より合成させた。保護の除去されたオリゴヌクレオチド
を７Ｍの尿素内の１５％のポリアクリルアミドゲル上で
純化させた。−晩中溶離させた後、これらを５ｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン
）カラム上で脱塩した。
７）プローブの声＝ ・レ
プローブとして用いられる合成オリゴヌクレオチドは、
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
、スエーデン）及びガン？ ２２ ｐ −ｄ Ａ Ｔ
Ｐ （Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリス）を用いて標識づ
けする。 （Ｍａｎｉａｔｉｓ他、 １９８２年）交雑
の間のベクター配列による妨害を除外するため、ｐＮＧ
Ｄｌ及びｐＮＧＫ３のインサートを制限酵素を用いて切
りとり、アガロースゲル電気泳動により浄化させた。浄
化されたインサートは、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、西ドイツ）を用いて接
着末端をアルファー３２ｐ−ｄ Ａ Ｔ ｐ （Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ、イギリス）で充填することにより標識づけ
した（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、 １９８２年）、内含され
なかった標識はＢｌｏ−Ｇｅ１ Ｐ−６ＤＧ（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ研究所、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）のスピンカラムを用い
て除去した。
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
、スエーデン）及びガン？ ２２ ｐ −ｄ Ａ Ｔ
Ｐ （Ａｍｅｒｓｈａｍ、イギリス）を用いて標識づ
けする。 （Ｍａｎｉａｔｉｓ他、 １９８２年）交雑
の間のベクター配列による妨害を除外するため、ｐＮＧ
Ｄｌ及びｐＮＧＫ３のインサートを制限酵素を用いて切
りとり、アガロースゲル電気泳動により浄化させた。浄
化されたインサートは、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、西ドイツ）を用いて接
着末端をアルファー３２ｐ−ｄ Ａ Ｔ ｐ （Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ、イギリス）で充填することにより標識づけ
した（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、 １９８２年）、内含され
なかった標識はＢｌｏ−Ｇｅ１ Ｐ−６ＤＧ（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ研究所、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）のスピンカラムを用い
て除去した。
８）ヌＪ填二
使用されるプローブの性質に条件を合わせたこと以外、
全ての実験において一般的な交雑プロトフルに従った。
全ての実験において一般的な交雑プロトフルに従った。
３０分から４時間、交雑と同じ温度で、プラスチック袋
の中で、３×ＳＳＣ１２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７，
１（ＦＢ）、２０％の脱イオンホルムアミド（ＦＡ）、
０．０２％のフィコール、０．０２％のウシ血清アルブ
ミン、０．０２％のポリビニルピロリドンそして０，１
ｍｇ／−のせん断され変性されたサケ精子ＤＮＡ内にて
、通常予備交雑を行なった。交雑は、同じ溶液に約０．
５〜Ｉ Ｘ １０’ｃｐｍ／−の３２ ｐ−プローブ
を加えた中で一時間から一晩の間行なった。交雑温度（
ＨＴ）は、実験によって異なっていた。
の中で、３×ＳＳＣ１２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７，
１（ＦＢ）、２０％の脱イオンホルムアミド（ＦＡ）、
０．０２％のフィコール、０．０２％のウシ血清アルブ
ミン、０．０２％のポリビニルピロリドンそして０，１
ｍｇ／−のせん断され変性されたサケ精子ＤＮＡ内にて
、通常予備交雑を行なった。交雑は、同じ溶液に約０．
５〜Ｉ Ｘ １０’ｃｐｍ／−の３２ ｐ−プローブ
を加えた中で一時間から一晩の間行なった。交雑温度（
ＨＴ）は、実験によって異なっていた。
３×ＳＳＣ１２５ｍ＆ｌのＦＢ及び２０％のＦＡの中で
の室温での簡単な洗浄の後、膜を、１５〜３０分の開国
に示されている洗浄温度（ＷＴ）にて３×ＳＳＣ１２５
ｍＭのＦＢ及び２０％のＦＡの中で洗浄した。その後、
膜を約１０分間室温で１．５×ＳＳＣ内で洗浄し、乾燥
させてからオートラジオグラフィに付した。
の室温での簡単な洗浄の後、膜を、１５〜３０分の開国
に示されている洗浄温度（ＷＴ）にて３×ＳＳＣ１２５
ｍＭのＦＢ及び２０％のＦＡの中で洗浄した。その後、
膜を約１０分間室温で１．５×ＳＳＣ内で洗浄し、乾燥
させてからオートラジオグラフィに付した。
■＝
ｌ）１里に亙スユ二ノ：
ナイセリア・ゴル工に対し特異性をもつプローブを選択
するため、ナイセリア・ゴル工の基準菌株のｒＲＮＡシ
ストロンをクローニングし配列付けした。シストロン内
の進化的に保存度の低い領域を、既知の配列との整列に
より識別した。領域のいくつかはサブクローニングする
（プローブＮｏ、 ３及び６）か又は化学的に合成させ
（プローブＮｏ、１．２，４．５．７．８，９，１０゜
１１．１２．１３，１４．１５，１６．１７及び１８）
、交雑プローブとして用いた。第１図は、ＤＮＡプロー
ブが構築されエシェリキア・コリ（大腸菌）の１６ｓ
ｒＲＮＡ２次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている（ Ｗｏｅｓｅ他、１９８３年
）。これらの領域は、太線により示されており、ローマ
数字で番号づけされている。プローブＮｏ、 ９は領域
Ｉから導き出され、プローブＮｏ、 １からＮｏ、 ４
は、領域ＩＩからそしてプローブＮｏ、 ５及びＮｏ、
６はそれぞれ領域ＩＩＩ及びＩＶから導き出されたも
のである。
するため、ナイセリア・ゴル工の基準菌株のｒＲＮＡシ
ストロンをクローニングし配列付けした。シストロン内
の進化的に保存度の低い領域を、既知の配列との整列に
より識別した。領域のいくつかはサブクローニングする
（プローブＮｏ、 ３及び６）か又は化学的に合成させ
（プローブＮｏ、１．２，４．５．７．８，９，１０゜
１１．１２．１３，１４．１５，１６．１７及び１８）
、交雑プローブとして用いた。第１図は、ＤＮＡプロー
ブが構築されエシェリキア・コリ（大腸菌）の１６ｓ
ｒＲＮＡ２次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている（ Ｗｏｅｓｅ他、１９８３年
）。これらの領域は、太線により示されており、ローマ
数字で番号づけされている。プローブＮｏ、 ９は領域
Ｉから導き出され、プローブＮｏ、 １からＮｏ、 ４
は、領域ＩＩからそしてプローブＮｏ、 ５及びＮｏ、
６はそれぞれ領域ＩＩＩ及びＩＶから導き出されたも
のである。
第２図では、本発明に従ったプローブＮｏ、 １ 。
Ｎｏ、２． Ｎｏ、３． Ｎｏ、４． Ｎｏ、５． Ｎ
ｏ、６及びＮｏ、 ９の相補的配列が、１６ｓ ｒＲ
ＮＡ配列を公開した元であるナイセリアの最も近い系統
発生的隣接基であるシュードモナス・テストステロニ
ＡＴＣＣ１１９９６の相応する配列（Ｙａｎｇ他、 １
９８５年）及び大腸菌の相応する配列（Ｂｒｏｓｉｕｓ
他、 １９７８年）と整列されている。
ｏ、６及びＮｏ、 ９の相補的配列が、１６ｓ ｒＲ
ＮＡ配列を公開した元であるナイセリアの最も近い系統
発生的隣接基であるシュードモナス・テストステロニ
ＡＴＣＣ１１９９６の相応する配列（Ｙａｎｇ他、 １
９８５年）及び大腸菌の相応する配列（Ｂｒｏｓｉｕｓ
他、 １９７８年）と整列されている。
第・３図では、２３ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から誘導され
たプローブＮｏ、７ 、 Ｎｏ、８ 、 Ｎｏ、 １０
及びＮｏ、１１の相補性配列が、相応する大腸菌配列（
Ｂｒｏｓｉｕｓ他、 １９８０年）と整列されている。
たプローブＮｏ、７ 、 Ｎｏ、８ 、 Ｎｏ、 １０
及びＮｏ、１１の相補性配列が、相応する大腸菌配列（
Ｂｒｏｓｉｕｓ他、 １９８０年）と整列されている。
１６ｓ ｒＲＮＡの領域ＩＩ （第１図）から異なる
長さの４つのプローブ（それぞれプローブＮｏ、ｌ 、
Ｎｏ、２． Ｎｏ、３及びＮｏ、 ４について２７，
３７゜４７及び５７の塩基）をテストした。プローブＮ
ｏ、 ７及びＮｏ、 ８は２Ｂｓ ｒＲＮＡ内の同じ
領域から誘導された。プローブＮｏ、 ８の配列は、ア
デノシン残基が挿入されたこと以外、プローブＮｏ、
７の配列と同じである（第３図参照）、その地金ての領
域からは１つのプローブしか実験に使用しなかった。
長さの４つのプローブ（それぞれプローブＮｏ、ｌ 、
Ｎｏ、２． Ｎｏ、３及びＮｏ、 ４について２７，
３７゜４７及び５７の塩基）をテストした。プローブＮ
ｏ、 ７及びＮｏ、 ８は２Ｂｓ ｒＲＮＡ内の同じ
領域から誘導された。プローブＮｏ、 ８の配列は、ア
デノシン残基が挿入されたこと以外、プローブＮｏ、
７の配列と同じである（第３図参照）、その地金ての領
域からは１つのプローブしか実験に使用しなかった。
第１１図は、ナイセリア・ゴル工の予定の１６ｓ ｒ
ＲＮＡ組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。
ＲＮＡ組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。
これらの領域は太線で示され、ローマ数字で番号付けさ
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
第１２図は、本発明のプローブが大腸菌の２３ｓ ｒ
ＲＮＡ二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている（Ｎｏ１１ｅｒ、 ＡｎｎＲｅｖ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 ５３： １１９−１１６．１９８４
） 。
ＲＮＡ二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている（Ｎｏ１１ｅｒ、 ＡｎｎＲｅｖ、 Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 ５３： １１９−１１６．１９８４
） 。
これらの領域は太線で示され、ローマ数字で番号付けさ
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
２）１三ニス五立異ユニ
ａ、１）プローブＮｏ、 ７からＮｏ、１１までの研究
：特異性についての基準は、ナイセリア・ゴル工とナイ
セリア・メニンシティディス菌株を識別する能力であっ
た。いくつかの独立した研究によリ（Ｋｉｎｇｓｋｕｒ
ｙ、 １９６７年ＨＥｌｗｅ１１ ＆ Ｆａｌｋｏｗ、
１９７７年ＨＨｏｋｅ ＆ Ｖｅｄｒｏｓ、１９８２年
； Ｒｉｏｕ他、 １９８３年；Ｇｕｉｂｏｕｒｄｅｎ
ｃｈｅ他、 １９８６年）、その全く異なる病原性にも
かかわらず両方の種が遺伝子型においてきわめて関係の
強いものであることがわかった。
：特異性についての基準は、ナイセリア・ゴル工とナイ
セリア・メニンシティディス菌株を識別する能力であっ
た。いくつかの独立した研究によリ（Ｋｉｎｇｓｋｕｒ
ｙ、 １９６７年ＨＥｌｗｅ１１ ＆ Ｆａｌｋｏｗ、
１９７７年ＨＨｏｋｅ ＆ Ｖｅｄｒｏｓ、１９８２年
； Ｒｉｏｕ他、 １９８３年；Ｇｕｉｂｏｕｒｄｅｎ
ｃｈｅ他、 １９８６年）、その全く異なる病原性にも
かかわらず両方の種が遺伝子型においてきわめて関係の
強いものであることがわかった。
両種の代表間について報告されたＤＮＡ ： ＤＮＡの
交雑相同値は６４％から９３％である。これらの値は、
同じ種のメンバーの間で見られることの多いものである
。ただし、「１つの種は一般に約７０％以上のＤＮＡ−
ＤＮＡ関係性及び５℃以下のデルタＴｍをもつ菌種を含
んでいる」と言っている種の定義づけ（Ｗａｙｎｅ他、
１９８７年）についての合意が達成されていることも
喚起しておきたい。この定義に従うと、ナイセリア・ゴ
ル工及びナイセリア・メニンシティディスは、１つの同
じ種の亜種であるとみなされるべきである（ＧｕｉＢｏ
ｕｒｄｅｎｃｈｅ他、 １９８６年）。
交雑相同値は６４％から９３％である。これらの値は、
同じ種のメンバーの間で見られることの多いものである
。ただし、「１つの種は一般に約７０％以上のＤＮＡ−
ＤＮＡ関係性及び５℃以下のデルタＴｍをもつ菌種を含
んでいる」と言っている種の定義づけ（Ｗａｙｎｅ他、
１９８７年）についての合意が達成されていることも
喚起しておきたい。この定義に従うと、ナイセリア・ゴ
ル工及びナイセリア・メニンシティディスは、１つの同
じ種の亜種であるとみなされるべきである（ＧｕｉＢｏ
ｕｒｄｅｎｃｈｅ他、 １９８６年）。
第１の一連の実験においては、ナイセリア・ゴルエ Ｎ
ＣＴＣ８３７５”（ＮＧ）、ナイセリア・メニンシティ
ディス ＮＣＴＣ１００２５”（ＮＭ）及び大腸菌Ｂ
（ＥＣ）の変性ＤＮＡを１９ｇ謹上にスポツティングし
、第４図に示されているプローブと温度（交雑温度）で
交雑させた。
ＣＴＣ８３７５”（ＮＧ）、ナイセリア・メニンシティ
ディス ＮＣＴＣ１００２５”（ＮＭ）及び大腸菌Ｂ
（ＥＣ）の変性ＤＮＡを１９ｇ謹上にスポツティングし
、第４図に示されているプローブと温度（交雑温度）で
交雑させた。
交雑の後、膜を１５分間異なる温度（ＷＴ）で洗浄し、
乾燥させ、２４時間−７０℃で増感スクリーンを用いて
オートラジオグラフィーに付した。第４図のオートラジ
オグラフから、１６ｓｒＲＮＡの領域１．Ｈ及びＩＩＩ
（第１図）から誘導された全てのプローブ（プローブ
Ｎｏ、 １〜５及びプローブＮｏ、 ９ ）及び２３ｓ
ｒＲＮＡの１つのプローブ（Ｎｏ、１１）は、次の
ような適切な洗浄温度においてナイセリア・ゴル工に対
して特異的であることが明らかであるニ ブローブＮｏ、 １については、５５℃、６０”Ｃ及び
６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、 ２については、６０℃、６５℃及び７
０℃の洗浄温度、 プローブＮ０１３については、６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、 ４については、７０℃及び７５℃の洗
浄温度、 プローブＮｏ、 ５については、６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、 ９については、６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、１１については、６５°Ｃの洗浄温度。
乾燥させ、２４時間−７０℃で増感スクリーンを用いて
オートラジオグラフィーに付した。第４図のオートラジ
オグラフから、１６ｓｒＲＮＡの領域１．Ｈ及びＩＩＩ
（第１図）から誘導された全てのプローブ（プローブ
Ｎｏ、 １〜５及びプローブＮｏ、 ９ ）及び２３ｓ
ｒＲＮＡの１つのプローブ（Ｎｏ、１１）は、次の
ような適切な洗浄温度においてナイセリア・ゴル工に対
して特異的であることが明らかであるニ ブローブＮｏ、 １については、５５℃、６０”Ｃ及び
６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、 ２については、６０℃、６５℃及び７
０℃の洗浄温度、 プローブＮ０１３については、６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、 ４については、７０℃及び７５℃の洗
浄温度、 プローブＮｏ、 ５については、６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、 ９については、６５℃の洗浄温度、 プローブＮｏ、１１については、６５°Ｃの洗浄温度。
比較すると、第４図のオートラジオグラフは、プローブ
Ｎｏ、６．Ｎｏ、７．Ｎｏ、８及びＮｏ、 １０がナイ
セリア・ゴル工に対し特異性を持たないことを示してい
る。
Ｎｏ、６．Ｎｏ、７．Ｎｏ、８及びＮｏ、 １０がナイ
セリア・ゴル工に対し特異性を持たないことを示してい
る。
ランダムに選択したナイセリア・ゴル工及びナイセリア
・メニンシティディス菌株からのゲノムＤＮＡとプロー
ブＮｏ、 １ 、 Ｎｏ、 ５及びＮＯ１９の交雑結果
は、第５図に示されている。９つのナイセリア・ゴル工
菌株（行Ａ、Ｂ及びＣ，１〜３）、１０・個のナイセリ
ア・メニンシティディス菌株（Ｄ、Ｅ及びＦ、１〜３及
び行Ｇ、１）及びシュードモナス・テストステロニ（行
Ｇ、２）及び大腸菌（行Ｇ、３）からの変性ＤＮＡを１
μｇ、ニトロセルロース上にスポツティングし、プロー
ブ１（パネルＡ）、プローブＮ［＋、５（パネルＢ）及
びプローブＮｏ、９（パネルＣ）とそれぞれ５０℃。
・メニンシティディス菌株からのゲノムＤＮＡとプロー
ブＮｏ、 １ 、 Ｎｏ、 ５及びＮＯ１９の交雑結果
は、第５図に示されている。９つのナイセリア・ゴル工
菌株（行Ａ、Ｂ及びＣ，１〜３）、１０・個のナイセリ
ア・メニンシティディス菌株（Ｄ、Ｅ及びＦ、１〜３及
び行Ｇ、１）及びシュードモナス・テストステロニ（行
Ｇ、２）及び大腸菌（行Ｇ、３）からの変性ＤＮＡを１
μｇ、ニトロセルロース上にスポツティングし、プロー
ブ１（パネルＡ）、プローブＮ［＋、５（パネルＢ）及
びプローブＮｏ、９（パネルＣ）とそれぞれ５０℃。
５５℃及び６０°Ｃで交雑させ、示された温度で洗浄し
た。第５図のオートラジオグラフは、プローブＮｏ、
１ 、 Ｎｏ、 ５及びＮｏ、 ９が、テストされた全
てのナイセリア・ゴル工菌株からのＤＮＡと二重らせん
化することを示している。プローブＮｏ、 ５及びＮｏ
、 ９は、厳しい条件の下でのみ（例えばプローブＮｏ
、 ５の場合５５゛Ｃの交雑温度、６５℃の洗浄温度）
ナイセリア・ゴル工菌株に対する特異性をもち、一方ブ
ローブＮｏ、 １はさほど厳しくない条件（５０°Ｃの
交雑温度、５０’Ｃ又は５５℃の洗浄温度）で特異性を
保つ、ｒＲＮＡシストロン内の配列保存を考えると、後
者のプローブが、これらの厳しくない条件の下でその他
のナイセリア・ゴル工菌株からの核酸との安定した二重
らせんを形成しない可能性は低いと思われる。
た。第５図のオートラジオグラフは、プローブＮｏ、
１ 、 Ｎｏ、 ５及びＮｏ、 ９が、テストされた全
てのナイセリア・ゴル工菌株からのＤＮＡと二重らせん
化することを示している。プローブＮｏ、 ５及びＮｏ
、 ９は、厳しい条件の下でのみ（例えばプローブＮｏ
、 ５の場合５５゛Ｃの交雑温度、６５℃の洗浄温度）
ナイセリア・ゴル工菌株に対する特異性をもち、一方ブ
ローブＮｏ、 １はさほど厳しくない条件（５０°Ｃの
交雑温度、５０’Ｃ又は５５℃の洗浄温度）で特異性を
保つ、ｒＲＮＡシストロン内の配列保存を考えると、後
者のプローブが、これらの厳しくない条件の下でその他
のナイセリア・ゴル工菌株からの核酸との安定した二重
らせんを形成しない可能性は低いと思われる。
分類群特異的ｒＲＮＡ誘導ＤＮＡプローブが、密に関係
する生体からの核酸を検出しない場合、それがより遠い
生体からの核酸を検出する確率はきわめて低いと考える
ことができる。このことは、プローブＮｏ、３． Ｎｏ
、５． Ｎｏ、６及びＮｏ、 ７を７つのナイセリア種
とその他のい（つかのゲノム陰性菌のゲノムＤＮＡと交
雑させた一つの実験に相応する第６図をみればわかる。
する生体からの核酸を検出しない場合、それがより遠い
生体からの核酸を検出する確率はきわめて低いと考える
ことができる。このことは、プローブＮｏ、３． Ｎｏ
、５． Ｎｏ、６及びＮｏ、 ７を７つのナイセリア種
とその他のい（つかのゲノム陰性菌のゲノムＤＮＡと交
雑させた一つの実験に相応する第６図をみればわかる。
さらに厳密に言うと、第６図は、ニトロセルロース上で
スポツティングされ指示された温度及びプローブで交雑
され指示された温度で洗浄されたナイセリア・ゴル工Ｎ
ＣＴＣ８３７５”（行Ａ、ｌ）、ナイセリア・メニンシ
ティディス ＮＣＴＣ１００２５”（行Ｂ、１〕、ナイ
セリア・ラクタミカ ＮＣＴＣ１０６１７”（行Ｃ，ｌ
）、ナイセリア・ムコーサＣＩＰ ５９．５１”（行
り、１）、ナイセリア・サブフラバ ＡＴＣＣ１０５５
５（行Ｅ、１１、ナイセリア・フラベツセンス ＡＴＣ
Ｃ１３１２０”（行Ｆ、１）、ナイセリア・エロンガー
タ亜種エロンガータ ＮＣＴＣ１０６６０”（行Ａ、２
）、クロモバクテリウム・ビオラセウム ＮＣＴＣ９７
５７”（行Ｂ、２）、 シュードモナス・テストステ
ロニ ＡＴＣＣ１７４０７（行Ｃ，２）、ヘモフィルス
・デュクレイイＣＩＰ ５４２ （行り、２）、モラ
クセラ（プランハメラ）カタラーリス ＮＣＴＣ４１０
３（行Ｅ、２）及び大腸菌Ｂ（行Ｆ、２）の変性ＤＮＡ
１ｕＣと、選択されたｒＲＮＡ誘導ＤＮＡプローブの交
雑結果を表わしている。使用された条件の下で、プロー
ブＮｏ、 ３及びＮｏ、 ５は、ナイセリア・ゴルより
ＮＡ以外のテストされたＤＮＡのいずれとも安定した複
式を形成しなかった。特異性がさらに低いプローブ（Ｎ
０６及びＮｏ、 ７ ）でさえ、非ナイセリアＤＮＡと
検出可能な信号を生成しなかった。又プローブＮｏ、
６が実際、３ＳＳＣと２０％ＦＡ内で６０℃でサイモン
シェラ・クラッサの基準株からのＤＮＡと交雑したこと
も言及しておかなくてはならない。
スポツティングされ指示された温度及びプローブで交雑
され指示された温度で洗浄されたナイセリア・ゴル工Ｎ
ＣＴＣ８３７５”（行Ａ、ｌ）、ナイセリア・メニンシ
ティディス ＮＣＴＣ１００２５”（行Ｂ、１〕、ナイ
セリア・ラクタミカ ＮＣＴＣ１０６１７”（行Ｃ，ｌ
）、ナイセリア・ムコーサＣＩＰ ５９．５１”（行
り、１）、ナイセリア・サブフラバ ＡＴＣＣ１０５５
５（行Ｅ、１１、ナイセリア・フラベツセンス ＡＴＣ
Ｃ１３１２０”（行Ｆ、１）、ナイセリア・エロンガー
タ亜種エロンガータ ＮＣＴＣ１０６６０”（行Ａ、２
）、クロモバクテリウム・ビオラセウム ＮＣＴＣ９７
５７”（行Ｂ、２）、 シュードモナス・テストステ
ロニ ＡＴＣＣ１７４０７（行Ｃ，２）、ヘモフィルス
・デュクレイイＣＩＰ ５４２ （行り、２）、モラ
クセラ（プランハメラ）カタラーリス ＮＣＴＣ４１０
３（行Ｅ、２）及び大腸菌Ｂ（行Ｆ、２）の変性ＤＮＡ
１ｕＣと、選択されたｒＲＮＡ誘導ＤＮＡプローブの交
雑結果を表わしている。使用された条件の下で、プロー
ブＮｏ、 ３及びＮｏ、 ５は、ナイセリア・ゴルより
ＮＡ以外のテストされたＤＮＡのいずれとも安定した複
式を形成しなかった。特異性がさらに低いプローブ（Ｎ
０６及びＮｏ、 ７ ）でさえ、非ナイセリアＤＮＡと
検出可能な信号を生成しなかった。又プローブＮｏ、
６が実際、３ＳＳＣと２０％ＦＡ内で６０℃でサイモン
シェラ・クラッサの基準株からのＤＮＡと交雑したこと
も言及しておかなくてはならない。
第４図、５図及び６図に示されている結果から、プロー
ブの特異性が、使用される交雑及び洗浄条件にきわめて
依存していることは明らかである。例えば、洗浄温度を
単に変えるだけで、プローブの検出範囲を拡張すること
ができ、こうしてナイセリア・ゴル工を特異的に又はよ
り大きい類属の生体を検出するために１つの同じプロー
ブを用いることができることになる。このことは第７図
に例示されている。ここでは、ナイセリア・ゴルエ Ｎ
ＣＴＣ８３７５丁（Ｎ Ｇ ） 、ナイセリア・メニン
シティディス ＮＣＴＣｌ ００２５”（ＮＭ） 、ナ
イセリア・エロンガーク亜種エロンガーク ＮＣＴＣ１
０６６０（ＮＥ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム
ＮＣＴＣ９５７５°（ＣＶ）、シュードモナス・テスト
ステロニ ＡＴＣＣ１７４０７（ＰＴ）及び大腸菌Ｂ
（ＥＣ）からのドツトスポットされた変性Ｄ Ｎ Ａ
Ｉ １．１ｇを、５０℃でホルムアミドの無い状態で”
ｐ−標識付きプローブＮｏ、 ３と交雑させた。膜は乾
燥させて、増感スクリーンを用いて一７０℃で一晩オー
トラジオグラフに付した。この図から、洗浄温度が低下
するとプローブの特異性は減少するという結果が得られ
る。８０℃において、プローブＮｏ、 ３は、ナイセリ
ア・ゴル工のＤＮＡに対して特異性をもつ、７０℃では
このプローブはナイセリア・ゴル工及びナイセリア・メ
ニンシティディスのＤＮＡと二重らせん化し、６０℃で
は、テストされた３つのナイセリア種からのＤＮＡ二重
らせん化する。しかしながら、洗浄温度が５０℃である
場合非ナイセリアＤＮＡでさえ検出できた。
ブの特異性が、使用される交雑及び洗浄条件にきわめて
依存していることは明らかである。例えば、洗浄温度を
単に変えるだけで、プローブの検出範囲を拡張すること
ができ、こうしてナイセリア・ゴル工を特異的に又はよ
り大きい類属の生体を検出するために１つの同じプロー
ブを用いることができることになる。このことは第７図
に例示されている。ここでは、ナイセリア・ゴルエ Ｎ
ＣＴＣ８３７５丁（Ｎ Ｇ ） 、ナイセリア・メニン
シティディス ＮＣＴＣｌ ００２５”（ＮＭ） 、ナ
イセリア・エロンガーク亜種エロンガーク ＮＣＴＣ１
０６６０（ＮＥ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム
ＮＣＴＣ９５７５°（ＣＶ）、シュードモナス・テスト
ステロニ ＡＴＣＣ１７４０７（ＰＴ）及び大腸菌Ｂ
（ＥＣ）からのドツトスポットされた変性Ｄ Ｎ Ａ
Ｉ １．１ｇを、５０℃でホルムアミドの無い状態で”
ｐ−標識付きプローブＮｏ、 ３と交雑させた。膜は乾
燥させて、増感スクリーンを用いて一７０℃で一晩オー
トラジオグラフに付した。この図から、洗浄温度が低下
するとプローブの特異性は減少するという結果が得られ
る。８０℃において、プローブＮｏ、 ３は、ナイセリ
ア・ゴル工のＤＮＡに対して特異性をもつ、７０℃では
このプローブはナイセリア・ゴル工及びナイセリア・メ
ニンシティディスのＤＮＡと二重らせん化し、６０℃で
は、テストされた３つのナイセリア種からのＤＮＡ二重
らせん化する。しかしながら、洗浄温度が５０℃である
場合非ナイセリアＤＮＡでさえ検出できた。
下表Ｉは、本発明に基づくプローブがナイセリア・ゴル
工に対し特異性をもつ温度範囲をまとめたものである。
工に対し特異性をもつ温度範囲をまとめたものである。
各プローブについて、この温度範囲はＴｓとＴｄの間で
ある。Ｔｓはそのプローブがなおナイセリア・ゴル工に
対する特異性をもつ最低温度であり、Ｔｄは、ブローブ
ー標的二重らせんが完全に解離される温度である。これ
らの値は、３ＳＳＣ１２５ｍＭのＦＢ ｐＨ７，１及
び２０％のＦＡという条件の下で得られたものである。
ある。Ｔｓはそのプローブがなおナイセリア・ゴル工に
対する特異性をもつ最低温度であり、Ｔｄは、ブローブ
ー標的二重らせんが完全に解離される温度である。これ
らの値は、３ＳＳＣ１２５ｍＭのＦＢ ｐＨ７，１及
び２０％のＦＡという条件の下で得られたものである。
これらの条件、プローブ又は標的の性質が変化した場合
、温度もそれに応じて変化することになる。温度は、５
°Ｃの間隔、従ってＴｓとＴｄのデルタ５°Ｃ範囲を用
いて実験的に決定された。ブロープＮｏ、 ｌは又４５
°〜５０℃より低い温度で特異的である可能性があり、
プローブＮｏ、 ６ 、 Ｎｏ、 ７Ｎｏ、 ８及びＮ
ｏ、 １０はデイセリア・ゴル工に対し特異的でないこ
とに留意されたい。
、温度もそれに応じて変化することになる。温度は、５
°Ｃの間隔、従ってＴｓとＴｄのデルタ５°Ｃ範囲を用
いて実験的に決定された。ブロープＮｏ、 ｌは又４５
°〜５０℃より低い温度で特異的である可能性があり、
プローブＮｏ、 ６ 、 Ｎｏ、 ７Ｎｏ、 ８及びＮ
ｏ、 １０はデイセリア・ゴル工に対し特異的でないこ
とに留意されたい。
表 Ｉ
プローブ エ玉ｆｌ Ｔｄ四）
１ ４５−５０ ６５−Ｔ
。
。
８．２）プローブＮｏ１に関する結果
２０２のデイセリア・ゴル工菌株と８４のデイセリア・
メニンシティディス菌株を用いて、プローブＮｏ、 ４
をさらにテストした。
メニンシティディス菌株を用いて、プローブＮｏ、 ４
をさらにテストした。
以下の方法を用いた。
１０％のＳＤＳで飽和されたワットマン３ＭＭ口紙上に
３分装置いたＢｉｏｄｙｎｅ Ａ膜に対し各菌株の数個
のコロ；−を適用した。嵌装の後、膜を８０℃で２時間
焼成し、交雑混合物内で５３℃で約１〜２時間交雑させ
た。この混合物に対しては約１０ ’ｃｐｍ／Ｍｌ”ｐ
−標識付きプローブ（Ｎｏ、１）を付加した。
３分装置いたＢｉｏｄｙｎｅ Ａ膜に対し各菌株の数個
のコロ；−を適用した。嵌装の後、膜を８０℃で２時間
焼成し、交雑混合物内で５３℃で約１〜２時間交雑させ
た。この混合物に対しては約１０ ’ｃｐｍ／Ｍｌ”ｐ
−標識付きプローブ（Ｎｏ、１）を付加した。
その結果は、第１５図に示されている。第１５図におい
て、各々の番号はデイセリア・ゴル工又はデイセリア・
メニンシティディス菌株のいずれかを表わしている。デ
イセリア・メニンシティディス菌株には囲みがついてい
る。
て、各々の番号はデイセリア・ゴル工又はデイセリア・
メニンシティディス菌株のいずれかを表わしている。デ
イセリア・メニンシティディス菌株には囲みがついてい
る。
全てのデイセリア・ゴル工菌株は、３時間の露出の後（
増感スクリーンで一８０℃で）明白な陽信号を与えた。
増感スクリーンで一８０℃で）明白な陽信号を与えた。
デイセリア・メニンシティディス菌株のいずれも、−晩
中露出した後でさえ陽の結果を出さなかった。デイセリ
ア・メニンシティデイススポット中に検出可能な量のｒ
ＲＮＡが存在することが、非特異的ｒＲＮＡ−誘導プロ
ーブを用いて、その後確認された。
中露出した後でさえ陽の結果を出さなかった。デイセリ
ア・メニンシティデイススポット中に検出可能な量のｒ
ＲＮＡが存在することが、非特異的ｒＲＮＡ−誘導プロ
ーブを用いて、その後確認された。
その他の実験によって、プローブＮｏ、 １もナイセリ
ア種の菌株ＡＴＣＣ４３８３１のＤＮＡに対して交雑す
ることがわかった（第１６図参照）。
ア種の菌株ＡＴＣＣ４３８３１のＤＮＡに対して交雑す
ることがわかった（第１６図参照）。
第１６図には、プローブＮＯ３１とナイセリア種菌株Ａ
ＴＣＣ４３８３１のＤＮＡでの交雑結果が示されている
：交雑及び洗浄の温度は５２．５℃であった（３ＳＳＣ
１２５ｍＭのＰＢ、 ｐＨ７，１及び２０％のＦＡ中で
）。
ＴＣＣ４３８３１のＤＮＡでの交雑結果が示されている
：交雑及び洗浄の温度は５２．５℃であった（３ＳＳＣ
１２５ｍＭのＰＢ、 ｐＨ７，１及び２０％のＦＡ中で
）。
このＡＴＣＣ４３８３１菌株は、デイセリア・ゴル工と
デイセリア・メニンシティディスの間の中間的特性をも
つ未分類の菌株である。
デイセリア・メニンシティディスの間の中間的特性をも
つ未分類の菌株である。
第１７図に示されているように、プローブＮｏ、 １は
その他のさまざまな細菌のＤＮＡと交叉交雑しなかった
。
その他のさまざまな細菌のＤＮＡと交叉交雑しなかった
。
第１７図には、さまざまな細菌株のドツトスポットされ
たゲノムＤＮＡ １マイクログラムとプローブＮｏ、
１の交雑結果が示されている：菌株の位置は以下の表
ＩＩに示されており、交雑及び洗浄温度は５２．５℃で
あった（３ＳＳＣ１２５ｍＭＰＢ ｐＨ”ｒ、１及び
２０％のＦＡ内で）。
たゲノムＤＮＡ １マイクログラムとプローブＮｏ、
１の交雑結果が示されている：菌株の位置は以下の表
ＩＩに示されており、交雑及び洗浄温度は５２．５℃で
あった（３ＳＳＣ１２５ｍＭＰＢ ｐＨ”ｒ、１及び
２０％のＦＡ内で）。
表ＩＩ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴル工
ＩＴＧ ４３３９
ＩＴＧ ４０８５
ＩＴＧ ４３０８
ＩＴＧ ３９３９
ＩＴＧ ４３６３
ＩＴＧ ４３６７
ＩＴＧ ４４０１
１ＴＧ ４４３？
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
ＩＴＧ ３３４２
ＩＴＧ ３３４３
ＩＴＧ ３３４５
ＩＴＧ ３３４６
ＩＴＧ ３３４８
ＩＴＧ ３３４９
ＩＴＧ ３３５０
ＩＴＧ ３３５７
ＩＴＧ ３３６２
４０、 ＣＤＣ類Ｉ）：Ｅ Ｆ −４ａ４１、 キ
ンゲラ・デニトリフィカンス（Ｋｉｎｇｅ１１ａ ｄｅ
ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ１４２、キンゲラ・デニトリフ
ィカンス ４３ キンゲラ・キング （Ｋｉｎｇｅ１１ａ ｋｉｎｇａｅ１ ４４、サイモンシェラ・ムエレリ （Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌ！ａ ｍｕｅ１１ｅｒｉ１４５、
サイモンシェラ・クラッセ ｌｓｉｍｏｎｓｉｅ１１ａ ｃｒａｓｓｅ１４６、サイ
モンシエラ・スチーデ （Ｓｉｍｏｎｓｉｅ１１ａ ５ｔａｅｄａｅ１４７、サ
イモンシェラ穏 ４８、 アリシェラ・フィリフォルミス（Ａｌｙｓｉｅ
１１ａ ｆｉ１１ｆｏｒｍｉｓ１４９、 エイケネラ・
コロ−デンス （Ｅｉｋｅｎｅ１１ａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）５０、
エイケネラ・コロ−デンス ＣＤＣＴ−１９１／７８ ＮＣＴＣ１０９９５” ＮＣＴＣ１０９９７ ＮＣＴＣ１０５２９” ＡＴＣＣ２９４５２ ＡＴＣＣ１５５３３” ＡＴＣＣ２７３９８ ＡＴＣＣ２７３８１ ＣＣＵＧ ３７１０” ＮＣＴＣ１０５９６” ＮＩＭ ８０１−１ ５３、 アクアスビリリウム・デイスパー（Ａｑｕａ
ｓｐｉｒｉ１１ｕｍ ｄｉｓｐａｒｌシュードモナス・
テストステロニ （Ｐｓｅｕｄａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
１５５、オリゲラ・ウレトラリス （Ｏ１１ｇｅ１１ａ ｕｒｅｔｈｒａ１１ｉｓ）５６、
ヘモフィルス・デエクレイイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ｄｕｃｒａｙｉ１ＡＴＣＣ２７６５０ ＡＴＣ［： １７４０７ ＬＩＡＧ ［１２２７ ＣＩＰ ５４２” ２２、デイセリア・ラクタミカ ２３、デイセリア・ラクタミカ ２４、デイセリア・ラクタミカ ＮＣＴＣ１０６１７” ＩＴＧ ３６８９ ＩＴＧ ３６９０ ２７、デイセリア・ムコーサ ２８、デイセリア・ムコーサ ＣＩＰ ５９．４８ ０ＩＰ ５９．４７ デイセリア・フラベツセンス （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓｌＡＴＣ
Ｃ１３１２０” ３２、デイセリア・サブフラパ ３３、デイセリア・シツカ ＩＴＧ ３８２１ １ＴＧ ３３８２ ３６、 デイセリア・カニメ ＡＴＣＣ
１４６８７”（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃａｎｉｓ１ ３７、 デイセリア・アニマリス ＮＣＴＣ
１０２１２”（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ａｎｉｍａ１１ｓ
１３８、 デイセリア・デニトリフィカンス ＡＴＣＣ
１４６８６”（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆ
ｉｃａｎｓ１３９、 ＣＤＣ類属Ｍ −５ＣＣＩＪＧ
４００７５７゜ キンゲラ・インドロゲネス （Ｋｉｎｇｅ１１ａ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓｌＮＣＴ
Ｃ１０７１７τ フィルターエ ＵＩＩ上の の位 フィルターＩ フィルターＩＩ 結論として、使用された条件の下で、プローブＮｏ、
’ｌは、従来の識別技法に比ベナイセリア・ゴル工に対
し１００％の特異性と１００％の信頼性をもつことがわ
かった。このプローブは又、Ｔｏｔｔｅｎ他のＪ、 Ｉ
ｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ、、 １４８：４Ｂ２−４７３．
１９８３年に最初に記されたクリプテイック（潜在）プ
ラスミドプローブよりもさらに信頼性が高いものである
ことがわかった。
ンゲラ・デニトリフィカンス（Ｋｉｎｇｅ１１ａ ｄｅ
ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ１４２、キンゲラ・デニトリフ
ィカンス ４３ キンゲラ・キング （Ｋｉｎｇｅ１１ａ ｋｉｎｇａｅ１ ４４、サイモンシェラ・ムエレリ （Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌ！ａ ｍｕｅ１１ｅｒｉ１４５、
サイモンシェラ・クラッセ ｌｓｉｍｏｎｓｉｅ１１ａ ｃｒａｓｓｅ１４６、サイ
モンシエラ・スチーデ （Ｓｉｍｏｎｓｉｅ１１ａ ５ｔａｅｄａｅ１４７、サ
イモンシェラ穏 ４８、 アリシェラ・フィリフォルミス（Ａｌｙｓｉｅ
１１ａ ｆｉ１１ｆｏｒｍｉｓ１４９、 エイケネラ・
コロ−デンス （Ｅｉｋｅｎｅ１１ａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）５０、
エイケネラ・コロ−デンス ＣＤＣＴ−１９１／７８ ＮＣＴＣ１０９９５” ＮＣＴＣ１０９９７ ＮＣＴＣ１０５２９” ＡＴＣＣ２９４５２ ＡＴＣＣ１５５３３” ＡＴＣＣ２７３９８ ＡＴＣＣ２７３８１ ＣＣＵＧ ３７１０” ＮＣＴＣ１０５９６” ＮＩＭ ８０１−１ ５３、 アクアスビリリウム・デイスパー（Ａｑｕａ
ｓｐｉｒｉ１１ｕｍ ｄｉｓｐａｒｌシュードモナス・
テストステロニ （Ｐｓｅｕｄａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ
１５５、オリゲラ・ウレトラリス （Ｏ１１ｇｅ１１ａ ｕｒｅｔｈｒａ１１ｉｓ）５６、
ヘモフィルス・デエクレイイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ｄｕｃｒａｙｉ１ＡＴＣＣ２７６５０ ＡＴＣ［： １７４０７ ＬＩＡＧ ［１２２７ ＣＩＰ ５４２” ２２、デイセリア・ラクタミカ ２３、デイセリア・ラクタミカ ２４、デイセリア・ラクタミカ ＮＣＴＣ１０６１７” ＩＴＧ ３６８９ ＩＴＧ ３６９０ ２７、デイセリア・ムコーサ ２８、デイセリア・ムコーサ ＣＩＰ ５９．４８ ０ＩＰ ５９．４７ デイセリア・フラベツセンス （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓｌＡＴＣ
Ｃ１３１２０” ３２、デイセリア・サブフラパ ３３、デイセリア・シツカ ＩＴＧ ３８２１ １ＴＧ ３３８２ ３６、 デイセリア・カニメ ＡＴＣＣ
１４６８７”（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃａｎｉｓ１ ３７、 デイセリア・アニマリス ＮＣＴＣ
１０２１２”（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ａｎｉｍａ１１ｓ
１３８、 デイセリア・デニトリフィカンス ＡＴＣＣ
１４６８６”（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｄｅｎｉｔｒｉｆ
ｉｃａｎｓ１３９、 ＣＤＣ類属Ｍ −５ＣＣＩＪＧ
４００７５７゜ キンゲラ・インドロゲネス （Ｋｉｎｇｅ１１ａ ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓｌＮＣＴ
Ｃ１０７１７τ フィルターエ ＵＩＩ上の の位 フィルターＩ フィルターＩＩ 結論として、使用された条件の下で、プローブＮｏ、
’ｌは、従来の識別技法に比ベナイセリア・ゴル工に対
し１００％の特異性と１００％の信頼性をもつことがわ
かった。このプローブは又、Ｔｏｔｔｅｎ他のＪ、 Ｉ
ｎｆｅｃｔ、 Ｄｉｓ、、 １４８：４Ｂ２−４７３．
１９８３年に最初に記されたクリプテイック（潜在）プ
ラスミドプローブよりもさらに信頼性が高いものである
ことがわかった。
ａ、３）プローブＮｏ、 ｌ Ｏに関する結果プローブ
Ｎｏ、１０は、さまざまな細菌ＤＮＡと交雑させられた
。その結果は第１８図に示されている。
Ｎｏ、１０は、さまざまな細菌ＤＮＡと交雑させられた
。その結果は第１８図に示されている。
第１８図には、さまざまな細菌株からのドツトスポット
されたゲノムＤＮＡ １マイクログラムとプローブＮ
ｏ、 １０の交雑の結果が示されている。
されたゲノムＤＮＡ １マイクログラムとプローブＮ
ｏ、 １０の交雑の結果が示されている。
交雑温度は５５℃であった（３ＳＳＣ１２５ｍＭのＰＢ
、ｐＨ７，１及び２０％のＦＡ内で）、洗浄温度は指示
されている（同じ媒質が用いられた）。菌株の位置は表
１１に与えられている。
、ｐＨ７，１及び２０％のＦＡ内で）、洗浄温度は指示
されている（同じ媒質が用いられた）。菌株の位置は表
１１に与えられている。
プローブＮｏ、 ｌ Ｏは、はぼ全てのデイセリア菌株
のＤＮＡに対し交雑する。６０°Ｃでは、デイセリアの
近い親類であるサイモンシエラ及びアリシェラ菌株から
のＤＮＡとの弱い交叉反応がみられた（ Ｒｏｓｓａｕ
他、ＩＪＳＢ、 １９８９年印刷中）。
のＤＮＡに対し交雑する。６０°Ｃでは、デイセリアの
近い親類であるサイモンシエラ及びアリシェラ菌株から
のＤＮＡとの弱い交叉反応がみられた（ Ｒｏｓｓａｕ
他、ＩＪＳＢ、 １９８９年印刷中）。
ｂ）プローブＮｏ、 １２からＮｏ、 １ Ｂまでの研
究プローブＮｏ、 ｌ ２からＮｏ、 １８までの特異
性が上述のとおりにテストされた（同じ方法、同じ媒質
）。用いられた交雑温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）
は第１８図に示されている。
究プローブＮｏ、 ｌ ２からＮｏ、 １８までの特異
性が上述のとおりにテストされた（同じ方法、同じ媒質
）。用いられた交雑温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）
は第１８図に示されている。
第１３図では、さまざまな洗浄温度でのプロプの特異性
が以下のように決定されている二指示された温度（ＨＴ
）及びプローブでの交雑の後、デイセリア・ゴルエ Ｎ
ＣＴＣ８３７５Ｔ （ＮＧ）、デイセリア・メニンシテ
ィディス ＮＣＴＣｌｏ０２５Ｔ（ＮＭ）、大腸菌Ｂ
（ＥＣ）及びブランハメラ・カタラリスＩＴＧ ４１
９７ （ＢＣ）の変性ＤＮＡ １μｇが上にスポツテ
ィングされた膜を１５分間、指示された洗浄温度にて洗
浄し、乾燥させ、７０℃で増感スクリーンを用いて２４
時間オートラジオグラフィに付した。
が以下のように決定されている二指示された温度（ＨＴ
）及びプローブでの交雑の後、デイセリア・ゴルエ Ｎ
ＣＴＣ８３７５Ｔ （ＮＧ）、デイセリア・メニンシテ
ィディス ＮＣＴＣｌｏ０２５Ｔ（ＮＭ）、大腸菌Ｂ
（ＥＣ）及びブランハメラ・カタラリスＩＴＧ ４１
９７ （ＢＣ）の変性ＤＮＡ １μｇが上にスポツテ
ィングされた膜を１５分間、指示された洗浄温度にて洗
浄し、乾燥させ、７０℃で増感スクリーンを用いて２４
時間オートラジオグラフィに付した。
第１３図に示された結果から、プローブＮｏ、１２．
Ｎｏ、１４及びＮｏ、１７がデイセリア・ゴル工に対し
特異性をもつものでないことは明らかである。これらは
、以下の交雑温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）で単数
又は複数のデイセリア菌株を検出するのに用いることが
できる プローブＮｏ、 ｌ ２ ：約５５℃と約６００℃の間
のＨＴ及びＷＴ。
Ｎｏ、１４及びＮｏ、１７がデイセリア・ゴル工に対し
特異性をもつものでないことは明らかである。これらは
、以下の交雑温度（ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）で単数
又は複数のデイセリア菌株を検出するのに用いることが
できる プローブＮｏ、 ｌ ２ ：約５５℃と約６００℃の間
のＨＴ及びＷＴ。
プローブＮｏ、 １４ ：約４０°Ｃと約４５℃の間の
ＨＴ及びＷＴ。
ＨＴ及びＷＴ。
プローブＮｏ、 １５ ：約５０°Ｃと約５５℃の間の
ＨＴ及びＷＴ。
ＨＴ及びＷＴ。
プローブＮｏ１５及びＮｏ、 ｌ ６は厳しい条件（第
１３図参照）の下でデイセリア・メニンシティディスの
基準株のＤＮＡと交雑しないものの、さらに実験すると
、これらは、その他のい（つかのデイセリア菌株主とし
てデイセリア・メニンシティディス菌株に対し交叉交雑
するために、デイセリア・ゴル工に対し充分な特異性を
もたないことがわかった。従って、両方のプローブ共、
以下の）（Ｔ及びＷＴで単数又は複数のデイセリア菌株
を検出するためにのみ用いることができるニブローブＮ
ｏ、 １５ ：約５０’Ｃと約５５℃の間のＨＴ及びＷ
Ｔ。
１３図参照）の下でデイセリア・メニンシティディスの
基準株のＤＮＡと交雑しないものの、さらに実験すると
、これらは、その他のい（つかのデイセリア菌株主とし
てデイセリア・メニンシティディス菌株に対し交叉交雑
するために、デイセリア・ゴル工に対し充分な特異性を
もたないことがわかった。従って、両方のプローブ共、
以下の）（Ｔ及びＷＴで単数又は複数のデイセリア菌株
を検出するためにのみ用いることができるニブローブＮ
ｏ、 １５ ：約５０’Ｃと約５５℃の間のＨＴ及びＷ
Ｔ。
プローブＮｏ、 １６ ：約５０°Ｃと約６００℃の間
のＦ（Ｔ及びＷＴ。
のＦ（Ｔ及びＷＴ。
きわめて厳しい条件の下で、プローブＮ０１３及び１８
は、以下の）（Ｔ及びＷＴで、テストされた全てのデイ
セリア・ゴル工菌株に対し交雑し、テストされたいずれ
のデイセリア・メニンジティエイスとも交雑しなかった
ニ ブローブＮｏ、 １３ ：約５０℃から約５５°Ｃの間
のＨＴ及びＷＴ。
は、以下の）（Ｔ及びＷＴで、テストされた全てのデイ
セリア・ゴル工菌株に対し交雑し、テストされたいずれ
のデイセリア・メニンジティエイスとも交雑しなかった
ニ ブローブＮｏ、 １３ ：約５０℃から約５５°Ｃの間
のＨＴ及びＷＴ。
プローブＮｏ、 １８ ：約６０°Ｃ０第１４図には、
プローブＮｏ、 １８との交雑結果に関しての一例が与
えられている。
プローブＮｏ、 １８との交雑結果に関しての一例が与
えられている。
９つのデイセリア・ゴル工菌株（行Ａ、Ｂ及びＣ，１〜
３）、１０個のデイセリア・メニンジティディス菌株（
行り、Ｅ及びＦ、１〜３及び行Ｇ、１）及びデイセリア
に関係のない２つの基準株（行Ｇ、２及び３）からのド
ツトスポットされた変性ＤＮＡ １μｇとプローブＮ
ｏ、 １８を交雑させた。交雑及び洗浄温度は６０’Ｃ
であった。
３）、１０個のデイセリア・メニンジティディス菌株（
行り、Ｅ及びＦ、１〜３及び行Ｇ、１）及びデイセリア
に関係のない２つの基準株（行Ｇ、２及び３）からのド
ツトスポットされた変性ＤＮＡ １μｇとプローブＮ
ｏ、 １８を交雑させた。交雑及び洗浄温度は６０’Ｃ
であった。
下表ＩＩＩは、本発明に基づ（プローブＮｏ、 １２及
びＮｏ、 ｌ ８がデイセリア・ゴル工に対し特異性を
もつ温度範囲をまとめている。この表の中で、Ｔｓ及び
Ｔｄは、上述の条件下で説明した上記の意味を有する（
表Ｉ参照）。
びＮｏ、 ｌ ８がデイセリア・ゴル工に対し特異性を
もつ温度範囲をまとめている。この表の中で、Ｔｓ及び
Ｔｄは、上述の条件下で説明した上記の意味を有する（
表Ｉ参照）。
表ＩＩＩ
１且ユニ１
プローブ
本発明に基づくプローブは、
１止」工）
核酸プローブベー
スの検定の特異性を高めるサンドイッチ交雑システム内
で用いることができる。
で用いることができる。
核酸プローブベースの検定におけるサンドイッチ交雑の
原理及び使用方法はすでに記述されてきた（例： Ｄｕ
ｎｎ ＆ Ｈａｓｓｅｌ共著、「細胞Ｊ 、 １２；２
３−３６、１９７７年； Ｒａｎｋｉ他著、「遺伝子Ｊ
２１．７７−８５１９８３年）、直接交雑検定は有利
な反応速度を有するものの、サンドイッチ交雑は、より
高い信号対雑音比に関し有利である。さらに、サンドイ
ッチ交雑は、核酸プローブベースの検定の特異性を高め
ることができる。適切に設計されている場合、サンドイ
ッチ交雑検定は実際、同じ１つの生体の２つの異なる核
酸伸張を認識する２つのプローブを用いたとき核酸プロ
ーブベースのテストの特異性を最大限にする。満たさな
くてはならない唯一の必要条件は、両方のプローブかい
）標的生体の核酸に対し交雑し、（ｉｉ ）同じ非標的
生体に対し交雑しないことである。
原理及び使用方法はすでに記述されてきた（例： Ｄｕ
ｎｎ ＆ Ｈａｓｓｅｌ共著、「細胞Ｊ 、 １２；２
３−３６、１９７７年； Ｒａｎｋｉ他著、「遺伝子Ｊ
２１．７７−８５１９８３年）、直接交雑検定は有利
な反応速度を有するものの、サンドイッチ交雑は、より
高い信号対雑音比に関し有利である。さらに、サンドイ
ッチ交雑は、核酸プローブベースの検定の特異性を高め
ることができる。適切に設計されている場合、サンドイ
ッチ交雑検定は実際、同じ１つの生体の２つの異なる核
酸伸張を認識する２つのプローブを用いたとき核酸プロ
ーブベースのテストの特異性を最大限にする。満たさな
くてはならない唯一の必要条件は、両方のプローブかい
）標的生体の核酸に対し交雑し、（ｉｉ ）同じ非標的
生体に対し交雑しないことである。
２つの与えられたプローブエ及びＩＩについて、サンド
イッチ交雑システムは以下のように説明することかでき
るニ ブロープＮｏ、 Ｉは、生体Ａ及びＢがらの核酸に対し
交雑する（Ｃとは交雑しない）。
イッチ交雑システムは以下のように説明することかでき
るニ ブロープＮｏ、 Ｉは、生体Ａ及びＢがらの核酸に対し
交雑する（Ｃとは交雑しない）。
プローブＮｏ、 ＩＩは、生体Ａ及びＣからの核酸に対
し交雑する（Ｂとは交雑しない）。
し交雑する（Ｂとは交雑しない）。
両方のプローブが標的核酸に対し交雑することが絶対に
必要であるため、検出可能な信号は、生体Ａからの核酸
が試料内に存在する場合にのみ生成される。
必要であるため、検出可能な信号は、生体Ａからの核酸
が試料内に存在する場合にのみ生成される。
第１０図には、高められた特異性をもつサンドイッチ交
雑検定が示されているニ プローブ■は、生体Ａ及びＢからの核酸と交雑し、固体
支持体に対し固定される。
雑検定が示されているニ プローブ■は、生体Ａ及びＢからの核酸と交雑し、固体
支持体に対し固定される。
プローブＩＩは、生体Ａ及びＣからの核酸と交雑し、標
識づけされる。
識づけされる。
この試験は、標識づけされたプローブ（プローブＩＩ）
が支持体に間接的に固定された場合すなわち、生体Ａか
らの核酸が存在する場合にのみ陽性となる。
が支持体に間接的に固定された場合すなわち、生体Ａか
らの核酸が存在する場合にのみ陽性となる。
本発明に基づ（プローブのい（っがは、デイセリア・ゴ
ル工に対する特異性の高いサンドイッチ交雑検定におい
て組合わせることができる。デイセリア・ゴル工に対す
る特異性を最大限にする本発明に基づくプローブの有利
な組合せは、以下のとおりであるニ グループ９のプローブと、グループ）、２゜３．５及び
１３のプローブのうちのいずれか。
ル工に対する特異性の高いサンドイッチ交雑検定におい
て組合わせることができる。デイセリア・ゴル工に対す
る特異性を最大限にする本発明に基づくプローブの有利
な組合せは、以下のとおりであるニ グループ９のプローブと、グループ）、２゜３．５及び
１３のプローブのうちのいずれか。
グループ１３のプローブと、グループｌ。
２．３及び５のプローブのうちのいずれか。
グループ１８のプローブと、グループ１２．３．５．９
及び１３のプローブのうちのいずれか。
及び１３のプローブのうちのいずれか。
グループ５のプローブと、グループ１．２及び３のプロ
ーブのうちのいずれか。
ーブのうちのいずれか。
デイセリア・ゴル工に対する特異性をもつ本発明に基づ
くプローブの有利な組合せは以下のようなものであるニ グループ１３のプローブと、グループ５．９及び１８の
プローブのうちのいずれか。
くプローブの有利な組合せは以下のようなものであるニ グループ１３のプローブと、グループ５．９及び１８の
プローブのうちのいずれか。
デイセリア・ゴル工に対する特異性をもつ本発明に基づ
くプローブの好ましい組合せは以下のようなものである
ニ グループ９のプローブと、グループ５のプローブ。
くプローブの好ましい組合せは以下のようなものである
ニ グループ９のプローブと、グループ５のプローブ。
グループ１８のプローブと、グループ５及び９のプロー
ブのうちの１つ。
ブのうちの１つ。
これらの組合せは、標的として１６ｓ
ｒＲＮＡ分子を有する。１６ｓ ｒＲＮＡ誘導及び２
３ｓ ｒＲＮＡ誘導のプローブ間（例えばグループ１
１のプローブとグループ１３又は１８のプローブ間）の
組合せは、ゲノムＤＮＡが標的分子である場合にのみ可
能である。
３ｓ ｒＲＮＡ誘導のプローブ間（例えばグループ１
１のプローブとグループ１３又は１８のプローブ間）の
組合せは、ゲノムＤＮＡが標的分子である場合にのみ可
能である。
デイセリア・ゴル工を検出するためのサンドイッチ交雑
プロセスにおいて、プローブは、同時に或いは同時にで
なく、標的ＤＮＡ又はＲＮＡが追及されている生物学的
試料に加えられつる。
プロセスにおいて、プローブは、同時に或いは同時にで
なく、標的ＤＮＡ又はＲＮＡが追及されている生物学的
試料に加えられつる。
上述の組合せに対する有利なおおよその交雑温度及び洗
浄温度は、以下の表ＩＶに与えられている。
浄温度は、以下の表ＩＶに与えられている。
表１■
１ ＊
２ − ＊
３ − − ＊
５ ５３ ６０ ６５ ＊９
５５ ５５ ６５ ６５ ＊１３
５２ ５２ ５２ ５２ ５２
＊１８ ５３ ６０ ６０ ６
０ ６０ ５２ ＊この表は、サンドイッチ
交雑検定におけるプローブのさまざまな組合せについて
の好ましい交雑温度及び洗浄温度じＣ単位）を表わして
いる。
５５ ５５ ６５ ６５ ＊１３
５２ ５２ ５２ ５２ ５２
＊１８ ５３ ６０ ６０ ６
０ ６０ ５２ ＊この表は、サンドイッチ
交雑検定におけるプローブのさまざまな組合せについて
の好ましい交雑温度及び洗浄温度じＣ単位）を表わして
いる。
「−」が示されている組合せは用いてはならない。
例えば、
プローブＮｏ、 １及ｉ１．Ｆ Ｎｏ、 ５が組合せら
れている検定は、約５３℃で行なわれなくてはならない
。
れている検定は、約５３℃で行なわれなくてはならない
。
プローブＮｏ、 １８及びＮｏ、 ９が組合せられてい
る検定は、約６０℃で行なわれなくてはならない。
る検定は、約６０℃で行なわれなくてはならない。
本発明は又、生物学的試料内のデイセリア・ゴル工菌株
を試験管内検出するための、サンドイッチ交雑検定用キ
ットにも関わるものであり、このキットには以下のもの
が含まれている： 次の組合せの中から選ばれた上述のようなデイセリア・
ゴル工に対する特異性をもつ少なくとも２つのプローブ
： グループ９のプローブと、グループ１゜２．３．５及び
１３のプローブのいずれか、 グループ１３のプローブと、グループ１２．３及び５の
プローブのいずれか、 グループ１８のプローブと、グループ１２．３．５．９
及び１３のプローブのいずれか、 グループ５のプローブと、グループ１゜２及び３のプロ
ーブのいずれか、 （なお特に、 グループ１３のプローブと、グループ５゜９、及び１８
のプローブのいずれか、 さらに特に グループ９のプローブと、グループ５のプローブ、 グループ１８のプローブと、グループ５及び９のプロー
ブのいずれか、 の中から選ばれる） デイセリア・ゴル工菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとこ
れらのプローブの間の交雑反応を行なえるようにする緩
衝液又はかかる緩衝液を生成するのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られる雑種を
検定するための手段。
を試験管内検出するための、サンドイッチ交雑検定用キ
ットにも関わるものであり、このキットには以下のもの
が含まれている： 次の組合せの中から選ばれた上述のようなデイセリア・
ゴル工に対する特異性をもつ少なくとも２つのプローブ
： グループ９のプローブと、グループ１゜２．３．５及び
１３のプローブのいずれか、 グループ１３のプローブと、グループ１２．３及び５の
プローブのいずれか、 グループ１８のプローブと、グループ１２．３．５．９
及び１３のプローブのいずれか、 グループ５のプローブと、グループ１゜２及び３のプロ
ーブのいずれか、 （なお特に、 グループ１３のプローブと、グループ５゜９、及び１８
のプローブのいずれか、 さらに特に グループ９のプローブと、グループ５のプローブ、 グループ１８のプローブと、グループ５及び９のプロー
ブのいずれか、 の中から選ばれる） デイセリア・ゴル工菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡとこ
れらのプローブの間の交雑反応を行なえるようにする緩
衝液又はかかる緩衝液を生成するのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られる雑種を
検定するための手段。
デイセリア・ゴル工及びデイセリア・メニンシティディ
ス菌株が互いに本発明に基づくプローブのいくつかによ
って識別されうるという事実は、これら両方の分類群が
亜種レベルで遺伝子型に関し関連性をもっていることか
ら、ｒＲＮＡ誘導プローブ全般の使用に対し成る程度広
範に関与してくる。従って、本発明に基づくプローブは
、広範な生体類属を検定するためにのみ用いられつるの
ではなく、亜種レベルでの生体間の識別を行なうのにも
用いることができる。これがデイセリアのみにあてはま
り、他の分類群に当てはまらないと考える理由は全く無
い、プローブの配列及び交雑条件が入念に選択されるこ
とを条件として、亜種レベルでの区別は単純な直接的交
雑型式で行なうことができ、長たらしいサザンプロット
分析法を時代遅れのものにしている。
ス菌株が互いに本発明に基づくプローブのいくつかによ
って識別されうるという事実は、これら両方の分類群が
亜種レベルで遺伝子型に関し関連性をもっていることか
ら、ｒＲＮＡ誘導プローブ全般の使用に対し成る程度広
範に関与してくる。従って、本発明に基づくプローブは
、広範な生体類属を検定するためにのみ用いられつるの
ではなく、亜種レベルでの生体間の識別を行なうのにも
用いることができる。これがデイセリアのみにあてはま
り、他の分類群に当てはまらないと考える理由は全く無
い、プローブの配列及び交雑条件が入念に選択されるこ
とを条件として、亜種レベルでの区別は単純な直接的交
雑型式で行なうことができ、長たらしいサザンプロット
分析法を時代遅れのものにしている。
本発明に基づく特異的プローブ特にプローブＮｏ、１−
Ｎｏ、５． Ｎｏ、９． Ｎｏ、ｌ １ 、 Ｎｏ、ｌ
３及びＮｏ、 １８は、適切な条件の下で他の微生物
からいかなる妨害も予想されないことから、あらゆるタ
イプの臨床試料内のデイセリア・ゴル工の診断及びデイ
セリア・ゴル工の培養確認に応用されるべきである。
Ｎｏ、５． Ｎｏ、９． Ｎｏ、ｌ １ 、 Ｎｏ、ｌ
３及びＮｏ、 １８は、適切な条件の下で他の微生物
からいかなる妨害も予想されないことから、あらゆるタ
イプの臨床試料内のデイセリア・ゴル工の診断及びデイ
セリア・ゴル工の培養確認に応用されるべきである。
さらに、本発明に基づくプローブは、制限フラグメント
長多形性分析に基づく分類学的又は免疫学的調査（Ｇｒ
ｉｍｏｎｔ ＆ Ｇｒｉｍｏｎｔ、１９８６年）のため
にも、又関連する微生物を識別し分類するためにも用い
ることができる。
長多形性分析に基づく分類学的又は免疫学的調査（Ｇｒ
ｉｍｏｎｔ ＆ Ｇｒｉｍｏｎｔ、１９８６年）のため
にも、又関連する微生物を識別し分類するためにも用い
ることができる。
以下の本発明の背景となる論文による参考試料を記す。
参考試料
１ 、 Ｂｒｏｓｉｎｓ、 Ｊ、、 Ｔ、 Ｊ、 Ｄｕ
１１及びＨ，Ｆ、 Ｎｏ１ｌｅｒ共著、１９８０年、「
大腸菌からの２３ｓ リ ポソームＲＮＡ遺伝子の完
全なヌクレオチド配列Ｊ 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ）、
Ａｃａｄ、 ５ｃｉ（米国科学アカデミ−会報、ＵＳ
Ａ ？７： ２０１〜２０４１゜ｌａ、 Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ、 Ｊ、、 Ｊ、 Ｌ、 Ｐａｌｍｅｒ、 Ｊ、 Ｐ
、 Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＨ，Ｆ、 Ｎｏ１ｌｅｒ共著、
１９７８年、「大腸菌からの１６ｓ リポソームＲＮ
Ａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列Ｊ Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ）、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
１１及びＨ，Ｆ、 Ｎｏ１ｌｅｒ共著、１９８０年、「
大腸菌からの２３ｓ リ ポソームＲＮＡ遺伝子の完
全なヌクレオチド配列Ｊ 、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ）、
Ａｃａｄ、 ５ｃｉ（米国科学アカデミ−会報、ＵＳ
Ａ ？７： ２０１〜２０４１゜ｌａ、 Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ、 Ｊ、、 Ｊ、 Ｌ、 Ｐａｌｍｅｒ、 Ｊ、 Ｐ
、 Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＨ，Ｆ、 Ｎｏ１ｌｅｒ共著、
１９７８年、「大腸菌からの１６ｓ リポソームＲＮ
Ａ遺伝子の完全なヌクレオチド配列Ｊ Ｐｒｏｃ、 Ｎ
ａｔ）、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７５： ４８０１−４８０５゜２ 、
Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ、 Ｐ、 Ｈ，著、 １９８６年、
「培養中のレジオネラの検出のためのＧｅｎ−Ｐｒｏｂ
ｅ Ｄ Ｎ Ａプローブの評価Ｊ 、 Ｊ、 Ｃ１１ｎ
、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ （微生物学臨床ジャーナル）
、２３： ４８１−４８４ 。
Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ、 Ｐ、 Ｈ，著、 １９８６年、
「培養中のレジオネラの検出のためのＧｅｎ−Ｐｒｏｂ
ｅ Ｄ Ｎ Ａプローブの評価Ｊ 、 Ｊ、 Ｃ１１ｎ
、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ （微生物学臨床ジャーナル）
、２３： ４８１−４８４ 。
３、 Ｅｌｗｅ１１、 Ｌ、 Ｐ、、及びＳ、 Ｆａｌ
ｋｏｗ共著、１９７７年。「デイセリア属のプラスミド
Ｊ ｐ１３８−１５４゜Ｉｎ、：Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ，
Ｂ、、 （刊行）「リン菌Ｊ ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ａ
ｎｄ ５ｏｎｓ、ニューヨーク。
ｋｏｗ共著、１９７７年。「デイセリア属のプラスミド
Ｊ ｐ１３８−１５４゜Ｉｎ、：Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ，
Ｂ、、 （刊行）「リン菌Ｊ ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ａ
ｎｄ ５ｏｎｓ、ニューヨーク。
４、 ｔ”ｅｓｔ）、 ｌ（−＋ ｗ、 Ｌｕｄ
ｕｒｉｇ、及びに、Ｈ１Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ共著、１９
８６年。「シュードモナス・フルオレッセンス類属のた
めのＤＮＡ交雑プローブＪ Ａｐｐ）、 Ｅｎｖ、 Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏ）、 （応用環境微生物学） 、 ５２
： １１９０−１１９４゜５、 Ｇｏｋｅ）、 Ｕ、
Ｂ、、 Ａ、 Ｇｅ１ｓｅｒ 及びＥ、 Ｊ
。
ｕｒｉｇ、及びに、Ｈ１Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ共著、１９
８６年。「シュードモナス・フルオレッセンス類属のた
めのＤＮＡ交雑プローブＪ Ａｐｐ）、 Ｅｎｖ、 Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏ）、 （応用環境微生物学） 、 ５２
： １１９０−１１９４゜５、 Ｇｏｋｅ）、 Ｕ、
Ｂ、、 Ａ、 Ｇｅ１ｓｅｒ 及びＥ、 Ｊ
。
Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ共著、１９８７年。「マイコプラ
ズマ種間の明確に区別されるリポソームＲＮＡの可変的
領域に対し相補性のオリゴヌクレオチドＪ Ｊ。
ズマ種間の明確に区別されるリポソームＲＮＡの可変的
領域に対し相補性のオリゴヌクレオチドＪ Ｊ。
Ｇｅｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、 （遺伝微生物学ジャ
ーナル）。
ーナル）。
１３３： １９６９−１９７４年。
６、 Ｇｒｉｍｏｎｔ、 Ｆ、、及びＰ、 Ａ、 Ｄ、
Ｇｒｉｍｏｎ共著、１９８６年。［潜在的な分類学的
手段としてのリポソーム リボ核酸遺伝子制限パターン
Ｊ Ａｎｎ。
Ｇｒｉｍｏｎ共著、１９８６年。［潜在的な分類学的
手段としてのリポソーム リボ核酸遺伝子制限パターン
Ｊ Ａｎｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、 （微生物学年報） ［Ｉｎ５
ｔ、 Ｐａ５ｔｅｕｒ （パスツール研究所１３．１３
７Ｂ： １６５〜１７５゜７ 、 Ｇｕｉｂｏｕｒｄｅ
ｎｃｈｅ、 Ｍ、、 Ｍ、 Ｙ、 Ｐｏｐｏｆｆ及びＪ
。
ｔ、 Ｐａ５ｔｅｕｒ （パスツール研究所１３．１３
７Ｂ： １６５〜１７５゜７ 、 Ｇｕｉｂｏｕｒｄｅ
ｎｃｈｅ、 Ｍ、、 Ｍ、 Ｙ、 Ｐｏｐｏｆｆ及びＪ
。
Ｙ、 Ｒｉｏｕ共著、１９８６年、「デイセリア・ゴル
工、デイセリア・メニンシティディス、デイセリア・ラ
クタミカ、デイセリア・シネレア及び゛°ナイセリア・
ポリサッカレア゛間のデオキシリボ核酸の関係性Ｊ 、
Ａｎｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｉｎｓｔ。
工、デイセリア・メニンシティディス、デイセリア・ラ
クタミカ、デイセリア・シネレア及び゛°ナイセリア・
ポリサッカレア゛間のデオキシリボ核酸の関係性Ｊ 、
Ａｎｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｉｎｓｔ。
Ｐａ５ｔｅｕｒ） 、 １３７Ｂ：１７７−１８５゜８
、 Ｈａｕｎ、 Ｇ、、及びＵ、 Ｇｕｂｅｌ共著、１
９８７年、「プロテウス属の代表の属、種及び亜種特異
的識別のためのオリゴヌクレオチドプローブ、 ＦＥＭ
Ｓ［Ｆｅｄ、 Ｅｕｒ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、 Ｓｏ
ｃ、 （欧州微生物学会連合）ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）
、 Ｌｅｔｔ、（微生物学文献）、４３： １８７−１
９３゜ ９、 Ｈｏｋｅ、 Ｃ，、及びＮ、 Ａ、 Ｖｅｄｒｏ
ｓ共著、１９８２年。
、 Ｈａｕｎ、 Ｇ、、及びＵ、 Ｇｕｂｅｌ共著、１
９８７年、「プロテウス属の代表の属、種及び亜種特異
的識別のためのオリゴヌクレオチドプローブ、 ＦＥＭ
Ｓ［Ｆｅｄ、 Ｅｕｒ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、 Ｓｏ
ｃ、 （欧州微生物学会連合）ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）
、 Ｌｅｔｔ、（微生物学文献）、４３： １８７−１
９３゜ ９、 Ｈｏｋｅ、 Ｃ，、及びＮ、 Ａ、 Ｖｅｄｒｏ
ｓ共著、１９８２年。
［デイセリアの分類学：デオキシリボ核酸塩基組成、種
間形質転換及びデオキシリボ核酸交雑、 Ｉｎｔ、 Ｊ
、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（国際系統細菌学
ジャーナル）、３２： ５７−６６゜ １０、 Ｋａｈｎ、 Ｍ、、 Ｒ，Ｋｏｌｔｅｒ、 Ｃ
，Ｔｈｏｍａｓ、 Ｄ。
間形質転換及びデオキシリボ核酸交雑、 Ｉｎｔ、 Ｊ
、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（国際系統細菌学
ジャーナル）、３２： ５７−６６゜ １０、 Ｋａｈｎ、 Ｍ、、 Ｒ，Ｋｏｌｔｅｒ、 Ｃ
，Ｔｈｏｍａｓ、 Ｄ。
Ｆｉｇｕｒｓｋｉ、 Ｒ，Ｍｅｙｅｒ、 Ｅ、 Ｒｅｍ
ａｕｔ及びり、 Ｒ。
ａｕｔ及びり、 Ｒ。
Ｈｅ１ｉｎａｋｉ共著、１９７９年、プラスミドＣａｌ
Ｅｌ。
Ｅｌ。
Ｆ、 Ｒ６に、 ＲＫ２から誘導されたプラスミドクロ
ーニング伝播体。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ）、
（酵素学的方法） 、 ６８： ２６８ 。
ーニング伝播体。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ）、
（酵素学的方法） 、 ６８： ２６８ 。
１１、 Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ、 Ｄ、 Ｔ、 １
９６７年、「デイセリア属の種間のデオキシリボ核酸相
同」、Ｊ。
９６７年、「デイセリア属の種間のデオキシリボ核酸相
同」、Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏ）、 （細菌学ジャーナル） ９４
：８７０−８７４゜１２、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ
、、 Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪＳａｍ
ｂｒｏｏｋ （刊行）、１９８２年、「分子クローニン
グ：実験所マニュアルＪ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｕｒ、 ；− ；−ヨーク。
：８７０−８７４゜１２、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ
、、 Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪＳａｍ
ｂｒｏｏｋ （刊行）、１９８２年、「分子クローニン
グ：実験所マニュアルＪ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｕｒ、 ；− ；−ヨーク。
１３、 Ｍａｒｍｕｒ、 Ｊ、 Ａ、 １９６１年、［
微生物からのデオキシリボ核酸の分離方法Ｊ 、Ｊ、
Ｍａｄ、 Ｂｉｏ）、 （分子生物学ジャーナル） 、
３： ２０８−２１８゜１４、Ｐａｌｍｅｒ、 Ｌ、
、 Ｓ、 Ｆａｌｋｏｗ及びり、 Ｋｌｅｖａｎ共著、
１９８６年、［クラミジア・トラコマチスの１８ｓリポ
ソームＲＮＡ遺伝子Ｊ ｐ８９−９１ 。
微生物からのデオキシリボ核酸の分離方法Ｊ 、Ｊ、
Ｍａｄ、 Ｂｉｏ）、 （分子生物学ジャーナル） 、
３： ２０８−２１８゜１４、Ｐａｌｍｅｒ、 Ｌ、
、 Ｓ、 Ｆａｌｋｏｗ及びり、 Ｋｌｅｖａｎ共著、
１９８６年、［クラミジア・トラコマチスの１８ｓリポ
ソームＲＮＡ遺伝子Ｊ ｐ８９−９１ 。
Ｊｎ、： ｐ、 Ｑｒｉ６１． Ｇ、 １１ｄｇｗａｙ
、 Ｊ、 ５ｃｈａｃｈｔｅｒ。
、 Ｊ、 ５ｃｈａｃｈｔｅｒ。
Ｄ、 Ｔａｙｌｏｒ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＭ、 Ｗａ
ｒｄ（刊行）、「クラミジア感染Ｊ 、 Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ。
ｒｄ（刊行）、「クラミジア感染Ｊ 、 Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ。
イギリス、ケンブリッジ。
１５、 Ｒｉｏｕ、 Ｊ、 Ｙ、、 Ｍ、 Ｇｕｉｂｏ
ｕｒｄｅｎｃｈｅ及びＭ、 Ｙ。
ｕｒｄｅｎｃｈｅ及びＭ、 Ｙ。
Ｐｏｐｏｆｆ共著、１９８３年、「デイセリア属内の新
しい分類群Ｊ 、 Ａｎｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、
（Ｉｎｓｔ、 Ｐａ５ｔｅｕｒ１１３４Ｂ： ２５７−
２６７ 。
しい分類群Ｊ 、 Ａｎｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、
（Ｉｎｓｔ、 Ｐａ５ｔｅｕｒ１１３４Ｂ： ２５７−
２６７ 。
１６、Ｒｏｓｓａｕ、 Ｒ，、Ａ、 Ｖａｎ Ｌａ
ｎｄｓｃｈｏｏｔ、 Ｗ。
ｎｄｓｃｈｏｏｔ、 Ｗ。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ及びＪ、 Ｄｅｌｅｙ共著、１９８６
年、「デイセリア科のリポソームリボ核酸シストロンの
居間及び属内類似性Ｊ 、 Ｉｎｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
年、「デイセリア科のリポソームリボ核酸シストロンの
居間及び属内類似性Ｊ 、 Ｉｎｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
３６： ３２３−３３２ 。
１７、 Ｗａｙｎｅ、 Ｌ、 Ｇ、、 Ｄ、
Ｊ、 Ｂｒｅｎｎｅｒ、 Ｒ，Ｒ。
Ｊ、 Ｂｒｅｎｎｅｒ、 Ｒ，Ｒ。
（：ｏｌｗｅ１１、 Ｐ、 Ａ、 Ｄ、 Ｇｒｉｍｏｎ
ｔ、 Ｏ，Ｋａｎｄｌｅｒ、 Ｍ）、 Ｋｒ１ｃｈｅ
ｖｓｋｙ、 Ｌ、 Ｈ，Ｍｏｏｒｅ、 Ｗ、
Ｅ、 Ｃ。
ｔ、 Ｏ，Ｋａｎｄｌｅｒ、 Ｍ）、 Ｋｒ１ｃｈｅ
ｖｓｋｙ、 Ｌ、 Ｈ，Ｍｏｏｒｅ、 Ｗ、
Ｅ、 Ｃ。
Ｍｏｏｒｅ、 Ｒ，Ｇ、 Ｅ、 Ｍｕｒｒａｙ、 Ｅ、
ＳｔａｃｋｂｒａｎｄｔＭ、 Ｐ、 ５ｔａｒｒ、及
びＨ，Ｇ、 Ｔｒｕｐｅｒ共著、１９８７年。
ＳｔａｃｋｂｒａｎｄｔＭ、 Ｐ、 ５ｔａｒｒ、及
びＨ，Ｇ、 Ｔｒｕｐｅｒ共著、１９８７年。
［細菌系統学に対するアプローチの一致に関する特別委
員会の報告書Ｊ 、 Ｉｎｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔＢａｃ
ｔｅｒｉｏ１．３７： ４６３−４６４゜１８、 Ｗｉ
ｌｋｉｎｓｏｎ−、Ｈ，Ｗ、 Ｊ、 Ｓ、 Ｓａｍｐｔ
ｏｎ、及びＢ。
員会の報告書Ｊ 、 Ｉｎｔ、 Ｊ、 ５ｙｓｔＢａｃ
ｔｅｒｉｏ１．３７： ４６３−４６４゜１８、 Ｗｉ
ｌｋｉｎｓｏｎ−、Ｈ，Ｗ、 Ｊ、 Ｓ、 Ｓａｍｐｔ
ｏｎ、及びＢ。
Ｂ、 Ｐ１１ｋａｙｔｉｓ共著、１９８６年、「レジオ
ネラ培養の識別のための市販の遺伝子プローブの評価Ｊ
、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、 ２３
： ２１７−２２０゜１９、 Ｗｏｅｓｅ、 Ｃ，Ｒ，
、Ｅ、 Ｇｕｔｅ１１、 Ｒ，Ｇｕｐｔａ、及びＨｏＦ
、 Ｎｏ１１ｅｒ、共著、１９８３年。「１６ｓ様のリ
ポソームリボ核酸の高位構造の詳細な分析」。
ネラ培養の識別のための市販の遺伝子プローブの評価Ｊ
、 Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、 ２３
： ２１７−２２０゜１９、 Ｗｏｅｓｅ、 Ｃ，Ｒ，
、Ｅ、 Ｇｕｔｅ１１、 Ｒ，Ｇｕｐｔａ、及びＨｏＦ
、 Ｎｏ１１ｅｒ、共著、１９８３年。「１６ｓ様のリ
ポソームリボ核酸の高位構造の詳細な分析」。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ）、 Ｒｅｖ、（微生物字詰） 、
４７： ６２１−６６９゜２０、 Ｙａｎｇ、 Ｄ、、
Ｙ、 ０ｙａｉｚｕ、 Ｈ，０ｙａｉｚｕ、 Ｇ、
Ｊ。
４７： ６２１−６６９゜２０、 Ｙａｎｇ、 Ｄ、、
Ｙ、 ０ｙａｉｚｕ、 Ｈ，０ｙａｉｚｕ、 Ｇ、
Ｊ。
０１ｓｅｎ及びＣ，Ｒ，Ｗｏｅｓｅ共著、１９８５年、
［ミトコンドリア起源Ｊ 、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ）、
Ａｃａｄ、 ５ｃｉｔ１．ｓ、Ａ、 ８２： ４４４３
−４４４７゜
［ミトコンドリア起源Ｊ 、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ）、
Ａｃａｄ、 ５ｃｉｔ１．ｓ、Ａ、 ８２： ４４４３
−４４４７゜
第１図は、ＤＮＡプローブが構築され大腸菌の１６ｓ
ｒＲＮＡ２次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている。 第２図は、シュードモナス・テストステロニＡＴＣＣ１
１９９６の相応する配列及び大腸菌の相応する配列と整
列させられた、本発明に従ったプローブＮｏ、 １ 、
Ｎｏ、２ 、 Ｎｏ、３． Ｎｏ、４． Ｎｏ、５
、 Ｎｏ、６及びＮｏ、 ９の相補的配列を表わしてい
る。 第３図は、相応する大腸菌配列と整列させられた、２３
ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から誘導されたプローブＮｏ、７
． Ｎｏ、８． Ｎｏ、１０及びＮ０１１の相補性配列
を示している。 第４図、第５図、第６図及び第７図は、交雑結果を示す
ラジオオートグラフである。 第１０図には、高められた特異性をもつサンドイッチ交
雑検定が示されている。 第１１図は、デイセリア・ゴル工の予定の１６ｓ ｒ
ＲＮＡ組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。 第１２図は、本発明のプローブが大腸菌の２３ｓ ｒ
ＲＮＡ二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている。 第１３図、第１４図、第１５図、第１６図。 第１７図、第１８図もさまざまな交雑結果を表わしてい
る。 第１ 洗浄温度 （’Ｃ） 第７ 図 沫 プローブ： Ｙｒ（＠ｃ） ： ｖｒ （”ｃ） ： ｎ”３ ｎ＠５ ｎ＠６ 図 ｎ” ７ プローブ８６１；ｉ！ プローブＮＯ ＨＴ： ４５６Ｃ 第１３図 ブローブエおよびプローブＩＩは標的核酸（Ａ）と交雑
する。標識付けされたプローブは固定される。ａ１１剣
ま陽性である。 一一一一一一一一一 プローブＩは生体Ｂからの核酸と交雑するがプローブＩ
ｆはしない。標識づけされたプローブは固定される。い
かなる信号もない：すなわち、刻剣ま陰性である。 −一一一一一一一う− 生体Ｃからの核酸は固定されない。従って標識づけされ
たプローブは固定されない。いかなる信号もない：すな
わち、試験は陰性である。 第１０図 第１４図 １、 デイセリア・ゴル工 （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｌナイ
セリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴル工 Ｎ（ＴＣ’ ８３７５” ＩＴＧ ４３３９ ＩＴＧ ４０８５ ＩＴＧ ４３０８ ＩＴＧ ３９３９ ＩＴＧ ４３６３ ＩＴＧ ４３６７ ＩＴＧ ４４０１ １ＴＧ ４４３７ １３゜ デイセリア・メニンシティディス （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｎ
ＣＴＣ１００２５” 手 続 補 正 書 （方式） ％式％：５ 事件の表示 平成１年特許願第 ９３２３６号 ２、発明の名称 ブイセリア菌株を検出するための交雑プローブ３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 名称 エヌ・ブイ・インノジェネティクス会ソシエテ
・アノニム ４、代 理 人 第１８図 ５、補正命令の日付 平成１年７月２５日 ６、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄及び図面（１）明細書の
図面の簡単な説明の欄 明細書第１２６頁第５行目と第６行目の間に以下の記載
を挿入する。 「第８図は、図中番号が大腸菌の１６ｓｒＲＮＡ配列を
示している大腸菌の１６３ｒＲＡ分子を表わしている。 第９図は、図中番号が大腸菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を示している大腸菌の２３ＳｒＲＮＡ分子
を表わしている。」 く＝ １．５＠口 ＝口 ＜− ロ１０ コｌコ くコ 口１Ｉｃ５ ０く 一■− 一■コ 一り く −く Ｕコ ロ−ｃ３ く■く く Ｃ −く Ｕ■ Ｑ 口■ロ コ層コ Ｕ■Ｑ く− 口ｌ口 υ−Ｕ 口ｌ口 ４＋１ ロ −一 −く く■く −く 一■− く− （２）図面において、第２図〜第５図、第８図及び第１
１図〜第１５図を、別紙のとおり補正する。 一り く 一■− コー 口ｌ口 く■く 口く く 中 口 に） 法 ｈＯ： ３０口口 こロココ （り χ ＝凹トコ ζ＝１１Ｄ 淀百品 瞭 ＝［口］ ル８０口］ Ｏｘ：口 冨 χ 田 ■
ｒＲＮＡ２次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている。 第２図は、シュードモナス・テストステロニＡＴＣＣ１
１９９６の相応する配列及び大腸菌の相応する配列と整
列させられた、本発明に従ったプローブＮｏ、 １ 、
Ｎｏ、２ 、 Ｎｏ、３． Ｎｏ、４． Ｎｏ、５
、 Ｎｏ、６及びＮｏ、 ９の相補的配列を表わしてい
る。 第３図は、相応する大腸菌配列と整列させられた、２３
ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から誘導されたプローブＮｏ、７
． Ｎｏ、８． Ｎｏ、１０及びＮ０１１の相補性配列
を示している。 第４図、第５図、第６図及び第７図は、交雑結果を示す
ラジオオートグラフである。 第１０図には、高められた特異性をもつサンドイッチ交
雑検定が示されている。 第１１図は、デイセリア・ゴル工の予定の１６ｓ ｒ
ＲＮＡ組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。 第１２図は、本発明のプローブが大腸菌の２３ｓ ｒ
ＲＮＡ二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている。 第１３図、第１４図、第１５図、第１６図。 第１７図、第１８図もさまざまな交雑結果を表わしてい
る。 第１ 洗浄温度 （’Ｃ） 第７ 図 沫 プローブ： Ｙｒ（＠ｃ） ： ｖｒ （”ｃ） ： ｎ”３ ｎ＠５ ｎ＠６ 図 ｎ” ７ プローブ８６１；ｉ！ プローブＮＯ ＨＴ： ４５６Ｃ 第１３図 ブローブエおよびプローブＩＩは標的核酸（Ａ）と交雑
する。標識付けされたプローブは固定される。ａ１１剣
ま陽性である。 一一一一一一一一一 プローブＩは生体Ｂからの核酸と交雑するがプローブＩ
ｆはしない。標識づけされたプローブは固定される。い
かなる信号もない：すなわち、刻剣ま陰性である。 −一一一一一一一う− 生体Ｃからの核酸は固定されない。従って標識づけされ
たプローブは固定されない。いかなる信号もない：すな
わち、試験は陰性である。 第１０図 第１４図 １、 デイセリア・ゴル工 （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅｌナイ
セリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴル工 Ｎ（ＴＣ’ ８３７５” ＩＴＧ ４３３９ ＩＴＧ ４０８５ ＩＴＧ ４３０８ ＩＴＧ ３９３９ ＩＴＧ ４３６３ ＩＴＧ ４３６７ ＩＴＧ ４４０１ １ＴＧ ４４３７ １３゜ デイセリア・メニンシティディス （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｎ
ＣＴＣ１００２５” 手 続 補 正 書 （方式） ％式％：５ 事件の表示 平成１年特許願第 ９３２３６号 ２、発明の名称 ブイセリア菌株を検出するための交雑プローブ３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 名称 エヌ・ブイ・インノジェネティクス会ソシエテ
・アノニム ４、代 理 人 第１８図 ５、補正命令の日付 平成１年７月２５日 ６、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄及び図面（１）明細書の
図面の簡単な説明の欄 明細書第１２６頁第５行目と第６行目の間に以下の記載
を挿入する。 「第８図は、図中番号が大腸菌の１６ｓｒＲＮＡ配列を
示している大腸菌の１６３ｒＲＡ分子を表わしている。 第９図は、図中番号が大腸菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を示している大腸菌の２３ＳｒＲＮＡ分子
を表わしている。」 く＝ １．５＠口 ＝口 ＜− ロ１０ コｌコ くコ 口１Ｉｃ５ ０く 一■− 一■コ 一り く −く Ｕコ ロ−ｃ３ く■く く Ｃ −く Ｕ■ Ｑ 口■ロ コ層コ Ｕ■Ｑ く− 口ｌ口 υ−Ｕ 口ｌ口 ４＋１ ロ −一 −く く■く −く 一■− く− （２）図面において、第２図〜第５図、第８図及び第１
１図〜第１５図を、別紙のとおり補正する。 一り く 一■− コー 口ｌ口 く■く 口く く 中 口 に） 法 ｈＯ： ３０口口 こロココ （り χ ＝凹トコ ζ＝１１Ｄ 淀百品 瞭 ＝［口］ ル８０口］ Ｏｘ：口 冨 χ 田 ■
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）単数又は複数のナイセリア菌株を検出するための
プローブにおいて、 −以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核酸に属
し、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数までのヌ
クレオチドで構成されている配列； 【遺伝子配列があります。】 −又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれ の末端のいずれかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、 前記配列のいずれかの内部における変更による、 又はその両方による、 上述の配列（４）から（１８）までのいずれとも異なる
変形配列； （ただし前記いずれの状況の下でもなお、当該プローブ
は相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的と交
雑する） を含むことを特徴とするプローブ。 （２）−以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核
酸に属し、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数ま
でのヌクレオチドで構成されている配列； 【遺伝子配列があります。】 −又は、 ・単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のい
ずれかへの付加又はこれからの除去による ・或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列の
いずれかの内部における変更による、 ・又はその両方による、 上述の配列（１）から（１８）までのいずれとも異なる
変形配列、 （ただし前記いずれの状況においてもなお、当該プロー
ブは相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的と
交雑する）、 を含むことを特徴とする請求項（１）に記載のプローブ
。 （３）交雑媒質又は洗浄媒質或いは場合によってその両
方が以下のものであるとき、以下に規定する配列又は相
応する相補性配列の１つを標的とする、単数または複数
のナイセリア菌株を検出するプローブにおいて： −交雑媒質：約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５
）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．１、２０％の
脱イオンホルムアミド、０．０２％のフィコール、０．
０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニル
ピロリドン及び約０．１ｍｇ／ｍｌのせん断され変性さ
れたサケ精子ＤＮＡを含む、 −洗浄媒質；約３×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液
ｐＨ７．１、及び２０％の脱イオンホルムアミドを含む
、 前記標的配列及び相応する関連交雑温度 （ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）がそれぞれ以下のとおり
であることを特徴とするプローブ： 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５５℃から約６０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃から約７０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５５℃から約６０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５５℃から約６０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃から約６５℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５５℃から約６０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約４５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約４０℃から約４５℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５０℃から約５５℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５０℃から約６０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５０℃から約５５℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約４５℃ （４）単数又は複数のナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓ
ｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）菌株をその他の
細菌株から特にその他のナイセリア菌株から検出するた
めのプローブにおいて、 −以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核酸に属
し、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数までのヌ
クレオチドで構成されている配列； 【遺伝子配列があります。】 −又は ・単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のい
ずれかへの付加又はそれからの除去による、 ・或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列の
いずれかの内部における変更による、 ・又はその両方による、 上述の配列（４）から（１８）までのいずれとも異なる
変形配列： （ただし前記いずれの状況の下でもなお、当該プローブ
は相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的と交
雑する） を含むことを特徴とするプローブ。 （５）単数又は複数のナイセリア・ゴノレエ菌株をその
他の細菌株特にその他のナイセリア菌株から検出するた
めのプローブにおいて、 −以下の核酸グループの中から選ばれた１つの核酸に属
し、それ自体選ばれた核酸の１０個から最大数までのヌ
クレオチドで構成されている配列： 【遺伝子配列があります。】 （ただし、ＴＣＡ ＴＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＡＴ
ＡＴＴ ＧＧＣという配列では構成されていない） −又は ・単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のい
ずれかへの付加又はそれからの除去による、 ・或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列の
いずれかの内部における変更による、 ・又はその両方による、 上述の配列（４）から（１８）までのいずれとも異なる
変形配列； （ただし前記いずれの状況の下でもなお、当該プローブ
は相応する未変更配列と同じＲＮＡ又はＤＮＡ標的と交
雑する） を含むことを特徴とするプローブ。 （６）交雑媒質又は洗浄媒質或いは場合によってその両
方が以下のものであるとき、以下に規定する配列又は相
応する相補性配列の１つを標的とする、単数または複数
のナイセリア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特にその
他のナイセリア菌の中から検出するプローブにおいて： −交雑媒質；約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．１、２０％の
脱イオンホルムアミド、０．０２％のフィコール、０．
０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニル
ピロリドン、及び約０．１ｍｇ／ｍｌのせん断され変性
されたサケ精子ＤＮＡを含む、 −洗浄媒質：約３×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液
ｐＨ７．１、及び２０％の脱イオンホルムアミドを含む
、 前記標的配列及び相応する関連交雑温度 （ＨＴ）及び洗浄温度（ＷＴ）がそれぞれ以下のとおり
であることを特徴とするプローブ： 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５０℃から約６５℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃から約７０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃から約７０℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約７０℃から約７５℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６５℃ 【遺伝子配列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約５０℃から約５５℃【遺伝子配
列があります。】 ＨＴ及び／又はＷＴ：約６０℃ （７）生物学的試料内でナイセリア菌株を他の細菌株か
ら検出するための方法において、かかる方法には、試料
中に存在しうるナイセリア菌株の相補性核酸とプローブ
の間の交雑を可能にする条件の下で、請求項（１）乃至
（６）のいずれか１つに従ったプローブを、適切な変性
条件の下で必要とあらば菌株の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ
）が交雑に対しアクセス可能な状態にされている前記生
物学的試料と接触させる作業が含まれていることを特徴
とする方法。 （８）使用されるプローブは、生物学的試料内に存在し
うるナイセリア菌株のＤＮＡ及びＲＮＡと両方共交雑す
るものであることを特徴とする、請求項（７）に記載の
生物学的試料内で他の細菌株からナイセリア菌株を検出
するための方法。 （９）交雑媒質には、約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５
ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．１、
２０％の脱イオンホルムアミド、０．０２％のフィコー
ル、０．０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポ
リビニルピロリドン、及び約０．１ｍｇ／ｍｌのせん断
され変性されたサケ精子ＤＮＡが含まれること、又は洗
浄媒質：約３×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ
７．１、及び２０％の脱イオンホルムアミドが含まれて
いること、そして使用されるプローブは、請求項（２）
に記載のプローブ（１）、（１ｂｉｓ）、（１ｔｅｒ）
又は（１ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約
５５℃好ましくは約５３℃の範囲にそして／又は洗浄温
度が約５５℃好ましくは約５３℃の範囲に適切に調整さ
れている）：又は、請求項（２）に記載のプローブ（２
）、（２ｂｉｓ）、（２ｔｅｒ）又は（２ｑｕａｔｅｒ
）のいずれか（なお交雑温度は約６０℃の範囲にそして
／又は洗浄温度が約６０℃の範囲に適切に調整されてい
る）；又は、請求項（２）に記載のプローブ（３）、（
３ｂｉｓ）、（３ｔｅｒ）又は（３ｑｕａｔｅｒ）のい
ずれか（なお交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又は
洗浄温度が約６０℃の範囲に適切に調整されている）；
又は、請求項（２）に記載のプローブ（４）、（４ｂｉ
ｓ）、（４ｔｅｒ）又は（４ｑｕａｔｅｒ）のいずれか
（なお交雑温度は約６５℃の範囲にそして／又は洗浄温
度が約６５℃の範囲に適切に調整されている）；又は、
請求項（２）に記載のプローブ（５）、（５ｂｉｓ）、
（５ｔｅｒ）又は（５ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお
交雑温度は約５５℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約
５５℃の範囲に適切に調整されている）；又は、請求項
（２）に記載のプローブ（９）、（９ｂｉｓ）、（９ｔ
ｅｒ）又は（９ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温
度は約６０℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約６０℃
の範囲に適切に調整されている）；又は、請求項（２）
に記載のプローブ（６）、（６ｂｉｓ）、（６ｔｅｒ）
又は（６ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約
６５℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約６５℃から約
７０℃の範囲に適切に調整されている）；又は、請求項
（２）に記載のプローブ（７）、（７ｂｉｓ）、（７ｔ
ｅｒ）又は（７ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温
度は約５５℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約５５℃
の範囲に適切に調整されている）；又は、請求項（２）
に記載のプローブ（８）、（８ｂｉｓ）、（８ｔｅｒ）
又は（８ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約
５５℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約５５℃の範囲
に適切に調整されている）；又は、請求項（２）に記載
のプローブ（１０）、（１０ｂｉｓ）、（１０ｔｅｒ）
又は（１０ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は
約５５℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約５５℃から
約６０℃の範囲に適切に調整されている）；又は、請求
項（２）に記載のプローブ（１１）、（１１ｂｉｓ）、
（１１ｔｅｒ）又は（１１ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（
なお交雑温度は約５５℃にそして／又は洗浄温度が約５
５℃に適切に調整されている）；又は、請求項（２）に
記載のプローブ（１２）、（１２ｂｉｓ）、（１２ｔｅ
ｒ）又は（１２ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温
度は約５５℃から約６０℃の範囲にそして／又は洗浄温
度が約５５℃から約６０℃の範囲に適切に調整されてい
る）；又は、請求項（２）に記載のプローブ（１３）、
（１３ｂｉｓ）、（１３ｔｅｒ）又は（１３ｑｕａｔｅ
ｒ）のいずれか（なお交雑温度は約４５℃の範囲にそし
て／又は洗浄温度が約４５℃の範囲に適切に調整されて
いる）；又は、請求項（２）に記載のプローブ（１４）
、（１４ｂｉｓ）、（１４ｔｅｒ）又は（１４ｑｕａｔ
ｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約４０℃から約４５
℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約４０℃から約４５
℃の範囲に適切に調整されている）；又は、請求項（２
）に記載のプローブ（１５）、（１５ｂｉｓ）、（１５
ｔｅｒ）又は（１５ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交
雑温度は約５０℃から約５５℃の範囲にそして／又は洗
浄温度が約５０℃から約５５℃の範囲に適切に調整され
ている）；又は、請求項（２）に記載のプローブ（１６
）、（１６ｂｉｓ）、（１６ｔｅｒ）又は（１６ｑｕａ
ｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約５０℃から約６
０℃の範囲にそして／又は洗浄温度が約５０℃から約６
００℃の範囲に適切に調整されている）；又は、請求項
（２）に記載のプローブ（１７）、（１７ｂｉｓ）、（
１７ｔｅｒ）又は（１７ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（な
お交雑温度は約５０℃から約５５℃の範囲にそして／又
は洗浄温度が約５０℃から約５５℃の範囲に適切に調整
されている）；又は、請求項（２）に記載のプローブ（
１８）、（１８ｂｉｓ）、（１８ｔｅｒ）又は（１８ｑ
ｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約４５℃の範
囲にそして／又は洗浄温度が約４５℃の範囲に適切に調
整されている）であることを特徴とする、請求項（７）
又は（８）に記載のナイセリア菌株をその他の細菌株か
ら検出するための方法。 （１０）ナイセリア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特
にその他のナイセリア菌株から検出するための方法にお
いて、その他のナイセリア菌株の相補性ＤＮＡ又はＲＮ
Ａとではなく、試料中に存在しうるナリセリア・ゴノレ
エ菌株の相補性核酸との特異的交雑を確実にするように
調整された交雑・洗浄条件の下で必要とされる場合つね
に、請求項（２）に記載のプローブ（１）、（１ｂｉｓ
）、（１ｔｅｒ）、（１ｑｕａｔｅｒ）、（２）、（２
ｂｉｓ）、（２ｔｅｒ）、（２ｑｕａｔｅｒ）、（３）
、（３ｂｉｓ）、（３ｔｅｒ）、（３ｑｕａｔｅｒ）、
（４）、（４ｂｉｓ）、（４ｔｅｒ）、（４ｑｕａｔｅ
ｒ）、（５）、（５ｂｉｓ）、（５ｔｅｒ）、（５ｑｕ
ａｔｅｒ）、（９）、（９ｂｉｓ）、（９ｔｅｒ）、（
９ｑｕａｔｅｒ）、（１１）、（１１ｂｉｓ）、（１１
ｔｅｒ）、（１１ｑｕａｔｅｒ）、（１３）、（１３ｂ
ｉｓ）、（１３ｔｅｒ）、（１３ｑｕａｔｅｒ）、（１
８）、（１８ｂｉｓ）、（１８ｔｅｒ）及び（１８ｑｕ
ａｔｅｒ）の中から選択されたナイセリア、ゴノレエ菌
株に特異的な本発明に基づくプローブを、適切な変性条
件下で必要とあらば核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）が交雑に
対してアクセス可能な状態にされているような前記生物
学的試料と接触させる段階、そして形成される可能性の
ある雑種を検出する段階が含まれていることを特徴とす
る方法。 （１１）交雑媒質には約３×ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５
ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０）、約２５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．１、
２０％の脱イオンホルムアミド、０．０２％のフィコー
ル、０．０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポ
リビニルピロリドン、及び約０．１ｍｇ／ｍｌのせん断
され変性されたサケ精液ＤＮＡが含まれていること又は
洗浄媒質には約３×ＳＳＣ、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液
ｐＨ７．１、及び２０％の脱イオンホルムアミドが含ま
れていること、そして使用されるプローブは、請求項（
２）に記載のプローブ（１）、（１ｂｉｓ）、（１ｔｅ
ｒ）又は（１ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度
は約５５℃好ましくは約５３℃の範囲にそして／又は洗
浄温度が約５５℃から約６５℃まで好ましくは約５３℃
から約６５℃までの範囲に適切に調整されている）；又
は、請求項（２）に記載のプローブ（２）、（２ｂｉｓ
）、（２ｔｅｒ）又は（２ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（
なお交雑温度は約６０℃の範囲にそして／又は洗浄温度
は約６５℃から約７０℃までの範囲に適切に調整されて
いる）；又は、請求項（２）に記載のプローブ（３）、
（３ｂｉｓ）、（３ｔｅｒ）又は（３ｑｕａｔｅｒ）の
いずれか（なお、交雑温度は約６０℃の範囲にそして／
又は洗浄温度は約６５℃から約７０℃の範囲に適切に調
整されている）；又は、請求項（２）に記載のプローブ
（４）、（４ｂｉｓ）、（４ｔｅｒ）又は（４ｑｕａｔ
ｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約６５℃の範囲にそ
して／及び洗浄温度は約７０℃から約７５℃の範囲に適
切に調整されている）；又は、請求項（２）に記載のプ
ローブ（５）、（５ｂｉｓ）、（５ｔｅｒ）又は（５ｑ
ｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約６０℃の範
囲にそして／又は洗浄温度は約６５℃の範囲に適切に調
整されている）；又は、請求項（２）に記載のプローブ
（９）、（９ｂｉｓ）、（９ｔｅｒ）又は（９ｑｕａｔ
ｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約６０℃から約６５
℃の範囲にそして／又は洗浄温度は約６５℃の範囲に適
切に調整されている）、又さらに好ましくは、請求項（
２）に記載のプローブ（１）、（１ｂｉｓ）、（１ｔｅ
ｒ）又は（１ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度
は約５５℃の範囲にそして／又は洗浄温度は約５５℃か
ら約６５℃の範囲に適切に調整されている）；又は、請
求項（２）に記載のプローブ（１１）、（１１ｂｉｓ）
、（１１ｔｅｒ）又は（１１ｑｕａｔｅｒ）のいずれか
（なお交雑温度は約６５℃にそして／又は洗浄温度は約
６５℃に適切に調整されている）；又は、請求項（２）
に記載のプローブ（１３）、（１３ｂｉｓ）、（１３ｔ
ｅｒ）又は（１３ｑｕａｔｅｒ）のいずれか（なお交雑
温度は約５０℃から約５５℃の範囲にそして／又は洗浄
温度は約５０℃から約５５℃の範囲に適切に調整されて
いる）；或いは又請求項（２）に記載のプローブ（１８
）、（１８ｂｉｓ）、（１８ｔｅｒ）又は（１８ｑｕａ
ｔｅｒ）のいずれか（なお交雑温度は約６０℃にそして
／又は洗浄温度は約６０℃に適切に調整されている）で
あることを特徴とする、請求項（１０）に記載のナイセ
リア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特にその他のナイ
セリア菌株から検出するための方法。 （１２）生物学的試料内のナイセリア菌株を大部分好ま
しくは全て試験管内で検出するためのキットにおいて、 −請求項（１）乃至（４）に記載のものの中から選択さ
れた少なくとも１つのプローブ； −これらのプローブと、大部分好ましくは全てのナイセ
リア菌株のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの間の交雑反応が行
なわれうるようにするような緩衝液又はそれを作るのに
必要な構成成分；−該当する場合には、先行する交雑の
結果得られた雑種を検出するための手段、 が含まれていることを特徴とするキット。 （１３）生物学的試料内のナイセリア・ゴノレエ菌株を
試験管内で検出するためのキットにおいて、 −請求項（２）に記載のプローブ（２）、 （２ｂｉｓ）、（２ｔｅｒ）、（２ｑｕａｔｅｒ）、（
３）、（３ｂｉｓ）、（３ｔｅｒ）、（３ｑｕａｔｅｒ
）、（４）、（４ｂｉｓ）、（４ｔｅｒ）、（４ｑｕａ
ｔｅｒ）、（５）、（５ｂｉｓ）、（５ｔｅｒ）、（５
ｑｕａｔｅｒ）、（９）、（９ｂｉｓ）、（９ｔｅｒ）
、（９ｑｕａｔｅｒ）、（１１）、（１１ｂｉｓ）、（
１１ｔｅｒ）、（１１ｑｕａｔｅｒ）、（１３）、（１
３ｂｉｓ）、（１３ｔｅｒ）、（１３ｑｕａｔｅｒ）、
（１８）、（１８ｂｉｓ）、（１８ｔｅｒ）、（１８ｑ
ｕａｔｅｒ）の中から選択されたプローブ好ましくは請
求項（２）に記載のプローブ （１）、（１ｂｉｓ）、（１ｔｅｒ）又は（１ｑｕａｔ
ｅｒ）のいずれかの中から選ばれたプローブといったよ
うな上述のナイセリア・ゴノレエに特異的な少なくとも
１つのプローブ； −これらのプローブとナイセリア・ゴノレエ菌株のＤＮ
Ａ及び／又はＲＮＡの間の交雑反応を行なうことができ
るようにするような緩衝液又はそれを作るのに必要な構
成成分； −該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種
を検出するための手段； が含まれていることを特徴とするキット。 （１４）ナイセリア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特
にその他のナイセリア菌株から検出するための方法にお
いて、かかる方法には、その他のナイセリア菌種の相補
性ＤＮＡ又はＲＮＡとは交雑せず、試料中に存在しうる
ナイセリア・ゴノレエ菌株の相補性核酸と特異的に交雑
するように調整された交雑及び洗浄条件の下で必要とさ
れる場合にはつねに、 −グループ９のプローブとグループ１、２、３、５及び
１３のプローブのうちのいずれか−グループ１３のプロ
ーブとグループ１、２、３、及び５のプローブのうちの
いずれか −グループ１８のプローブとグループ１、２、３、５、
９及び１３のプローブのうちのいずれか −グループ５のプローブとグループ１、２、及び３のプ
ローブのうちのいずれか といった組合せの中から選択された、そしてさらに好ま
しくは、 −グループ９のプローブとグループ５のプローブ −グループ１８のプローブとグループ５及び９のプロー
ブのうちの１つ といった組合せの中から選択された、 ナイセリア・ゴノレエ菌種に特異的でかつそれぞれ同じ
非標的菌種に対し交雑することのできない請求項（１）
乃至（６）のいずれかに記載の２つのプローブと、必要
とあらば適切な変性条件の下で核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ
）が交雑に対しアクセス可能な状態にされる前記生物学
的試料を接触させる作業及び形成されうる雑種を検出す
る作業が含まれていることを特徴とする方法。 （１５）生物学的試料内のナイセリア・ゴノレエ菌種を
試験管内で検出するための、サンドイッチ交雑検定用キ
ットにおいて、 −・グループ９のプローブとグループ１、２、３、５及
び１３のプローブのうちのいずれ か ・グループ１３のプローブとグループ１、 ２、３及び５のプローブのうちのいずれか ・グループ１８のプローブとグループ１、 ２、３、５、９及び１３のプローブのうちのいずれか グループ５のプローブとグループ１、２及 び３のプローブのうちのいずれか といった組合せの中から選択された、さらに好ましくは
、 ・グループ９のプローブとグループ５のプ ローブ ・グループ１８のプローブとグループ５及び９のプロー
ブのいずれか１つ といった組合せの中から選択されたナイセリア・ゴノレ
エに特異的な少なくとも２つのプローブ； −これらのプローブと、ナイセリア・ゴノレエのＤＮＡ
及び／又はＲＮＡの間の交雑反応が行なわれうるように
する緩衝液又はこの緩衝液を作るのに必要な構成成分； −該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種
を検出するための手段 が含まれていることを特徴とするキット。
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