JPH02203800A - ナイセリア菌株を検出するための交雑プローブ - Google Patents
ナイセリア菌株を検出するための交雑プローブInfo
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、ナイセリア菌株及びナイセリア属及び関連す
る分類群に属する分離株を検出するための交雑プローブ
に関する。以下「菌株」という語は生物学的試料中に含
まれている生体又は分離株をも網羅する。
る分類群に属する分離株を検出するための交雑プローブ
に関する。以下「菌株」という語は生物学的試料中に含
まれている生体又は分離株をも網羅する。
〈従来の技術〉
これまで知られており、全ゲノムデオキシリボ核酸(D
NA) 、自生プラスミド、クローニングされたDNA
フラグメント(断片)又は合成オリゴヌクレオチドのい
ずれかでありうるプローブのほとんどは、検出されるべ
き生体のDNAを標的とする。
NA) 、自生プラスミド、クローニングされたDNA
フラグメント(断片)又は合成オリゴヌクレオチドのい
ずれかでありうるプローブのほとんどは、検出されるべ
き生体のDNAを標的とする。
rRNAから誘導されたプローブを用いてリポソームリ
ボ核酸(rRNA)を標的にすることが、何度が提案さ
れてきた。リポソームリボ核酸を標的にすることは、リ
ポソームが細胞内にきわめて豊富にあることから、診断
テストの感度の増大につながる。
ボ核酸(rRNA)を標的にすることが、何度が提案さ
れてきた。リポソームリボ核酸を標的にすることは、リ
ポソームが細胞内にきわめて豊富にあることから、診断
テストの感度の増大につながる。
それでも反対に、rRNAシストロンの中にみられる高
い配列保存度ひいてはrRNAにより誘導されたプロー
ブの特異性の欠如は、関係する分類群を選択するのにr
RNAにより誘導されたプローブを用いることに対する
障害となる重要な欠点である。実際、これまでに知られ
ているrRNAにより誘導されたプローブは、主として
レジオネラ(Wi 1kinson他、 1986年:
Edelstein、 1986年)又はシュード
モナス・フルオレッセンス類属(Festl他、198
6年)のような生体の広範なグループを検出するため又
はマイコプラズマ(Coekel伯、 1987年)及
びクラミジア種IPa1mer他、 1986年)とい
った比較的遠い関係の種を互いに区別するために主とし
て用いられている。プロテウス・ブルガリスとプロテウ
ス・ミラビリスの識別について記した報告書もある(H
ann及びGoebel共著。
い配列保存度ひいてはrRNAにより誘導されたプロー
ブの特異性の欠如は、関係する分類群を選択するのにr
RNAにより誘導されたプローブを用いることに対する
障害となる重要な欠点である。実際、これまでに知られ
ているrRNAにより誘導されたプローブは、主として
レジオネラ(Wi 1kinson他、 1986年:
Edelstein、 1986年)又はシュード
モナス・フルオレッセンス類属(Festl他、198
6年)のような生体の広範なグループを検出するため又
はマイコプラズマ(Coekel伯、 1987年)及
びクラミジア種IPa1mer他、 1986年)とい
った比較的遠い関係の種を互いに区別するために主とし
て用いられている。プロテウス・ブルガリスとプロテウ
ス・ミラビリスの識別について記した報告書もある(H
ann及びGoebel共著。
1987年)。両種共約50%のDNA相同値を有する
。現在のところ、これが、サザンプロット分析法を用い
ることな(rRNA誘導のプローブを用いて達すること
のできる最高の特異性である。
。現在のところ、これが、サザンプロット分析法を用い
ることな(rRNA誘導のプローブを用いて達すること
のできる最高の特異性である。
従って、本発明の発明者によって発見されたように、高
い関連性をもつ細菌種同士のみならず亜種レベルで関係
する分類群同士をも単純な直接交雑方法を用いて識別す
ることのできる特異的rDNA誘導のプローブを作り出
すことができるというのは、予想外のことであった。特
に、ナイセリア・ゴル工菌株を、本書に記されているい
くつかのプローブでの・ドツト−スポット交雑検定を用
いて、ナイセリア・メニンシティディス菌株を含むその
他のナイセリア菌株から識別することができた。
い関連性をもつ細菌種同士のみならず亜種レベルで関係
する分類群同士をも単純な直接交雑方法を用いて識別す
ることのできる特異的rDNA誘導のプローブを作り出
すことができるというのは、予想外のことであった。特
に、ナイセリア・ゴル工菌株を、本書に記されているい
くつかのプローブでの・ドツト−スポット交雑検定を用
いて、ナイセリア・メニンシティディス菌株を含むその
他のナイセリア菌株から識別することができた。
く課題を解決するための方法〉
従って、本発明の1つの目的は、単数又は複数のナイセ
リア菌株を検出するためのrRNAに関係するプローブ
を提供することにある。
リア菌株を検出するためのrRNAに関係するプローブ
を提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、ナイセリア・ゴル工菌株を
他の細菌株特にその他のナイセリア菌株及びナイセリア
・メニンシティディス菌株と識別するためのrRNA関
係プローブを提供することにある。
他の細菌株特にその他のナイセリア菌株及びナイセリア
・メニンシティディス菌株と識別するためのrRNA関
係プローブを提供することにある。
本発明のもう1つの目的は、サザンプロット分析法とい
った他のいかなる補足的分析にも頼ることなく、ドツト
スポット交雑試験といった単純な交雑試験により単数又
は複数のナイセリア菌株を検出するためのプローブを提
供することにある。
った他のいかなる補足的分析にも頼ることなく、ドツト
スポット交雑試験といった単純な交雑試験により単数又
は複数のナイセリア菌株を検出するためのプローブを提
供することにある。
本発明のさらにもう1つの目的は、単数又は複数のナイ
セリア菌株の試験管内診断のためのプローブ及び単純な
方法を提供することにある。
セリア菌株の試験管内診断のためのプローブ及び単純な
方法を提供することにある。
本書で用いられているrrRNA関係の」という話は、
該当するプローブが、それ自体DNA又はRNAのいず
れのフラグメントで形成されているか又それがクローニ
ングされたフラグメント(DNAの場合)又は合成オリ
ゴヌクレオチドのいずれで構成されているかにかかわら
ず、リポソームRNA内に通常存在する配列と交雑する
という事実を表わす。
該当するプローブが、それ自体DNA又はRNAのいず
れのフラグメントで形成されているか又それがクローニ
ングされたフラグメント(DNAの場合)又は合成オリ
ゴヌクレオチドのいずれで構成されているかにかかわら
ず、リポソームRNA内に通常存在する配列と交雑する
という事実を表わす。
本書で用いられている「ナイセリア」という語は、「ナ
イセリア」という名の細菌のみを表わすのではなく、「
ナイセリア」属に属する細菌と相互にきわめて関係の強
いキンゲラ(1(inge11a)、エイケネラ(Ei
kene11a) 、シモンシェラ(Simonsie
11a) 、アリシェラ(Alysie11a)及びC
DC類属EF−4及びM−5のような名前のある又は名
前の無い分類群をも表わす、これらの分類群は、フラグ
メント(Flavescens)ATCC1312Dの
リポソームRNAに対して約6℃のTm (e)範囲内
で見られる。Tm(e)は、Rossau、 R,、A
、 Van Landschoot、 Vl。
イセリア」という名の細菌のみを表わすのではなく、「
ナイセリア」属に属する細菌と相互にきわめて関係の強
いキンゲラ(1(inge11a)、エイケネラ(Ei
kene11a) 、シモンシェラ(Simonsie
11a) 、アリシェラ(Alysie11a)及びC
DC類属EF−4及びM−5のような名前のある又は名
前の無い分類群をも表わす、これらの分類群は、フラグ
メント(Flavescens)ATCC1312Dの
リポソームRNAに対して約6℃のTm (e)範囲内
で見られる。Tm(e)は、Rossau、 R,、A
、 Van Landschoot、 Vl。
Mannheim、及びJ、 De Ley共著(19
86年)の[ナイセリア科のリポソーム リボ核酸シス
トロンの居間及び翼内類似性J (Int、 J、 5
yst、Bacterio136、323−332)内
に定義されている。
86年)の[ナイセリア科のリポソーム リボ核酸シス
トロンの居間及び翼内類似性J (Int、 J、 5
yst、Bacterio136、323−332)内
に定義されている。
指示されているデルタ Tm (e) 範囲内に見
られない、Ne1sseria caviae、 Ne
1sseriacunicu11、 Ne1sser
ia ovis、 Ne1sseriacatar
rha11s (Bran hame11a(Mor
axe11a)catarrha11s)、 Kin
ge11a indologenes及びAlysie
11a種などの誤った名をもつ細菌は、ナイセリア類属
には属していないということに留意されたい。
られない、Ne1sseria caviae、 Ne
1sseriacunicu11、 Ne1sser
ia ovis、 Ne1sseriacatar
rha11s (Bran hame11a(Mor
axe11a)catarrha11s)、 Kin
ge11a indologenes及びAlysie
11a種などの誤った名をもつ細菌は、ナイセリア類属
には属していないということに留意されたい。
単数又は複数のナイセリア菌株を検出するための本発明
に基づく交雑プローブは、以下のものを含んでいる: 以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列 グループ4 GGTACCGTCATCGGCCGCCGATATT
GGCA^C^入入入GTCC CAAAAGUeC (4bis) TATCGGCGGCCGATGACGOTACC(4
t6r) GGIJACCGIJCAtJCGGCCGCCG^U
AUUGGCA^GGACTTTTGTCAGGG^^ (4quatar) グループ5 グループ6 ATAl’CG’rGGT グループ7 グループ8 ACCCTACCTJLCTTCTGGTATCCCC
CAC(6quatar) グループ9 t11jAGCtlGUIJGGGCAAC(J(jG
AUUGcUU(11GLIAGcGU(5quata
z) グループ10 グループ15 グループ11 丁TTCGTACGCTTAG’rACCGCTOT’
rOAGAouucaυ^CGCIJUAGUACCG
CUGUUGAGATCTCAACAGCGGTACT
AAGCOT^CG入入AUCtlCAACAGCGG
UACUAAGC(iUAcOAAAグループ16 GTCGTATCGGTTGCTTCGTGTCCGT
AGAC入GIJGGtl^ (15bis) (15tat) (15quatar) (16bis) グループ12 kCk グループ13 TGC グループ14 TCTCGACAGT?A〒TACG1’ACAtlC
UCGACAGUUAtlUACOtlACAテG丁A
CGTAA’l’AACTGTCGAO^tJOUAC
GtlAAIJAACOQUCGAGA(12bis) (12tar) (12quatsr) (13bis) C14】 (14b11) (14tar) (14quat@r) グループ17 AAGCTA A
AAAGCUAUUCCAACAGCtlUGCCAA
CCUAA丁丁
TAGCTT11(J
AGCUUグループ18 TGGTGGGCCTTTACCCCGCC^^CCA
GCTuaauaaaccuouAcccccccxA
ccxacuAAAGGCCCACCA GGCCC^CC^ (17big) (17七5r) (17quater) (1B) (18bis) (18ter) (113quater) (なおここにおいて、それぞれの文字は以下のようなヌ
クレオチドを意味する: A:アデニル残基 C:シチジル残基 G:グアニジル残基 T:チミジル残基 U:ウラシル残基 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による、 先行する配列(4)から(18)までのいずれとも異な
る変形配列、 (ただし、前記いずれの状況の下でもなお、かかるプロ
ーブは相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的
と交雑する)。
に基づく交雑プローブは、以下のものを含んでいる: 以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列 グループ4 GGTACCGTCATCGGCCGCCGATATT
GGCA^C^入入入GTCC CAAAAGUeC (4bis) TATCGGCGGCCGATGACGOTACC(4
t6r) GGIJACCGIJCAtJCGGCCGCCG^U
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CUGUUGAGATCTCAACAGCGGTACT
AAGCOT^CG入入AUCtlCAACAGCGG
UACUAAGC(iUAcOAAAグループ16 GTCGTATCGGTTGCTTCGTGTCCGT
AGAC入GIJGGtl^ (15bis) (15tat) (15quatar) (16bis) グループ12 kCk グループ13 TGC グループ14 TCTCGACAGT?A〒TACG1’ACAtlC
UCGACAGUUAtlUACOtlACAテG丁A
CGTAA’l’AACTGTCGAO^tJOUAC
GtlAAIJAACOQUCGAGA(12bis) (12tar) (12quatsr) (13bis) C14】 (14b11) (14tar) (14quat@r) グループ17 AAGCTA A
AAAGCUAUUCCAACAGCtlUGCCAA
CCUAA丁丁
TAGCTT11(J
AGCUUグループ18 TGGTGGGCCTTTACCCCGCC^^CCA
GCTuaauaaaccuouAcccccccxA
ccxacuAAAGGCCCACCA GGCCC^CC^ (17big) (17七5r) (17quater) (1B) (18bis) (18ter) (113quater) (なおここにおいて、それぞれの文字は以下のようなヌ
クレオチドを意味する: A:アデニル残基 C:シチジル残基 G:グアニジル残基 T:チミジル残基 U:ウラシル残基 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による、 先行する配列(4)から(18)までのいずれとも異な
る変形配列、 (ただし、前記いずれの状況の下でもなお、かかるプロ
ーブは相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的
と交雑する)。
「標的」という表現は、前述のグループ(4)から(1
8)までの配列のいずれかに対し相補的な配列を意味す
る。なお、本発明に基づくプローブに前述の配列の片側
又は両側に核酸の延長が含まれる場合(例えばクローニ
ングベクターの核酸フラグメント又は、このクローニン
グベクターからのこのプローブの開裂の結果として生じ
るリンカ−フラグメント)、このような延長は、それら
自体、以下に規定するような本発明に基づく方法により
テストされる可能性のあるいずれかの微生物のDNA内
で上述の標的の外のその他の相応する相補足核酸配列し
うる可能性を避けるように選択されるべきである。かか
る交雑は、寄生的性質のものでプローブの特異性を低下
させる。
8)までの配列のいずれかに対し相補的な配列を意味す
る。なお、本発明に基づくプローブに前述の配列の片側
又は両側に核酸の延長が含まれる場合(例えばクローニ
ングベクターの核酸フラグメント又は、このクローニン
グベクターからのこのプローブの開裂の結果として生じ
るリンカ−フラグメント)、このような延長は、それら
自体、以下に規定するような本発明に基づく方法により
テストされる可能性のあるいずれかの微生物のDNA内
で上述の標的の外のその他の相応する相補足核酸配列し
うる可能性を避けるように選択されるべきである。かか
る交雑は、寄生的性質のものでプローブの特異性を低下
させる。
好ましいプローブは、(4)〜(18)の配列のいずれ
かで形成された核酸フラグメントから成り、かかるフラ
グメントには、関連する核酸酉d列の10個から最大数
までのヌクレオチドが含まれている。
かで形成された核酸フラグメントから成り、かかるフラ
グメントには、関連する核酸酉d列の10個から最大数
までのヌクレオチドが含まれている。
上述のヌクレオチド配列において(そして以下言及され
ている他のヌクレオチド配列において)、式の左端はつ
ねに関係する配列の5′末端に相当し、右端はその3′
末端に相当する。
ている他のヌクレオチド配列において)、式の左端はつ
ねに関係する配列の5′末端に相当し、右端はその3′
末端に相当する。
ここで「グループ゛X”のプローブJ (” X ”は
lから10まで)を参照すると、かかるプローブは、上
述の又は以下に記されているグループに属する核酸の1
つの中に含まれている配列を有することがわかる。
lから10まで)を参照すると、かかるプローブは、上
述の又は以下に記されているグループに属する核酸の1
つの中に含まれている配列を有することがわかる。
同様に、本書に用いられている「ヌクレオチド」という
語は、ここでは、相反する規定の無いかぎり、リボヌク
レオチド及びデオキシリボヌクレオチドそしてイノシン
のような変更されたヌクレオチドのことを区別熱(表わ
しているということがわかる。「ヌクレオチド」という
表現も、その交雑能力に影響を与えない化学修飾基とい
った修飾基を含むものも網羅している。かかる修飾基は
例えば、直接的又は間接的に適切なマーカーつまり標識
との結合を容易にしその後特に関連するrRNA又はD
NA鎖との交雑生成物例えば他のDNA及び/又はRN
Aと共に生物学的試料の中に当初台まれていたものとの
交雑生成物においてこのように標識づけされたプローブ
を検出することをその目的としている。
語は、ここでは、相反する規定の無いかぎり、リボヌク
レオチド及びデオキシリボヌクレオチドそしてイノシン
のような変更されたヌクレオチドのことを区別熱(表わ
しているということがわかる。「ヌクレオチド」という
表現も、その交雑能力に影響を与えない化学修飾基とい
った修飾基を含むものも網羅している。かかる修飾基は
例えば、直接的又は間接的に適切なマーカーつまり標識
との結合を容易にしその後特に関連するrRNA又はD
NA鎖との交雑生成物例えば他のDNA及び/又はRN
Aと共に生物学的試料の中に当初台まれていたものとの
交雑生成物においてこのように標識づけされたプローブ
を検出することをその目的としている。
例えば、かかる修飾基は、それ自体適切な酵素又はけい
光又は化学発光標識を有するその他の抗体により特異的
に認識されうる抗体によって認識されうる。考えられる
標識づけ手順が本書の後の部分において例示されている
。
光又は化学発光標識を有するその他の抗体により特異的
に認識されうる抗体によって認識されうる。考えられる
標識づけ手順が本書の後の部分において例示されている
。
本発明は又、上述の配列のうちのいずれかを有し、その
ヌクレオチドが異なるものであるようなプローブ(ただ
し異なるヌクレオチドが上述のプローブの特異性を変え
ることはない)にも関する。プローブの中には、上述の
グループ4から10までのいずれかに属する核酸の1つ
又はその一部分で構成されているものもある。ただしか
かるプローブは、それが以下に論述するようなナイセリ
アの遺伝形質とのこのプローブの特異性を変えることが
ないかぎりにおいて、そのいずれかの側にヌクレオチド
延長を含んでいる。
ヌクレオチドが異なるものであるようなプローブ(ただ
し異なるヌクレオチドが上述のプローブの特異性を変え
ることはない)にも関する。プローブの中には、上述の
グループ4から10までのいずれかに属する核酸の1つ
又はその一部分で構成されているものもある。ただしか
かるプローブは、それが以下に論述するようなナイセリ
アの遺伝形質とのこのプローブの特異性を変えることが
ないかぎりにおいて、そのいずれかの側にヌクレオチド
延長を含んでいる。
これらのプローブの大部分は、全てのナイセリアとはい
わないまでも多数のナイセリアと交雑されうる。しかし
ながら、グループ4.5.9゜11.13及び18のプ
ローブは、ナイセリア・ゴル工菌株のRNA又はDNA
の相応する領域とより選択的に(又場合によっては制御
された交雑条件の下で)交雑し、その他のナイセリア菌
株とは交雑しない。
わないまでも多数のナイセリアと交雑されうる。しかし
ながら、グループ4.5.9゜11.13及び18のプ
ローブは、ナイセリア・ゴル工菌株のRNA又はDNA
の相応する領域とより選択的に(又場合によっては制御
された交雑条件の下で)交雑し、その他のナイセリア菌
株とは交雑しない。
このことは特にグループ4のプローブから選択されたサ
ブグループにあてはまる。このサブグループは以下全体
的にグループlから3と呼ばれ、かかるグループの各々
はさらに特異的なプローブを含み(それでもなお通常少
なくとも10個のヌクレオチドを含む)、そのプローブ
には以下のものが含まれる: 以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列ニ グループ1: AAGGCtJGUtjGCCA入uiucaccac
ccc入(1quater) グループ2ニ グループ3: 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による。
ブグループにあてはまる。このサブグループは以下全体
的にグループlから3と呼ばれ、かかるグループの各々
はさらに特異的なプローブを含み(それでもなお通常少
なくとも10個のヌクレオチドを含む)、そのプローブ
には以下のものが含まれる: 以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核酸に属し
、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数までのヌク
レオチドで構成されている配列ニ グループ1: AAGGCtJGUtjGCCA入uiucaccac
ccc入(1quater) グループ2ニ グループ3: 又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のいず
れかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列のい
ずれかの内部における変更による、 又はその両方による。
先行する配列(1)から(3)までのいずれとも異なる
変形配列。
変形配列。
(ただし、前記いずれの状況の下でもなおかかるプロー
ブは相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的と
交雑する。) このように本発明は、場合によってヌクレオチド配列に
おいていくつかの細かい差異はあるもののほとんどのナ
イセリア菌株のrRNA内に含まれている配列のヌクレ
オチド配列に関するレプリカ(rterJ又はrqua
terJが後に続いている数字で表わされているもの)
であるか、或いは又、ナイセリア菌株の天然RNA内に
含まれている配列に対して相補的な(何もつかない数字
又はrbisJがついている数字により表わされている
)配列で形成されているようなプローブを提供する。
ブは相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的と
交雑する。) このように本発明は、場合によってヌクレオチド配列に
おいていくつかの細かい差異はあるもののほとんどのナ
イセリア菌株のrRNA内に含まれている配列のヌクレ
オチド配列に関するレプリカ(rterJ又はrqua
terJが後に続いている数字で表わされているもの)
であるか、或いは又、ナイセリア菌株の天然RNA内に
含まれている配列に対して相補的な(何もつかない数字
又はrbisJがついている数字により表わされている
)配列で形成されているようなプローブを提供する。
さらに限定的に言うと、関係するrRNA内の標的配列
は、ナイセリア菌株間の天然のわずかな差異はあるもの
の、全てのとは言わないまでもほとんどのナイセリア菌
株に存在する以下の連続的配列のいずれかから成り、こ
のため、このような自然の差異がかかる標的についての
本発明に基づくプローブの交雑特異性に影響を与えるこ
とは考えられないということがわかる: (5’)AAGGCoGtJUGCl:AAIJAIJ
CGGCOGCCGA (3’) (I
quatar)(5自)
UAUCCiGC
GGCCG& (3’) (2quatar)(5
’ )
UAUCGGCGGCCOAUGACGGUAC
C(3’ )(3quatat) GGCUGUUGCCAAtjAIJCGGCGGCC
GAUGACGGUACC(5“)(3・) (4quatar) (5’) U[1M:CU(iUIJGGOCAAC
UUGAUUGCUUGGIJAGCGU (3’)
(Squater)3UGGGGGAυA
CCAGAAGUAGGUAGGGUAACCGCAA
GGAGUCCGCUUACCACGGUAU(5°)
(3・)(6quater) 5’) UCG
GACIjGA (3’)
(7quater)5’) ACCUAGGtJC
CGGUCGGAAAIJCGGACUGA (3’
) (8quatez)5噛)
(コ’) (9q
uater)5’ )
(3’ )(10quater
)5’) O(’C0GG(iAGclX:GCAA
tJ入^^aCO^υGAIJtJCCGe (3’
) (11qua七sr)”’
(3’)
(12quatar)5′)
(コ’)
(13quatar)5’)
tlGOACGUAAUAACUGUCGAGA (
311(14quatar)s’)ococ^^cka
caat+xcυ^入GCOUACGA^^ (3’)
(15quater)5’)
UGIJCLIACGGACACGA^0CAACCG
ALIACCAC(3’) (16quat
er)5’)
(3’) (17quat@r)5’)
CCA (3’
) (18quatar)さまざまなプロ
ーブのヌクレオチド配列[又は(8quater)、
(9quater)、 (10quater)について
は関係するrRNA配列]相互の交雑能力の差異は、そ
れを含むと思われる生物学的試料内のナイセリア菌株(
ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイ
セリア・サブフラバ、ナイセリア・フラベツセンス、ナ
イセリア・エロンガータなど)の検出及び識別に関して
グループ(4)〜(18)の配列の選択性を確実なもの
にししかもそれらをその他の分類群と区別するのに十分
なほど小さいものである。しかしながら、グループ(4
)内でも(又グループ3.2及びlにおいてはさらにそ
うであるのだが)ならびにグループ5.9,11.13
内でも、これらの差異は、場合によってはさほど厳しく
ない交雑条件下でさえ(これについては後にさらに精密
に述べられている)又例えばホ乳動物特にヒトからとっ
た試料などの調査中の試料の中に存在するその他のDN
A又はRNAがある状態で、ナイセリア・ゴル工は菌株
をその他のナイセリア菌株から識別できるほど充分大き
いものとなっている。後に述べるように、必要とあらば
交雑条件及びそれに続く形成された雑種の洗浄条件を適
切に調整する時点でドツト・スポット方法を用いて交雑
を行なうことも可能である。
は、ナイセリア菌株間の天然のわずかな差異はあるもの
の、全てのとは言わないまでもほとんどのナイセリア菌
株に存在する以下の連続的配列のいずれかから成り、こ
のため、このような自然の差異がかかる標的についての
本発明に基づくプローブの交雑特異性に影響を与えるこ
とは考えられないということがわかる: (5’)AAGGCoGtJUGCl:AAIJAIJ
CGGCOGCCGA (3’) (I
quatar)(5自)
UAUCCiGC
GGCCG& (3’) (2quatar)(5
’ )
UAUCGGCGGCCOAUGACGGUAC
C(3’ )(3quatat) GGCUGUUGCCAAtjAIJCGGCGGCC
GAUGACGGUACC(5“)(3・) (4quatar) (5’) U[1M:CU(iUIJGGOCAAC
UUGAUUGCUUGGIJAGCGU (3’)
(Squater)3UGGGGGAυA
CCAGAAGUAGGUAGGGUAACCGCAA
GGAGUCCGCUUACCACGGUAU(5°)
(3・)(6quater) 5’) UCG
GACIjGA (3’)
(7quater)5’) ACCUAGGtJC
CGGUCGGAAAIJCGGACUGA (3’
) (8quatez)5噛)
(コ’) (9q
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)5’) O(’C0GG(iAGclX:GCAA
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) (11qua七sr)”’
(3’)
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(コ’)
(13quatar)5’)
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311(14quatar)s’)ococ^^cka
caat+xcυ^入GCOUACGA^^ (3’)
(15quater)5’)
UGIJCLIACGGACACGA^0CAACCG
ALIACCAC(3’) (16quat
er)5’)
(3’) (17quat@r)5’)
CCA (3’
) (18quatar)さまざまなプロ
ーブのヌクレオチド配列[又は(8quater)、
(9quater)、 (10quater)について
は関係するrRNA配列]相互の交雑能力の差異は、そ
れを含むと思われる生物学的試料内のナイセリア菌株(
ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイ
セリア・サブフラバ、ナイセリア・フラベツセンス、ナ
イセリア・エロンガータなど)の検出及び識別に関して
グループ(4)〜(18)の配列の選択性を確実なもの
にししかもそれらをその他の分類群と区別するのに十分
なほど小さいものである。しかしながら、グループ(4
)内でも(又グループ3.2及びlにおいてはさらにそ
うであるのだが)ならびにグループ5.9,11.13
内でも、これらの差異は、場合によってはさほど厳しく
ない交雑条件下でさえ(これについては後にさらに精密
に述べられている)又例えばホ乳動物特にヒトからとっ
た試料などの調査中の試料の中に存在するその他のDN
A又はRNAがある状態で、ナイセリア・ゴル工は菌株
をその他のナイセリア菌株から識別できるほど充分大き
いものとなっている。後に述べるように、必要とあらば
交雑条件及びそれに続く形成された雑種の洗浄条件を適
切に調整する時点でドツト・スポット方法を用いて交雑
を行なうことも可能である。
上述の特異性は、それがティセリア分類群に対するもの
であれ、ナイセリア・ゴル工亜分類群(サブタクソン)
に対するものであれ、使用されるプローブ内のヌクレオ
チドの数が10未満に低下したとき失われてしまうとい
うことがわかるだろう。それでも特にグループ1.2,
3.45.9.11.13及び18において、最高の結
果は、ヌクレオチドの数が大きい数を超えて(関係する
配列の最大炎によりグループ4から18において定めら
れている最大数を念頭に置いて)大きくならない場合に
得られる。ナイセリア・ゴル工菌株とその他のナイセリ
ア菌株の選択的識別のために最も好ましいプローブは、
15から27のヌクレオチドを含む配列を有し、かかる
配列はグループlの配列のいずれにも全て含まれている
。ナイセリア・ゴル工菌株に対する選択性は、なおさら
に厳しく交雑条件及び洗浄条件を調整しなければならな
いものの、グループlと2又は3の相応する核酸の領域
と重なり合う配列をもつ(又はグループ2又は3のみの
核酸に属する配列内に特異的に含まれている配列を持つ
)(又はグループ3のみの核酸に含まれている配列内に
特異的に含まれている配列をもつ)プローブについては
なお保持される。
であれ、ナイセリア・ゴル工亜分類群(サブタクソン)
に対するものであれ、使用されるプローブ内のヌクレオ
チドの数が10未満に低下したとき失われてしまうとい
うことがわかるだろう。それでも特にグループ1.2,
3.45.9.11.13及び18において、最高の結
果は、ヌクレオチドの数が大きい数を超えて(関係する
配列の最大炎によりグループ4から18において定めら
れている最大数を念頭に置いて)大きくならない場合に
得られる。ナイセリア・ゴル工菌株とその他のナイセリ
ア菌株の選択的識別のために最も好ましいプローブは、
15から27のヌクレオチドを含む配列を有し、かかる
配列はグループlの配列のいずれにも全て含まれている
。ナイセリア・ゴル工菌株に対する選択性は、なおさら
に厳しく交雑条件及び洗浄条件を調整しなければならな
いものの、グループlと2又は3の相応する核酸の領域
と重なり合う配列をもつ(又はグループ2又は3のみの
核酸に属する配列内に特異的に含まれている配列を持つ
)(又はグループ3のみの核酸に含まれている配列内に
特異的に含まれている配列をもつ)プローブについては
なお保持される。
好ましいプローブは、前記RNA及び相応するDNAの
両方と交雑するため、当該天然r RNAに対し相補性
であるようなプローブである。
両方と交雑するため、当該天然r RNAに対し相補性
であるようなプローブである。
それでも、このrRNA内に含まれている配列をもつ従
って関連する天然DNAとのみ交雑し前述のものに比べ
感度が低いプローブも、同様に本発明の一部である。
って関連する天然DNAとのみ交雑し前述のものに比べ
感度が低いプローブも、同様に本発明の一部である。
本発明に基づくプローブのその他のグループは、必要と
あらば交雑条件及び形成された雑種の洗浄条件の適切な
調整の下で、ナイセリア菌株に対して特異性をもつプロ
ーブにより構成され、なお全体的に考えると(上述のよ
うに)、上に規定されているようにグループ6.7.8
,10゜12.14.16及び17から成る。
あらば交雑条件及び形成された雑種の洗浄条件の適切な
調整の下で、ナイセリア菌株に対して特異性をもつプロ
ーブにより構成され、なお全体的に考えると(上述のよ
うに)、上に規定されているようにグループ6.7.8
,10゜12.14.16及び17から成る。
本発明に基づ(プローブは、相応するヌクレオチド配列
を含むインサートを含む組換え型プラスミドのクローニ
ングによって、必要とあらば、適当なヌクレアーゼ(核
酸分解酵素)を用いた時点でクローニングされたプラス
ミドからこのヌクレオチド配列をへき関させ、分子量に
応じての分別によりそれらを回収することによって、形
成することができる。
を含むインサートを含む組換え型プラスミドのクローニ
ングによって、必要とあらば、適当なヌクレアーゼ(核
酸分解酵素)を用いた時点でクローニングされたプラス
ミドからこのヌクレオチド配列をへき関させ、分子量に
応じての分別によりそれらを回収することによって、形
成することができる。
本発明に従ったプローブは又、例えば従来のホスホトリ
エステル方法によって化学的にも合成可能である。
エステル方法によって化学的にも合成可能である。
上述の変形態様の中には、場合によって交雑媒質又は洗
浄媒質又はその両方が以下に記すものである場合、以下
に規定される配列のうちの1つ又は相応する相補性配列
を標的とする、単数又は複数のナイセリア菌株を検出す
るための交雑プローブが含まれている: 交緒媒質:約3×SSC(SSC=0.15MのNaC
jl!、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7,
0)、約25mMのリン酸塩緩衝液、20%の脱イオン
ホルムアミド、0.02%のフィコール、0.02%の
ウシ血清アルブミン、0.02%のポリビニルピロリド
ンそして約0.1mg/−のせん断され変性されたサケ
精子DNAを含んでいる。
浄媒質又はその両方が以下に記すものである場合、以下
に規定される配列のうちの1つ又は相応する相補性配列
を標的とする、単数又は複数のナイセリア菌株を検出す
るための交雑プローブが含まれている: 交緒媒質:約3×SSC(SSC=0.15MのNaC
jl!、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7,
0)、約25mMのリン酸塩緩衝液、20%の脱イオン
ホルムアミド、0.02%のフィコール、0.02%の
ウシ血清アルブミン、0.02%のポリビニルピロリド
ンそして約0.1mg/−のせん断され変性されたサケ
精子DNAを含んでいる。
洗浄媒質:約3×SSC125n+LIのリン酸塩緩衝
液plt7.)、及び20%の脱イオンホルムアミドを
含んでいる。
液plt7.)、及び20%の脱イオンホルムアミドを
含んでいる。
なおここで、前記標的配列及び相応する関連交雑温度(
HT)及び洗浄温度(WT)はそれぞれ以下のとおりで
ある: 入AGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCC
G^HT及び/又はWT;約55℃ tlALlcGGcGGccOA HT及び/又はWT:約60℃ UAtJCGGCGGCCGAUGACGGtlACC
HT及び/又はWT:約60℃ CA UAUCGGCGGCCGAtlGAC(iGUAcc
HT及び/又はWT:約65℃ ot+xacuauuaaacxActyuaAuoa
cuuaauAacauHT及び/又はWT:約り5℃
〜約60℃GOGOGGGAUACCAGAAGtfA
GGOACCACOGUAυ HT及び/又はWT:約り5℃〜約70℃A(CUAG
GUCCGGCGGAAAUCGGAeUGAHT及び
/又はWT:約55℃ CCD F(T及び/又はWT:約り5℃〜約60℃CAGCA F(T及び/又はWTz約55り〜約60°Ct)At
)GCCCtlCl)AAGGt)t)入^GGJlI
C1lLIGCυCCGUAAGCCCCGHT及び/
又はWT:約り0℃〜約65℃GCGOOGGAGCU
GGCAAUAAAGCUAUGAUtjCCGCHT
及び/又はWT:約55℃ GUUCljGAACt)GGGUGACUCGAGυ
auaucHT及び/又はWT;約り5℃〜約60℃G
CAUAC(iUcUUGAGAGGG^入AGC入H
T及び/又はWT:約45℃ tTGUAcGtjAAUAAct)G(JCGAGA
)IT及び/又はWT:約り0℃〜約45℃υCuCk
kCkGCGGukCukkGCCmCGkkkHT及
び/又はWT:約50℃〜約55℃UGUCUACGG
ACACGAAGCAACCGAUACCACHT及び
/又はWT:約り0℃〜約60℃uxacuu HT及び/又はWT:約り0℃〜約55℃AGCIJG
GtlUGGCGGGGUAAAGGCCCACCAH
T及び/又はWT;約45℃ 示されている温度は上述の条件の下でのみ有効であると
いうことを強調しておきたい、その他の交雑媒質又は洗
浄媒質も同様に使用可能である。
HT)及び洗浄温度(WT)はそれぞれ以下のとおりで
ある: 入AGGCUGUUGCCAAUAUCGGCGGCC
G^HT及び/又はWT;約55℃ tlALlcGGcGGccOA HT及び/又はWT:約60℃ UAtJCGGCGGCCGAUGACGGtlACC
HT及び/又はWT:約60℃ CA UAUCGGCGGCCGAtlGAC(iGUAcc
HT及び/又はWT:約65℃ ot+xacuauuaaacxActyuaAuoa
cuuaauAacauHT及び/又はWT:約り5℃
〜約60℃GOGOGGGAUACCAGAAGtfA
GGOACCACOGUAυ HT及び/又はWT:約り5℃〜約70℃A(CUAG
GUCCGGCGGAAAUCGGAeUGAHT及び
/又はWT:約55℃ CCD F(T及び/又はWT:約り5℃〜約60℃CAGCA F(T及び/又はWTz約55り〜約60°Ct)At
)GCCCtlCl)AAGGt)t)入^GGJlI
C1lLIGCυCCGUAAGCCCCGHT及び/
又はWT:約り0℃〜約65℃GCGOOGGAGCU
GGCAAUAAAGCUAUGAUtjCCGCHT
及び/又はWT:約55℃ GUUCljGAACt)GGGUGACUCGAGυ
auaucHT及び/又はWT;約り5℃〜約60℃G
CAUAC(iUcUUGAGAGGG^入AGC入H
T及び/又はWT:約45℃ tTGUAcGtjAAUAAct)G(JCGAGA
)IT及び/又はWT:約り0℃〜約45℃υCuCk
kCkGCGGukCukkGCCmCGkkkHT及
び/又はWT:約50℃〜約55℃UGUCUACGG
ACACGAAGCAACCGAUACCACHT及び
/又はWT:約り0℃〜約60℃uxacuu HT及び/又はWT:約り0℃〜約55℃AGCIJG
GtlUGGCGGGGUAAAGGCCCACCAH
T及び/又はWT;約45℃ 示されている温度は上述の条件の下でのみ有効であると
いうことを強調しておきたい、その他の交雑媒質又は洗
浄媒質も同様に使用可能である。
しかしながら、変更が行なわれる場合には、それがプロ
ーブについてであれ媒質についてであれ、必要とされる
特異性を得るようそのプローブを用いることができる温
度を、B D、 Hames及びS、 J。
ーブについてであれ媒質についてであれ、必要とされる
特異性を得るようそのプローブを用いることができる温
度を、B D、 Hames及びS、 J。
t11ggins共著「核酸交雑、その実際的アプロー
チJ(IRL出版、オックスフォード、イギリス、19
85年)に記されているもののような既知の関係式に従
って変更すべきである。
チJ(IRL出版、オックスフォード、イギリス、19
85年)に記されているもののような既知の関係式に従
って変更すべきである。
上述の変形態様の中には、場合によって交雑媒質又は洗
浄媒質或いはその両方が以下のものであるとき、以下に
定める配列のうちの1つ又は相応する相補性配列を標的
にする、単数又は複数のナイセリア・ゴル工菌株を検出
するための交雑プローブが含まれる: 交雑媒質:約3×SSC(SSC=0.15MのNaC
g、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7,0)
、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7,1,20%の脱
イオンホルムアミド、0.02%のフィコール、0.0
2%のウシ血清アルブミン、0.02%のポリビニルピ
ロリドンそして約0.1mg/−のせん断され変性され
たサケ精子DNAを含んでいる。
浄媒質或いはその両方が以下のものであるとき、以下に
定める配列のうちの1つ又は相応する相補性配列を標的
にする、単数又は複数のナイセリア・ゴル工菌株を検出
するための交雑プローブが含まれる: 交雑媒質:約3×SSC(SSC=0.15MのNaC
g、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7,0)
、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7,1,20%の脱
イオンホルムアミド、0.02%のフィコール、0.0
2%のウシ血清アルブミン、0.02%のポリビニルピ
ロリドンそして約0.1mg/−のせん断され変性され
たサケ精子DNAを含んでいる。
洗浄媒質:約3×SSCl25mMのリン酸塩緩衝液p
H7,1、及び20%の脱イオンホルムアミドを含んで
いる。
H7,1、及び20%の脱イオンホルムアミドを含んで
いる。
なおここで、前記標的配列及び相応する関連交雑温度(
HT)及び洗浄温度(WT)はそれぞれ以下のとおりで
ある: AAGGCUGUtJGCCAAυAUCGGCGGC
CGA)IT及び/又はWT:約50℃〜65℃CA(
iGOAAGAAAAGGCUGtJIJGCCAAU
AOCGGCGGCCGA)IT及び/又はWT:約り
0℃〜約70℃A (JAUCGGCGGCeGAUGACGGUACCH
T及び/又はWT:約り5℃〜約70℃GGA
LIAtJCGGCGGCCGAUGACGGU
ACeHT及び/又はWT:約り0℃〜約75℃0UA
GCUGUUGGGCAACUUGAUUGCUUGG
UAGCGtJHT及び/又はWT:約65°C C1CAGC入 HT及び/又はWT:約65°C GCGGGGGAGCUGGCAAUAAAGCtJA
UGAUUCCGCHT及び/又はWT:約65℃ CAU HT及び/又はWT:約り0℃〜約55℃CA トIT及び/又はWT:約60℃ ナイセリア・ゴル工菌株を検出するための本発明に基づ
く好ましいプローブは、そのプローブがTCA TCG
GCCGCCGAT ATT GG(:の配列で構成
されていないことを条件として、グループ(1)から(
4)までのものである。
HT)及び洗浄温度(WT)はそれぞれ以下のとおりで
ある: AAGGCUGUtJGCCAAυAUCGGCGGC
CGA)IT及び/又はWT:約50℃〜65℃CA(
iGOAAGAAAAGGCUGtJIJGCCAAU
AOCGGCGGCCGA)IT及び/又はWT:約り
0℃〜約70℃A (JAUCGGCGGCeGAUGACGGUACCH
T及び/又はWT:約り5℃〜約70℃GGA
LIAtJCGGCGGCCGAUGACGGU
ACeHT及び/又はWT:約り0℃〜約75℃0UA
GCUGUUGGGCAACUUGAUUGCUUGG
UAGCGtJHT及び/又はWT:約65°C C1CAGC入 HT及び/又はWT:約65°C GCGGGGGAGCUGGCAAUAAAGCtJA
UGAUUCCGCHT及び/又はWT:約65℃ CAU HT及び/又はWT:約り0℃〜約55℃CA トIT及び/又はWT:約60℃ ナイセリア・ゴル工菌株を検出するための本発明に基づ
く好ましいプローブは、そのプローブがTCA TCG
GCCGCCGAT ATT GG(:の配列で構成
されていないことを条件として、グループ(1)から(
4)までのものである。
本発明は又、約55%から約75%のDNA:DNA交
雑相同値をもつ生体間の区別ができる上述の配列をもつ
プローブにも関係する。
雑相同値をもつ生体間の区別ができる上述の配列をもつ
プローブにも関係する。
rRNA分子の進化を考えると、ナイセリア類属内(例
えばボルデテラ内)にみ・られるもの以外の関係の強い
分類群(55%以上のDNA相同)の間の識別を可能に
するrRNA・誘導の交雑プローブも同様に作り上げる
ことができるというのは、理にかなったことと思われる
。
えばボルデテラ内)にみ・られるもの以外の関係の強い
分類群(55%以上のDNA相同)の間の識別を可能に
するrRNA・誘導の交雑プローブも同様に作り上げる
ことができるというのは、理にかなったことと思われる
。
これらのきわめて特異性の高いプローブが、ナイセリア
・ゴル工に対する特異的配列がみられた領域(例えば、
16s rRNAの場合、第1図の領域I、II及び
III )と同じrRNA分子の領域内にみられる配列
から得られるということは、考えられることである。こ
れらの領域は、大腸菌のrRNA配列と当該生体の全体
的又は部分的rRNA配列を適切に整列させた後、容易
に位置設定することができる。
・ゴル工に対する特異的配列がみられた領域(例えば、
16s rRNAの場合、第1図の領域I、II及び
III )と同じrRNA分子の領域内にみられる配列
から得られるということは、考えられることである。こ
れらの領域は、大腸菌のrRNA配列と当該生体の全体
的又は部分的rRNA配列を適切に整列させた後、容易
に位置設定することができる。
これらの領域は、大腸菌の16s rRNA分子にお
いては、 (1)領域Iについては69〜99 (ii )領域IIについては432〜488(i)領
域IIIについては825〜858のヌクレオチド間(
なおここで番号は第8図に示されている大腸菌の16s
rRNA配列を表わす)、そして大腸菌の23s
rRNA分子においては77〜109のヌクレオチド
間(なおここで番号は第9図に示されている大腸菌の部
分的23s rRNA配列を表わす)に見られる領域
に相当する。
いては、 (1)領域Iについては69〜99 (ii )領域IIについては432〜488(i)領
域IIIについては825〜858のヌクレオチド間(
なおここで番号は第8図に示されている大腸菌の16s
rRNA配列を表わす)、そして大腸菌の23s
rRNA分子においては77〜109のヌクレオチド
間(なおここで番号は第9図に示されている大腸菌の部
分的23s rRNA配列を表わす)に見られる領域
に相当する。
しかしながら、
(i)きわめて特異性の高いプローブはその他の領域か
らでも作り上げることができること、及び (ii)これらの領域のうちのいくつかは、成る種の分
類群のrRNA分子内には存在しない可能性があること
(進化中の突然変異による)も強調しておかなければな
らない。
らでも作り上げることができること、及び (ii)これらの領域のうちのいくつかは、成る種の分
類群のrRNA分子内には存在しない可能性があること
(進化中の突然変異による)も強調しておかなければな
らない。
本発明は又、試料中に存在しうるナイセリア菌株の相補
性核酸とプローブの間の交雑を可能にする条件の下で本
発明のプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で
核酸(DNA及びRNA)が交雑に対してアクセス可能
な状態にされた生物学的試料と接触させる作業そして、
形成され得た雑種を検出する段階が含まれていることを
特徴とする、生物学的試料中のナイセリア菌株を検出す
るための方法にも関するものである。
性核酸とプローブの間の交雑を可能にする条件の下で本
発明のプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で
核酸(DNA及びRNA)が交雑に対してアクセス可能
な状態にされた生物学的試料と接触させる作業そして、
形成され得た雑種を検出する段階が含まれていることを
特徴とする、生物学的試料中のナイセリア菌株を検出す
るための方法にも関するものである。
当該方法は菌株が培養された後の試料内に直接存在する
ナイセリア菌株の検出に関わるものである。
ナイセリア菌株の検出に関わるものである。
雑種の検出は、グループ1か618までのプローブのい
ずれかが用いられているときナイセリア感染が生物学的
試料中に存在していたこと、そしてさらに特定的に言う
と、例えば適切な交雑条件の下でグループ4.5.9.
11.13又は18の核酸に属する配列をプローブが有
している場合、さらに著しくはグループ3、グループ2
好ましくはグループ1の配列に属する1つの配列をプロ
ーブが有している場合にナイセリア・ゴル工の感染が存
在していたということを意味するものとして解釈されう
る。
ずれかが用いられているときナイセリア感染が生物学的
試料中に存在していたこと、そしてさらに特定的に言う
と、例えば適切な交雑条件の下でグループ4.5.9.
11.13又は18の核酸に属する配列をプローブが有
している場合、さらに著しくはグループ3、グループ2
好ましくはグループ1の配列に属する1つの配列をプロ
ーブが有している場合にナイセリア・ゴル工の感染が存
在していたということを意味するものとして解釈されう
る。
本発明の有利な実施態様によると、ナイセリア菌株を検
出するためのプロセスにおいて、使用されるプローブは
、生物学的試料内に存在しうるナイセリア菌株のRNA
及びDNA全体の両方と交雑するものである。
出するためのプロセスにおいて、使用されるプローブは
、生物学的試料内に存在しうるナイセリア菌株のRNA
及びDNA全体の両方と交雑するものである。
交雑条件はいくつかのパラメータ、例えば交雑温度、媒
質の性質と温度及び形成された雑種の洗浄温度に依存し
て、監視されうる。
質の性質と温度及び形成された雑種の洗浄温度に依存し
て、監視されうる。
交雑温度はプローブに応じて(その核酸組成、種類及び
長さに応じて)その上限が定められており、ここで記述
されているプローブの最高交雑温度は約55℃から75
℃である。これ以上の温度では、二本鎖化はプローブと
標的の間で形成された雑種の解離(又は変性)と競合す
る。
長さに応じて)その上限が定められており、ここで記述
されているプローブの最高交雑温度は約55℃から75
℃である。これ以上の温度では、二本鎖化はプローブと
標的の間で形成された雑種の解離(又は変性)と競合す
る。
交雑温度は好ましくは約45℃から約70℃、特に約4
5℃から約65℃に含まれている。
5℃から約65℃に含まれている。
好ましい交雑媒質には、約3×SSC,(SSC=0.
15MのNaCl2.0.015Mのクエン酸ナトリウ
ム、pH7,0)、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7
,1、そして20%の脱イオンホルムアミド、0.02
%のフィコール、0.02%のウシ血清アルブミン、0
.02%のポリビニルピロリドンそして約0.1mg/
Wdlのせん断され変性されたサケ精子DNAが含まれ
ている。
15MのNaCl2.0.015Mのクエン酸ナトリウ
ム、pH7,0)、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7
,1、そして20%の脱イオンホルムアミド、0.02
%のフィコール、0.02%のウシ血清アルブミン、0
.02%のポリビニルピロリドンそして約0.1mg/
Wdlのせん断され変性されたサケ精子DNAが含まれ
ている。
洗浄温度は、約50°Cから約75°Cの間である。
本発明に基づくナイセリア菌株全般を検出するための方
法は、交雑が特異的である1つの値に交雑温度を適切に
調整することにより実施することができ、この場合、さ
らに厳しい条件の下での洗浄は不要である。
法は、交雑が特異的である1つの値に交雑温度を適切に
調整することにより実施することができ、この場合、さ
らに厳しい条件の下での洗浄は不要である。
本発明に基づく方法のもう1つの実施例によると、交雑
温度は必ずしも、交雑が特異的である値に調整される必
要はなく、交雑が特異的である温度より低くてもよい。
温度は必ずしも、交雑が特異的である値に調整される必
要はなく、交雑が特異的である温度より低くてもよい。
ただし、洗浄は、交雑が特異的である値に相当する温度
で行なわれる。
で行なわれる。
グループ6のプローブでナイセリア菌株全般を検出する
ため(これらをその他の細菌分類株から識別するため)
の方法の一実施態様において、交雑温度は約65℃の範
囲にそして/又は洗浄温度は約65℃から約70℃の範
囲に適切に調整されている。なおここで媒質は前述のも
のである。
ため(これらをその他の細菌分類株から識別するため)
の方法の一実施態様において、交雑温度は約65℃の範
囲にそして/又は洗浄温度は約65℃から約70℃の範
囲に適切に調整されている。なおここで媒質は前述のも
のである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プのいずれかであり、交雑温度は約55℃の範囲にそし
て/又洗浄温度は約55℃の範囲に適切に調整されてい
る。
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プのいずれかであり、交雑温度は約55℃の範囲にそし
て/又洗浄温度は約55℃の範囲に適切に調整されてい
る。
さらにもう1つのナイセリア菌株全般の検出方法実施態
様において、使用されるプローブは、前記グループ1の
いずれかである。
様において、使用されるプローブは、前記グループ1の
いずれかである。
交雑温度は約55℃の範囲好ましくは約53℃の範囲に
、そして/又洗浄温度は約55℃の範囲好ましくは約5
3℃の範囲に適切に調整されている。なお交雑媒質は上
述のものである。
、そして/又洗浄温度は約55℃の範囲好ましくは約5
3℃の範囲に適切に調整されている。なお交雑媒質は上
述のものである。
ナイセリア菌株全般の検出方法のさらにもう1つの実施
態様においては、使用されるプローブは、上述のグルー
プ2のいずれかである。
態様においては、使用されるプローブは、上述のグルー
プ2のいずれかである。
交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗浄温度は約6
0℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
0℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プ3のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、上述のグルー
プ3のいずれかである。
交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗浄温度は約6
0℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
0℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
さらにナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの
方法実施態様において、使用されているプローブは、上
述のグループ4のいずれかである。
方法実施態様において、使用されているプローブは、上
述のグループ4のいずれかである。
交雑温度は約65℃の範囲にそして/又洗浄温度は約6
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのさらにもう1つの
方法実施態様において、用いられるプローブは、上述の
グループ5のいずれかである。
方法実施態様において、用いられるプローブは、上述の
グループ5のいずれかである。
交雑温度は約55℃の範囲にそして/又洗浄温度は約5
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は、上述のもの
である。
ナイセリア菌株全般を検出するためのさらにもう1つの
方法実施態様において、使用されるプローブは、上述の
グループ8のいずれかである。
方法実施態様において、使用されるプローブは、上述の
グループ8のいずれかである。
交雑温度は約55℃の範囲にそして/又洗浄温度は約5
5℃から約60℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
5℃から約60℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ9のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ9のいずれかである。
交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗浄温度は約6
0℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
0℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ10のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ10のいずれかである。
交雑温度は約55℃の範囲にそして/又洗浄温度は約5
5℃から約60℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
5℃から約60℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は
上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ11のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ11のいずれかである。
交雑温度は約55℃の範囲にそして/又洗浄温度は約5
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ12のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ12のいずれかである。
交雑温度は約55℃から約60℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約55℃から約60℃の範囲に調整され、交雑
媒質は上述のものである。
浄温度は約55℃から約60℃の範囲に調整され、交雑
媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ13のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ13のいずれかである。
交雑温度は約45℃の範囲にそして/又洗浄温度は約4
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ14のいずれがである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ14のいずれがである。
交雑温度は約40℃から約45℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約40℃から約45℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約40℃から約45℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ15のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ15のいずれかである。
交雑温度は約50℃から約55℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約50℃から約55℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約50℃から約55℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ16のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ16のいずれかである。
交雑温度は約50℃から約60℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約50℃から約60℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約50℃から約60℃の範囲に適切に調整され
、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ17のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ17のいずれかである。
交雑温度は約50℃から約55℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約50℃から約55°Cの範囲に適切に調整さ
れ、交雑媒質は上述のものである。
浄温度は約50℃から約55°Cの範囲に適切に調整さ
れ、交雑媒質は上述のものである。
ナイセリア菌株全般を検出するためのもう1つの方法実
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ18のいずれかである。
施態様において、使用されるプローブは、前述のグルー
プ18のいずれかである。
交雑温度は約45℃の範囲にそして/又洗浄温度は約4
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
5℃の範囲に適切に調整され、交雑媒質は上述のもので
ある。
本発明はさらに、生物学的試料内でナイセリア・ゴル工
菌株をその他のナイセリア菌株から検出するためそして
好ましくはナイセリア・メニンシティディスのような関
係の強い分類群からナイセリア・ゴル工菌株を識別する
ための方法にも関するものであり、かかる方法には、必
要とされる場合にはつねにその他のナイセリア種の相補
的DNA又はRNAとではなく試料中に存在しうるナイ
セリア・ゴル工菌株の相補的核酸との特異的交雑を確実
なものとするよう調整された交雑及び洗浄条件の下で、
グループ1から5.9゜11.13及び18の中から選
ばれたナイセリア・ゴル工菌株に特異的な本発明に基づ
くプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で核酸
(DNA及びRNA)が交雑に対してアクセス可能な状
態にされている上記生物学的試料と接触させる作業、及
び形成されうる雑種を検出する作業が含まれている。
菌株をその他のナイセリア菌株から検出するためそして
好ましくはナイセリア・メニンシティディスのような関
係の強い分類群からナイセリア・ゴル工菌株を識別する
ための方法にも関するものであり、かかる方法には、必
要とされる場合にはつねにその他のナイセリア種の相補
的DNA又はRNAとではなく試料中に存在しうるナイ
セリア・ゴル工菌株の相補的核酸との特異的交雑を確実
なものとするよう調整された交雑及び洗浄条件の下で、
グループ1から5.9゜11.13及び18の中から選
ばれたナイセリア・ゴル工菌株に特異的な本発明に基づ
くプローブを、必要とあらば適切な変性条件の下で核酸
(DNA及びRNA)が交雑に対してアクセス可能な状
態にされている上記生物学的試料と接触させる作業、及
び形成されうる雑種を検出する作業が含まれている。
ナイセリア・ゴル工菌株を特異的に識別する対象である
その他のナイセリア菌株としては、例えば、ナイセリア
・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイセリア・サ
プフラバ、ナイセリア・フラベツセンス及びナイセリア
・エロンガータなどがある。
その他のナイセリア菌株としては、例えば、ナイセリア
・ラクタミカ、ナイセリア・ムコーサ、ナイセリア・サ
プフラバ、ナイセリア・フラベツセンス及びナイセリア
・エロンガータなどがある。
この点において、交雑温度は約50℃から約75°Cま
でであることが好ましい。
でであることが好ましい。
好ましい交雑媒質には、約3×SSC(SSC=0.1
5MのNaCg、O,015Mのクエン酸ナトリウム、
pH7,0)、約25mMのリン酸塩緩衝液そして20
%の脱イオンホルムアミド、0.02%のフィコール、
0.02%のウシ血清アルブミン、0.02%のポリビ
ニルピロリドンそして約0.1mg/−のせん断され変
性されたサケ精子DNAが含まれ、好ましい洗浄媒質に
は約3×SSC125mMのリン酸塩緩衝液pH7,1
、及び20%の脱イオンホルムアミドが含まれている。
5MのNaCg、O,015Mのクエン酸ナトリウム、
pH7,0)、約25mMのリン酸塩緩衝液そして20
%の脱イオンホルムアミド、0.02%のフィコール、
0.02%のウシ血清アルブミン、0.02%のポリビ
ニルピロリドンそして約0.1mg/−のせん断され変
性されたサケ精子DNAが含まれ、好ましい洗浄媒質に
は約3×SSC125mMのリン酸塩緩衝液pH7,1
、及び20%の脱イオンホルムアミドが含まれている。
洗浄温度は約50℃から約70℃までである。
ナイセリア・ゴル工を検出するための方法の一実施態様
において、使用されるプローブは上記グループ2に属し
、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗浄温度は約
65℃から約70℃好ましくは約65℃の範囲に適切に
調整されており、媒質は上述のものである。
において、使用されるプローブは上記グループ2に属し
、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗浄温度は約
65℃から約70℃好ましくは約65℃の範囲に適切に
調整されており、媒質は上述のものである。
ナイセリア・ゴル工を検出するための1つの方法の実施
態様において、使用されているプローブは上述のグルー
プ3に属し、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約65℃から約70℃好ましくは約65℃の範
囲に適切に調整され、媒質は上述のものである。
態様において、使用されているプローブは上述のグルー
プ3に属し、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約65℃から約70℃好ましくは約65℃の範
囲に適切に調整され、媒質は上述のものである。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう1つの方法の
実施態様において、使用されているプローブは上述のグ
ループ4に属し、交雑温度は約65℃の範囲に、そして
/又洗浄温度は約70°Cから約75°C好ましくは約
70℃の範囲に適切に調整される。
実施態様において、使用されているプローブは上述のグ
ループ4に属し、交雑温度は約65℃の範囲に、そして
/又洗浄温度は約70°Cから約75°C好ましくは約
70℃の範囲に適切に調整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう1つの方法の
実施態様において、使用されるプローブは上述のグルー
プ5に属し、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約65℃の範囲に適切に調整される。
実施態様において、使用されるプローブは上述のグルー
プ5に属し、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗
浄温度は約65℃の範囲に適切に調整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのさらにもう1つの
方法の実施態様において、使用されるプローブは上述の
グループ9に属し、交雑温度は約60℃から約65℃の
範囲にそして/又洗浄温度は約65℃の範囲に適切に調
整される。
方法の実施態様において、使用されるプローブは上述の
グループ9に属し、交雑温度は約60℃から約65℃の
範囲にそして/又洗浄温度は約65℃の範囲に適切に調
整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう1つの方法の
実施態様においては、使用されるプローブはグループ1
1に属し、交雑温度及び/又は洗浄温度は約65℃の範
囲に適切に調整されている。
実施態様においては、使用されるプローブはグループ1
1に属し、交雑温度及び/又は洗浄温度は約65℃の範
囲に適切に調整されている。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう1つの方法実
施態様においては、使用されるプローブはグループ13
に属し、交雑温度は約50℃から約55℃の範囲にそし
て/又洗浄温度は約50℃から約55℃の範囲に適切に
調整され、媒質は上述のものである。
施態様においては、使用されるプローブはグループ13
に属し、交雑温度は約50℃から約55℃の範囲にそし
て/又洗浄温度は約50℃から約55℃の範囲に適切に
調整され、媒質は上述のものである。
ナイセリア・ゴル工を検出するための方法の実施態様に
おいて、使用されるプローブはグループ18に属してお
り、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗浄温度は
約60℃の範囲に適切に調整され、媒質は上述のもので
ある。
おいて、使用されるプローブはグループ18に属してお
り、交雑温度は約60℃の範囲にそして/又洗浄温度は
約60℃の範囲に適切に調整され、媒質は上述のもので
ある。
ナイセリア・ゴル工を検出するためのもう1つの特に好
ましい方法実施態様によると、使用されるプローブは上
述のグループlに属し、交雑温度は約55℃好ましくは
約53℃の範囲にそして/又洗浄温度は約55℃から約
65℃好ましくは約53℃の範囲に適切に調整される。
ましい方法実施態様によると、使用されるプローブは上
述のグループlに属し、交雑温度は約55℃好ましくは
約53℃の範囲にそして/又洗浄温度は約55℃から約
65℃好ましくは約53℃の範囲に適切に調整される。
ナイセリア・ゴル工を検出するための本発明に基づく好
ましい方法において、使用されるプローブはグループ(
1)から(4)までのいずれかに属する。ただしこのプ
ローブはTCA TCG GCCGCCGAT ATT
GGCという配列で構成されることはない。
ましい方法において、使用されるプローブはグループ(
1)から(4)までのいずれかに属する。ただしこのプ
ローブはTCA TCG GCCGCCGAT ATT
GGCという配列で構成されることはない。
本発明は又、生物学的試料内のナイセリア菌株の多く好
ましくは全てを試験管内で検出するための、以下のもの
を含むキットにも関係する:上述のもののうちのいずれ
かから選択された少なくとも1つのプローブ、 ナイセリア菌株のDNA及び/又はRNAとこれらのプ
ローブの間の交雑反応が行なえるようにする緩衝液又は
かかる緩衝液を作るのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種を
検出するための手段。
ましくは全てを試験管内で検出するための、以下のもの
を含むキットにも関係する:上述のもののうちのいずれ
かから選択された少なくとも1つのプローブ、 ナイセリア菌株のDNA及び/又はRNAとこれらのプ
ローブの間の交雑反応が行なえるようにする緩衝液又は
かかる緩衝液を作るのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種を
検出するための手段。
本発明はさらにナイセリア・ゴル工菌株を特異的に検出
するための、以下のものを含むキットにも関係している
: 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも1つのプローブ、例え
ばグループ(2)。
するための、以下のものを含むキットにも関係している
: 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも1つのプローブ、例え
ばグループ(2)。
(3)、(4)、(5)、(9)、(11)。
(13)又は(18)のプローブ好ましくはグループ(
1)のブローブ: ナイセリア・ゴル工の菌株のDNA及び/又はRNAの
みとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえるように
する緩衝液又はかかる緩衝液を作るのに必要な構成成分
。
1)のブローブ: ナイセリア・ゴル工の菌株のDNA及び/又はRNAの
みとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえるように
する緩衝液又はかかる緩衝液を作るのに必要な構成成分
。
ナイセリア・ゴル工を検出するための好ましいキットに
おいて、プローブは、それがTCA TCGGCCGC
CGAT ATT GGCで構成されていないことを条
件として、グループ(1)から(4)に属している。
おいて、プローブは、それがTCA TCGGCCGC
CGAT ATT GGCで構成されていないことを条
件として、グループ(1)から(4)に属している。
本発明は、多数の好ましくは全てのナイセリア菌株そし
て特異的にナイセリ・ア・ゴル工を検出するための、以
下のものを含むキットに関する: 上述のもののいずれかの中から選択された少なくとも1
つのプローブ、例えばグループ(1)から(18)まで
のプローブ、さらに好ましくはグループ(6)、(7)
、(8)(10)、(12)、(14)、(15)。
て特異的にナイセリ・ア・ゴル工を検出するための、以
下のものを含むキットに関する: 上述のもののいずれかの中から選択された少なくとも1
つのプローブ、例えばグループ(1)から(18)まで
のプローブ、さらに好ましくはグループ(6)、(7)
、(8)(10)、(12)、(14)、(15)。
(16)又は(17)のプローブ;
多数好ましくは全てのナイセリアの菌株のDNA及び/
又はRNAとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえ
るようにする、いつでも使用可能な状態にある緩衝液又
はかかる緩衝液を作るために必要な適当な割合での構成
成分; 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも1つのプローブ、例え
ばグループ(2)。
又はRNAとこれらのプローブの間の交雑反応が行なえ
るようにする、いつでも使用可能な状態にある緩衝液又
はかかる緩衝液を作るために必要な適当な割合での構成
成分; 上述のようなナイセリア・ゴル工に特異的なもののいず
れかの中から選ばれた少なくとも1つのプローブ、例え
ばグループ(2)。
(3)、(4)、(5)、(9)、(11)。
(13)又は(18)のプローブ又さらに好ましくはグ
ループ(1)のプローブ; ナイセリア・ゴル工の菌株のDNA及び/又はRNAの
みとこれらのプローブの間の交雑反応を行なえるように
する。いつでも使用可能な状態にある緩衝液又はそれを
作るのに必要な適当な割合での構成成分。
ループ(1)のプローブ; ナイセリア・ゴル工の菌株のDNA及び/又はRNAの
みとこれらのプローブの間の交雑反応を行なえるように
する。いつでも使用可能な状態にある緩衝液又はそれを
作るのに必要な適当な割合での構成成分。
ナイセリア菌株及び特異的にナイセリア・ゴル工菌株を
検出するための好ましいキットにおいて、ナイセリア・
ゴル工菌株を検出するために用いられるプローブは、そ
れがTCA TCG GCCGCCGAT ATT G
GCという配列で構成されていないことを条件として、
グループ(1)から(4)に属する。
検出するための好ましいキットにおいて、ナイセリア・
ゴル工菌株を検出するために用いられるプローブは、そ
れがTCA TCG GCCGCCGAT ATT G
GCという配列で構成されていないことを条件として、
グループ(1)から(4)に属する。
プローブの
本発明に基づくプローブは、有利なことに標識付けされ
ている。従来のいかなる標識でも用いることができる。
ている。従来のいかなる標識でも用いることができる。
プローブは32p、 3118.128J。
3H及び14Cといった放射性トレーサを用いて標識づ
けすることもできる。
けすることもできる。
放射性標識づけは、放射性標識をもつヌクレオチド、ポ
リヌクリオチドキナーゼ(ホスファターゼによる脱リン
酸化を伴う又は伴わない)又はリガーゼ(標識づけすべ
き末端に従って)を用いた3′又は5′の位置における
末端標識付けといった従来のいかなる方法を用いてでも
行なうことができる0本発明に基づくプローブの1つは
、複数の放射性ヌクレオチド又は複数の放射性又は非放
射性ヌクレオチドから成る鎖の合成のためのマトリクス
である可能性もある0本発明に基づ(プローブは又、単
数又は複数の放射性ヌクレオチドを用いた化学合成によ
っても調製できる。放射性標識づけのもう1つの方法は
、プローブ上への複数の118工原子の結合へと導く本
発明に基づくプローブの化学的ヨウ素化である。
リヌクリオチドキナーゼ(ホスファターゼによる脱リン
酸化を伴う又は伴わない)又はリガーゼ(標識づけすべ
き末端に従って)を用いた3′又は5′の位置における
末端標識付けといった従来のいかなる方法を用いてでも
行なうことができる0本発明に基づくプローブの1つは
、複数の放射性ヌクレオチド又は複数の放射性又は非放
射性ヌクレオチドから成る鎖の合成のためのマトリクス
である可能性もある0本発明に基づ(プローブは又、単
数又は複数の放射性ヌクレオチドを用いた化学合成によ
っても調製できる。放射性標識づけのもう1つの方法は
、プローブ上への複数の118工原子の結合へと導く本
発明に基づくプローブの化学的ヨウ素化である。
本発明に基づくプローブの1つが非放射性RNA又はD
NAとの交雑のために使用すべく放射性にされる場合、
交雑検出方法は、使用される放射性トレーサによって異
なる。一般に、オートラジオグラフィ、液体シンチレー
ション、ガンマ計数又は放射性トレーサが発した電離線
を検出できるようにする従来のあらゆる方法を用いるこ
とが可能である。
NAとの交雑のために使用すべく放射性にされる場合、
交雑検出方法は、使用される放射性トレーサによって異
なる。一般に、オートラジオグラフィ、液体シンチレー
ション、ガンマ計数又は放射性トレーサが発した電離線
を検出できるようにする従来のあらゆる方法を用いるこ
とが可能である。
本発明に基づくプローブを、免疫学的特異性(例えば抗
原又はハブテン)、いくつかの試薬に対する特異的親和
力(例えばリガンド)、検出可能な酵素反応を提供する
特性(例えば酵素、補酵素、酵素基質又は酵素反応に参
加する基質)或いは蛍光又は発光又はあらゆる波長にお
ける吸光といった物理的特性をもつ残基と結びつけるこ
とにより、非放射性標識づけを利用することも可能であ
る。プローブと標的により形成された雑種を特異的に検
出する抗体も又利用できる。
原又はハブテン)、いくつかの試薬に対する特異的親和
力(例えばリガンド)、検出可能な酵素反応を提供する
特性(例えば酵素、補酵素、酵素基質又は酵素反応に参
加する基質)或いは蛍光又は発光又はあらゆる波長にお
ける吸光といった物理的特性をもつ残基と結びつけるこ
とにより、非放射性標識づけを利用することも可能であ
る。プローブと標的により形成された雑種を特異的に検
出する抗体も又利用できる。
非放射性標識は、本発明のプローブを化学的に合成する
場合に与えることができる。そのアデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン及びウラシル残基が、プローブ
或いはプローブと相補的DNA又はRNAグラグメント
の間で形成された雑種の検出を可能にするその他の化学
的残基に結合しやすいのである。しかしながらプローブ
のヌクレオチド配列は、単数又は複数のヌクレオチドを
その他の化学的残基に結合することにより変更されたと
き、本発明に基づくプローブの1つのヌクレオチド配列
と同じとなる。
場合に与えることができる。そのアデノシン、グアノシ
ン、シチジン、チミジン及びウラシル残基が、プローブ
或いはプローブと相補的DNA又はRNAグラグメント
の間で形成された雑種の検出を可能にするその他の化学
的残基に結合しやすいのである。しかしながらプローブ
のヌクレオチド配列は、単数又は複数のヌクレオチドを
その他の化学的残基に結合することにより変更されたと
き、本発明に基づくプローブの1つのヌクレオチド配列
と同じとなる。
本発明は又、上述のように標識づけされており検出可能
である本発明に基づくプローブで交雑によりRNA及び
/又はDNAを検出する方法にも関係する。ここにおい
て、従来の交雑方法を用いることが可能である。
である本発明に基づくプローブで交雑によりRNA及び
/又はDNAを検出する方法にも関係する。ここにおい
て、従来の交雑方法を用いることが可能である。
生体組織からとった又はそれ自体生体組織である細胞を
検出するためこれらの細胞のRNA及び/又はDNAは
必要とあらば、化学的又は物理的方法を用いて細胞の部
分的又は全体的溶解によりアクセス可能な状態にされ、
検出可能な本発明に基づく単数又は複数のプローブと接
触させられる。この接触は液体媒質内の又は溶液の形で
のニトロセルロース、セルロース又はナイロンフィルタ
ーのような適切な支持体の上で行なわれる。この接触は
、最適下限条件、最適条件又は制限条件(すなわち、配
列が1つの分子長で完全に相同である場合にのみ雑種形
成を可能にする条件)の下で行なわれつる。このような
条件としては、温度、反応体の温度、核酸の対合の最適
温度を低下させる物質(例えばホルムアミド、ジメチル
スルフオキシド及び尿素)の存在、及び明らかに反応体
積を低下させ及び/又は雑種形成を促進させる物質(例
えば、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール又は
フェノール)の存在などがある。
検出するためこれらの細胞のRNA及び/又はDNAは
必要とあらば、化学的又は物理的方法を用いて細胞の部
分的又は全体的溶解によりアクセス可能な状態にされ、
検出可能な本発明に基づく単数又は複数のプローブと接
触させられる。この接触は液体媒質内の又は溶液の形で
のニトロセルロース、セルロース又はナイロンフィルタ
ーのような適切な支持体の上で行なわれる。この接触は
、最適下限条件、最適条件又は制限条件(すなわち、配
列が1つの分子長で完全に相同である場合にのみ雑種形
成を可能にする条件)の下で行なわれつる。このような
条件としては、温度、反応体の温度、核酸の対合の最適
温度を低下させる物質(例えばホルムアミド、ジメチル
スルフオキシド及び尿素)の存在、及び明らかに反応体
積を低下させ及び/又は雑種形成を促進させる物質(例
えば、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール又は
フェノール)の存在などがある。
交雑されなかった本発明に基づくプローブの除去は、適
切・なイオン長の緩衝溶液を用いて適切な温度で、単鎖
RNA又はRNAを消化するがDNA−RNA雑種又は
2重鎖DNAは消化しないS1ヌクレアーゼ又はその他
の酵素での処理を伴って又は伴わずに、洗浄することに
よって行なうことができる。
切・なイオン長の緩衝溶液を用いて適切な温度で、単鎖
RNA又はRNAを消化するがDNA−RNA雑種又は
2重鎖DNAは消化しないS1ヌクレアーゼ又はその他
の酵素での処理を伴って又は伴わずに、洗浄することに
よって行なうことができる。
液体媒質中では、細胞DNA又はRNAのフラグメント
に対合された本発明に基づくプローブの雑種は、さまざ
まな方法で、例えば水酸化リン灰石(ヒドロキシアパタ
イト)でのクロマトグラフィによって、液体媒質の残り
から分離されうる。
に対合された本発明に基づくプローブの雑種は、さまざ
まな方法で、例えば水酸化リン灰石(ヒドロキシアパタ
イト)でのクロマトグラフィによって、液体媒質の残り
から分離されうる。
次に、交雑されたプローブはプローブ上の標識を用いて
検出される。
検出される。
本発明に基づく標識づけされたプローブが誘導されたも
とであるRNAフラグメントに対しコード化する遺伝子
を有するナイセリア染色体DNAフラグメントと標的に
するためには、DNAを単数又は複数の酵素により処理
しDNAフラグメントを変性させた(すなわち画調の分
離)後、本発明に基づくプローブの1つは、交雑を可能
にする条件の下でDNAフラグメントと接触させられ、
交雑の終りにまでたどりつくのに必要な時間の後、交雑
されなかったフラグメントは交雑されたフラグメントか
ら分離され、細胞の検出について上述されてきたように
標識が検出される。
とであるRNAフラグメントに対しコード化する遺伝子
を有するナイセリア染色体DNAフラグメントと標的に
するためには、DNAを単数又は複数の酵素により処理
しDNAフラグメントを変性させた(すなわち画調の分
離)後、本発明に基づくプローブの1つは、交雑を可能
にする条件の下でDNAフラグメントと接触させられ、
交雑の終りにまでたどりつくのに必要な時間の後、交雑
されなかったフラグメントは交雑されたフラグメントか
ら分離され、細胞の検出について上述されてきたように
標識が検出される。
一般的に言って、本発明に基づくさまざまなプローブは
、網羅されている用途において異種DNAの存在がプロ
ーブの特異性に対する有害物でない場合、そのクローニ
ングを可能にする組換え型DNAの中にも含まれつる。
、網羅されている用途において異種DNAの存在がプロ
ーブの特異性に対する有害物でない場合、そのクローニ
ングを可能にする組換え型DNAの中にも含まれつる。
さらに厳密に言うと、以下に挙げる例は、それぞれプロ
ーブNo、l 、 No、2. No、3. No、4
.No、5゜No、6. No、7.No、8. No
、9. No、10. No、11 、 No。
ーブNo、l 、 No、2. No、3. No、4
.No、5゜No、6. No、7.No、8. No
、9. No、10. No、11 、 No。
12、 No、13. No、14. No、1
5. No、16. No、17及びNo、 18
として上述され以下にも言及されている配列(1)、(
2)、(3)、(4)。
5. No、16. No、17及びNo、 18
として上述され以下にも言及されている配列(1)、(
2)、(3)、(4)。
(5)、(6)、(7)、(8)、(9)。
(10)、(11)、(12)、、(13)。
(14)、(15)、(16)、(17)及び(18)
にぞれぞれ相当する本発明に基づくプローブの調製に関
するものである。
にぞれぞれ相当する本発明に基づくプローブの調製に関
するものである。
Rossau他(1986年)により記されているよう
に以下の菌株を培養した:ナイセリア・ゴル工NCTC
8375”、ナイセリア・メニンシティディス NCT
C10025’、ナイセリア・ラククミカ NCTC1
0617”、ナイセリア・ムコーサ CIP 59.
51’、ナイセリア・サブフラバ ATCC10555
,ナイセリア・フラグメント ATCC13120”、
ナイセリア・エロンガータ亜種エロンガータ NCTC
10660”及びモラクセラ(ブランハメラ)カタラ−
リス NCTC4103,ランダムに選択した8つのナ
イセリア・ゴル工菌株と9つのナイセリア・メニンシテ
ィディス菌株(異なる血清型からの)を、ベルギーのア
ントワープ市の熱帯医療インスティチュートにおいて、
−晩血清寒天平板上で培養した。菌種の同定を従来の方
法でチエツクした。残りの菌株からの純化されたゲノム
DNAは、J、 De Ley (ベルギー ゲント
州立大学、微生物学研究所)により提供された。
に以下の菌株を培養した:ナイセリア・ゴル工NCTC
8375”、ナイセリア・メニンシティディス NCT
C10025’、ナイセリア・ラククミカ NCTC1
0617”、ナイセリア・ムコーサ CIP 59.
51’、ナイセリア・サブフラバ ATCC10555
,ナイセリア・フラグメント ATCC13120”、
ナイセリア・エロンガータ亜種エロンガータ NCTC
10660”及びモラクセラ(ブランハメラ)カタラ−
リス NCTC4103,ランダムに選択した8つのナ
イセリア・ゴル工菌株と9つのナイセリア・メニンシテ
ィディス菌株(異なる血清型からの)を、ベルギーのア
ントワープ市の熱帯医療インスティチュートにおいて、
−晩血清寒天平板上で培養した。菌種の同定を従来の方
法でチエツクした。残りの菌株からの純化されたゲノム
DNAは、J、 De Ley (ベルギー ゲント
州立大学、微生物学研究所)により提供された。
2)DK八へ遷l
主としてMarmurが記している方法(1961年)
によって高分子量のゲノムDNAを調製した。プラスミ
ドDNAは、Kahn他(1979年)により記されて
いる方法によって分離させ、CsCβ−勾配遠心分離に
より純化させた。
によって高分子量のゲノムDNAを調製した。プラスミ
ドDNAは、Kahn他(1979年)により記されて
いる方法によって分離させ、CsCβ−勾配遠心分離に
より純化させた。
3)ニトロセルロース への DNAのDNA溶液を
95℃で10分間加熱し、氷上に置き、6×SSC(S
SC:0.15MのNaCf2、O,015Mのクエン
酸ナトリウム、pH7,0)に調整した。適量の溶液を
ドツトスポットマニホルド内でBA85膜(Schle
icher &5chue11.西ドイツ)に適用した
。空気乾燥の後、膜を80℃で2時間焼成した。
95℃で10分間加熱し、氷上に置き、6×SSC(S
SC:0.15MのNaCf2、O,015Mのクエン
酸ナトリウム、pH7,0)に調整した。適量の溶液を
ドツトスポットマニホルド内でBA85膜(Schle
icher &5chue11.西ドイツ)に適用した
。空気乾燥の後、膜を80℃で2時間焼成した。
4) NGDI び NGK3の
プラスミドpNGDl及びpNGK3は、それぞれイン
サートとしてプローブN013及びN016を含んでい
る。これらはそれぞれ、ナイセリア・ゴルエ NCTC
8375”の16s rDNA遺伝子の一部を含むp
T Z l 8 R(Pharmacia、スエーデ
ン)により誘導された組換え型プラスミドであるpNG
4及びpNG3から作られた。
サートとしてプローブN013及びN016を含んでい
る。これらはそれぞれ、ナイセリア・ゴルエ NCTC
8375”の16s rDNA遺伝子の一部を含むp
T Z l 8 R(Pharmacia、スエーデ
ン)により誘導された組換え型プラスミドであるpNG
4及びpNG3から作られた。
pNGDlの場合、71塩基対の5tuI−KpnIフ
ラグメントをサブクローニングさせ、5tuI部位から
始まる25の塩基対を次にExonuclease I
II (Stratagene、 USA )及び緑豆
ヌクレアーゼ(Stratagene、 USA )に
よる処理によって除去した。pNGK3の構成のために
は、同様にして63の塩基対をpNG3のインサートの
3′末端から除去した。その結果得られたプラスミドは
Sph r及びBstXIでへき開させ、その後接着末
端を鈍化させ分子間結紮を行なった。制限酵素は、 B
oehringer Mannheim (西ドイツ
)又はBio Labs (U、 S、 A、 )から
購入し、供給業者が推奨するとおりに使用した。
ラグメントをサブクローニングさせ、5tuI部位から
始まる25の塩基対を次にExonuclease I
II (Stratagene、 USA )及び緑豆
ヌクレアーゼ(Stratagene、 USA )に
よる処理によって除去した。pNGK3の構成のために
は、同様にして63の塩基対をpNG3のインサートの
3′末端から除去した。その結果得られたプラスミドは
Sph r及びBstXIでへき開させ、その後接着末
端を鈍化させ分子間結紮を行なった。制限酵素は、 B
oehringer Mannheim (西ドイツ
)又はBio Labs (U、 S、 A、 )から
購入し、供給業者が推奨するとおりに使用した。
5)D凡戊配憇二鳳2
Gem Seq K/RT”の配列骨はシステム技術指
導書(Promega、 U、S、A、)に記されてい
るようにスーパーコイルプラスミドDNAについてのジ
デオキシ鎖終結方法により、pNGDl及びpNGK3
のインサートを配列づけした。
導書(Promega、 U、S、A、)に記されてい
るようにスーパーコイルプラスミドDNAについてのジ
デオキシ鎖終結方法により、pNGDl及びpNGK3
のインサートを配列づけした。
6)才1ゴヌクレオチドのA と
オリゴヌクレオチドは、遺伝子アセンブラ18−580
0−01 (Pharmacia、スウェーデン)又は
サイクロン8400 (New Brunswick、
U、S、A、1において亜リン酸塩−トリエステルに
より合成させた。保護の除去されたオリゴヌクレオチド
を7Mの尿素内の15%のポリアクリルアミドゲル上で
純化させた。−晩中溶離させた後、これらを5epha
dex G−25(Pharmacia、スウェーデン
)カラム上で脱塩した。
0−01 (Pharmacia、スウェーデン)又は
サイクロン8400 (New Brunswick、
U、S、A、1において亜リン酸塩−トリエステルに
より合成させた。保護の除去されたオリゴヌクレオチド
を7Mの尿素内の15%のポリアクリルアミドゲル上で
純化させた。−晩中溶離させた後、これらを5epha
dex G−25(Pharmacia、スウェーデン
)カラム上で脱塩した。
7)プローブの声= ・レ
プローブとして用いられる合成オリゴヌクレオチドは、
T4−ポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia
、スエーデン)及びガン? 22 p −d A T
P (Amersham、イギリス)を用いて標識づ
けする。 (Maniatis他、 1982年)交雑
の間のベクター配列による妨害を除外するため、pNG
Dl及びpNGK3のインサートを制限酵素を用いて切
りとり、アガロースゲル電気泳動により浄化させた。浄
化されたインサートは、Klenow酵素(Boehr
inger Mannheim、西ドイツ)を用いて接
着末端をアルファー32p−d A T p (Ame
rsham、イギリス)で充填することにより標識づけ
した(Maniatis他、 1982年)、内含され
なかった標識はBlo−Ge1 P−6DG(Bio−
Rad研究所、 U、S、A、)のスピンカラムを用い
て除去した。
T4−ポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia
、スエーデン)及びガン? 22 p −d A T
P (Amersham、イギリス)を用いて標識づ
けする。 (Maniatis他、 1982年)交雑
の間のベクター配列による妨害を除外するため、pNG
Dl及びpNGK3のインサートを制限酵素を用いて切
りとり、アガロースゲル電気泳動により浄化させた。浄
化されたインサートは、Klenow酵素(Boehr
inger Mannheim、西ドイツ)を用いて接
着末端をアルファー32p−d A T p (Ame
rsham、イギリス)で充填することにより標識づけ
した(Maniatis他、 1982年)、内含され
なかった標識はBlo−Ge1 P−6DG(Bio−
Rad研究所、 U、S、A、)のスピンカラムを用い
て除去した。
8)ヌJ填二
使用されるプローブの性質に条件を合わせたこと以外、
全ての実験において一般的な交雑プロトフルに従った。
全ての実験において一般的な交雑プロトフルに従った。
30分から4時間、交雑と同じ温度で、プラスチック袋
の中で、3×SSC125mMのリン酸緩衝液pH7,
1(FB)、20%の脱イオンホルムアミド(FA)、
0.02%のフィコール、0.02%のウシ血清アルブ
ミン、0.02%のポリビニルピロリドンそして0,1
mg/−のせん断され変性されたサケ精子DNA内にて
、通常予備交雑を行なった。交雑は、同じ溶液に約0.
5〜I X 10’cpm/−の32 p−プローブ
を加えた中で一時間から一晩の間行なった。交雑温度(
HT)は、実験によって異なっていた。
の中で、3×SSC125mMのリン酸緩衝液pH7,
1(FB)、20%の脱イオンホルムアミド(FA)、
0.02%のフィコール、0.02%のウシ血清アルブ
ミン、0.02%のポリビニルピロリドンそして0,1
mg/−のせん断され変性されたサケ精子DNA内にて
、通常予備交雑を行なった。交雑は、同じ溶液に約0.
5〜I X 10’cpm/−の32 p−プローブ
を加えた中で一時間から一晩の間行なった。交雑温度(
HT)は、実験によって異なっていた。
3×SSC125m&lのFB及び20%のFAの中で
の室温での簡単な洗浄の後、膜を、15〜30分の開国
に示されている洗浄温度(WT)にて3×SSC125
mMのFB及び20%のFAの中で洗浄した。その後、
膜を約10分間室温で1.5×SSC内で洗浄し、乾燥
させてからオートラジオグラフィに付した。
の室温での簡単な洗浄の後、膜を、15〜30分の開国
に示されている洗浄温度(WT)にて3×SSC125
mMのFB及び20%のFAの中で洗浄した。その後、
膜を約10分間室温で1.5×SSC内で洗浄し、乾燥
させてからオートラジオグラフィに付した。
■=
l)1里に亙スユ二ノ:
ナイセリア・ゴル工に対し特異性をもつプローブを選択
するため、ナイセリア・ゴル工の基準菌株のrRNAシ
ストロンをクローニングし配列付けした。シストロン内
の進化的に保存度の低い領域を、既知の配列との整列に
より識別した。領域のいくつかはサブクローニングする
(プローブNo、 3及び6)か又は化学的に合成させ
(プローブNo、1.2,4.5.7.8,9,10゜
11.12.13,14.15,16.17及び18)
、交雑プローブとして用いた。第1図は、DNAプロー
ブが構築されエシェリキア・コリ(大腸菌)の16s
rRNA2次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている( Woese他、1983年
)。これらの領域は、太線により示されており、ローマ
数字で番号づけされている。プローブNo、 9は領域
Iから導き出され、プローブNo、 1からNo、 4
は、領域IIからそしてプローブNo、 5及びNo、
6はそれぞれ領域III及びIVから導き出されたも
のである。
するため、ナイセリア・ゴル工の基準菌株のrRNAシ
ストロンをクローニングし配列付けした。シストロン内
の進化的に保存度の低い領域を、既知の配列との整列に
より識別した。領域のいくつかはサブクローニングする
(プローブNo、 3及び6)か又は化学的に合成させ
(プローブNo、1.2,4.5.7.8,9,10゜
11.12.13,14.15,16.17及び18)
、交雑プローブとして用いた。第1図は、DNAプロー
ブが構築されエシェリキア・コリ(大腸菌)の16s
rRNA2次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている( Woese他、1983年
)。これらの領域は、太線により示されており、ローマ
数字で番号づけされている。プローブNo、 9は領域
Iから導き出され、プローブNo、 1からNo、 4
は、領域IIからそしてプローブNo、 5及びNo、
6はそれぞれ領域III及びIVから導き出されたも
のである。
第2図では、本発明に従ったプローブNo、 1 。
No、2. No、3. No、4. No、5. N
o、6及びNo、 9の相補的配列が、16s rR
NA配列を公開した元であるナイセリアの最も近い系統
発生的隣接基であるシュードモナス・テストステロニ
ATCC11996の相応する配列(Yang他、 1
985年)及び大腸菌の相応する配列(Brosius
他、 1978年)と整列されている。
o、6及びNo、 9の相補的配列が、16s rR
NA配列を公開した元であるナイセリアの最も近い系統
発生的隣接基であるシュードモナス・テストステロニ
ATCC11996の相応する配列(Yang他、 1
985年)及び大腸菌の相応する配列(Brosius
他、 1978年)と整列されている。
第・3図では、23s rRNA遺伝子から誘導され
たプローブNo、7 、 No、8 、 No、 10
及びNo、11の相補性配列が、相応する大腸菌配列(
Brosius他、 1980年)と整列されている。
たプローブNo、7 、 No、8 、 No、 10
及びNo、11の相補性配列が、相応する大腸菌配列(
Brosius他、 1980年)と整列されている。
16s rRNAの領域II (第1図)から異なる
長さの4つのプローブ(それぞれプローブNo、l 、
No、2. No、3及びNo、 4について27,
37゜47及び57の塩基)をテストした。プローブN
o、 7及びNo、 8は2Bs rRNA内の同じ
領域から誘導された。プローブNo、 8の配列は、ア
デノシン残基が挿入されたこと以外、プローブNo、
7の配列と同じである(第3図参照)、その地金ての領
域からは1つのプローブしか実験に使用しなかった。
長さの4つのプローブ(それぞれプローブNo、l 、
No、2. No、3及びNo、 4について27,
37゜47及び57の塩基)をテストした。プローブN
o、 7及びNo、 8は2Bs rRNA内の同じ
領域から誘導された。プローブNo、 8の配列は、ア
デノシン残基が挿入されたこと以外、プローブNo、
7の配列と同じである(第3図参照)、その地金ての領
域からは1つのプローブしか実験に使用しなかった。
第11図は、ナイセリア・ゴル工の予定の16s r
RNA組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。
RNA組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。
これらの領域は太線で示され、ローマ数字で番号付けさ
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
第12図は、本発明のプローブが大腸菌の23s r
RNA二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている(No11er、 AnnRev、 B
iochem、 53: 119−116.1984
) 。
RNA二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている(No11er、 AnnRev、 B
iochem、 53: 119−116.1984
) 。
これらの領域は太線で示され、ローマ数字で番号付けさ
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
れている。相応するプローブ番号がカッコ内に示されて
いる。
2)1三ニス五立異ユニ
a、1)プローブNo、 7からNo、11までの研究
:特異性についての基準は、ナイセリア・ゴル工とナイ
セリア・メニンシティディス菌株を識別する能力であっ
た。いくつかの独立した研究によリ(Kingskur
y、 1967年HElwe11 & Falkow、
1977年HHoke & Vedros、1982年
; Riou他、 1983年;Guibourden
che他、 1986年)、その全く異なる病原性にも
かかわらず両方の種が遺伝子型においてきわめて関係の
強いものであることがわかった。
:特異性についての基準は、ナイセリア・ゴル工とナイ
セリア・メニンシティディス菌株を識別する能力であっ
た。いくつかの独立した研究によリ(Kingskur
y、 1967年HElwe11 & Falkow、
1977年HHoke & Vedros、1982年
; Riou他、 1983年;Guibourden
che他、 1986年)、その全く異なる病原性にも
かかわらず両方の種が遺伝子型においてきわめて関係の
強いものであることがわかった。
両種の代表間について報告されたDNA : DNAの
交雑相同値は64%から93%である。これらの値は、
同じ種のメンバーの間で見られることの多いものである
。ただし、「1つの種は一般に約70%以上のDNA−
DNA関係性及び5℃以下のデルタTmをもつ菌種を含
んでいる」と言っている種の定義づけ(Wayne他、
1987年)についての合意が達成されていることも
喚起しておきたい。この定義に従うと、ナイセリア・ゴ
ル工及びナイセリア・メニンシティディスは、1つの同
じ種の亜種であるとみなされるべきである(GuiBo
urdenche他、 1986年)。
交雑相同値は64%から93%である。これらの値は、
同じ種のメンバーの間で見られることの多いものである
。ただし、「1つの種は一般に約70%以上のDNA−
DNA関係性及び5℃以下のデルタTmをもつ菌種を含
んでいる」と言っている種の定義づけ(Wayne他、
1987年)についての合意が達成されていることも
喚起しておきたい。この定義に従うと、ナイセリア・ゴ
ル工及びナイセリア・メニンシティディスは、1つの同
じ種の亜種であるとみなされるべきである(GuiBo
urdenche他、 1986年)。
第1の一連の実験においては、ナイセリア・ゴルエ N
CTC8375”(NG)、ナイセリア・メニンシティ
ディス NCTC10025”(NM)及び大腸菌B
(EC)の変性DNAを19g謹上にスポツティングし
、第4図に示されているプローブと温度(交雑温度)で
交雑させた。
CTC8375”(NG)、ナイセリア・メニンシティ
ディス NCTC10025”(NM)及び大腸菌B
(EC)の変性DNAを19g謹上にスポツティングし
、第4図に示されているプローブと温度(交雑温度)で
交雑させた。
交雑の後、膜を15分間異なる温度(WT)で洗浄し、
乾燥させ、24時間−70℃で増感スクリーンを用いて
オートラジオグラフィーに付した。第4図のオートラジ
オグラフから、16srRNAの領域1.H及びIII
(第1図)から誘導された全てのプローブ(プローブ
No、 1〜5及びプローブNo、 9 )及び23s
rRNAの1つのプローブ(No、11)は、次の
ような適切な洗浄温度においてナイセリア・ゴル工に対
して特異的であることが明らかであるニ ブローブNo、 1については、55℃、60”C及び
65℃の洗浄温度、 プローブNo、 2については、60℃、65℃及び7
0℃の洗浄温度、 プローブN013については、65℃の洗浄温度、 プローブNo、 4については、70℃及び75℃の洗
浄温度、 プローブNo、 5については、65℃の洗浄温度、 プローブNo、 9については、65℃の洗浄温度、 プローブNo、11については、65°Cの洗浄温度。
乾燥させ、24時間−70℃で増感スクリーンを用いて
オートラジオグラフィーに付した。第4図のオートラジ
オグラフから、16srRNAの領域1.H及びIII
(第1図)から誘導された全てのプローブ(プローブ
No、 1〜5及びプローブNo、 9 )及び23s
rRNAの1つのプローブ(No、11)は、次の
ような適切な洗浄温度においてナイセリア・ゴル工に対
して特異的であることが明らかであるニ ブローブNo、 1については、55℃、60”C及び
65℃の洗浄温度、 プローブNo、 2については、60℃、65℃及び7
0℃の洗浄温度、 プローブN013については、65℃の洗浄温度、 プローブNo、 4については、70℃及び75℃の洗
浄温度、 プローブNo、 5については、65℃の洗浄温度、 プローブNo、 9については、65℃の洗浄温度、 プローブNo、11については、65°Cの洗浄温度。
比較すると、第4図のオートラジオグラフは、プローブ
No、6.No、7.No、8及びNo、 10がナイ
セリア・ゴル工に対し特異性を持たないことを示してい
る。
No、6.No、7.No、8及びNo、 10がナイ
セリア・ゴル工に対し特異性を持たないことを示してい
る。
ランダムに選択したナイセリア・ゴル工及びナイセリア
・メニンシティディス菌株からのゲノムDNAとプロー
ブNo、 1 、 No、 5及びNO19の交雑結果
は、第5図に示されている。9つのナイセリア・ゴル工
菌株(行A、B及びC,1〜3)、10・個のナイセリ
ア・メニンシティディス菌株(D、E及びF、1〜3及
び行G、1)及びシュードモナス・テストステロニ(行
G、2)及び大腸菌(行G、3)からの変性DNAを1
μg、ニトロセルロース上にスポツティングし、プロー
ブ1(パネルA)、プローブN[+、5(パネルB)及
びプローブNo、9(パネルC)とそれぞれ50℃。
・メニンシティディス菌株からのゲノムDNAとプロー
ブNo、 1 、 No、 5及びNO19の交雑結果
は、第5図に示されている。9つのナイセリア・ゴル工
菌株(行A、B及びC,1〜3)、10・個のナイセリ
ア・メニンシティディス菌株(D、E及びF、1〜3及
び行G、1)及びシュードモナス・テストステロニ(行
G、2)及び大腸菌(行G、3)からの変性DNAを1
μg、ニトロセルロース上にスポツティングし、プロー
ブ1(パネルA)、プローブN[+、5(パネルB)及
びプローブNo、9(パネルC)とそれぞれ50℃。
55℃及び60°Cで交雑させ、示された温度で洗浄し
た。第5図のオートラジオグラフは、プローブNo、
1 、 No、 5及びNo、 9が、テストされた全
てのナイセリア・ゴル工菌株からのDNAと二重らせん
化することを示している。プローブNo、 5及びNo
、 9は、厳しい条件の下でのみ(例えばプローブNo
、 5の場合55゛Cの交雑温度、65℃の洗浄温度)
ナイセリア・ゴル工菌株に対する特異性をもち、一方ブ
ローブNo、 1はさほど厳しくない条件(50°Cの
交雑温度、50’C又は55℃の洗浄温度)で特異性を
保つ、rRNAシストロン内の配列保存を考えると、後
者のプローブが、これらの厳しくない条件の下でその他
のナイセリア・ゴル工菌株からの核酸との安定した二重
らせんを形成しない可能性は低いと思われる。
た。第5図のオートラジオグラフは、プローブNo、
1 、 No、 5及びNo、 9が、テストされた全
てのナイセリア・ゴル工菌株からのDNAと二重らせん
化することを示している。プローブNo、 5及びNo
、 9は、厳しい条件の下でのみ(例えばプローブNo
、 5の場合55゛Cの交雑温度、65℃の洗浄温度)
ナイセリア・ゴル工菌株に対する特異性をもち、一方ブ
ローブNo、 1はさほど厳しくない条件(50°Cの
交雑温度、50’C又は55℃の洗浄温度)で特異性を
保つ、rRNAシストロン内の配列保存を考えると、後
者のプローブが、これらの厳しくない条件の下でその他
のナイセリア・ゴル工菌株からの核酸との安定した二重
らせんを形成しない可能性は低いと思われる。
分類群特異的rRNA誘導DNAプローブが、密に関係
する生体からの核酸を検出しない場合、それがより遠い
生体からの核酸を検出する確率はきわめて低いと考える
ことができる。このことは、プローブNo、3. No
、5. No、6及びNo、 7を7つのナイセリア種
とその他のい(つかのゲノム陰性菌のゲノムDNAと交
雑させた一つの実験に相応する第6図をみればわかる。
する生体からの核酸を検出しない場合、それがより遠い
生体からの核酸を検出する確率はきわめて低いと考える
ことができる。このことは、プローブNo、3. No
、5. No、6及びNo、 7を7つのナイセリア種
とその他のい(つかのゲノム陰性菌のゲノムDNAと交
雑させた一つの実験に相応する第6図をみればわかる。
さらに厳密に言うと、第6図は、ニトロセルロース上で
スポツティングされ指示された温度及びプローブで交雑
され指示された温度で洗浄されたナイセリア・ゴル工N
CTC8375”(行A、l)、ナイセリア・メニンシ
ティディス NCTC10025”(行B、1〕、ナイ
セリア・ラクタミカ NCTC10617”(行C,l
)、ナイセリア・ムコーサCIP 59.51”(行
り、1)、ナイセリア・サブフラバ ATCC1055
5(行E、11、ナイセリア・フラベツセンス ATC
C13120”(行F、1)、ナイセリア・エロンガー
タ亜種エロンガータ NCTC10660”(行A、2
)、クロモバクテリウム・ビオラセウム NCTC97
57”(行B、2)、 シュードモナス・テストステ
ロニ ATCC17407(行C,2)、ヘモフィルス
・デュクレイイCIP 542 (行り、2)、モラ
クセラ(プランハメラ)カタラーリス NCTC410
3(行E、2)及び大腸菌B(行F、2)の変性DNA
1uCと、選択されたrRNA誘導DNAプローブの交
雑結果を表わしている。使用された条件の下で、プロー
ブNo、 3及びNo、 5は、ナイセリア・ゴルより
NA以外のテストされたDNAのいずれとも安定した複
式を形成しなかった。特異性がさらに低いプローブ(N
06及びNo、 7 )でさえ、非ナイセリアDNAと
検出可能な信号を生成しなかった。又プローブNo、
6が実際、3SSCと20%FA内で60℃でサイモン
シェラ・クラッサの基準株からのDNAと交雑したこと
も言及しておかなくてはならない。
スポツティングされ指示された温度及びプローブで交雑
され指示された温度で洗浄されたナイセリア・ゴル工N
CTC8375”(行A、l)、ナイセリア・メニンシ
ティディス NCTC10025”(行B、1〕、ナイ
セリア・ラクタミカ NCTC10617”(行C,l
)、ナイセリア・ムコーサCIP 59.51”(行
り、1)、ナイセリア・サブフラバ ATCC1055
5(行E、11、ナイセリア・フラベツセンス ATC
C13120”(行F、1)、ナイセリア・エロンガー
タ亜種エロンガータ NCTC10660”(行A、2
)、クロモバクテリウム・ビオラセウム NCTC97
57”(行B、2)、 シュードモナス・テストステ
ロニ ATCC17407(行C,2)、ヘモフィルス
・デュクレイイCIP 542 (行り、2)、モラ
クセラ(プランハメラ)カタラーリス NCTC410
3(行E、2)及び大腸菌B(行F、2)の変性DNA
1uCと、選択されたrRNA誘導DNAプローブの交
雑結果を表わしている。使用された条件の下で、プロー
ブNo、 3及びNo、 5は、ナイセリア・ゴルより
NA以外のテストされたDNAのいずれとも安定した複
式を形成しなかった。特異性がさらに低いプローブ(N
06及びNo、 7 )でさえ、非ナイセリアDNAと
検出可能な信号を生成しなかった。又プローブNo、
6が実際、3SSCと20%FA内で60℃でサイモン
シェラ・クラッサの基準株からのDNAと交雑したこと
も言及しておかなくてはならない。
第4図、5図及び6図に示されている結果から、プロー
ブの特異性が、使用される交雑及び洗浄条件にきわめて
依存していることは明らかである。例えば、洗浄温度を
単に変えるだけで、プローブの検出範囲を拡張すること
ができ、こうしてナイセリア・ゴル工を特異的に又はよ
り大きい類属の生体を検出するために1つの同じプロー
ブを用いることができることになる。このことは第7図
に例示されている。ここでは、ナイセリア・ゴルエ N
CTC8375丁(N G ) 、ナイセリア・メニン
シティディス NCTCl 0025”(NM) 、ナ
イセリア・エロンガーク亜種エロンガーク NCTC1
0660(NE)、クロモバクテリウム・ビオラセウム
NCTC9575°(CV)、シュードモナス・テスト
ステロニ ATCC17407(PT)及び大腸菌B
(EC)からのドツトスポットされた変性D N A
I 1.1gを、50℃でホルムアミドの無い状態で”
p−標識付きプローブNo、 3と交雑させた。膜は乾
燥させて、増感スクリーンを用いて一70℃で一晩オー
トラジオグラフに付した。この図から、洗浄温度が低下
するとプローブの特異性は減少するという結果が得られ
る。80℃において、プローブNo、 3は、ナイセリ
ア・ゴル工のDNAに対して特異性をもつ、70℃では
このプローブはナイセリア・ゴル工及びナイセリア・メ
ニンシティディスのDNAと二重らせん化し、60℃で
は、テストされた3つのナイセリア種からのDNA二重
らせん化する。しかしながら、洗浄温度が50℃である
場合非ナイセリアDNAでさえ検出できた。
ブの特異性が、使用される交雑及び洗浄条件にきわめて
依存していることは明らかである。例えば、洗浄温度を
単に変えるだけで、プローブの検出範囲を拡張すること
ができ、こうしてナイセリア・ゴル工を特異的に又はよ
り大きい類属の生体を検出するために1つの同じプロー
ブを用いることができることになる。このことは第7図
に例示されている。ここでは、ナイセリア・ゴルエ N
CTC8375丁(N G ) 、ナイセリア・メニン
シティディス NCTCl 0025”(NM) 、ナ
イセリア・エロンガーク亜種エロンガーク NCTC1
0660(NE)、クロモバクテリウム・ビオラセウム
NCTC9575°(CV)、シュードモナス・テスト
ステロニ ATCC17407(PT)及び大腸菌B
(EC)からのドツトスポットされた変性D N A
I 1.1gを、50℃でホルムアミドの無い状態で”
p−標識付きプローブNo、 3と交雑させた。膜は乾
燥させて、増感スクリーンを用いて一70℃で一晩オー
トラジオグラフに付した。この図から、洗浄温度が低下
するとプローブの特異性は減少するという結果が得られ
る。80℃において、プローブNo、 3は、ナイセリ
ア・ゴル工のDNAに対して特異性をもつ、70℃では
このプローブはナイセリア・ゴル工及びナイセリア・メ
ニンシティディスのDNAと二重らせん化し、60℃で
は、テストされた3つのナイセリア種からのDNA二重
らせん化する。しかしながら、洗浄温度が50℃である
場合非ナイセリアDNAでさえ検出できた。
下表Iは、本発明に基づくプローブがナイセリア・ゴル
工に対し特異性をもつ温度範囲をまとめたものである。
工に対し特異性をもつ温度範囲をまとめたものである。
各プローブについて、この温度範囲はTsとTdの間で
ある。Tsはそのプローブがなおナイセリア・ゴル工に
対する特異性をもつ最低温度であり、Tdは、ブローブ
ー標的二重らせんが完全に解離される温度である。これ
らの値は、3SSC125mMのFB pH7,1及
び20%のFAという条件の下で得られたものである。
ある。Tsはそのプローブがなおナイセリア・ゴル工に
対する特異性をもつ最低温度であり、Tdは、ブローブ
ー標的二重らせんが完全に解離される温度である。これ
らの値は、3SSC125mMのFB pH7,1及
び20%のFAという条件の下で得られたものである。
これらの条件、プローブ又は標的の性質が変化した場合
、温度もそれに応じて変化することになる。温度は、5
°Cの間隔、従ってTsとTdのデルタ5°C範囲を用
いて実験的に決定された。ブロープNo、 lは又45
°〜50℃より低い温度で特異的である可能性があり、
プローブNo、 6 、 No、 7No、 8及びN
o、 10はデイセリア・ゴル工に対し特異的でないこ
とに留意されたい。
、温度もそれに応じて変化することになる。温度は、5
°Cの間隔、従ってTsとTdのデルタ5°C範囲を用
いて実験的に決定された。ブロープNo、 lは又45
°〜50℃より低い温度で特異的である可能性があり、
プローブNo、 6 、 No、 7No、 8及びN
o、 10はデイセリア・ゴル工に対し特異的でないこ
とに留意されたい。
表 I
プローブ エ玉fl Td四)
1 45−50 65−T
。
。
8.2)プローブNo1に関する結果
202のデイセリア・ゴル工菌株と84のデイセリア・
メニンシティディス菌株を用いて、プローブNo、 4
をさらにテストした。
メニンシティディス菌株を用いて、プローブNo、 4
をさらにテストした。
以下の方法を用いた。
10%のSDSで飽和されたワットマン3MM口紙上に
3分装置いたBiodyne A膜に対し各菌株の数個
のコロ;−を適用した。嵌装の後、膜を80℃で2時間
焼成し、交雑混合物内で53℃で約1〜2時間交雑させ
た。この混合物に対しては約10 ’cpm/Ml”p
−標識付きプローブ(No、1)を付加した。
3分装置いたBiodyne A膜に対し各菌株の数個
のコロ;−を適用した。嵌装の後、膜を80℃で2時間
焼成し、交雑混合物内で53℃で約1〜2時間交雑させ
た。この混合物に対しては約10 ’cpm/Ml”p
−標識付きプローブ(No、1)を付加した。
その結果は、第15図に示されている。第15図におい
て、各々の番号はデイセリア・ゴル工又はデイセリア・
メニンシティディス菌株のいずれかを表わしている。デ
イセリア・メニンシティディス菌株には囲みがついてい
る。
て、各々の番号はデイセリア・ゴル工又はデイセリア・
メニンシティディス菌株のいずれかを表わしている。デ
イセリア・メニンシティディス菌株には囲みがついてい
る。
全てのデイセリア・ゴル工菌株は、3時間の露出の後(
増感スクリーンで一80℃で)明白な陽信号を与えた。
増感スクリーンで一80℃で)明白な陽信号を与えた。
デイセリア・メニンシティディス菌株のいずれも、−晩
中露出した後でさえ陽の結果を出さなかった。デイセリ
ア・メニンシティデイススポット中に検出可能な量のr
RNAが存在することが、非特異的rRNA−誘導プロ
ーブを用いて、その後確認された。
中露出した後でさえ陽の結果を出さなかった。デイセリ
ア・メニンシティデイススポット中に検出可能な量のr
RNAが存在することが、非特異的rRNA−誘導プロ
ーブを用いて、その後確認された。
その他の実験によって、プローブNo、 1もナイセリ
ア種の菌株ATCC43831のDNAに対して交雑す
ることがわかった(第16図参照)。
ア種の菌株ATCC43831のDNAに対して交雑す
ることがわかった(第16図参照)。
第16図には、プローブNO31とナイセリア種菌株A
TCC43831のDNAでの交雑結果が示されている
:交雑及び洗浄の温度は52.5℃であった(3SSC
125mMのPB、 pH7,1及び20%のFA中で
)。
TCC43831のDNAでの交雑結果が示されている
:交雑及び洗浄の温度は52.5℃であった(3SSC
125mMのPB、 pH7,1及び20%のFA中で
)。
このATCC43831菌株は、デイセリア・ゴル工と
デイセリア・メニンシティディスの間の中間的特性をも
つ未分類の菌株である。
デイセリア・メニンシティディスの間の中間的特性をも
つ未分類の菌株である。
第17図に示されているように、プローブNo、 1は
その他のさまざまな細菌のDNAと交叉交雑しなかった
。
その他のさまざまな細菌のDNAと交叉交雑しなかった
。
第17図には、さまざまな細菌株のドツトスポットされ
たゲノムDNA 1マイクログラムとプローブNo、
1の交雑結果が示されている:菌株の位置は以下の表
IIに示されており、交雑及び洗浄温度は52.5℃で
あった(3SSC125mMPB pH”r、1及び
20%のFA内で)。
たゲノムDNA 1マイクログラムとプローブNo、
1の交雑結果が示されている:菌株の位置は以下の表
IIに示されており、交雑及び洗浄温度は52.5℃で
あった(3SSC125mMPB pH”r、1及び
20%のFA内で)。
表II
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴルエ
デイセリア・ゴル工
ITG 4339
ITG 4085
ITG 4308
ITG 3939
ITG 4363
ITG 4367
ITG 4401
1TG 443?
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
デイセリア・メニンシティディス
ITG 3342
ITG 3343
ITG 3345
ITG 3346
ITG 3348
ITG 3349
ITG 3350
ITG 3357
ITG 3362
40、 CDC類I):E F −4a41、 キ
ンゲラ・デニトリフィカンス(Kinge11a de
nitrificans142、キンゲラ・デニトリフ
ィカンス 43 キンゲラ・キング (Kinge11a kingae1 44、サイモンシェラ・ムエレリ (Simonsiel!a mue11eri145、
サイモンシェラ・クラッセ lsimonsie11a crasse146、サイ
モンシエラ・スチーデ (Simonsie11a 5taedae147、サ
イモンシェラ穏 48、 アリシェラ・フィリフォルミス(Alysie
11a fi11formis149、 エイケネラ・
コロ−デンス (Eikene11a corrodens)50、
エイケネラ・コロ−デンス CDCT−191/78 NCTC10995” NCTC10997 NCTC10529” ATCC29452 ATCC15533” ATCC27398 ATCC27381 CCUG 3710” NCTC10596” NIM 801−1 53、 アクアスビリリウム・デイスパー(Aqua
spiri11um disparlシュードモナス・
テストステロニ (Pseudamonas testosteroni
155、オリゲラ・ウレトラリス (O11ge11a urethra11is)56、
ヘモフィルス・デエクレイイ(Haemophil
us ducrayi1ATCC27650 ATC[: 17407 LIAG [1227 CIP 542” 22、デイセリア・ラクタミカ 23、デイセリア・ラクタミカ 24、デイセリア・ラクタミカ NCTC10617” ITG 3689 ITG 3690 27、デイセリア・ムコーサ 28、デイセリア・ムコーサ CIP 59.48 0IP 59.47 デイセリア・フラベツセンス (Neisseria flavescenslATC
C13120” 32、デイセリア・サブフラパ 33、デイセリア・シツカ ITG 3821 1TG 3382 36、 デイセリア・カニメ ATCC
14687”(Neisseria canis1 37、 デイセリア・アニマリス NCTC
10212”(Neisseria anima11s
138、 デイセリア・デニトリフィカンス ATCC
14686”(Neisseria denitrif
icans139、 CDC類属M −5CCIJG
400757゜ キンゲラ・インドロゲネス (Kinge11a indologeneslNCT
C10717τ フィルターエ UII上の の位 フィルターI フィルターII 結論として、使用された条件の下で、プローブNo、
’lは、従来の識別技法に比ベナイセリア・ゴル工に対
し100%の特異性と100%の信頼性をもつことがわ
かった。このプローブは又、Totten他のJ、 I
nfect、 Dis、、 148:4B2−473.
1983年に最初に記されたクリプテイック(潜在)プ
ラスミドプローブよりもさらに信頼性が高いものである
ことがわかった。
ンゲラ・デニトリフィカンス(Kinge11a de
nitrificans142、キンゲラ・デニトリフ
ィカンス 43 キンゲラ・キング (Kinge11a kingae1 44、サイモンシェラ・ムエレリ (Simonsiel!a mue11eri145、
サイモンシェラ・クラッセ lsimonsie11a crasse146、サイ
モンシエラ・スチーデ (Simonsie11a 5taedae147、サ
イモンシェラ穏 48、 アリシェラ・フィリフォルミス(Alysie
11a fi11formis149、 エイケネラ・
コロ−デンス (Eikene11a corrodens)50、
エイケネラ・コロ−デンス CDCT−191/78 NCTC10995” NCTC10997 NCTC10529” ATCC29452 ATCC15533” ATCC27398 ATCC27381 CCUG 3710” NCTC10596” NIM 801−1 53、 アクアスビリリウム・デイスパー(Aqua
spiri11um disparlシュードモナス・
テストステロニ (Pseudamonas testosteroni
155、オリゲラ・ウレトラリス (O11ge11a urethra11is)56、
ヘモフィルス・デエクレイイ(Haemophil
us ducrayi1ATCC27650 ATC[: 17407 LIAG [1227 CIP 542” 22、デイセリア・ラクタミカ 23、デイセリア・ラクタミカ 24、デイセリア・ラクタミカ NCTC10617” ITG 3689 ITG 3690 27、デイセリア・ムコーサ 28、デイセリア・ムコーサ CIP 59.48 0IP 59.47 デイセリア・フラベツセンス (Neisseria flavescenslATC
C13120” 32、デイセリア・サブフラパ 33、デイセリア・シツカ ITG 3821 1TG 3382 36、 デイセリア・カニメ ATCC
14687”(Neisseria canis1 37、 デイセリア・アニマリス NCTC
10212”(Neisseria anima11s
138、 デイセリア・デニトリフィカンス ATCC
14686”(Neisseria denitrif
icans139、 CDC類属M −5CCIJG
400757゜ キンゲラ・インドロゲネス (Kinge11a indologeneslNCT
C10717τ フィルターエ UII上の の位 フィルターI フィルターII 結論として、使用された条件の下で、プローブNo、
’lは、従来の識別技法に比ベナイセリア・ゴル工に対
し100%の特異性と100%の信頼性をもつことがわ
かった。このプローブは又、Totten他のJ、 I
nfect、 Dis、、 148:4B2−473.
1983年に最初に記されたクリプテイック(潜在)プ
ラスミドプローブよりもさらに信頼性が高いものである
ことがわかった。
a、3)プローブNo、 l Oに関する結果プローブ
No、10は、さまざまな細菌DNAと交雑させられた
。その結果は第18図に示されている。
No、10は、さまざまな細菌DNAと交雑させられた
。その結果は第18図に示されている。
第18図には、さまざまな細菌株からのドツトスポット
されたゲノムDNA 1マイクログラムとプローブN
o、 10の交雑の結果が示されている。
されたゲノムDNA 1マイクログラムとプローブN
o、 10の交雑の結果が示されている。
交雑温度は55℃であった(3SSC125mMのPB
、pH7,1及び20%のFA内で)、洗浄温度は指示
されている(同じ媒質が用いられた)。菌株の位置は表
11に与えられている。
、pH7,1及び20%のFA内で)、洗浄温度は指示
されている(同じ媒質が用いられた)。菌株の位置は表
11に与えられている。
プローブNo、 l Oは、はぼ全てのデイセリア菌株
のDNAに対し交雑する。60°Cでは、デイセリアの
近い親類であるサイモンシエラ及びアリシェラ菌株から
のDNAとの弱い交叉反応がみられた( Rossau
他、IJSB、 1989年印刷中)。
のDNAに対し交雑する。60°Cでは、デイセリアの
近い親類であるサイモンシエラ及びアリシェラ菌株から
のDNAとの弱い交叉反応がみられた( Rossau
他、IJSB、 1989年印刷中)。
b)プローブNo、 12からNo、 1 Bまでの研
究プローブNo、 l 2からNo、 18までの特異
性が上述のとおりにテストされた(同じ方法、同じ媒質
)。用いられた交雑温度(HT)及び洗浄温度(WT)
は第18図に示されている。
究プローブNo、 l 2からNo、 18までの特異
性が上述のとおりにテストされた(同じ方法、同じ媒質
)。用いられた交雑温度(HT)及び洗浄温度(WT)
は第18図に示されている。
第13図では、さまざまな洗浄温度でのプロプの特異性
が以下のように決定されている二指示された温度(HT
)及びプローブでの交雑の後、デイセリア・ゴルエ N
CTC8375T (NG)、デイセリア・メニンシテ
ィディス NCTClo025T(NM)、大腸菌B
(EC)及びブランハメラ・カタラリスITG 41
97 (BC)の変性DNA 1μgが上にスポツテ
ィングされた膜を15分間、指示された洗浄温度にて洗
浄し、乾燥させ、70℃で増感スクリーンを用いて24
時間オートラジオグラフィに付した。
が以下のように決定されている二指示された温度(HT
)及びプローブでの交雑の後、デイセリア・ゴルエ N
CTC8375T (NG)、デイセリア・メニンシテ
ィディス NCTClo025T(NM)、大腸菌B
(EC)及びブランハメラ・カタラリスITG 41
97 (BC)の変性DNA 1μgが上にスポツテ
ィングされた膜を15分間、指示された洗浄温度にて洗
浄し、乾燥させ、70℃で増感スクリーンを用いて24
時間オートラジオグラフィに付した。
第13図に示された結果から、プローブNo、12.
No、14及びNo、17がデイセリア・ゴル工に対し
特異性をもつものでないことは明らかである。これらは
、以下の交雑温度(HT)及び洗浄温度(WT)で単数
又は複数のデイセリア菌株を検出するのに用いることが
できる プローブNo、 l 2 :約55℃と約600℃の間
のHT及びWT。
No、14及びNo、17がデイセリア・ゴル工に対し
特異性をもつものでないことは明らかである。これらは
、以下の交雑温度(HT)及び洗浄温度(WT)で単数
又は複数のデイセリア菌株を検出するのに用いることが
できる プローブNo、 l 2 :約55℃と約600℃の間
のHT及びWT。
プローブNo、 14 :約40°Cと約45℃の間の
HT及びWT。
HT及びWT。
プローブNo、 15 :約50°Cと約55℃の間の
HT及びWT。
HT及びWT。
プローブNo15及びNo、 l 6は厳しい条件(第
13図参照)の下でデイセリア・メニンシティディスの
基準株のDNAと交雑しないものの、さらに実験すると
、これらは、その他のい(つかのデイセリア菌株主とし
てデイセリア・メニンシティディス菌株に対し交叉交雑
するために、デイセリア・ゴル工に対し充分な特異性を
もたないことがわかった。従って、両方のプローブ共、
以下の)(T及びWTで単数又は複数のデイセリア菌株
を検出するためにのみ用いることができるニブローブN
o、 15 :約50’Cと約55℃の間のHT及びW
T。
13図参照)の下でデイセリア・メニンシティディスの
基準株のDNAと交雑しないものの、さらに実験すると
、これらは、その他のい(つかのデイセリア菌株主とし
てデイセリア・メニンシティディス菌株に対し交叉交雑
するために、デイセリア・ゴル工に対し充分な特異性を
もたないことがわかった。従って、両方のプローブ共、
以下の)(T及びWTで単数又は複数のデイセリア菌株
を検出するためにのみ用いることができるニブローブN
o、 15 :約50’Cと約55℃の間のHT及びW
T。
プローブNo、 16 :約50°Cと約600℃の間
のF(T及びWT。
のF(T及びWT。
きわめて厳しい条件の下で、プローブN013及び18
は、以下の)(T及びWTで、テストされた全てのデイ
セリア・ゴル工菌株に対し交雑し、テストされたいずれ
のデイセリア・メニンジティエイスとも交雑しなかった
ニ ブローブNo、 13 :約50℃から約55°Cの間
のHT及びWT。
は、以下の)(T及びWTで、テストされた全てのデイ
セリア・ゴル工菌株に対し交雑し、テストされたいずれ
のデイセリア・メニンジティエイスとも交雑しなかった
ニ ブローブNo、 13 :約50℃から約55°Cの間
のHT及びWT。
プローブNo、 18 :約60°C0第14図には、
プローブNo、 18との交雑結果に関しての一例が与
えられている。
プローブNo、 18との交雑結果に関しての一例が与
えられている。
9つのデイセリア・ゴル工菌株(行A、B及びC,1〜
3)、10個のデイセリア・メニンジティディス菌株(
行り、E及びF、1〜3及び行G、1)及びデイセリア
に関係のない2つの基準株(行G、2及び3)からのド
ツトスポットされた変性DNA 1μgとプローブN
o、 18を交雑させた。交雑及び洗浄温度は60’C
であった。
3)、10個のデイセリア・メニンジティディス菌株(
行り、E及びF、1〜3及び行G、1)及びデイセリア
に関係のない2つの基準株(行G、2及び3)からのド
ツトスポットされた変性DNA 1μgとプローブN
o、 18を交雑させた。交雑及び洗浄温度は60’C
であった。
下表IIIは、本発明に基づ(プローブNo、 12及
びNo、 l 8がデイセリア・ゴル工に対し特異性を
もつ温度範囲をまとめている。この表の中で、Ts及び
Tdは、上述の条件下で説明した上記の意味を有する(
表I参照)。
びNo、 l 8がデイセリア・ゴル工に対し特異性を
もつ温度範囲をまとめている。この表の中で、Ts及び
Tdは、上述の条件下で説明した上記の意味を有する(
表I参照)。
表III
1且ユニ1
プローブ
本発明に基づくプローブは、
1止」工)
核酸プローブベー
スの検定の特異性を高めるサンドイッチ交雑システム内
で用いることができる。
で用いることができる。
核酸プローブベースの検定におけるサンドイッチ交雑の
原理及び使用方法はすでに記述されてきた(例: Du
nn & Hassel共著、「細胞J 、 12;2
3−36、1977年; Ranki他著、「遺伝子J
21.77−851983年)、直接交雑検定は有利
な反応速度を有するものの、サンドイッチ交雑は、より
高い信号対雑音比に関し有利である。さらに、サンドイ
ッチ交雑は、核酸プローブベースの検定の特異性を高め
ることができる。適切に設計されている場合、サンドイ
ッチ交雑検定は実際、同じ1つの生体の2つの異なる核
酸伸張を認識する2つのプローブを用いたとき核酸プロ
ーブベースのテストの特異性を最大限にする。満たさな
くてはならない唯一の必要条件は、両方のプローブかい
)標的生体の核酸に対し交雑し、(ii )同じ非標的
生体に対し交雑しないことである。
原理及び使用方法はすでに記述されてきた(例: Du
nn & Hassel共著、「細胞J 、 12;2
3−36、1977年; Ranki他著、「遺伝子J
21.77−851983年)、直接交雑検定は有利
な反応速度を有するものの、サンドイッチ交雑は、より
高い信号対雑音比に関し有利である。さらに、サンドイ
ッチ交雑は、核酸プローブベースの検定の特異性を高め
ることができる。適切に設計されている場合、サンドイ
ッチ交雑検定は実際、同じ1つの生体の2つの異なる核
酸伸張を認識する2つのプローブを用いたとき核酸プロ
ーブベースのテストの特異性を最大限にする。満たさな
くてはならない唯一の必要条件は、両方のプローブかい
)標的生体の核酸に対し交雑し、(ii )同じ非標的
生体に対し交雑しないことである。
2つの与えられたプローブエ及びIIについて、サンド
イッチ交雑システムは以下のように説明することかでき
るニ ブロープNo、 Iは、生体A及びBがらの核酸に対し
交雑する(Cとは交雑しない)。
イッチ交雑システムは以下のように説明することかでき
るニ ブロープNo、 Iは、生体A及びBがらの核酸に対し
交雑する(Cとは交雑しない)。
プローブNo、 IIは、生体A及びCからの核酸に対
し交雑する(Bとは交雑しない)。
し交雑する(Bとは交雑しない)。
両方のプローブが標的核酸に対し交雑することが絶対に
必要であるため、検出可能な信号は、生体Aからの核酸
が試料内に存在する場合にのみ生成される。
必要であるため、検出可能な信号は、生体Aからの核酸
が試料内に存在する場合にのみ生成される。
第10図には、高められた特異性をもつサンドイッチ交
雑検定が示されているニ プローブ■は、生体A及びBからの核酸と交雑し、固体
支持体に対し固定される。
雑検定が示されているニ プローブ■は、生体A及びBからの核酸と交雑し、固体
支持体に対し固定される。
プローブIIは、生体A及びCからの核酸と交雑し、標
識づけされる。
識づけされる。
この試験は、標識づけされたプローブ(プローブII)
が支持体に間接的に固定された場合すなわち、生体Aか
らの核酸が存在する場合にのみ陽性となる。
が支持体に間接的に固定された場合すなわち、生体Aか
らの核酸が存在する場合にのみ陽性となる。
本発明に基づ(プローブのい(っがは、デイセリア・ゴ
ル工に対する特異性の高いサンドイッチ交雑検定におい
て組合わせることができる。デイセリア・ゴル工に対す
る特異性を最大限にする本発明に基づくプローブの有利
な組合せは、以下のとおりであるニ グループ9のプローブと、グループ)、2゜3.5及び
13のプローブのうちのいずれか。
ル工に対する特異性の高いサンドイッチ交雑検定におい
て組合わせることができる。デイセリア・ゴル工に対す
る特異性を最大限にする本発明に基づくプローブの有利
な組合せは、以下のとおりであるニ グループ9のプローブと、グループ)、2゜3.5及び
13のプローブのうちのいずれか。
グループ13のプローブと、グループl。
2.3及び5のプローブのうちのいずれか。
グループ18のプローブと、グループ12.3.5.9
及び13のプローブのうちのいずれか。
及び13のプローブのうちのいずれか。
グループ5のプローブと、グループ1.2及び3のプロ
ーブのうちのいずれか。
ーブのうちのいずれか。
デイセリア・ゴル工に対する特異性をもつ本発明に基づ
くプローブの有利な組合せは以下のようなものであるニ グループ13のプローブと、グループ5.9及び18の
プローブのうちのいずれか。
くプローブの有利な組合せは以下のようなものであるニ グループ13のプローブと、グループ5.9及び18の
プローブのうちのいずれか。
デイセリア・ゴル工に対する特異性をもつ本発明に基づ
くプローブの好ましい組合せは以下のようなものである
ニ グループ9のプローブと、グループ5のプローブ。
くプローブの好ましい組合せは以下のようなものである
ニ グループ9のプローブと、グループ5のプローブ。
グループ18のプローブと、グループ5及び9のプロー
ブのうちの1つ。
ブのうちの1つ。
これらの組合せは、標的として16s
rRNA分子を有する。16s rRNA誘導及び2
3s rRNA誘導のプローブ間(例えばグループ1
1のプローブとグループ13又は18のプローブ間)の
組合せは、ゲノムDNAが標的分子である場合にのみ可
能である。
3s rRNA誘導のプローブ間(例えばグループ1
1のプローブとグループ13又は18のプローブ間)の
組合せは、ゲノムDNAが標的分子である場合にのみ可
能である。
デイセリア・ゴル工を検出するためのサンドイッチ交雑
プロセスにおいて、プローブは、同時に或いは同時にで
なく、標的DNA又はRNAが追及されている生物学的
試料に加えられつる。
プロセスにおいて、プローブは、同時に或いは同時にで
なく、標的DNA又はRNAが追及されている生物学的
試料に加えられつる。
上述の組合せに対する有利なおおよその交雑温度及び洗
浄温度は、以下の表IVに与えられている。
浄温度は、以下の表IVに与えられている。
表1■
1 *
2 − *
3 − − *
5 53 60 65 *9
55 55 65 65 *13
52 52 52 52 52
*18 53 60 60 6
0 60 52 *この表は、サンドイッチ
交雑検定におけるプローブのさまざまな組合せについて
の好ましい交雑温度及び洗浄温度じC単位)を表わして
いる。
55 55 65 65 *13
52 52 52 52 52
*18 53 60 60 6
0 60 52 *この表は、サンドイッチ
交雑検定におけるプローブのさまざまな組合せについて
の好ましい交雑温度及び洗浄温度じC単位)を表わして
いる。
「−」が示されている組合せは用いてはならない。
例えば、
プローブNo、 1及i1.F No、 5が組合せら
れている検定は、約53℃で行なわれなくてはならない
。
れている検定は、約53℃で行なわれなくてはならない
。
プローブNo、 18及びNo、 9が組合せられてい
る検定は、約60℃で行なわれなくてはならない。
る検定は、約60℃で行なわれなくてはならない。
本発明は又、生物学的試料内のデイセリア・ゴル工菌株
を試験管内検出するための、サンドイッチ交雑検定用キ
ットにも関わるものであり、このキットには以下のもの
が含まれている: 次の組合せの中から選ばれた上述のようなデイセリア・
ゴル工に対する特異性をもつ少なくとも2つのプローブ
: グループ9のプローブと、グループ1゜2.3.5及び
13のプローブのいずれか、 グループ13のプローブと、グループ12.3及び5の
プローブのいずれか、 グループ18のプローブと、グループ12.3.5.9
及び13のプローブのいずれか、 グループ5のプローブと、グループ1゜2及び3のプロ
ーブのいずれか、 (なお特に、 グループ13のプローブと、グループ5゜9、及び18
のプローブのいずれか、 さらに特に グループ9のプローブと、グループ5のプローブ、 グループ18のプローブと、グループ5及び9のプロー
ブのいずれか、 の中から選ばれる) デイセリア・ゴル工菌株のDNA及び/又はRNAとこ
れらのプローブの間の交雑反応を行なえるようにする緩
衝液又はかかる緩衝液を生成するのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られる雑種を
検定するための手段。
を試験管内検出するための、サンドイッチ交雑検定用キ
ットにも関わるものであり、このキットには以下のもの
が含まれている: 次の組合せの中から選ばれた上述のようなデイセリア・
ゴル工に対する特異性をもつ少なくとも2つのプローブ
: グループ9のプローブと、グループ1゜2.3.5及び
13のプローブのいずれか、 グループ13のプローブと、グループ12.3及び5の
プローブのいずれか、 グループ18のプローブと、グループ12.3.5.9
及び13のプローブのいずれか、 グループ5のプローブと、グループ1゜2及び3のプロ
ーブのいずれか、 (なお特に、 グループ13のプローブと、グループ5゜9、及び18
のプローブのいずれか、 さらに特に グループ9のプローブと、グループ5のプローブ、 グループ18のプローブと、グループ5及び9のプロー
ブのいずれか、 の中から選ばれる) デイセリア・ゴル工菌株のDNA及び/又はRNAとこ
れらのプローブの間の交雑反応を行なえるようにする緩
衝液又はかかる緩衝液を生成するのに必要な構成成分、 該当する場合には、先行する交雑の結果得られる雑種を
検定するための手段。
デイセリア・ゴル工及びデイセリア・メニンシティディ
ス菌株が互いに本発明に基づくプローブのいくつかによ
って識別されうるという事実は、これら両方の分類群が
亜種レベルで遺伝子型に関し関連性をもっていることか
ら、rRNA誘導プローブ全般の使用に対し成る程度広
範に関与してくる。従って、本発明に基づくプローブは
、広範な生体類属を検定するためにのみ用いられつるの
ではなく、亜種レベルでの生体間の識別を行なうのにも
用いることができる。これがデイセリアのみにあてはま
り、他の分類群に当てはまらないと考える理由は全く無
い、プローブの配列及び交雑条件が入念に選択されるこ
とを条件として、亜種レベルでの区別は単純な直接的交
雑型式で行なうことができ、長たらしいサザンプロット
分析法を時代遅れのものにしている。
ス菌株が互いに本発明に基づくプローブのいくつかによ
って識別されうるという事実は、これら両方の分類群が
亜種レベルで遺伝子型に関し関連性をもっていることか
ら、rRNA誘導プローブ全般の使用に対し成る程度広
範に関与してくる。従って、本発明に基づくプローブは
、広範な生体類属を検定するためにのみ用いられつるの
ではなく、亜種レベルでの生体間の識別を行なうのにも
用いることができる。これがデイセリアのみにあてはま
り、他の分類群に当てはまらないと考える理由は全く無
い、プローブの配列及び交雑条件が入念に選択されるこ
とを条件として、亜種レベルでの区別は単純な直接的交
雑型式で行なうことができ、長たらしいサザンプロット
分析法を時代遅れのものにしている。
本発明に基づく特異的プローブ特にプローブNo、1−
No、5. No、9. No、l 1 、 No、l
3及びNo、 18は、適切な条件の下で他の微生物
からいかなる妨害も予想されないことから、あらゆるタ
イプの臨床試料内のデイセリア・ゴル工の診断及びデイ
セリア・ゴル工の培養確認に応用されるべきである。
No、5. No、9. No、l 1 、 No、l
3及びNo、 18は、適切な条件の下で他の微生物
からいかなる妨害も予想されないことから、あらゆるタ
イプの臨床試料内のデイセリア・ゴル工の診断及びデイ
セリア・ゴル工の培養確認に応用されるべきである。
さらに、本発明に基づくプローブは、制限フラグメント
長多形性分析に基づく分類学的又は免疫学的調査(Gr
imont & Grimont、1986年)のため
にも、又関連する微生物を識別し分類するためにも用い
ることができる。
長多形性分析に基づく分類学的又は免疫学的調査(Gr
imont & Grimont、1986年)のため
にも、又関連する微生物を識別し分類するためにも用い
ることができる。
以下の本発明の背景となる論文による参考試料を記す。
参考試料
1 、 Brosins、 J、、 T、 J、 Du
11及びH,F、 No1ler共著、1980年、「
大腸菌からの23s リ ポソームRNA遺伝子の完
全なヌクレオチド配列J 、 Proc、 Nat)、
Acad、 5ci(米国科学アカデミ−会報、US
A ?7: 201〜2041゜la、 Brosiu
s、 J、、 J、 L、 Palmer、 J、 P
、 Kennedy及びH,F、 No1ler共著、
1978年、「大腸菌からの16s リポソームRN
A遺伝子の完全なヌクレオチド配列J Proc、 N
at)、 Acad、 Sci。
11及びH,F、 No1ler共著、1980年、「
大腸菌からの23s リ ポソームRNA遺伝子の完
全なヌクレオチド配列J 、 Proc、 Nat)、
Acad、 5ci(米国科学アカデミ−会報、US
A ?7: 201〜2041゜la、 Brosiu
s、 J、、 J、 L、 Palmer、 J、 P
、 Kennedy及びH,F、 No1ler共著、
1978年、「大腸菌からの16s リポソームRN
A遺伝子の完全なヌクレオチド配列J Proc、 N
at)、 Acad、 Sci。
U、S、A、 75: 4801−4805゜2 、
Edelstein、 P、 H,著、 1986年、
「培養中のレジオネラの検出のためのGen−Prob
e D N Aプローブの評価J 、 J、 C11n
、 Microbiol (微生物学臨床ジャーナル)
、23: 481−484 。
Edelstein、 P、 H,著、 1986年、
「培養中のレジオネラの検出のためのGen−Prob
e D N Aプローブの評価J 、 J、 C11n
、 Microbiol (微生物学臨床ジャーナル)
、23: 481−484 。
3、 Elwe11、 L、 P、、及びS、 Fal
kow共著、1977年。「デイセリア属のプラスミド
J p138−154゜In、:Roberts R,
B、、 (刊行)「リン菌J JohnWiley a
nd 5ons、ニューヨーク。
kow共著、1977年。「デイセリア属のプラスミド
J p138−154゜In、:Roberts R,
B、、 (刊行)「リン菌J JohnWiley a
nd 5ons、ニューヨーク。
4、 t”est)、 l(−+ w、 Lud
urig、及びに、H1Schleifer共著、19
86年。「シュードモナス・フルオレッセンス類属のた
めのDNA交雑プローブJ App)、 Env、 M
icrobio)、 (応用環境微生物学) 、 52
: 1190−1194゜5、 Goke)、 U、
B、、 A、 Ge1ser 及びE、 J
。
urig、及びに、H1Schleifer共著、19
86年。「シュードモナス・フルオレッセンス類属のた
めのDNA交雑プローブJ App)、 Env、 M
icrobio)、 (応用環境微生物学) 、 52
: 1190−1194゜5、 Goke)、 U、
B、、 A、 Ge1ser 及びE、 J
。
Stanbridge共著、1987年。「マイコプラ
ズマ種間の明確に区別されるリポソームRNAの可変的
領域に対し相補性のオリゴヌクレオチドJ J。
ズマ種間の明確に区別されるリポソームRNAの可変的
領域に対し相補性のオリゴヌクレオチドJ J。
Gen、 Microbio)、 (遺伝微生物学ジャ
ーナル)。
ーナル)。
133: 1969−1974年。
6、 Grimont、 F、、及びP、 A、 D、
Grimon共著、1986年。[潜在的な分類学的
手段としてのリポソーム リボ核酸遺伝子制限パターン
J Ann。
Grimon共著、1986年。[潜在的な分類学的
手段としてのリポソーム リボ核酸遺伝子制限パターン
J Ann。
Microbio)、 (微生物学年報) [In5
t、 Pa5teur (パスツール研究所13.13
7B: 165〜175゜7 、 Guibourde
nche、 M、、 M、 Y、 Popoff及びJ
。
t、 Pa5teur (パスツール研究所13.13
7B: 165〜175゜7 、 Guibourde
nche、 M、、 M、 Y、 Popoff及びJ
。
Y、 Riou共著、1986年、「デイセリア・ゴル
工、デイセリア・メニンシティディス、デイセリア・ラ
クタミカ、デイセリア・シネレア及び゛°ナイセリア・
ポリサッカレア゛間のデオキシリボ核酸の関係性J 、
Ann、 Microbiol(Inst。
工、デイセリア・メニンシティディス、デイセリア・ラ
クタミカ、デイセリア・シネレア及び゛°ナイセリア・
ポリサッカレア゛間のデオキシリボ核酸の関係性J 、
Ann、 Microbiol(Inst。
Pa5teur) 、 137B:177−185゜8
、 Haun、 G、、及びU、 Gubel共著、1
987年、「プロテウス属の代表の属、種及び亜種特異
的識別のためのオリゴヌクレオチドプローブ、 FEM
S[Fed、 Eur、 Microbio)、 So
c、 (欧州微生物学会連合)l Microbio)
、 Lett、(微生物学文献)、43: 187−1
93゜ 9、 Hoke、 C,、及びN、 A、 Vedro
s共著、1982年。
、 Haun、 G、、及びU、 Gubel共著、1
987年、「プロテウス属の代表の属、種及び亜種特異
的識別のためのオリゴヌクレオチドプローブ、 FEM
S[Fed、 Eur、 Microbio)、 So
c、 (欧州微生物学会連合)l Microbio)
、 Lett、(微生物学文献)、43: 187−1
93゜ 9、 Hoke、 C,、及びN、 A、 Vedro
s共著、1982年。
[デイセリアの分類学:デオキシリボ核酸塩基組成、種
間形質転換及びデオキシリボ核酸交雑、 Int、 J
、 5yst、 Bacteriol(国際系統細菌学
ジャーナル)、32: 57−66゜ 10、 Kahn、 M、、 R,Kolter、 C
,Thomas、 D。
間形質転換及びデオキシリボ核酸交雑、 Int、 J
、 5yst、 Bacteriol(国際系統細菌学
ジャーナル)、32: 57−66゜ 10、 Kahn、 M、、 R,Kolter、 C
,Thomas、 D。
Figurski、 R,Meyer、 E、 Rem
aut及びり、 R。
aut及びり、 R。
He1inaki共著、1979年、プラスミドCal
El。
El。
F、 R6に、 RK2から誘導されたプラスミドクロ
ーニング伝播体。Methods Enzymo)、
(酵素学的方法) 、 68: 268 。
ーニング伝播体。Methods Enzymo)、
(酵素学的方法) 、 68: 268 。
11、 Kingsbury、 D、 T、 1
967年、「デイセリア属の種間のデオキシリボ核酸相
同」、J。
967年、「デイセリア属の種間のデオキシリボ核酸相
同」、J。
Bacterio)、 (細菌学ジャーナル) 94
:870−874゜12、 Maniatis、 T
、、 E、 F、 Fr1tsch及びJSam
brook (刊行)、1982年、「分子クローニン
グ:実験所マニュアルJ 、 Co1d Spring
Harbour、 ;− ;−ヨーク。
:870−874゜12、 Maniatis、 T
、、 E、 F、 Fr1tsch及びJSam
brook (刊行)、1982年、「分子クローニン
グ:実験所マニュアルJ 、 Co1d Spring
Harbour、 ;− ;−ヨーク。
13、 Marmur、 J、 A、 1961年、[
微生物からのデオキシリボ核酸の分離方法J 、J、
Mad、 Bio)、 (分子生物学ジャーナル) 、
3: 208−218゜14、Palmer、 L、
、 S、 Falkow及びり、 Klevan共著、
1986年、[クラミジア・トラコマチスの18sリポ
ソームRNA遺伝子J p89−91 。
微生物からのデオキシリボ核酸の分離方法J 、J、
Mad、 Bio)、 (分子生物学ジャーナル) 、
3: 208−218゜14、Palmer、 L、
、 S、 Falkow及びり、 Klevan共著、
1986年、[クラミジア・トラコマチスの18sリポ
ソームRNA遺伝子J p89−91 。
Jn、: p、 Qri61. G、 11dgway
、 J、 5chachter。
、 J、 5chachter。
D、 Taylor−Robinson及びM、 Wa
rd(刊行)、「クラミジア感染J 、 Cambri
dge University Press。
rd(刊行)、「クラミジア感染J 、 Cambri
dge University Press。
イギリス、ケンブリッジ。
15、 Riou、 J、 Y、、 M、 Guibo
urdenche及びM、 Y。
urdenche及びM、 Y。
Popoff共著、1983年、「デイセリア属内の新
しい分類群J 、 Ann、 Microbio)、
(Inst、 Pa5teur1134B: 257−
267 。
しい分類群J 、 Ann、 Microbio)、
(Inst、 Pa5teur1134B: 257−
267 。
16、Rossau、 R,、A、 Van La
ndschoot、 W。
ndschoot、 W。
Mannheim及びJ、 Deley共著、1986
年、「デイセリア科のリポソームリボ核酸シストロンの
居間及び属内類似性J 、 Int、 J、 5yst
、 Bacteriol。
年、「デイセリア科のリポソームリボ核酸シストロンの
居間及び属内類似性J 、 Int、 J、 5yst
、 Bacteriol。
36: 323−332 。
17、 Wayne、 L、 G、、 D、
J、 Brenner、 R,R。
J、 Brenner、 R,R。
(:olwe11、 P、 A、 D、 Grimon
t、 O,Kandler、 M)、 Kr1che
vsky、 L、 H,Moore、 W、
E、 C。
t、 O,Kandler、 M)、 Kr1che
vsky、 L、 H,Moore、 W、
E、 C。
Moore、 R,G、 E、 Murray、 E、
StackbrandtM、 P、 5tarr、及
びH,G、 Truper共著、1987年。
StackbrandtM、 P、 5tarr、及
びH,G、 Truper共著、1987年。
[細菌系統学に対するアプローチの一致に関する特別委
員会の報告書J 、 Int、 J、 5ystBac
terio1.37: 463−464゜18、 Wi
lkinson−、H,W、 J、 S、 Sampt
on、及びB。
員会の報告書J 、 Int、 J、 5ystBac
terio1.37: 463−464゜18、 Wi
lkinson−、H,W、 J、 S、 Sampt
on、及びB。
B、 P11kaytis共著、1986年、「レジオ
ネラ培養の識別のための市販の遺伝子プローブの評価J
、 J、 Cl1n、 Microbio)、 23
: 217−220゜19、 Woese、 C,R,
、E、 Gute11、 R,Gupta、及びHoF
、 No11er、共著、1983年。「16s様のリ
ポソームリボ核酸の高位構造の詳細な分析」。
ネラ培養の識別のための市販の遺伝子プローブの評価J
、 J、 Cl1n、 Microbio)、 23
: 217−220゜19、 Woese、 C,R,
、E、 Gute11、 R,Gupta、及びHoF
、 No11er、共著、1983年。「16s様のリ
ポソームリボ核酸の高位構造の詳細な分析」。
Microbio)、 Rev、(微生物字詰) 、
47: 621−669゜20、 Yang、 D、、
Y、 0yaizu、 H,0yaizu、 G、
J。
47: 621−669゜20、 Yang、 D、、
Y、 0yaizu、 H,0yaizu、 G、
J。
01sen及びC,R,Woese共著、1985年、
[ミトコンドリア起源J 、Proc、 Nat)、
Acad、 5cit1.s、A、 82: 4443
−4447゜
[ミトコンドリア起源J 、Proc、 Nat)、
Acad、 5cit1.s、A、 82: 4443
−4447゜
第1図は、DNAプローブが構築され大腸菌の16s
rRNA2次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている。 第2図は、シュードモナス・テストステロニATCC1
1996の相応する配列及び大腸菌の相応する配列と整
列させられた、本発明に従ったプローブNo、 1 、
No、2 、 No、3. No、4. No、5
、 No、6及びNo、 9の相補的配列を表わしてい
る。 第3図は、相応する大腸菌配列と整列させられた、23
s rRNA遺伝子から誘導されたプローブNo、7
. No、8. No、10及びN011の相補性配列
を示している。 第4図、第5図、第6図及び第7図は、交雑結果を示す
ラジオオートグラフである。 第10図には、高められた特異性をもつサンドイッチ交
雑検定が示されている。 第11図は、デイセリア・ゴル工の予定の16s r
RNA組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。 第12図は、本発明のプローブが大腸菌の23s r
RNA二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている。 第13図、第14図、第15図、第16図。 第17図、第18図もさまざまな交雑結果を表わしてい
る。 第1 洗浄温度 (’C) 第7 図 沫 プローブ: Yr(@c) : vr (”c) : n”3 n@5 n@6 図 n” 7 プローブ861;i! プローブNO HT: 456C 第13図 ブローブエおよびプローブIIは標的核酸(A)と交雑
する。標識付けされたプローブは固定される。a11剣
ま陽性である。 一一一一一一一一一 プローブIは生体Bからの核酸と交雑するがプローブI
fはしない。標識づけされたプローブは固定される。い
かなる信号もない:すなわち、刻剣ま陰性である。 −一一一一一一一う− 生体Cからの核酸は固定されない。従って標識づけされ
たプローブは固定されない。いかなる信号もない:すな
わち、試験は陰性である。 第10図 第14図 1、 デイセリア・ゴル工 (Neisseria gonorrhoeaelナイ
セリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴル工 N(TC’ 8375” ITG 4339 ITG 4085 ITG 4308 ITG 3939 ITG 4363 ITG 4367 ITG 4401 1TG 4437 13゜ デイセリア・メニンシティディス (Neisseria meningitidis)N
CTC10025” 手 続 補 正 書 (方式) %式%:5 事件の表示 平成1年特許願第 93236号 2、発明の名称 ブイセリア菌株を検出するための交雑プローブ3、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 名称 エヌ・ブイ・インノジェネティクス会ソシエテ
・アノニム 4、代 理 人 第18図 5、補正命令の日付 平成1年7月25日 6、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄及び図面(1)明細書の
図面の簡単な説明の欄 明細書第126頁第5行目と第6行目の間に以下の記載
を挿入する。 「第8図は、図中番号が大腸菌の16srRNA配列を
示している大腸菌の163rRA分子を表わしている。 第9図は、図中番号が大腸菌の23S rRNA配列を示している大腸菌の23SrRNA分子
を表わしている。」 く= 1.5@口 =口 <− ロ10 コlコ くコ 口1Ic5 0く 一■− 一■コ 一り く −く Uコ ロ−c3 く■く く C −く U■ Q 口■ロ コ層コ U■Q く− 口l口 υ−U 口l口 4+1 ロ −一 −く く■く −く 一■− く− (2)図面において、第2図〜第5図、第8図及び第1
1図〜第15図を、別紙のとおり補正する。 一り く 一■− コー 口l口 く■く 口く く 中 口 に) 法 hO: 30口口 こロココ (り χ =凹トコ ζ=11D 淀百品 瞭 =[口] ル80口] Ox:口 冨 χ 田 ■
rRNA2次構造について用いられた対象である領域
の割当てを表わしている。 第2図は、シュードモナス・テストステロニATCC1
1996の相応する配列及び大腸菌の相応する配列と整
列させられた、本発明に従ったプローブNo、 1 、
No、2 、 No、3. No、4. No、5
、 No、6及びNo、 9の相補的配列を表わしてい
る。 第3図は、相応する大腸菌配列と整列させられた、23
s rRNA遺伝子から誘導されたプローブNo、7
. No、8. No、10及びN011の相補性配列
を示している。 第4図、第5図、第6図及び第7図は、交雑結果を示す
ラジオオートグラフである。 第10図には、高められた特異性をもつサンドイッチ交
雑検定が示されている。 第11図は、デイセリア・ゴル工の予定の16s r
RNA組換え型構造上で本発明に基づくプローブが構成
されたもとである領域の割当てを示している。 第12図は、本発明のプローブが大腸菌の23s r
RNA二次構造上で構成されたもとである領域の割当て
を表わしている。 第13図、第14図、第15図、第16図。 第17図、第18図もさまざまな交雑結果を表わしてい
る。 第1 洗浄温度 (’C) 第7 図 沫 プローブ: Yr(@c) : vr (”c) : n”3 n@5 n@6 図 n” 7 プローブ861;i! プローブNO HT: 456C 第13図 ブローブエおよびプローブIIは標的核酸(A)と交雑
する。標識付けされたプローブは固定される。a11剣
ま陽性である。 一一一一一一一一一 プローブIは生体Bからの核酸と交雑するがプローブI
fはしない。標識づけされたプローブは固定される。い
かなる信号もない:すなわち、刻剣ま陰性である。 −一一一一一一一う− 生体Cからの核酸は固定されない。従って標識づけされ
たプローブは固定されない。いかなる信号もない:すな
わち、試験は陰性である。 第10図 第14図 1、 デイセリア・ゴル工 (Neisseria gonorrhoeaelナイ
セリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴルエ デイセリア・ゴル工 N(TC’ 8375” ITG 4339 ITG 4085 ITG 4308 ITG 3939 ITG 4363 ITG 4367 ITG 4401 1TG 4437 13゜ デイセリア・メニンシティディス (Neisseria meningitidis)N
CTC10025” 手 続 補 正 書 (方式) %式%:5 事件の表示 平成1年特許願第 93236号 2、発明の名称 ブイセリア菌株を検出するための交雑プローブ3、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 名称 エヌ・ブイ・インノジェネティクス会ソシエテ
・アノニム 4、代 理 人 第18図 5、補正命令の日付 平成1年7月25日 6、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄及び図面(1)明細書の
図面の簡単な説明の欄 明細書第126頁第5行目と第6行目の間に以下の記載
を挿入する。 「第8図は、図中番号が大腸菌の16srRNA配列を
示している大腸菌の163rRA分子を表わしている。 第9図は、図中番号が大腸菌の23S rRNA配列を示している大腸菌の23SrRNA分子
を表わしている。」 く= 1.5@口 =口 <− ロ10 コlコ くコ 口1Ic5 0く 一■− 一■コ 一り く −く Uコ ロ−c3 く■く く C −く U■ Q 口■ロ コ層コ U■Q く− 口l口 υ−U 口l口 4+1 ロ −一 −く く■く −く 一■− く− (2)図面において、第2図〜第5図、第8図及び第1
1図〜第15図を、別紙のとおり補正する。 一り く 一■− コー 口l口 く■く 口く く 中 口 に) 法 hO: 30口口 こロココ (り χ =凹トコ ζ=11D 淀百品 瞭 =[口] ル80口] Ox:口 冨 χ 田 ■
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)単数又は複数のナイセリア菌株を検出するための
プローブにおいて、 −以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核酸に属
し、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数までのヌ
クレオチドで構成されている配列; 【遺伝子配列があります。】 −又は 単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれ の末端のいずれかへの付加又はそれからの除去による、 或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、 前記配列のいずれかの内部における変更による、 又はその両方による、 上述の配列(4)から(18)までのいずれとも異なる
変形配列; (ただし前記いずれの状況の下でもなお、当該プローブ
は相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的と交
雑する) を含むことを特徴とするプローブ。 (2)−以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核
酸に属し、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数ま
でのヌクレオチドで構成されている配列; 【遺伝子配列があります。】 −又は、 ・単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のい
ずれかへの付加又はこれからの除去による ・或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列の
いずれかの内部における変更による、 ・又はその両方による、 上述の配列(1)から(18)までのいずれとも異なる
変形配列、 (ただし前記いずれの状況においてもなお、当該プロー
ブは相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的と
交雑する)、 を含むことを特徴とする請求項(1)に記載のプローブ
。 (3)交雑媒質又は洗浄媒質或いは場合によってその両
方が以下のものであるとき、以下に規定する配列又は相
応する相補性配列の1つを標的とする、単数または複数
のナイセリア菌株を検出するプローブにおいて: −交雑媒質:約3×SSC(SSC=0.15MのNa
Cl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7.5
)、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7.1、20%の
脱イオンホルムアミド、0.02%のフィコール、0.
02%のウシ血清アルブミン、0.02%のポリビニル
ピロリドン及び約0.1mg/mlのせん断され変性さ
れたサケ精子DNAを含む、 −洗浄媒質;約3×SSC、25mMのリン酸塩緩衝液
pH7.1、及び20%の脱イオンホルムアミドを含む
、 前記標的配列及び相応する関連交雑温度 (HT)及び洗浄温度(WT)がそれぞれ以下のとおり
であることを特徴とするプローブ: 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約55℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約60℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約60℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約65℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約55℃から約60℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約65℃から約70℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約55℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約55℃から約60℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約55℃から約60℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約60℃から約65℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約55℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約55℃から約60℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約45℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約40℃から約45℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約50℃から約55℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約50℃から約60℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約50℃から約55℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約45℃ (4)単数又は複数のナイセリア・ゴノレエ(Neis
seria gonorrhoeae)菌株をその他の
細菌株から特にその他のナイセリア菌株から検出するた
めのプローブにおいて、 −以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核酸に属
し、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数までのヌ
クレオチドで構成されている配列; 【遺伝子配列があります。】 −又は ・単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のい
ずれかへの付加又はそれからの除去による、 ・或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列の
いずれかの内部における変更による、 ・又はその両方による、 上述の配列(4)から(18)までのいずれとも異なる
変形配列: (ただし前記いずれの状況の下でもなお、当該プローブ
は相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的と交
雑する) を含むことを特徴とするプローブ。 (5)単数又は複数のナイセリア・ゴノレエ菌株をその
他の細菌株特にその他のナイセリア菌株から検出するた
めのプローブにおいて、 −以下の核酸グループの中から選ばれた1つの核酸に属
し、それ自体選ばれた核酸の10個から最大数までのヌ
クレオチドで構成されている配列: 【遺伝子配列があります。】 (ただし、TCA TCG GCC GCC GAT
ATT GGCという配列では構成されていない) −又は ・単数又は数個のヌクレオチドの、それぞれの末端のい
ずれかへの付加又はそれからの除去による、 ・或いは、単数又は複数のヌクレオチドの、前記配列の
いずれかの内部における変更による、 ・又はその両方による、 上述の配列(4)から(18)までのいずれとも異なる
変形配列; (ただし前記いずれの状況の下でもなお、当該プローブ
は相応する未変更配列と同じRNA又はDNA標的と交
雑する) を含むことを特徴とするプローブ。 (6)交雑媒質又は洗浄媒質或いは場合によってその両
方が以下のものであるとき、以下に規定する配列又は相
応する相補性配列の1つを標的とする、単数または複数
のナイセリア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特にその
他のナイセリア菌の中から検出するプローブにおいて: −交雑媒質;約3×SSC(SSC=0.15MのNa
Cl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7.0
)、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7.1、20%の
脱イオンホルムアミド、0.02%のフィコール、0.
02%のウシ血清アルブミン、0.02%のポリビニル
ピロリドン、及び約0.1mg/mlのせん断され変性
されたサケ精子DNAを含む、 −洗浄媒質:約3×SSC、25mMのリン酸塩緩衝液
pH7.1、及び20%の脱イオンホルムアミドを含む
、 前記標的配列及び相応する関連交雑温度 (HT)及び洗浄温度(WT)がそれぞれ以下のとおり
であることを特徴とするプローブ: 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約50℃から約65℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約60℃から約70℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約65℃から約70℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約70℃から約75℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約65℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約65℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約65℃ 【遺伝子配列があります。】 HT及び/又はWT:約50℃から約55℃【遺伝子配
列があります。】 HT及び/又はWT:約60℃ (7)生物学的試料内でナイセリア菌株を他の細菌株か
ら検出するための方法において、かかる方法には、試料
中に存在しうるナイセリア菌株の相補性核酸とプローブ
の間の交雑を可能にする条件の下で、請求項(1)乃至
(6)のいずれか1つに従ったプローブを、適切な変性
条件の下で必要とあらば菌株の核酸(DNA及びRNA
)が交雑に対しアクセス可能な状態にされている前記生
物学的試料と接触させる作業が含まれていることを特徴
とする方法。 (8)使用されるプローブは、生物学的試料内に存在し
うるナイセリア菌株のDNA及びRNAと両方共交雑す
るものであることを特徴とする、請求項(7)に記載の
生物学的試料内で他の細菌株からナイセリア菌株を検出
するための方法。 (9)交雑媒質には、約3×SSC(SSC=0.15
MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、p
H7.0)、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7.1、
20%の脱イオンホルムアミド、0.02%のフィコー
ル、0.02%のウシ血清アルブミン、0.02%のポ
リビニルピロリドン、及び約0.1mg/mlのせん断
され変性されたサケ精子DNAが含まれること、又は洗
浄媒質:約3×SSC、25mMのリン酸塩緩衝液pH
7.1、及び20%の脱イオンホルムアミドが含まれて
いること、そして使用されるプローブは、請求項(2)
に記載のプローブ(1)、(1bis)、(1ter)
又は(1quater)のいずれか(なお交雑温度は約
55℃好ましくは約53℃の範囲にそして/又は洗浄温
度が約55℃好ましくは約53℃の範囲に適切に調整さ
れている):又は、請求項(2)に記載のプローブ(2
)、(2bis)、(2ter)又は(2quater
)のいずれか(なお交雑温度は約60℃の範囲にそして
/又は洗浄温度が約60℃の範囲に適切に調整されてい
る);又は、請求項(2)に記載のプローブ(3)、(
3bis)、(3ter)又は(3quater)のい
ずれか(なお交雑温度は約60℃の範囲にそして/又は
洗浄温度が約60℃の範囲に適切に調整されている);
又は、請求項(2)に記載のプローブ(4)、(4bi
s)、(4ter)又は(4quater)のいずれか
(なお交雑温度は約65℃の範囲にそして/又は洗浄温
度が約65℃の範囲に適切に調整されている);又は、
請求項(2)に記載のプローブ(5)、(5bis)、
(5ter)又は(5quater)のいずれか(なお
交雑温度は約55℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約
55℃の範囲に適切に調整されている);又は、請求項
(2)に記載のプローブ(9)、(9bis)、(9t
er)又は(9quater)のいずれか(なお交雑温
度は約60℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約60℃
の範囲に適切に調整されている);又は、請求項(2)
に記載のプローブ(6)、(6bis)、(6ter)
又は(6quater)のいずれか(なお交雑温度は約
65℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約65℃から約
70℃の範囲に適切に調整されている);又は、請求項
(2)に記載のプローブ(7)、(7bis)、(7t
er)又は(7quater)のいずれか(なお交雑温
度は約55℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約55℃
の範囲に適切に調整されている);又は、請求項(2)
に記載のプローブ(8)、(8bis)、(8ter)
又は(8quater)のいずれか(なお交雑温度は約
55℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約55℃の範囲
に適切に調整されている);又は、請求項(2)に記載
のプローブ(10)、(10bis)、(10ter)
又は(10quater)のいずれか(なお交雑温度は
約55℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約55℃から
約60℃の範囲に適切に調整されている);又は、請求
項(2)に記載のプローブ(11)、(11bis)、
(11ter)又は(11quater)のいずれか(
なお交雑温度は約55℃にそして/又は洗浄温度が約5
5℃に適切に調整されている);又は、請求項(2)に
記載のプローブ(12)、(12bis)、(12te
r)又は(12quater)のいずれか(なお交雑温
度は約55℃から約60℃の範囲にそして/又は洗浄温
度が約55℃から約60℃の範囲に適切に調整されてい
る);又は、請求項(2)に記載のプローブ(13)、
(13bis)、(13ter)又は(13quate
r)のいずれか(なお交雑温度は約45℃の範囲にそし
て/又は洗浄温度が約45℃の範囲に適切に調整されて
いる);又は、請求項(2)に記載のプローブ(14)
、(14bis)、(14ter)又は(14quat
er)のいずれか(なお交雑温度は約40℃から約45
℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約40℃から約45
℃の範囲に適切に調整されている);又は、請求項(2
)に記載のプローブ(15)、(15bis)、(15
ter)又は(15quater)のいずれか(なお交
雑温度は約50℃から約55℃の範囲にそして/又は洗
浄温度が約50℃から約55℃の範囲に適切に調整され
ている);又は、請求項(2)に記載のプローブ(16
)、(16bis)、(16ter)又は(16qua
ter)のいずれか(なお交雑温度は約50℃から約6
0℃の範囲にそして/又は洗浄温度が約50℃から約6
00℃の範囲に適切に調整されている);又は、請求項
(2)に記載のプローブ(17)、(17bis)、(
17ter)又は(17quater)のいずれか(な
お交雑温度は約50℃から約55℃の範囲にそして/又
は洗浄温度が約50℃から約55℃の範囲に適切に調整
されている);又は、請求項(2)に記載のプローブ(
18)、(18bis)、(18ter)又は(18q
uater)のいずれか(なお交雑温度は約45℃の範
囲にそして/又は洗浄温度が約45℃の範囲に適切に調
整されている)であることを特徴とする、請求項(7)
又は(8)に記載のナイセリア菌株をその他の細菌株か
ら検出するための方法。 (10)ナイセリア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特
にその他のナイセリア菌株から検出するための方法にお
いて、その他のナイセリア菌株の相補性DNA又はRN
Aとではなく、試料中に存在しうるナリセリア・ゴノレ
エ菌株の相補性核酸との特異的交雑を確実にするように
調整された交雑・洗浄条件の下で必要とされる場合つね
に、請求項(2)に記載のプローブ(1)、(1bis
)、(1ter)、(1quater)、(2)、(2
bis)、(2ter)、(2quater)、(3)
、(3bis)、(3ter)、(3quater)、
(4)、(4bis)、(4ter)、(4quate
r)、(5)、(5bis)、(5ter)、(5qu
ater)、(9)、(9bis)、(9ter)、(
9quater)、(11)、(11bis)、(11
ter)、(11quater)、(13)、(13b
is)、(13ter)、(13quater)、(1
8)、(18bis)、(18ter)及び(18qu
ater)の中から選択されたナイセリア、ゴノレエ菌
株に特異的な本発明に基づくプローブを、適切な変性条
件下で必要とあらば核酸(DNA及びRNA)が交雑に
対してアクセス可能な状態にされているような前記生物
学的試料と接触させる段階、そして形成される可能性の
ある雑種を検出する段階が含まれていることを特徴とす
る方法。 (11)交雑媒質には約3×SSC(SSC=0.15
MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、p
H7.0)、約25mMのリン酸塩緩衝液pH7.1、
20%の脱イオンホルムアミド、0.02%のフィコー
ル、0.02%のウシ血清アルブミン、0.02%のポ
リビニルピロリドン、及び約0.1mg/mlのせん断
され変性されたサケ精液DNAが含まれていること又は
洗浄媒質には約3×SSC、25mMのリン酸塩緩衝液
pH7.1、及び20%の脱イオンホルムアミドが含ま
れていること、そして使用されるプローブは、請求項(
2)に記載のプローブ(1)、(1bis)、(1te
r)又は(1quater)のいずれか(なお交雑温度
は約55℃好ましくは約53℃の範囲にそして/又は洗
浄温度が約55℃から約65℃まで好ましくは約53℃
から約65℃までの範囲に適切に調整されている);又
は、請求項(2)に記載のプローブ(2)、(2bis
)、(2ter)又は(2quater)のいずれか(
なお交雑温度は約60℃の範囲にそして/又は洗浄温度
は約65℃から約70℃までの範囲に適切に調整されて
いる);又は、請求項(2)に記載のプローブ(3)、
(3bis)、(3ter)又は(3quater)の
いずれか(なお、交雑温度は約60℃の範囲にそして/
又は洗浄温度は約65℃から約70℃の範囲に適切に調
整されている);又は、請求項(2)に記載のプローブ
(4)、(4bis)、(4ter)又は(4quat
er)のいずれか(なお交雑温度は約65℃の範囲にそ
して/及び洗浄温度は約70℃から約75℃の範囲に適
切に調整されている);又は、請求項(2)に記載のプ
ローブ(5)、(5bis)、(5ter)又は(5q
uater)のいずれか(なお交雑温度は約60℃の範
囲にそして/又は洗浄温度は約65℃の範囲に適切に調
整されている);又は、請求項(2)に記載のプローブ
(9)、(9bis)、(9ter)又は(9quat
er)のいずれか(なお交雑温度は約60℃から約65
℃の範囲にそして/又は洗浄温度は約65℃の範囲に適
切に調整されている)、又さらに好ましくは、請求項(
2)に記載のプローブ(1)、(1bis)、(1te
r)又は(1quater)のいずれか(なお交雑温度
は約55℃の範囲にそして/又は洗浄温度は約55℃か
ら約65℃の範囲に適切に調整されている);又は、請
求項(2)に記載のプローブ(11)、(11bis)
、(11ter)又は(11quater)のいずれか
(なお交雑温度は約65℃にそして/又は洗浄温度は約
65℃に適切に調整されている);又は、請求項(2)
に記載のプローブ(13)、(13bis)、(13t
er)又は(13quater)のいずれか(なお交雑
温度は約50℃から約55℃の範囲にそして/又は洗浄
温度は約50℃から約55℃の範囲に適切に調整されて
いる);或いは又請求項(2)に記載のプローブ(18
)、(18bis)、(18ter)又は(18qua
ter)のいずれか(なお交雑温度は約60℃にそして
/又は洗浄温度は約60℃に適切に調整されている)で
あることを特徴とする、請求項(10)に記載のナイセ
リア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特にその他のナイ
セリア菌株から検出するための方法。 (12)生物学的試料内のナイセリア菌株を大部分好ま
しくは全て試験管内で検出するためのキットにおいて、 −請求項(1)乃至(4)に記載のものの中から選択さ
れた少なくとも1つのプローブ; −これらのプローブと、大部分好ましくは全てのナイセ
リア菌株のDNA及び/又はRNAの間の交雑反応が行
なわれうるようにするような緩衝液又はそれを作るのに
必要な構成成分;−該当する場合には、先行する交雑の
結果得られた雑種を検出するための手段、 が含まれていることを特徴とするキット。 (13)生物学的試料内のナイセリア・ゴノレエ菌株を
試験管内で検出するためのキットにおいて、 −請求項(2)に記載のプローブ(2)、 (2bis)、(2ter)、(2quater)、(
3)、(3bis)、(3ter)、(3quater
)、(4)、(4bis)、(4ter)、(4qua
ter)、(5)、(5bis)、(5ter)、(5
quater)、(9)、(9bis)、(9ter)
、(9quater)、(11)、(11bis)、(
11ter)、(11quater)、(13)、(1
3bis)、(13ter)、(13quater)、
(18)、(18bis)、(18ter)、(18q
uater)の中から選択されたプローブ好ましくは請
求項(2)に記載のプローブ (1)、(1bis)、(1ter)又は(1quat
er)のいずれかの中から選ばれたプローブといったよ
うな上述のナイセリア・ゴノレエに特異的な少なくとも
1つのプローブ; −これらのプローブとナイセリア・ゴノレエ菌株のDN
A及び/又はRNAの間の交雑反応を行なうことができ
るようにするような緩衝液又はそれを作るのに必要な構
成成分; −該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種
を検出するための手段; が含まれていることを特徴とするキット。 (14)ナイセリア・ゴノレエ菌株をその他の細菌株特
にその他のナイセリア菌株から検出するための方法にお
いて、かかる方法には、その他のナイセリア菌種の相補
性DNA又はRNAとは交雑せず、試料中に存在しうる
ナイセリア・ゴノレエ菌株の相補性核酸と特異的に交雑
するように調整された交雑及び洗浄条件の下で必要とさ
れる場合にはつねに、 −グループ9のプローブとグループ1、2、3、5及び
13のプローブのうちのいずれか−グループ13のプロ
ーブとグループ1、2、3、及び5のプローブのうちの
いずれか −グループ18のプローブとグループ1、2、3、5、
9及び13のプローブのうちのいずれか −グループ5のプローブとグループ1、2、及び3のプ
ローブのうちのいずれか といった組合せの中から選択された、そしてさらに好ま
しくは、 −グループ9のプローブとグループ5のプローブ −グループ18のプローブとグループ5及び9のプロー
ブのうちの1つ といった組合せの中から選択された、 ナイセリア・ゴノレエ菌種に特異的でかつそれぞれ同じ
非標的菌種に対し交雑することのできない請求項(1)
乃至(6)のいずれかに記載の2つのプローブと、必要
とあらば適切な変性条件の下で核酸(DNA及びRNA
)が交雑に対しアクセス可能な状態にされる前記生物学
的試料を接触させる作業及び形成されうる雑種を検出す
る作業が含まれていることを特徴とする方法。 (15)生物学的試料内のナイセリア・ゴノレエ菌種を
試験管内で検出するための、サンドイッチ交雑検定用キ
ットにおいて、 −・グループ9のプローブとグループ1、2、3、5及
び13のプローブのうちのいずれ か ・グループ13のプローブとグループ1、 2、3及び5のプローブのうちのいずれか ・グループ18のプローブとグループ1、 2、3、5、9及び13のプローブのうちのいずれか グループ5のプローブとグループ1、2及 び3のプローブのうちのいずれか といった組合せの中から選択された、さらに好ましくは
、 ・グループ9のプローブとグループ5のプ ローブ ・グループ18のプローブとグループ5及び9のプロー
ブのいずれか1つ といった組合せの中から選択されたナイセリア・ゴノレ
エに特異的な少なくとも2つのプローブ; −これらのプローブと、ナイセリア・ゴノレエのDNA
及び/又はRNAの間の交雑反応が行なわれうるように
する緩衝液又はこの緩衝液を作るのに必要な構成成分; −該当する場合には、先行する交雑の結果得られた雑種
を検出するための手段 が含まれていることを特徴とするキット。
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JP2016198018A (ja) * | 2015-04-08 | 2016-12-01 | 東ソー株式会社 | 淋菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび当該プライマーを用いた淋菌の検出方法 |
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