JP2003511015A - 高度に保存された遺伝子、および種特異的、属特異的、科特異的、群特異的および普遍的核酸プローブおよび増幅プライマーを発生させて、診断の臨床検体からの藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の微生物を急速に検出しかつ同定するためのそれらの使用 - Google Patents

高度に保存された遺伝子、および種特異的、属特異的、科特異的、群特異的および普遍的核酸プローブおよび増幅プライマーを発生させて、診断の臨床検体からの藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の微生物を急速に検出しかつ同定するためのそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】 翻訳伸長因子Ｔｕ、翻訳伸長因子Ｇ、プロトン転位ＡＴＰアーゼのサブユニットおよびｒｅｃＡリコンビナーゼをコードする、４つの高度に保存された遺伝子を使用して、配列レパートリーまたはバンクおよび種特異的、属特異的、科特異的、群特異的および普遍的核酸プローブおよび増幅プライマーを発生させて、診断検体からの藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の微生物を急速に検出しかつ同定する。また、関連する抗菌剤耐性遺伝子およびトキシン遺伝子の検出は本発明の範囲内に入る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 微生物の古典的同定方法 古典的には、生化学的試験、例えば、API20ETMシステム（bioM rieux）を使用
して、炭素および窒素源として異なる基質を利用する微生物の能力により、微生
物は同定される。感受性試験のために、臨床微生物実験室において、ディスク拡
散、寒天希釈およびブロス微小希釈を包含する方法を使用する。生化学的試験お
よび抗菌感受性試験に基づく同定は原価効率であるが、臨床検体から細菌を同定
するために、ならびに抗菌剤に対する細菌の感受性を測定するために、連続2夜
のインキュベーションを必要とするために、予備的結果を得るために一般に2日
間を必要とする。
【０００２】 いくつかの商業的に入手可能な自動化システム（すなわち、MicroScanTMシス
テム、Dade Behring製およびVitekTMシステム、bioM rieux製）が存在し、これ
らは微生物の同定および感受性試験をよく速くするために、複雑化した高価な装
置を使用する（StagerおよびDavis、1992、Clin. Microbiol. Rev. 5：302−
327）。これらのシステムはより短いインキュベーション期間を必要とし、これ
により大部分の細菌同定および感受性試験を6時間より短い時間で実行すること
ができる。
【０００３】 それにもかかわらず、これらのより速いシステムは、純粋な培養物として細菌
または真菌の一次的単離を常に必要とし、そのプロセスは精製培養のために少な
くとも18時間または混合培養のために少なくとも2日間を要する。それゆえ、酵
母以外の真菌は臨床検体から増殖することがしばしば困難であるか、あるいは非
常に時間を要する。同定は労力を要する技術、例えば、検体の直接的顕微鏡検査
および直接的および／または間接的免疫学的アッセイに頼らなくてはならない。
大部分の寄生生物の培養は臨床的実験室において実際的ではない。それゆえ、検
体の顕微鏡検査、わずかの免疫学的試験および臨床的症状はしばしば頻繁に推定
的に止まる同定に使用される唯一の方法である。
【０００４】 最も速い細菌同定システム、autoSCAN−Walk−AwayTMシステム（Dade Behrin
g）は、標準化接種物からグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方の種を2時
間程度に短い時間で同定し、大部分の抗生物質に対して感受性パターンを5〜6時
間で与える。しかしながら、このシステムは腸内細菌科（Enterobacteriaceae）
以外の細菌種を使用して非決定的同定の特に高い百分率（すなわち、3.3〜40.5
％）を有する（Croiz J.、1995、Lett. Infectiol. 10：109−113；York他
、1992、J. Clin. Microbiol. 30：2903−2910）。腸内細菌科（Enterobacte
riaceae）について、非決定的同定の百分率は2.7〜11.4％である。古典的同定法
に基づく商業的システムにより同定される微生物の列挙は第15表に記載されてい
る。
【０００５】 広範な種類の細菌および真菌は、微生物学実験室において臨床検体から日常的
に単離され、同定される。種々のタイプの臨床検体からの大部分の普通に単離さ
れた細菌および真菌の病原体についての発生率は、第1表および第2表に記載され
ている。これらの病原体は院内および地域獲得性ヒト感染に関連する主要な生物
であり、したがって最も臨床的に重要であると考えられている。
【０００６】 臨床微生物学実験室において試験された臨床検体 臨床微生物学実験室において受け取られる大部分の臨床検体は、Centre Hosp
italier de l'Universit Laval（CHUL）の微生物学実験室において、尿およ
び血液は受け取った検体の、それぞれ、ほぼ55％および30％の割合を占める（第
3表）。臨床検体の残りの15％は種々の生物学的流体、例えば、痰、膿、脳脊髄
液、滑液、およびその他を含んでなる（第3表）。尿路、気道および血流の感染
は通常細菌の病因学であり、抗菌療法を必要とする。事実、臨床微生物学実験室
において受け取られたすべての臨床試料は日常的に細菌の同定および抗生物質の
感受性について試験される。
【０００７】 臨床検体からの慣習的病原体同定 尿検体 尿検体中の病原体についての探索は日常的微生物学実験室において非常に優位
を占めるので、多数の試験が開発されてきている。金標準は古典的半定量的平板
培養法に止まり、ここで1μlの尿を寒天平板上にストリークし、18〜24時間イン
キュベートする。次いでコロニーを計数して、尿1リットル当たりのコロニー形
成単位（CFU）の総数を決定する。細菌の尿路感染（UTI）は通常尿中の107CFU／
Lまたはそれ以上の細菌計数に関連する。
【０００８】 しかしながら、尿中107CFU／Lまたはそれより少ない感染は、特に発病率が高
い患者またはカテーテル挿入患者において、可能である（StarkおよびMaki、198
4、N. Engl. J. Med. 311：560−564）。重要なことには、臨床微生物学実
験室において試験した尿検体のほぼ80％は陰性と考えられる（すなわち、107CFU
／Lより少ない細菌計数；第3表）。培養により陽性であると見出される尿は細菌
病原体を同定する標準生化学的試験により特性決定され、また、抗生物質に対す
る感受性について試験される。生化学的および感受性試験は通常18〜24時間のイ
ンキュベーションを必要とする。
【０００９】 細菌病原体を正確かつ急速に尿をスクリーニングする方法は、陰性検体のより
速い同定および患者のより効率よい治療およびケアー管理を可能とするであろう
。いくつかの急速な同定方法（UriscreenTM、UTIscreenTM、Flash TrackTM DN
Aプローブおよびその他）は、細菌病原体の培養に基づく、より遅い標準生化学
的方法と比較されてきている。これらの急速試験は、非常により速いが、低い感
受性および劣った特異性ならびに多数の誤った陰性および誤った陽性の結果を示
した（Koening他、1992、J. Clin. Microbiol. 30：342−345；Pezzlo他、19
92、J. Clin. Microbiol. 30：640−684）。
【００１０】 血液検体 微生物学実験室が受け取る血液検体は常に培養に付される。血液培養システム
はマニュアル、半自動化または完全に自動化であることができる。BACTECTMシス
テム（Becton Dickinsonから）およびBacTAlertTMシステム（Organon Teknika Corporattionから）は、2つの最も広く使用されている自動化血液培養システ
ムである。これらのシステムは、大部分の細菌の最適な成長条件下に血液培養び
んをインキュベートする。高度に感受性の細菌成長検出器を使用することによっ
て、細菌増殖を連続的にモニターして初期陽性を検出する。
【００１１】 いったん増殖が検出されると、グラム染色を血液培養から直接実行し、次いで
栄養寒天平板を接種するために使用する。引き続いて、以前に記載されたように
自動化システムを使用して単離された細菌コロニーから、細菌同定および感受性
試験を実施する。6〜7日のインキュベーション後に増殖が検出されない場合、血
液培養びんは通常陰性と報告される。通常、ほとんど大部分の血液培養は陰性と
報告される。例えば、1994年2月〜1995年1月の期間の間CHULの微生物学実験室に
おける陰性血液培養の百分率は93.1％であった（第3表）。
【００１２】 他の臨床試料 臨床微生物学実験室により受け取られると、通常無菌部位（すなわち、脳脊髄
、滑液、胸膜、心臓周囲およびその他）からの血液および尿以外のすべての体液
を直接的顕微鏡検査についてプロセスし、引き続いて培養する。再び、大部分の
臨床試料は培養について陰性である（第3表）。すべてのこれらの無菌部位にお
いて、藻類、古細菌（archaea）、細菌、真菌および寄生生物の普遍的検出のた
めの試験は非常に有効である。
【００１３】 無菌部位からでない臨床検体、例えば、痰または糞便に関すると、培養による
実験室の診断は、通常のフローラによる汚染のために、問題である。感染に潜在
的に関連する細菌または真菌の病原体を増殖させ、選択的方法によりコロニー化
微生物から分離し、次いで以前に記載されたように同定する。もちろん、DNAに
基づく細菌の普遍的検出はこれらの非無菌部位における細菌感染の診断に有効で
ないであろう。他方において、種または属または科または群を検出および同定し
かつこれらの検体からの抗菌剤耐性遺伝子を検出するDNAに基づくアッセイは非
常に有効であり、そして古典的同定および感受性試験法を超えたいくつかの利点
を提供するであろう。
【００１４】 任意の検体を使用するDNAに基づくアッセイ 直接的に臨床検体から藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物を検出および
同定する、急速かつ正確な診断試験が明らかに必要とされている。DNAに基づく
技術は急速かつ正確であり、感染症の診断を改良する、大きい可能性を提供する
（Persing他、1993、Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications，American Society for Microbiology、ワシントンD.C.；Be
rgeronおよびOuellette、1995、Infection 23：69−72；BergeronおよびOuelle
tte、1998、J. Clin. Microbiol. 36：2169−72）。
【００１５】 本発明の目的であるDNAプローブおよび増幅プライマーは、任意の臨床検体、
例えば、血液、尿、痰、脳脊髄液、膿、性器および胃腸管、皮膚または任意の他
のタイプの検体から直接的に藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物を検出お
よび同定するために適用可能である（第3表）。また、これらのアッセイは微生
物培養物（例えば、血液培養物、栄養寒天上の細菌または真菌のコロニー、また
は栄養ブロス中の液体細胞培養物）からの検出に適用可能である。
【００１６】 本発明において提案されたDNAに基づく試験は、急速性および正確性の両方に
おいて、微生物学実験室において任意の臨床検体からの日常的診断に現在使用さ
れている標準的生化学的方法よりすぐれる。これらの試験は1時間以内で実行す
ることができるので、感染症を有する患者のよりすぐれた管理に寄与するであろ
う、新しい診断ツールを臨床医に提供する。ヒト以外の源からの検体（例えば、
他の霊長類、鳥類、植物、哺乳動物、農場動物、家畜、食物生産物、環境、例え
ば、水または土、およびその他）をこれらのアッセイにより試験することもでき
る。
【００１７】 培養陰性検体の高い百分率 日常的診断のために受け取る臨床検体のすべての間で、尿検体のほぼ80％およ
び他のタイプの通常の無菌的臨床検体についてなおそれより高い百分率（約95％
）は細菌病原体の存在について陰性である（第3表）。また、所定の検体におい
て種または属または科または群のレベルで細菌を同定することに加えて、任意の
細菌の存在を検出するDNAに基づく試験（すなわち、普遍的細菌検出）を使用し
て、高い比率の陰性臨床検体をスクリーニングすることは望ましいことがある。
【００１８】 本発明において開示するように、このようなスクリーニング試験はすべての細
菌の中に見出される高度に保存された遺伝学的ターゲットのPCRによるDNA増幅に
基づくことができる。細菌について陰性の検体はこのアッセイにより増幅されな
いであろう。他方において、任意の細菌について陽性である検体は陽性の増幅シ
グナルを与えるであろう。同様に、真菌および寄生生物の高度に保存された遺伝
子は特定の種または属または科または群を同定するばかりでなく、かつまた検体
中の任意の真菌または寄生生物の存在を検出する働きをすることができる。
【００１９】 急速なDNAに基づく診断試験の開発について 急速診断試験は感染管理に対して有意な衝撃を有すべきである。DNAプローブ
およびDNA増幅技術は、臨床試料から病原体抗菌剤耐性遺伝子を同定する慣用法
を超えた、いくつかの利点を提供する（Persing他、1993、Diagnostic Molecul
ar Microbiology：Principles and Applications，American Society for Microbiology、ワシントンD.C.；EhrlichおよびGreenberg、1994、PCR−based Diagnostics in Infections Disease、Blackwell Scientific Publicati
ons、マサチュセッツ州ボストン）。病原体培養の必要性が存在しないので、生
物を臨床試料から直接検出することができ、これにより病原体の単離および同定
に関連する時間を短縮することができる。
【００２０】 さらに、DNAに基づくアッセイは、生化学的試験および／または顕微鏡検査に
基づく、現在使用されている表現型同定システムよりも、微生物同定についてい
っそう正確である。商業的に入手可能なDNAに基づく技術は、主として選好性細
菌病原体、例えば、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、トラコー
マクラミジア（Chlamydia trachomatis）、淋菌（Neisseria gonorrhaeae）の
直接的または間接的のために、ならびに種々のウイルスの検出のために、臨床微
生物学実験室において現在使用されている（Tang Y.およびPersing D. H.、M
olecular detｅction and identification of microoｒganisms、In：P.
Murray他、1999、Manual of Clinical Microbiology、ASM press、第7版、
ワシントンD.C.）。また、培養確証アッセイに使用する、他の商業的に入手可能
なDNAに基づくアッセイが存在する。
【００２１】 本発明の目的である細菌病原体、例えば、スタヒロコッカス（Staphylococcus
）種（米国特許第5,437,978号）、ナイセリア（Neisseria）種（米国特許第5,16
2,199号およびEP 0,337,896,131）およびリステリア菌（Listeria monocytoge
nes）（米国特許第5,389,513号および米国特許第5,089,386号）の検出および同
定のためのDNAに基づく試験が開発された。これらの特許に記載されている診断
試験はrRNA遺伝子に基づくか、あるいは本発明において記載するものと異なる遺
伝学的ターゲットに基づく。我々の知る限りでは、診断目的で本発明において記
載する4つの高度に保存された遺伝子ターゲットのいずれかの使用を述べている
他の研究者らにより発表された4件の特許が存在するだけである（PCT国際出願WO 92／03455およびWO 00／14274、EP 0 133 671 B1、およびEP 0 133 2
88 A2）。
【００２２】 WO 92／03455は療法上の目的でカンジダ（Candida）種の同定に集中されてい
る。それには、カンジダ（Candida）メッセンジャーRNAに対してハイブリダイゼ
ーションするアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブが記載されている。ター
ゲットとして提案されている多数のmRNAのうちの2つは、翻訳伸長因子1（tef1）
およびATPアーゼのベータサブユニットをコードする。DNAの増幅またはハイブリ
ダイゼーションは彼らの発明の範囲内でなく、診断的使用は出願の中に簡単に述
べられているが、診断に関して特に特許請求されていない。
【００２３】 WO 00／14274には、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）
複合体の細菌の同定および種分化のための細菌recAの使用が記載されている。タ
ーゲット細菌からのrecA遺伝子についてヌクレオチド配列の情報を獲得し、次い
でヌクレオチド配列の情報の標準ライブラリーと比較する方法（請求項1）、お
よび問題の試料中のrecA遺伝子の増幅のためにPCRを使用すること（請求項4〜7
、および13）が特に特許請求されている。しかしながら、RFLP手順における識別
制限酵素の使用は種分化を満足するために必須であり、そしてWO 00／14274に
は、多数のrecAプローブを同時に使用できることは述べられていない。
【００２４】 特許EP 0 133 288 A2において、細菌DNAとのtuf（またはfus）プローブの
ハイブリダイゼーションに基づく診断のために細菌のtuf（およびfus）配列の使
用が記載されており、そして特許請求されている。DNA増幅はEP 0 133 288
A2の範囲内ではない。多数のtuf（またはfus）プローブを同時に使用できること
は、どこにも記載されていない。tuf（またはfus）DNA核酸および／または配列
を使用する種分化に関して、記載されていない。報告されているtufハイブリダ
イゼーションの感度は1×106細菌または1〜100ngのDNAである。これは核酸増幅
技術を使用する我々のアッセイにより達成されるものよりも非常に低い感度であ
る。
【００２５】 臨床微生物学実験室において125年以上使用されてきている表現型同定法が存
在するが、これらの方法は患者の初期管理において有効であるために十分に速い
情報を提供しない。普通に直面する細菌、真菌および寄生生物の感染の診断速度
を増加することが必要である。非常により速いことの外に、DNAに基づく診断試
験は診断に現在使用されている標準生化学的試験よりも正確である。なぜなら、
微生物遺伝子型（例えば、DNAレベル）は表現型（例えば、生理学的レベル）よ
りも安定であるからである。
【００２６】 細菌、真菌および寄生生物は多数のよく知られている微生物病原体を包含する
。また、他の微生物は病原体であるか、あるいはヒト疾患に関連することができ
る。例えば、プロトセカ（Prototheca）属のアクロロフィリアス（achlorophyli
ous）藻類はヒトを感染することができる。古細菌、特にメタン細菌はヒトの腸
フローラの中に存在する（Reeve、J. H.、1999、J. Bacteriol. 181：3613−
3617）。しかしながら、メタン細菌は結腸、膣、および口における病理学的発現
に関連づけられた（Belay他、1988、Appl. Enviro. Microbiol. 54：600−60
3；Belay他、1990、J. Clin. Microbiol. 28：1666−1668；Weaver他、Gut
27：698−704）。
【００２７】 感染因子の同定に加えて、有害なトキシンを同定しおよび／または抗菌剤に対
する微生物の感受性をモニターすることはしばしば望ましい。本発明において明
らかなように、微生物の遺伝学的同定はトキシンおよび抗菌剤耐性遺伝子を使用
して同時に実行することができる。 公衆用データベース、例えば、遺伝子バンクから入手可能である配列の数によ
り示されるように、藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物種のゲノム配列の
知識は連続的に増加している。公衆用データベースから容易に入手可能である配
列から、診断目的に対する配列の可能性に関する指示は存在しない。
【００２８】 診断目的に対するすぐれた候補を決定するために、（i）普通に直面する細菌
、真菌および寄生生物の病原体の種特異的検出および同定、（ii）普通に直面す
る細菌、真菌および寄生生物の病原体の属特異的検出および同定、（iii）普通
に直面する細菌、真菌および寄生生物の病原体の科特異的検出および同定、（iv
） 普通に直面する細菌、真菌および寄生生物の病原体の群特異的検出および同
定、（v）藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の病原体の普遍的検出、お
よび／または（vi）抗菌剤耐性遺伝子の特異的検出および同定、および／または
（vii）細菌トキシン遺伝子の特異的検出および同定のためのDNAに基づくアッセ
イのために配列を選択することができる。DNAに基づくアッセイの上記タイプの
すべては、任意のタイプの臨床検体または微生物培養物から直接実行することが
できる。
【００２９】 我々の譲渡した米国特許第6,001,564号および我々のWO 98／20157特許刊行物
において、臨床的に重要な細菌病原体の種特異的検出および同定、（ii）細菌の
普遍的検出、および（iii）抗菌剤耐性遺伝子の検出に適当なDNA配列を我々は記
載した。
【００３０】 WO 98／20157特許刊行物において、登録tufDNA配列ならびに公衆用データベ
ースから選択されたtuf配列（両方の場合において、少なくとも100塩基対のフラ
グメント）、ならびにこれらの配列に由来するオリゴヌクレオチドプローブおよ
び増幅プライマーが記載されている。その特許刊行物に記載されているすべての
核酸配列は、a）細菌および真菌の存在を検出する、b）種、属、科または群のレ
ベルにおいて、細菌および真菌およびこれらの病原体に関連する抗菌剤耐性遺伝
子の存在を特異的に検出することができる診断キットまたは産物の組成物および
方法において添加することができる。
【００３１】 しかしながら、これらの方法およびキットは改良することが必要である。なぜ
なら、理想的キットおよび方法は微生物病原体および関連する抗菌剤耐性遺伝子
およびトキシン遺伝子の100％近くまで診断することができるべきであるからで
ある。例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）によ
り引き起こされる感染は多数の抗生物質に対して耐性を有するために臨床的に問
題となってきた。これらの細菌の検出およびそれらの耐性プロファイルの評価の
両方は望ましい。それ以外に、同一および他の微生物病原体または同一および追
加の抗菌剤耐性遺伝子を認識することができる新規なDNA配列（プローブおよび
プライマー）は、また、より多くのターゲット遺伝子を検出しかつ我々の初期特
許出願を補足するために望ましい。
【００３２】 本発明は、新しい登録tuf核酸および／または配列を開示し、ならびにtuf核酸
および／または配列を獲得する新しい方法を記載することによって、譲渡された
出願を改良する。さらに、新しい登録atpDおよびrecA核酸および／または配列を
開示する。公衆用データベースから選択されたtuf、atpDおよびrecA DNA核酸お
よび／または配列の新しい使用が開示される。
【００３３】 同定および診断のための高度に保存された遺伝子 高度に保存された遺伝子は微生物の同定に有用である。細菌のために、微生物
を同定するための大部分の研究された遺伝子は、普遍的に保存されたリボソーム
RNA遺伝子（rRNA）である。それらのうちで、同定の目的に使用される主要なタ
ーゲットは小さいサブユニット（SSU）のリボソーム16S rRNA遺伝子（原核生物
における）および16S rRNA遺伝子（真核生物における）である（RelmanおよびP
ersing、Genotyping Methods for Microbial Identification、In：D. H. Persing、1996、PCR Protocols for Emerging Infections Diseases、AS
M Press、ワシントンD.C.）。また、rRNA遺伝子は細菌（Chen他、1988、FEBS
Microbiol. Lett. 57：19−24；McCabe他、1999、Mol. Genet. Metabol. 6
6：205−211）および真菌（Van Burik他、1998、J. Clin. Microbiol. 36：
1169−1175）の普遍的検出のために最も普通に使用されるターゲットである。
【００３４】 しかしながら、16S rRNAに由来するプライマーを使用するとき、密接に関係
する種間を識別することが困難であることがある。ある場合において、16S rRN
A配列の同一性は種の同一性を保証するために十分でないことがあり、そしてオ
ペロン間の配列変動ならびに菌株対菌株の変動は同定目的の16S rRNAの適用を
害することがあることが示された（Clayton他、1995、Int. J. Syst. Bacter
iol. 45：595−599）。熱ショックタンパク質（HSP）は非常に保存されたタン
パク質の他の科である。細菌および真核生物におけるこれらの偏在的タンパク質
は、外部のストレス因子に応答して発現される。
【００３５】 これらのHSPの最も記載された1つはHSP 60である。このタンパク質はアミノ
酸レベルで非常に保存され、それゆえ系統発生の研究のための有効であった。16
S rRNAと同様に、診断ツールとしてHSP 60ヌクレオチド配列を使用して種間を
識別することは困難であろう。しかしながら、Goh他はHSP 60において可変領域
をフランキングする高度に保存された領域を同定し、これはこの可変領域を増幅
する普遍的プライマーの設計に導いた（Goh他、米国特許第5,708,160号）。生ず
るアンプリコンにおける配列の変動は、種特異的アッセイの設計に有効であるこ
とが見出された。
【００３６】 発明の要約 本発明の目的は、プローブおよび／または増幅プライマーを使用する、下記の
ものから核酸の存在および／または量を決定する、特異的、偏在的および感受性
の方法を提供することである： − 前記核酸を含有することが推測される任意の試料中の藻類、古細菌、細菌
、真菌または寄生生物種から、および必要に応じて − 第4表に列挙する種または属から成る群から選択される特定の微生物種ま
たは属から、および必要に応じて − 第5表に列挙する遺伝子から成る群から選択される抗菌剤耐性遺伝子から
、および必要に応じて
【００３７】 − 第6表に列挙する遺伝子から成る群から選択されるトキシン遺伝子から、 ここで前記核酸またはその変異型または一部分は前記プローブまたはプライマ
ーとハイブリダイゼーション可能な選択されたターゲット領域を含んでなる； 前記方法は前記試料を前記プローブまたはプライマーと接触させ、前記任意の
微生物種、特定の微生物種または属または科または群および抗菌剤耐性遺伝子お
よび／またはトキシン遺伝子の存在および／または量の指示として、ハイブリダ
イゼーションしたプローブまたは増幅された生成物の存在および／または量を検
出する工程を含む。
【００３８】 特定の態様において、各特定の微生物種または属または科または群の検出およ
び同定、抗菌剤耐性遺伝子の検出、トキシン遺伝子の検出、および普遍的細菌検
出に、別々に、向けられた同様な方法が提供される。 いっそう特定の態様において、この方法において、ターゲッテッド藻類、古細
菌、細菌、真菌および寄生生物の核酸を感受的、特異的および偏在的に検出する
、それらの能力について選択された、保存された遺伝子からDNAフラグメント（
登録配列および公衆用データベースから得られた配列）を使用する。
【００３９】 特に好ましい態様において、少なくとも12ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオ
チドがより大きいDNAフラグメントから誘導され、そしてこれらのオリゴヌクレ
オチドを本発明の方法においてプローブまたは増幅プライマーとして使用する。
すぐれた診断候補であるためには、少なくとも12ヌクレオチドのオリゴヌクレオ
チドは所定の1またはそれ以上の微生物と、前記1またはそれ以上の微生物の実質
的すべての株および代表的なものとハイブリダイゼーションすることができるべ
きである；前記オリゴヌクレオチドは種特異的、または遺伝子特異的、または科
特異的、または群特異的または普遍的である。
【００４０】 他の特に好ましい態様において、少なくとも12ヌクレオチド長さのオリゴヌク
レオチドのプライマーおよびプローブは、tuf、atpDおよびrecA DNA配列の我々
のデータベースの解析に基づく特異性および偏在性のために設計される。これら
のデータベースは、登録配列および公衆用配列の両方の情報を使用して発生させ
る。同時に、これらのデータベースは、藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生
物の検出および同定のためのプライマーおよびプローブの設計に有効な配列レパ
ートリーを形成する。また、このレパートリーを配列分析のために再分割して、
種々のプライマーおよびプローブを設計する。
【００４１】 また、藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の検出および同定のためのオ
リゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブの設計を促進する生成物として、
tuf、atpDおよびrecA DNA配列のデータベースがカバーされる。 また、登録オリゴヌクレオチド（プローブおよびプライマー）は本発明の他の
目的である。
【００４２】 本発明の目的は、また、プローブまたは増幅プライマー、例えば、下記のリス
トから選択される微生物の種または属または科または門または群を検出するプロ
ーブまたは増幅プライマーを含んでなる：アビオトロフィア・アジアセンス（Ab
iotrophia adiacens）、アシネトバクター・ボゥマニイィ（Acinetobacter ba
umanii）、アクチノマイセテ（Actinomycetae）、バクテロイデス（Bacteroides
）、サイトファガ（Cytophaga）およびフレキシバクター・フィルム（Flexibact
er phylum）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、ボル
デデラ・プロンキセプチカ［百日咳菌］（Bordetella pertussis）、ボルデデ
ラ（Bordetella）種、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni
）およびカンピロバクター・コリ（C. coli）、カンジダ・アルビカンス（Cand
ida albicans）、カンジダ・ヅブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カ
ンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、
【００４３】 カンジダ・グイリエルモンディイ（Candida guilliermondii）、カンジダ・
クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・ルシタニエ（Candida lusitaniae）
、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・トロピカ
リス（Candida tropicalis）、カンジダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoi
des）、カンジダ（Candida）種、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneum
oniae）、クロストリジウム（Clostridium）種、コリネバクテリウム（Coryneba
cterium）種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoforman
s）、クリプトコッカス（Cryptococcus）種、クリプトスポリジウム・パルヴム
（Cryptosporidium parvum）、エンタメバ（Entamoeba）種、エンテロバクデリ
アセエ［腸内細菌科］（Enterobacteriaceae）群、
【００４４】 エンテロコッカス・カッセリフラブス−エンテロコッカス・フラベセンス−ガ
リナルム（Enterococcus casseliflavus−flavescens)− gallinarum)群、エン
テロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フ
ェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナヌム（Enteroc
occus gallinarum）、エンテロコッカス（Enterococcus）種、大腸菌（E. col
i）およびシゲラ[赤痢菌]（Shigella）種群、ゲメラ（Gemella）種、ギアルジア
（Giardia）種、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、クレブシエラ
・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Le
gionella pneumophila）、レジオネラ（Legionella）種、レイシュマニア（Lei
shmania）種、
【００４５】 マイコバクテリアセエ（Mycobacteriaceae）科、マイコプラズマ・ニゥモニエ
（Mycoplasma pneumoniae）、ナイセリア・ゴノレエ［淋菌］（Neisseria gon
orrhaeae）、血小板含有群（第14表参照）、シュードモナス・エルジノーサ［緑
膿菌］（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス（Pseudomonas）群、スタ
ヒロコッカス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（Staphylococcus aureus）、表
皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタヒロコッカス・ヘモリチ
カス（Staphylococcus haemolyticus）、スタヒロコッカス・ホミニス（Staphy
lococcus hominis）、
【００４６】 スタヒロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、
スタヒロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトコッカス・アガラクチエ（
Streptococcus agalctiae）、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球
菌］（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿
レンサ球菌］（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス（Streptococc
us）種、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ
（Trypanosoma）種、トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）、トリパ
ノソーマ（Trypanosoma）種、トリパノソーマチデ（Trypanosomatidae）科。
【００４７】 第5表に列挙する群から選択される抗菌剤耐性遺伝子を検出するプローブまた
は増幅プライマーをさらに含んでなる診断キットは、また、本発明の目的である
。 第6表に列挙する群から選択されるトキシン遺伝子を検出するプローブまたは
増幅プライマーをさらに含んでなる診断キットは、また、本発明の目的である。 上に列挙した特定の種または属または科または群を検出するプローブまたは増
幅プライマーを含むか、あるいは含まず、第5表に列挙する群から選択される抗
菌剤耐性遺伝子を検出するプローブまたは増幅プライマーをさらに含むか、ある
いは含まず、そして第6表に列挙する群から選択されるトキシン遺伝子を検出す
るプローブまたは増幅プライマーをさらに含むか、あるいは含まない、本明細書
において詳しく列挙するもの以外の、任意の他の藻類、古細菌、細菌、真菌およ
び寄生生物種を検出するプローブまたは増幅プライマーをさらに含んでなる診断
キットは、また、本発明の目的である。
【００４８】 好ましい態様において、このようなキットは上に列挙した微生物種または属ま
たは科または群の別々のまたは同時の検出および同定；または藻類、古細菌、細
菌、真菌および寄生生物；または抗菌剤耐性遺伝子；またはトキシン遺伝子の普
遍的検出；任意の微生物（藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物）の検出を
可能とする。
【００４９】 上記方法およびキットにおいて、プローブおよびプライマーは核酸に限定され
ず、下記のものを包含するが、これらに限定されない：ヌクレオチドのアナロー
グ、例えば、イノシン、3−ニトロピロールヌクレオシド（Nichole他、1994、Na
ture 369：492−493）、連鎖核酸（LNA）（Koskin他、1998、Tetrahedron 54
：3607−3630）、およびペプチド核酸（PNA）（Egholm他、1993、Nature 365：
566−568）。
【００５０】 上記方法およびキットにおいて、下記のものを包含するが、これらに限定され
ない：a）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、b）リガーゼ連鎖反応（LCR）、c）核
酸配列をベースとする増幅（NASBA）、d）自己持続配列複製（3SR）、e）鎖置換
増幅（SDA）、f）分岐DNAシグナル増幅（bDNA）、g）転写仲介増幅（TMA）、h）
サイクリングプローブ技術（CPT）、i）ネステッドPCR、j）多重PCR、k）固相増
幅（SPA）、l）ヌクレアーゼ依存シグナル増幅（NDSA）、m）ローリングサーク
ル増幅技術（RCA）、n）アンカード鎖置換増幅、o）固相（固定化）ローリング
サークル増幅。
【００５１】 上記方法およびキットにおいて、ターゲット遺伝子の核酸の検出は実時間また
は増幅後技術を包含することができる。これらの検出下記のものを包含するが、
これらに限定されない：蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）に基づく方法、例えば
、FRETプローブに対する隣接ハイブリダイゼーション（プローブ−プローブおよ
びプローブ−プライマー法を包含する）、TaqMan、モラキュラービーコンズ（Mo
lecular Beacons）、スコーピオンズ（scorpions）、ナノ粒子プローブおよび
サンライズ（Sunrise）（Ampliflour）。
【００５２】 他の検出法は、免疫学的方法を介するターゲット遺伝子核酸検出、フィルター
、チップまたは任意の他の固体支持体上の固相ハイブリダイゼーション法を包含
し、ハイブリダイゼーションは蛍光、化学発光、電位差測定、質量分析、プラス
モン共鳴、偏光測定、測色、またはスキャノメトリー（scanometry）によりモニ
ターされる。ジデオキシ終結による配列決定またはハイブリダイゼーションによ
る配列決定、例えば、DNAチップを使用する配列決定を包含する配列決定は、タ
ーゲット遺伝子を検出および同定する他の可能な方法である。
【００５３】 好ましい態様において、核酸増幅、診断法において、ならびに核酸および推定
された配列のレパートリーを構築する方法において、PCRプロトコルを使用する
。特に好ましい態様において、95℃における1〜3分の開始変性支持体、次いで95
℃における1秒の変性工程および45〜65℃における30秒のアニーリング工程、伸
長工程のために特別の時間を使用しない、を含んでなるPCRプロトコルが提供さ
れる。このPCRプロトコルは大部分の選択された対を使用するPCR反応ために適当
であるように標準化され、これは試験を大きく促進する。なぜなら、普遍的、種
特異的、属特異的、抗菌剤耐性遺伝子およびトキシン遺伝子のPCRプライマーを
使用して均一なサイクリング条件下に各臨床試料を試験することができるからで
ある。さらに、プライマー対の種々の組合わせを多重PCRアッセイにおいて使用
することができる。
【００５４】 また、tuf、atpDおよびrecA DNA配列が薬物ターゲットとして働くことができ
、そしてこれらの配列および本発明において明らかにされたこれらの配列を獲得
する手段がこれらの薬物のスクリーニング、設計およびモデル化を促進すること
ができることは本発明の目的である。 また、tuf、atpDおよびrecA DNA配列がワクチンの目的のために働くことがで
き、そしてこれらの配列および本発明において明らかにされたこれらの配列を獲
得する手段がこれらのワクチンのスクリーニング、設計およびモデル化を促進す
ることができることは本発明の目的である。
【００５５】 藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の細胞を含まない試料を急速にスク
リーニングするための普遍的のDNAに基づく試験またはキットを開発することを
我々はもくろんだ。この試験は単独でまたはいっそう特異的な同定試験と組合わ
せて使用して、藻類および／または古細菌および／または細菌および／または真
菌および寄生生物の種および／または属および／または科および／または群を検
出および同定し、そして抗生物質に対して耐性の細菌および／または細菌トキシ
ンの存在を急速に決定することができる。
【００５６】 選択された抗菌剤耐性遺伝子からの配列は公衆用データベースから入手可能で
あり、それらの検出のためのDNAに基づく試験を開発するために使用されてきた
が、我々のアプローチは細菌培養物に基づく現在の方法を超えた主要な改良を表
すので、ユニークである。同時または独立または順次の微生物の検出−同定およ
び抗菌剤耐性遺伝子の検出の方法を使用すると、試験前に臨床試料を培養するこ
とは不必要である。その上、均一な条件下にほぼ1時間ですべてのターゲットDNA
配列を検出するために、変更されたPCRプロトコルが開発された。この手順は治
療を最適化することによって生命を救い、抗菌剤耐性を最小にすべきである。な
ぜなら、より少ない抗生物質が処方され、高価な広いスペクトルの抗生物質の使
用が減少され、入院を防止しまたは短縮することによって全体の健康看護のコス
トを減少し、薬剤の副作用を減少し、そして臨床実験室の試験に関連する時間お
よびコストを減少するからである。
【００５７】 他の態様において、配列レパートリーおよび他のターゲット遺伝子のためにそ
れらを獲得する方法は、hexA核酸および／またはストレプトコッキ（Streptococ
ci）の配列の場合におけるように、また、本発明の目的である。 なお他の態様において、抗生物質耐性遺伝子に関連する突然変異を検出するた
めに、遺伝子多様性のみを反映する点突然変異と、耐性に関係する点突然変異と
の間を区別するためにレパートリーを構築した。このようなレパートリーおよび
感受性およびペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌
］（Streptococcus pneumoniae）のpbp1a、pbp2bおよびpbp2x遺伝子のレパート
リーおよびまた種々の細菌種からのgyrAおよびparC遺伝子フラグメントのレパー
トリーを獲得する方法は、また、本発明の目的である。
【００５８】 前述の診断キット、プライマーおよびプローブを使用して、任意のタイプの試
料について藻類、古細菌、細菌、真菌、寄生生物、抗菌剤耐性遺伝子およびトキ
シン遺伝子を同定することができ、前記診断キット、プライマーおよびプローブ
はin vitroまたはin situ適用のために使用することができる。前記試料は下
記のものを包含するが、これらに限定されない：臨床試料、環境試料、任意の微
生物培養物、任意の微生物コロニー、任意の組織、および任意の細胞系統。
【００５９】 また、本発明の目的は、前記診断キット、プライマーおよびプローブは単独で
または微生物の同定に適当な他のアッセイと組合わせて使用することができるこ
とである。このようなアッセイは下記のものを包含するが、これらに限定されな
い：イムノアッセイ、酵素アッセイ、生化学的アッセイ、リゾチピック（lysoti
pic）アッセイ、血清学的アッセイ、鑑別培地、濃縮培地、選択的培地、特異的
アッセイ培地、同定培地、計数培地、細胞系統、特異的細胞系統についての培養
、および動物に対する感染性アッセイ。
【００６０】 後述する方法およびキットにおいて、オリゴヌクレオチドプローブおよび増幅
プライマーはより大きい配列（すなわち、少なくとも100塩基対のDNAフラグメン
ト）から誘導された。すべてのDNAフラグメントは登録フラグメントまたは公衆
用データベースから得られた。公衆用データベースから選択されたDNAフラグメ
ントは、それらの診断的可能性について選択されたので、本発明による検出法に
おいて新しく使用される。 他の態様において、tuf、atpDおよびrecA核酸および／または配列のレパート
リーから翻訳されたアミノ酸配列はまた本発明の目的である。
【００６１】 当業者とって明らかなように、添付書類I〜III、XXI〜XXII、XXXII〜XXXVII、
XXXIX〜XLI、およびXLIII〜LIVに列挙されているもの以外の、（i）藻類、古細
菌、細菌、真菌および寄生生物の普遍的検出、（ii）上記微生物種または属また
は科または群の検出および同定、および（iii）抗菌剤耐性遺伝子の検出、およ
び（iv）トキシン遺伝子の検出に適当な他のオリゴヌクレオチド配列を、また、
登録フラグメントまたは選択された公衆用データベースの配列から誘導すること
ができる。例えば、オリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブは選択した
ものよりも短いか、あるいは長いことができる；また、それらは登録DNAフラグ
メントまたは公衆用データベースから選択された配列の中から選択することがで
きる；それらは、また、同一オリゴヌクレオチドの変異型であることができる。
【００６２】 ターゲットDNAまたはその変異型が所定のオリゴヌクレオチドに対してハイブ
リダイゼーションする場合、またはターゲットDNAまたはその変異型が所定のオ
リゴヌクレオチドPCRプライマー対により増幅されることができる場合、逆はま
た真実である；所定のターゲットDNAが変異型オリゴヌクレオチドプローブに対
してハイブリダイゼーションするか、あるいは変異型オリゴヌクレオチドプロー
ブにより増幅されることができる。選択的に、PCR以外の増幅方法において使用
するために、オリゴヌクレオチドを任意のDNAフラグメント配列から設計するこ
とができる。
【００６３】 結局、本発明の中心は特異的および偏在的オリゴヌクレオチドプローブおよび
／または増幅プライマー源として使用される普遍的、種特異的、属特異的、科特
異的、群特異的、耐性遺伝子特異的、トキシン遺伝子特異的ゲノムまたは非ゲノ
ムDNAフラグメントの同定である。選択されたDNAフラグメントから、診断目的に
適当なオリゴヌクレオチドの選択および評価は多くの努力を必要とするが、診断
目的に適当である添付書類I〜III、XXI〜XXII、XXXII〜XXXVII、XXXIX〜XLI、お
よびXLIII〜LIVに列挙されている以外のオリゴヌクレオチドを誘導することは当
業者にとって極めて容易である。登録フラグメントまたは公衆用データベースの
配列をその特異性および偏在性について選択するとき、それらのサブセットがま
た特異的および偏在的である可能性を増加する。
【００６４】 臨床検体の高い百分率は細菌について陰性である（第3表）ので、普遍的オリ
ゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーの選択について高い可能性を有する
DNAフラグメントは登録および公衆用データベースの配列から選択された。増幅
プライマーは藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物において高度に保存され
た遺伝子から選択され、そして臨床検体中の藻類、古細菌、細菌、真菌および寄
生生物の病原体の存在を検出して、臨床検体が藻類、古細菌、細菌、真菌および
寄生生物について陽性または陰性であるかどうかを急速に決定するために使用さ
れる。
【００６５】 選択された遺伝子は、tuf、fus、atpDおよびrecAと表示され、タンパク質質合
成間の翻訳プロセスに関係する、それぞれ2つのタンパク質（伸長因子TuおよびG
）、すなわち、プロトンポンプATPアーゼの触媒活性に関係するタンパク質およ
び遺伝物質の相同的組換えに関係するタンパク質、をコードする。普遍的プライ
マーを誘導するために使用するtuf、atpDおよびrecA配列の整列は、登録および
公衆用データベースの両方の配列を包含する。普遍的プライマー法は、微生物学
的試験に提出された多数の陰性臨床検体（受け取られた検体の約80％、第3表参
照）の急速スクリーニングを可能とする。
【００６６】 tufおよび／またはatpDおよび／またはrecA核酸および／または配列が本発明
において明らかにされた、古細菌、細菌、真菌および寄生生物種は第4表に列挙
されている。診断目的のために選択された抗菌剤耐性遺伝子およびトキシン遺伝
子は第5表および第6表に列挙されている。配列のリストに記載されているtuf、a
tpDおよびrecA核酸および／または配列の由来は第7表に記載されている。実施例
に記載されているいくつかのアッセイの特異性、偏在性および選択性を試験する
ために使用する種のリストは、第8表〜10および12〜14に記載されている。tufお
よび／またはatpDおよび／またはrecA核酸は公衆用データベースにおいて入手可
能である、微生物種のリストは第11表に記載されている。商業的システムにより
同定される微生物は第15表に列挙されている。第16表〜18は実施例42の一部分で
あるが、第19表〜20は実施例43の一部分である。第21表〜22は実施例44を例示す
るが、第23表〜25は実施例45を例示する。
【００６７】 本発明によれば、複数の決定された藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物
の種の核酸を配列番号558〜561、562−574、636−655、664、681−683、696−69
7、699−700、708、812−815、911−917、919−922、935−938、1203−1207、12
12−1213、1221−1229、1605−1606、1974−1984、1999−2003、2282−2285によ
り規定されるプライマー対の任意の組合わせで増幅する工程を含む、藻類、古細
菌、細菌、真菌および寄生生物から選択されるグループの1つ、2以上の関係する
微生物、または実質的にすべての微生物の検出に有用なプローブまたはプライマ
ー、または両方が由来されるtuf、fus、atpDおよび／またはrecA遺伝子の核酸の
レパートリーを発生させる方法が提供される。
【００６８】 用語「関係する微生物」は、種形成までの共通の進化的プロファイル共有する
微生物、例えば、種、属、科または門に属する微生物を包含することを意図する
。また、同一用語は、例えば、それらのすべてが共通の宿主組織または細胞を有
するために、特定の理由でグループ化される異なる種の1群を包含することを意
図する。1つの特定の例において、血小板調製物の中に潜在的に見出される微生
物の1群は一緒にグループ化され、その特定のタイプの試料において生物を同時
に検出する目的で「関係する」生物と考える。 また、核酸およびそれらに由来する配列のレパートリーそれら自体、ならびに
これらの報告を含んでなる「遺伝子バンク」が提供される。
【００６９】 プローブまたはプライマーの配列を発生させるために、上記方法を再現するか
、あるいは配列レパートリーまたは遺伝子バンクそれ自体から出発することがで
き、そして下記の工程が付加される： 前記レパートリーの核酸配列のサブセットを整列させ、 前記グループの前記1つ、2以上の関係する微生物、または実質的にすべての微
生物の株または代表的なものの核酸の中に存在するが、他の微生物の核酸配列の
中に存在しない核酸ストレッチを捜し出し、そして 前記ストレッチからプローブまたはプライマーとして有効なコンセンサス核酸
配列を誘導する。
【００７０】 いったんプローブまたはプライマーの配列が設計されると、それらを核酸合成
により現実の分子に変換する。 上記方法および生ずるレパートリーから、藻類、古細菌、細菌、真菌および寄
生生物の任意の1つの普遍的検出が可能である。 さらに詳しくは、配列番号543、556−574、636−655、658−661、664、681−6
83、694、696、697、699、700、708、812−815、911−917、919−922、935−938
、1203−1207、1212−1213、1221−1229、1605−1606、1974−1984、1999−2003
、2282−2285により規定される配列を有する下記のプローブまたはプライマー、
または1または2以上のターゲッテッド微生物とハイブリダイゼーションすること
ができる少なくとも12ヌクレオチドの任意の変異型およびこれらの配列およびそ
れらを使用する診断法が提供される。
【００７１】 さらに、藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の種、属、科および群の任
意の1つを検出および同定するための特異的および普遍的性質を有するプローブ
またはプライマーがまた設計され、同一の方法およびレパートリーから誘導され
る。 さらに詳しくは、微生物の検出および同定のための特異的および普遍的性質を
有する、規定されたプローブまたはプライマーが提供される。
【００７２】 事実、工程： a） 任意の試験試料のtufまたはatpDまたはrecA配列と、核酸プライマーおよ
び／またはプローブとを接触させ、前記プライマーおよび／またはプローブは十
分に相補的であって、前記微生物群に対して特異的である1または2以上のtufま
たはatpDまたはrecA配列に対してハイブリダイゼーションするように選択されて
おり；
【００７３】 b） プライマーおよび／またはプローブと、任意の試験試料のtufまたはatpD
またはrecA配列を特定した条件下にハイブリダイゼーションさせ、前記条件は前
記プライマーおよび／またはプローブが前記微生物のtufまたはatpDまたはrecA
配列にハイブリダイゼーションするが、他の微生物からのtufまたはatpDまたはr
ecA配列と検出可能にハイブリダイゼーションしないような条件であり；そして c） 任意の試験試料のtufまたはatpDまたはrecA配列に対する前記プライマー
および／またはプローブのハイブリダイゼーションについて試験する； を含む、試験試料中の藻類、古細菌、細菌、真菌または寄生生物である微生物の
存在を決定する一般的方法が提供される。 後者において、工程c）は核酸ターゲットの増幅法、またはシグナル増幅法に
基づく。
【００７４】 微生物の普遍的または特異的検出および／または同定に加えて、抗菌剤耐性遺
伝子またはトキシン遺伝子の同時の検出は組成物または診断法で提供される。抗
菌剤耐性遺伝子および／またはトキシン遺伝子とハイブリダイゼーションするこ
とができる少なくとも12ヌクレオチド長さを有するプローブまたはプライマーを
使用することによって、このような検出は実行され、それらの定義された組が特
に提供される。
【００７５】 もちろん、任意の登録核酸およびそれに由来するヌクレオチド配列、および下
記の核酸とハイブリダイゼーションすることができる少なくとも12ヌクレオチド
の変異型、ならびに誘導された組換えベクターおよび宿主は、本発明の範囲内に
入る： 配列番号：1−73、75−241、399−457、498−529、612−618、621−624、675
、677、717−736、779−792、840−855、865、868−888、897−910、932、967−
989、992、1266−1297、1518−1526、1561−1575、1578−1580、1662−1664、16
66−1667、1669−1670、1673−1683、1685−1689、1786−1843、1874−1881、19
56−1960、2183−2185、2187−2188、2193−2201、2214−2249、2255−2272、こ
れらのすべてはtuf配列である；
【００７６】 配列番号：242−270、272−398、458−497、530−538、663、667、673−676、
678−680、737−778、827−832、834−839、856−862、866−867、889−896、92
9−931、941−966、1245−1254、1256−1265、1527、1576−1577、1600−1604、
1638−1647、1649−1660、1671、1684、1844−1848、1849−1865、2189−2192、
これらのすべてはatpD配列である； 配列番号：990−991、1003、1288−1289、1714、1756−1763、1866−1873およ
び2202−2212、これらのすべてはrecA配列である； 配列番号：1004−1075、1255、1607−1608、1648、1764−1785、2013−2014、
2056−2064、2273−2280、これらは微生物種の検出および同定に適当であること
が見出された抗菌剤耐性遺伝子またはトキシン遺伝子配列である。
【００７７】 下記のレパートリーを補足するために、hexA核酸および誘導された配列を含ん
でなる他の1つは、ストレプトコッカス種の核酸をプライマー配列番号1179、118
1、1182および1184〜1191の組合わせで増幅することによって構築された。この
特定のレパートリーから、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］
（Streptococcus pneumoniae）を検出するためのプライマーおよび／またはプ
ローブが設計され、得られた。特に、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レ
ンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）および配列番号1184〜1187または配
列番号1179、1180、1181または1182とハイブリダイゼーションすることができる
、少なくとも12ヌクレオチドの核酸配列が提供される。
【００７８】 タンパク質をコードする核酸の顕著な配列の破壊的は、また、本発明の範囲内
に入る他のレパートリーを構築するペプチド配列の多様性を提供する。タンパク
質および核酸配列のレパートリーから、ターゲット微生物に対して有効な治療剤
、例えば、抗生物質、ワクチンまたは遺伝子治療剤を設計するためにそれらを使
用することが提供される。 診断法における絶えまない進化のために、最後に、試験試料中の微生物を同定
する方法が提供され、この方法は下記の工程を含んでなる：
【００７９】 a） 微生物のtuf、fus、atpD、および／またはrecA遺伝子から核酸配列を獲
得し、そして b） 前記核酸配列を請求項5に記載のバンクの核酸配列と比較し、前記レパー
トリーは前記微生物の核酸から得られた核酸配列を含んでなり、これにより前記
配列が合致したとき、前記微生物が同定される。 この方法において、特定した所定の配列を得る方法が意図され、そしてこの配
列をバンクまたはレパートリーの配列と単に比較する。比較により合致する場合
、例えば、バンクが問題の核酸配列を含んでなる場合、微生物が同定される。
【００８０】 発明の詳細な説明 高度に保存された遺伝子、および種特異的、属特異的、科特異的、群特異的およ
び普遍的核酸プローブおよび増幅プライマーを発生させて、診断の臨床検体から
の藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の微生物を急速に検出しかつ同定す
るためのそれらの使用
【００８１】 発表されたインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）およびマイコプラ
ズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）ゲノムを比較し、保存された遺
伝子を検索することは、有効な診断プライマーおよびプローブを開発するための
ターゲットを提供すると、我々は理由づけた。これらの2つの細菌が距離的に関
係しかつマイコプラズマ・ゲニタリウム（M. genitalium）の最小ゲノムの中に
存在する大部分の遺伝子はすべての細菌の中に存在するように思われるので、こ
の配列の比較は高度に情報を与える。したがって、これらの2つの細菌の間に保
存された遺伝子はすべての他の細菌において保存されるように思われる。
【００８２】 ゲノムの比較後、いくつかのタンパク質をコードする遺伝子は進化において保
存されることが発見された。高度に保存されたタンパク質は、翻訳伸長因子G（E
F−G）およびTu（EF−Tu）およびF0F1型ATP−シンターゼのβサブユニット、お
よびより少ない程度に、RecAリコンビナーゼを含んでいた。これらの4つのタン
パク質コーディング遺伝子は、それらのすべてが普遍的増幅および配列決定プラ
イマーの設計に適当な、少なくとも2つの高度に保存された領域を有するという
基準に基づいて、20の最も保存された遺伝子の中から選択された。その上、これ
らのプライマーにより増幅されたフラグメント内に、高度に保存された、いっそ
う可変な領域がまた存在し、それゆえ、微生物の検出および同定および／または
定量のために潜在的に使用される普遍的ならびに種特異的、属特異的、科特異的
、または群特異的プライマーおよびプローブを設計するための配列情報を種々の
微生物種から急速に得ることができるであろう。
【００８３】 翻訳伸長因子はGTP結合性タンパク質の1ファミリーのメンバーであり、タンパ
ク質合成の必須工程間のtRNA分子とリボソーム機構との相互作用に関与する。因
子Tuの役割は、リボソームのA部位へのアミノアシル化tRNA分子の結合を促進す
ることである。EF−Tuの真核生物、古細菌（archaebacterial）および藻類の相
同体は伸長因子1アルファ（EF−1α）と呼ばれる。すべてのタンパク質合成因子
は、遺伝子複製および融合を介して共通のアンカーに由来した（Cousineau他、1
997、J. Mol. Evol. 45：661−670）。特に、伸長因子G（EF−G）は、リボソ
ームのA部位からP部位へのアミンアシル−tRNA分子の転位の促進において機能的
役割を有するが、EF−Tuとの配列相同性を共有し、EF−Tu遺伝子の祖先の複製お
よび融合から発生したと考えられる。
【００８４】 さらに、EF−Tuはエルファミシンならびに他の構造的クラスに属する抗生物質
のターゲットであることが知られている（AnborghおよびParmeggiani、1991、EM
BO J. 10：779−784；Luiten他、1992、欧州特許出願No. EP 0 446 251
A1）。EF−Gはその一部分について、抗生物質フシジン酸のターゲットである。
翻訳におけるそのきわめて重要な活性に加えて、EF−Tuはタンパク質フォルディ
ング、タンパク質の熱変性に対する保護および変性タンパク質との相互作用にお
いてシャペロン様機能を有する（Caldas他、1998、J. Biol. Chem. 273：114
78−11482）。興味深いことには、EF−Tuタンパク質の1形態はナイセリア・ゴノ
レエ［淋菌］（Neisseria gonorrhaeae）の周辺質の優性成分として同定され（
Porcella他、1996、Microbiology 142：2481−2489）、それゆえ少なくともい
くつかの細菌種において、EF−Tuはワクチン可能性を有する抗原であろう。
【００８５】 F0F1型ATP−シンターゼは3つの主要なファミリーに分割されたタンパク質転位
ATPアーゼのサブファミリーに属する：P、VおよびF（NelsonおよびTaiz、1989、
TIBS 14：113−116）、P−ATPアーゼ（またはE1−E2型）はリン酸化中間体を介
して働き、他の2つのファミリーに進化的に関係しない。V−ATPアーゼ（またはV
0V1型）は真核生物の液胞および他の内膜、古細菌および藻類の原形質膜、およ
びまたいくつかの真性細菌、特に他のスピロケタレス（Spirochaetales）ならび
にクラミジアセエ（Chlamydiaceae）およびデイノコッカセエ（Deinococcaceae
）科に属する種の原形質膜上に存在する。
【００８６】 F−ATPアーゼ（またはF0F1型）は最も真性細菌の原形質膜、ミトコンドリアの
内膜および葉緑体のチラコイド（thylakoid）膜上に見出される。それらは主と
してATP合成において機能する。それらはV−ATPアーゼと多数の構造的および機
能的特徴を共有する、大きいマルチマー酵素である。FおよびV型ATPアーゼは、
真核生物の出現に先行する事象において共通の祖先から分岐した。F−ATPアーゼ
のβサブユニットは触媒サブユニットであり、そしてV−ATPアーゼの触媒Aサブ
ユニットと低いが、有意な配列相同性を有する。
【００８７】 翻訳伸長因子EF−Tu、EF−GおよびEF−1α、およびFまたはV型ATPシンターゼ
は時には系統樹の解析に使用される高度に保存されたタンパク質であり、そして
それらの遺伝子はまた高度に保存されされることが知られている（Iwabe他、198
9、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：9355−9359；Gogarten他、1989、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 86：6661−6665；Ludwig他、1993、Antonie va
n Leeuwenhoek 64：285−305）。遺伝子バンク、欧州分子生物学研究所（EMBL
）、日本国DNAデータベース（DDBJ）および特定のゲノムプロジェクトデータベ
ースの本発明者らによる最近のBLAST（Altschul他、1997、J. Mol. Biol. 21
5：403−410）検索により、細菌を通じて、EF−TuおよびF0F1型ATP−シンターゼ
のβサブユニットは、インフルエンザ菌（H. influenzae）とマイコプラズマ・
ゲニタリウム（M. genitalium）との間に十分に保存されている他の遺伝子より
もいっそう保存されることができることが示された。
【００８８】 RecAリコンビナーゼはrecA遺伝子によりコードされる多機能タンパク質である
。それは相同的組換えにおいて重要な役割を演じ、DNA損傷の修復について重大
であり、そしてLexAリプレッサーのタンパク質分解的消化を促進することによっ
てSOSシステムの調節に関係づけられる。それは細菌において高度に保存され、
細菌の系統発生を再構築するために有効な遺伝的マーカーとして働くことができ
るであろう（MillerおよびKokjohn、1990、Ann. Rev. Microbiol. 44：365−
394）。RecAはrecAフラグメントの配列決定することを目的とした普遍的プライ
マーを設計するために我々が使用した、いくつかの高度に保存された配列を有す
るが、それは十分に保存されたEF−G、EF−TuおよびF0F1型ATP−シンターゼのβ
サブユニットとして明瞭ではない。
【００８９】 それゆえ、RecAは高い感受性を有する細菌の普遍的検出について最適でないこ
とがあるが、それを選択した。なぜなら、予備的データにより、EF−G、EF−Tu
およびF0F1型ATP−シンターゼのβサブユニットは時には密接に関係し過ぎて、
ある種の密接に関係する種および属を識別することができる、特定のプライマー
対を見出すことができないことが示されたからである。RecA、EF−G、EF−Tuお
よびF0F1型ATP−シンターゼのβサブユニットは普遍的配列決定プライマーの設
計に適当な高度に保存された領域を有するが、プライマー間で低い程度に保存さ
れた領域はそれらの場合において種特異的および属特異的プライマーを可能とす
るために十分に分岐している。
【００９０】 こうして、微生物を遺伝的検出するプライマーおよびプローブを設計するため
のターゲットとして、本発明はこれらの4つのタンパク質をコードする遺伝子に
集中した：tuf、伸長因子Tu（EF−Tu）；fus、伸長因子G（EF−G）の遺伝子；at
pD、F0F1型ATP−シンターゼのβサブユニットの遺伝子；およびrecA、RecAリコ
ンビナーゼをコードする遺伝子。いくつかの細菌ゲノムにおいて、tufはしばし
ば2つの高度に類似する複製コピー（tufAおよびtufBと命名する）の中に見出さ
れた（FilerおよびFurano、1981、J. Bacteriol. 148：1006−1011；Sela他、
1989、J. Bacteriol. 171：581−584）。
【００９１】 いくつかの特定の場合において、tuf遺伝子のいっそう分岐したコピーはいく
つかの細菌種、例えば、アクチノミセテスの中に存在し（Luiten他、欧州特許出
願公開No.EP 0 446 251 A1；Vijgenboom他、1994、Microbiology 140：983
−998）そして、本発明の一部分として明らかにされたように、いくつかのエン
テロコッカル種の中に存在することができる。いくつかの細菌種において、tuf
はfusA遺伝子によりコードされる伸長因子G（EF−G）についてその相同性遺伝子
を有するオペロン中で体制化される（図3）。このオペロンはしばしばstrオペロ
ンと命名される。tuf、fus、atpDおよびrecAは進化において十分に保存され、高
度に保存されたストレッチならびにいっそう変動性のセグメントを有するので、
それらを選択した。
【００９２】 その上、これらの4つの遺伝子は、本発明において真菌および寄生生物を同定
するターゲットとして記載されている、真核生物のオーソログである。伸長因子
Tuの真核生物相同体は伸長因子1−アルファ（EF−1α）と呼ばれる（遺伝子名：
tef、tef1、ef1、ef−1またはEF−1）。真菌において、EF−1αの遺伝子は時に
は2以上の高度に類似する複製コピー（しばしばtef1、tef2、tef3．．．と命名
される）で存在する。さらに、真核生物はそれらのオルガネラ祖先（遺伝子名：
tuf1、tufMまたはtufA）に由来する伸長因子Tuのコピーを有する。
【００９３】 本発明の目的に対して、これらの4つの機能的、進化的に連鎖した伸長因子の
遺伝子（細菌のEF−TuおよびEF−G、真核生物のEF−1α、およびオルガネラのEF
−Tu）は以後において「tuf核酸および／または配列」と表示される。真核生物
（ミトコンドリア）F0F1型ATP−シンターゼのベータサブユニット遺伝子は酵母
においてatp2と命名される。本発明の目的に対して、FまたはV型ATPシンターゼ
の触媒サブユニットの遺伝子は以後において「atpD核酸および／または配列」と
表示される。RecAの真核生物相同体は、Rad51およびDmc1により型別される、2つ
のファミリーにおいて分布している。RecAの古細菌相同体はRadAと呼ばれる。本
発明の目的に対して、後者のタンパク質に対応する遺伝子は以後において「recA
核酸および／または配列」と表示される。
【００９４】 本発明の記載において、用語「核酸」は互換的に使用されることがある。しか
しながら、用語「核酸」は化学的実在物であるが、「配列」はこれらの「核酸」
（に対して固有の）に由来する情報の片である。核酸および配列の両方は本発明
に関係する事項についての情報の同等に価値のある源である。
【００９５】 tufおよびatpDの多重配列整列の解析は、広範な種類の細菌種からのtuf（およ
び／またはfus）およびatpD遺伝子のセグメントを増幅する（またはそれらに対
してハイブリダイゼーションする）ことができるオリゴヌクレオチドプライマー
（およびプローブ）の設計を可能とした（実施例1〜4、24および26、および第7
表参照）。tuf核酸および／または配列の配列決定および増幅プライマー対は添
付書類Iに列挙されており、そしてハイブリダイゼーションプローブは添付書類I
IIおよびXLVIIに列挙されている。atpD核酸および／または配列の配列決定およ
び増幅プライマー対は添付書類IIに列挙されている。
【００９６】 tufおよびatpD配列の主要な再分割の解析（図1および図2参照）は、これらの
再分割の各々を特異的に増幅する配列決定プライマーの設計を可能とした。これ
らの配列決定プライマーはまた普遍的プライマーとして使用することができるこ
とに注意すべきである。しかしながら、これらの配列決定プライマーのいくつか
はいくつかの価値のある配列（デジェネレイト）位置を含むので、それらの感受
性は診断目的に開発された普遍的プライマーのそれよりも低いことがある。これ
らの遺伝子が直面する種々の門に基づいて、それ以上の再分割を実施することが
できるであろう。
【００９７】 同様に、公衆用データベースの中に存在するrecA配列の多重配列整列の解析は
、広範な種類の細菌種からのrecA遺伝子のセグメントを増幅することができるオ
リゴヌクレオチドプライマーの設計を可能とした。recA配列の配列決定および増
幅プライマー対は添付書類XXIに列挙されている。recA核酸および／または配列
の主要な再分割は、recA、RadA、Rad51およびdmc1を含んでなる。これらの遺伝
子が直面する種々の門に基づいて、それ以上の再分割を実施することができるで
あろう。
【００９８】 本発明の方法は、4つの保存された遺伝子（tuf、fus、atpDおよびrecA）から
できるだけ多くの配列データの情報を獲得することである。配列データのこの集
合はレパートリー（各ターゲット遺伝子に対応するサブレパートリーおよびそれ
らの主要な配列再分割を有する）を形成し、次いで配列レパートリーの配列情報
を使用して、藻類または古細菌または細菌または真菌または寄生生物の普遍的検
出、微生物の科または群（例えば、Enterobacteriaceae）の検出、属（例えば、
Streptococcus）または最後に特定の種（例えば、Staphylococcus aureus）の
検出を可能とするプライマー対を設計する。本発明の目的に対して、微生物の群
は特定の診断試験の必要性に依存して規定されることに注意すべきである。特定
の分類学的群または門を尊重することは不必要である。
【００９９】 実施例12を参照のこと。実施例12において、血小板濃縮物の汚染物質として直
面する17の主要な細菌種から成る細菌の群を増幅するために、プライマーを設計
した。また、第14表に示すように、その実施例において、プライマーは少なくと
も17の重要な細菌種を感受的にかつ急速に検出することができるばかりでなく、
かつまた他の種をその上検出することができた。これらの環境において、実施例
12に示すプライマーは細菌を含有する血小板について普遍的であると考えられる
。後者に対して特異的なアッセイを開発するために、各種に対して特異的な1ま
たは2以上のプライマーまたはプローブを設計することができるであろう。群検
出のためのプライマーおよび／またはプローブの他の例は、シュードモナド（Ps
eudomonad）群のプライマーである。
【０１００】 これらのプライマーは、現実のシュードモナス（Pseudomonas）種ならびに前
者のシュードモナス（Pseudomonas）種、例えば、ステノトロフォモナス・マル
トフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）からのtuf配列の整列に基づいて
設計された。生ずるプライマーは試験したすべてのシュードモナス（Pseudomona
s）種ならびに異なる属に属するいくつかの種を増幅することができ、それゆえ
、シュードモナス（Pseudomonas）および他の種を包含する群に対して特異的で
あるので、我々はその群をシュードモナド（Pseudomonad）として定義し、いく
つかのメンバーは前者のシュードモナス（Pseudomonas）であった。
【０１０１】 ある種の適用について、普遍的、群、科または属特異的反応を開発することが
でき、そしてアンプリコン内の配列情報を使用して種同定に進行して、種特異的
な内部のプローブまたはプライマーを設計するか、あるいは選択的に、アンプリ
コンを配列決定することによって直接的に進行することができる。 公衆用および登録tuf、atpDおよびrecA核酸および／または配列により形成さ
れた集合を新規な方式で使用し、こうしてそれらにより微生物同定のために有効
な情報を含有する3つのデータベースを構築する。
【０１０２】 また、他の遺伝子ターゲットの配列レパートリーを構築して、特に互いに遺伝
的に非常に類似する微生物種、例えば、大腸菌（E. coli）およびシゲラ[赤痢
菌]（Shigella）について、いくつかの特定の同定の問題を解決した（実施例23
参照）。tuf、atpDおよびrecA配列に基づいて、ストレプトコッカス・ニゥモニ
エ［肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）は密接に関係する種スト
レプトコッカス・オラリス（S. oralis）およびストレプトコッカス・ミチス（
S. mitis）と区別することが非常に困難である。したがって、我々の高度に保
存されたtuf、atpDおよびrecA核酸および／または配列よりも非常にいっそう可
変性の遺伝子である、hexA配列（実施例19）から配列レパートリーを構築するこ
とを選択した。
【０１０３】 抗生物質耐性遺伝子とアソシエート突然変異を検出するために、また、遺伝子
多様性を反映する点突然変異と耐性に関係する点突然変異とを区別するレパート
リーを我々は構築した。これはペニシリン耐性および感受性ストレプトコッカス
・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）のpbp1a、pbp2
bおよびpbp2xについて実施し、そしてキノロン耐性がモニターするために重要で
ある、種々の細菌種のgyrAおよびparC遺伝子フラグメントについて実施した。
【０１０４】 オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブの設計および合成 我々が配列決定したおよび／または公衆用データベース（遺伝子バンクおよび
EMBL）から選択したtuf、fus、atpDおよびrecA DNAフラグメントを使用して、
診断目的のオリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブを設計した。tufま
たはatpDまたはrecA配列レパートリーのサブセットを使用して、多重配列整列を
行った。できるだけ多くのターゲッテッド微生物DNA配列を含み、また、1または
2以上のターゲッテッド微生物が区別される、系統発生的に関係する金属イオン
からの配列データを包含するように、サブセットを選択した。プライマーおよび
プローブに適当な領域は1または2以上のターゲッテッド微生物について保存され
、そして1または2以上のターゲッテッド微生物が区別される、微生物について分
岐されている。
【０１０５】 我々のレパートリーにおける大量のtufまたはatpDまたはrecA配列データは、
特異的および偏在的プローブおよびプライマーを獲得するときの手探り法を減少
する。また、プライマーおよびプローブの設計に適当な領域の同定を促進するた
めに、tuf、fus、atpDおよびrecA核酸および／または配列に対応するペプチド配
列に頼った。設計ルールの一部分として、標準プログラム（すなわち、Genetics Computer Group（GCG）プログラムおよびプライマー解析ソフトウェアOligoT M 5.0）により、すべてのオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーションのための
プローブおよびPCRによりDNA増幅のためのプライマー）の適当性をハイブリダイ
ゼーションまたはPCR増幅について評価した。
【０１０６】 また、合成前に、不必要な特徴、例えば、1つのヌクレオチドの長いストレッ
チおよび3'末端におけるGまたはC残基の高い比率の非存在を確認することによっ
て、PCRプライマー対の潜在的適当性を評価した（Persing他、1993、Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications、American Soci
ety for Microbiology、ワシントンD.C.）。自動化DNA合成装置（Perkin− E
lmer Corp.、Applied Biosystems Division）を使用して、オリゴヌクレオチ
ドプローブおよび増幅プライマーを合成した。
【０１０７】 プローブまたはプライマーのオリゴヌクレオチド配列は、二本鎖DNAのいずれ
かの鎖から誘導することができる。プライマーまたはプローブは塩基A、G、C、
またはTまたはアナローグから成ることができ、そしてそれらは1または2以上の
選択されたヌクレオチド位置においてデジェネレイトであることができる。プラ
イマーまたはプローブは任意の適当な長さを有することができ、そして下記の検
出に適当である、登録フラグメントまたは選択されたデータベース配列からのDN
A配列内のいずれかで選択することができる： （i）藻類または古細菌または細菌または真菌または寄生生物の普遍的検出、 （ii）下記のものを包含するが、これらに限定されない、任意の微生物の種特
異的検出および同定：
【０１０８】 アビオトロフィア・アジアセンス（Abiotrophia adiacens）、アシネトバク
ター・ボゥマニイィ（Acinetobacter baumanii）、バクテロイデス・フラジリ
ス（Bacteroides fragilis）、ボルデデラ・プロンキセプチカ［百日咳菌］（B
ordetella pertussis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カ
ンジダ・ヅブリニエンシス（Candida dubliniensis）、カンジダ・グラブラタ
（Candida glabrata）、カンジダ・グイリエルモンディイ（Candida guillier
mondii）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・ルシタニエ（C
andida lusitaniae）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）
、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・ゼイラノイデ
ス（Candida zeylanoides）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）およびカンピロバクター・コリ（C. coli）、
【０１０９】 クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、トラコーマクラミジ
ア（Chlamydia trachomatis）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Crypto
coccus neoformans）、クリプトスポリジウム・パルヴム（Cryptosporidium p
arvum）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテ
ロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリ
ナヌム（Enterococcus gallinarum）、大腸菌（Escherichia coli）、インフ
ルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legio
nella pneumophila）、マイコプラズマ・ニゥモニエ（Mycoplasma pneumoniae
）、ナイセリア・ゴノレエ［淋菌］（Neisseria gonorrhaeae）、シュードモナ
ス・エルジノーサ［緑膿菌］（Pseudomonas aeruginosa）、
【０１１０】 スタヒロコッカス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（Staphylococcus aureus
）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタヒロコッカス・ヘ
モリチカス（Staphylococcus haemolyticus）、スタヒロコッカス・ホミニス（
Staphylococcus hominis）、スタヒロコッカス・サプロフィチカス（Staphyloc
occus saprophyticus）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalctiae）、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（Strepto
coccus pneumoniae）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、
【０１１１】 （iii）下記の微生物の属特異的検出：ボルデデラ（Bordetella）種、カンジ
ダ（Candida）種、クロストリジウム（Clostridium）種、コリネバクテリウム（
Corynebacterium）種、クリプトコッカス（Cryptococcus）種、エンタメバ（Ent
amoeba）種、エンテロコッカス（Enterococcus）種、ゲメラ（Gemella）種、ギ
アルジア（Giardia）種、レジオネラ（Legionella）種、レイシュマニア（Leish
mania）種、スタヒロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプトコッカス（Str
eptococcus）種、トリパノソーマ（Trypanosoma）種、 （iv）下記の微生物の科特異的検出：エンテロバクデリアセエ［腸内細菌科］
（Enterobacteriaceae）科のメンバー、マイコバクテリアセエ（Mycobacteriace
ae）科のメンバー、トリパノソーマチデ（Trypanosomatidae）科メンバー、
【０１１２】 （v）下記の微生物の検出：エンテロコッカス・カッセリフラブス−エンテロ
コッカス・フラベセンス−ガリナルム（Enterococcus casseliflavus−flavesc
ens)− gallinarum)群、エンテロコッカス（Enterococcus）種、ゲメラ（Gemell
a）種、アビオトロフィア・アジアセンス（Abiotrophia adiacens）群、シュー
ドモナドス（Pseudomonads）拡張群、細菌群を含有する血小板、 （vi）第5表に列挙されている臨床的に重要な抗菌剤耐性遺伝子の検出、 （vii）第6表に列挙されている臨床的に重要なトキシン遺伝子の検出。
【０１１３】 所定のターゲット微生物遺伝子の変異型は天然に存在し、そして進化間の遺伝
子内の配列変動に寄与する（Watson他、1987、Molecular Biology of the G
ene、第4版、The Benjamn／Cummings Publishing Company、カリフォルニア
州メラノパーク；Lewin、1989、Gene IV、John Wiley & Sons、New York、
NY）。例えば、同一微生物種の異なる系統はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼ
ーション部位に単一またはそれより多いヌクレオチド変動を有することがある。
当業者はよく知っているように、特定の遺伝子について変異型藻類、古細菌、細
菌、真菌および寄生生物DNA核酸および／または配列が存在し、そして配列変動
の頻度は所定の遺伝子産物に対する進化間の選択的圧力に依存する。2つのPCRプ
ライマー間の領域についての変異型配列の検出は、増幅生成物を配列決定するこ
とによって証明することができる。
【０１１４】 プライマーハイブリダイゼーション部位における配列変異型の存在を示すため
に、より大きいDNAターゲットをそのハイブリダイゼーション部位の外側におい
てPCRプライマーで増幅しなくてはならない。このより大きいフラグメントはこ
の部位における配列変動の検出を可能とする。同様な方法を適用して、プローブ
のハイブリダイゼーション部位における変異型を示することができる。ターゲッ
ト核酸および／または配列またはそれらの一部分のダイバージェンスが増幅プラ
イマーまたはプローブの特異性および偏在性に影響を与えないかぎり、変異型微
生物DNAは本発明の範囲内に入る。また、選択されたプライマーまたはプローブ
の変異型を使用して、変異型DNAを増幅するか、あるいはそれに対してハイブリ
ダイゼーションさせることができる。
【０１１５】 種々の古細菌、細菌、真菌および寄生生物種からのtuf核酸および／または配列
の配列決定 種々の古細菌、細菌、真菌および寄生生物について、tuf核酸および／または
配列の一部分のヌクレオチド配列を決定した。ほぼ890bpのtuf遺伝子の一部分を
増幅する増幅プライマー（配列番号664および697）を、新しく設計した配列決定
プライマー対（recA核酸および／または配列の配列決定プライマー対については
添付書類I参照）。大部分のプライマー対はtuf遺伝子の異なるコピー（tufAおよ
びtufB）を増幅することができる。いくつかの細菌種について、これらの2つの
遺伝子はほとんど同一であることが知られているので、これは驚くべきことでは
ない。
【０１１６】 例えば、大腸菌（E. coli）からの全体のtufAおよびtufB遺伝子はわずかに13
ヌクレオチド位置において異なるだけである（Neidhardtet他、1996、Escherich
ia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology、第2版、Ame
rican Society for Microbiology Press、ワシントンD.C.）。同様に、いく
つかの真菌はtuf核酸および／または配列の2つのほとんど同一のコピーを有する
ことが知られている（EF−1α）。これらの増幅プライマーはいくつかのヌクレ
オチド位置においてデジェネレイトであり、そして広い範囲のtuf核酸および／
または配列の増幅を可能とするためにイノシンを含有する。これらの増幅プライ
マーを選択するために使用した方法は、普遍的プライマーを選択するために添付
書類Iに例示した方法に類似する。
【０１１７】 tuf配列決定プライマーは、いくつかのエンテロコッカル種の場合において例
示したように、時々でさえtuf遺伝子の高度に分岐したコピー（tufC）を増幅し
た（配列番号73、75、76、614〜618、621および987〜989）。これを証明するた
めに、PCRアンプリコンからのエンテロコッカルtuf核酸および／または配列をプ
ラスミドベクターの中にクローニングすることを我々は決定した。クローニング
したアンプリコンからの配列データを使用して、エンテロコッカルの分岐（tufC
）コピーに対して特異的な新しい配列決定プライマー（配列番号658〜659および
661）を設計し、次いでtufCアンプリコンを直接配列決定した。増幅プライマー
（配列番号543、556、557、643〜645、660、664、694、696および697）を使用し
て、任意の細菌種からのtuf核酸および／または配列を増幅することができた。
【０１１８】 増幅プライマー（配列番号558、559、560、653、654、655、813、815、1974〜
1984、1999〜2003）を使用して、任意の真菌および／または寄生生物種からのtu
f（EF−1α）遺伝子を増幅することができた。増幅プライマー配列番号1221〜12
28を使用して、EF−G再分割（fusA）の細菌のtuf核酸および／または配列を増幅
することができた（図3）。増幅プライマー配列番号1224、および1227〜1229を
使用して、EF−Gの末端（fusA）と、EF−Tuの開始（tuf）とを含んでなり、遺伝
子間領域を含む、細菌のtuf核酸および／または配列を増幅することができた（
図3に示すように）。下記の増幅プロトコルを使用して、配列決定すべき大部分
のtufフラグメント増幅した：1μlの細胞懸濁液（または精製したゲノムDNA、0.
1〜100ng／μl）を19μlのPCR反応混合物に直接移した。
【０１１９】 各PCR反応混合物は50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH9.0）、0.1％のTriton X
−100、2.5mMのMgCl2、1μMの2プライマーの各々、200μMの4つのdNTPの各々、0
.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（Promega Corp.、ウイスコンシン州マディソン
）を含有した。次のようにしてPTC−200サーマルサークラー（MJ Research In
c.、マサチュセッツ州ウォータータウン）を使用して、PCR反応をサイクリング
した：94〜96℃において3分、次いで30〜35サイクルの95℃において1分の変性工
程、50〜55℃において1分のアニーリング工程および72℃において1分のエクステ
ンション工程。引き続いて、20μlのPCR増幅混合物を1.5％のアガロースゲル中
の電気泳動により分割した。次いでメチレンブルーで染色することによって、ア
ンプリコンを可視化した（Flores他、1992、Biotechniques 13：203−205）。
【０１２０】 100bpの分子量ラダーと比較することによって、増幅生成物のサイズを推定し
た。特定の増幅生成物に対応するバンドをアガロースゲルから切除し、QIAquick TM ゲル抽出キット（QIAGEN Inc.、カリフォルニア州チャツワース）を使用して
精製した。次いでゲル精製したDNAフラグメントを配列決定プロトコルにおいて
直接使用した。Big DyeTMターミネーターサイクル配列決定レディー反応キット
（Applied Biosystems、フォスターシティー、カリフォルニア州）とともに自
動化DNA配列決定装置（モデル377、Applied Biosystems）を使用するジデオキ
シヌクレオチド連鎖停止配列決定法により、tuf遺伝子増幅生成物の両方の鎖を
配列決定した。同一増幅プライマーおよび10ng／100bpのゲル精製したアンプリ
コン／反応を使用することによって、配列決定反応を実行した。
【０１２１】 長いアンプリコン、例えば、真核生物のtuf（EF−1α）を配列決定するために
、大部分のフラグメント長さについて両方の鎖の配列データを得ることができる
ように、内部の配列決定プライマー（配列番号654、655および813）を設計した
。決定した配列がPCR人工物の配列決定に帰するエラーを含有しないことを保証
するために、2つの独立PCR増幅に由来するゲル精製tuf増幅生成物の2つの調製物
を配列決定した。大部分のターゲット微生物種について、両方のアンプリコン調
製物について決定された配列は同一であった。不一致の場合において、第3の独
立PCR増幅からのアンプリコンを配列決定した。さらに、両方の鎖の配列は100％
相補的であり、これにより決定された配列の高い精度が確証された。上記方法に
より決定されたtuf核酸および／または配列は配列リストに記載されている。生
ずる微生物種および配列リスト中の各tuf配列についての源は第7表に記載されて
いる。
【０１２２】 我々が決定したtuf配列またはデータベースから選択したtuf配列の整列により
、tuf遺伝子の配列決定した部分の長さは変動性であることが明らかに証明され
た。いくつかのアミノ酸の挿入または欠失が存在することができる。さらに、い
くつかの真菌において、イントロンが観測された。イントロンの核酸および／ま
たは配列はtuf核酸および／または配列の一部分であり、そして種特異的プライ
マーおよびプローブの設計において有効であろう。これは配列決定したtuf増幅
生成物のサイズが1つの真菌種から他の真菌種において変動した理由を説明する
。結局、添付書類IV〜XX、XXIII〜XXXI、XXXVIIIおよびXLIIの各々の上部に示さ
れているヌクレオチド位置は挿入または欠失を有する配列について対応しない。
【０１２３】 また、我々が決定した種々のtuf核酸および／または配列は時々塩基の不明確
さを含有することに注意すべきである。これらのデジェネレイトヌクレオチドは
、tufA遺伝子およびtufB遺伝子（またはtuf核酸および／または配列のEF−G再分
割のコピー、または真菌および寄生生物についてのrecA核酸および／または配列
のEF−1α再分割のコピー）間の配列の変動に対応する。なぜなら、増幅プライ
マーは両方のtuf遺伝子を増幅するからである。両方の鎖の配列が同一であり、
また、2つの独立PCR増幅から得られたゲル精製tufアンプリコンの両方の調製物
が同一であったので、これらのヌクレオチドの変動はTaq DNAポリメラーゼによ
るヌクレオチドの誤組込みに起因しなかった。
【０１２４】 tuf核酸および／または配列からの増幅プライマーの選択 我々が決定したtuf配列または公衆用データベースから選択したtuf配列を使用
して、細菌の普遍的検出、ならびに属特異的、種特異的、科特異的または群特異
的検出および同定のためのPCRプライマーを選択した。これらのPCRプライマーの
選択に使用した方法は、種々のtuf配列の多重配列整列の解析に基づく。tuf配列
からのPCRプライマーの選択についての詳細は下記を参照のこと：実施例5、7〜1
4、17、22、24、28、30〜31、33、36、および38〜40、および添付書類VI〜IX、X
I〜XIXおよびXXV。
【０１２５】 種々の古細菌、細菌、真菌および寄生生物種からのatpDおよびrecA核酸および／
または配列の配列決定 atpDおよびrecA核酸および／または配列を得るために使用した方法は、tuf核
酸および／または配列について前述した方法に類似する。 atpDまたはrecA核酸および／または配列からの増幅プライマーの選択 種々の古細菌、細菌、真菌および寄生生物種からのatpDまたはrecA遺伝子のヌ
クレオチド配列を比較すると、PCRプライマーを選択することができた（実施例6
、13、29、34および37、および添付書類IV、V、X、およびXX参照）。
【０１２６】 DNA増幅 広く使用されているPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりDNAを増幅するため
に、プライマー対は登録DNAフラグメントまたはデータベース配列に由来した。
合成前に、潜在的プライマー対をOligoTM5.0ソフトウェアにより解析して、それ
らがPCR増幅のためのすぐれた候補であることを確認した。 PCRによるDNA増幅間に、微生物ゲノムからの加熱変性ターゲットDNAの各鎖に
それぞれ結合する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、DNAの変性、
プライマーのアナローグおよび各サイクルにおける新しいターゲットの合成を可
能とする連続的サーマルサイクルにより、ターゲットDNAを指数的にin vitro増
幅する（Persing他、1993、Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications、American Society for Microbiology、ワシントンD.C
.）。
【０１２７】 簡単に述べると、PCRプロトコルは次の通りであった：処理した臨床検体また
は標準化した細菌または真菌または寄生生物の懸濁液（下文参照）または細菌、
真菌または寄生生物から精製したゲノムDNAを20μlのPCR反応混合物中で増幅し
た。各PCR反応混合物は50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH9.0）、2.5mMのMgCl2、
0.4μMの各プライマー、200μMの4つのdNTPの各々および0.5単位のTaq DNAポリ
メラーゼ（Promega）をTaqStartTM抗体（Clontech Laboratories，Inc.、カリ
フォルニア州パロアルト）と組合わせて含有した。TaqStartTM抗体は、Taq DNA
ポリメラーゼに対する中和性モノクローナル抗体であり、すべてのPCR反応に添
加して、増幅の特異的および感受性を増強させた（Kellogg他、1994、Biotechni
ques 16：1134−1137）。
【０１２８】 必要な組成および感受性レベルは各検体の型について異なるので、臨床検体の
処理を試験した検体のタイプとともに変化させる。それは微生物細胞を溶解しか
つPCRインヒビターを排除または中和する急速プロトコルにある。細菌または真
菌または寄生生物の培養物から、または精製したゲノムDNAから増幅するために
、前処理工程を使用しないで、試料をPCR増幅混合物に直接添加した。ターゲッ
ト微生物またはヒトゲノムの中に見出されない配列から、内部対照を誘導した。
内部対照をすべての増幅反応の中に統合して、PCRアッセイの効率を確実にし、
有意なPCR阻害が存在しないようにした。選択的に、rRNAに由来する内部対照は
また微生物溶解プロトコルの効率をモニターするために有効であった。
【０１２９】 次いでPTC−200サーマルサークラー（MJ Research Inc.）を使用して、PCR
反応をサーマルサイクリングに付した：94〜96℃において3分、次いで30サイク
ルの95℃において1秒の変性工程および50〜65℃において30秒のアニーリング−
エクステンション工程。PCRアッセイについて実行したサイクル数は、必要な感
受性レベルに従い変化する。例えば、臨床検体から直接的微生物検出に要求され
る感受性レベルは尿検体についてよりも血液検体についてより高い。なぜなら、
敗血症に関連する微生物濃度は尿路感染に関連するそれよりも非常に低いことが
あるからである。
【０１３０】 結局、いっそうサーマルサイクルを有するいっそう感受性のPCRアッセイは血
液検体からの直接的検出のために多分要求される。同様に、細菌または真菌また
は寄生生物の培養から直接的に実行したPCRアッセイの感受性は、臨床検体から
直接的に実行したPCRアッセイのそれよりも低いことがある。なぜなら、ターゲ
ット生物数は微生物培養物におけるよりも臨床検体において通常非常に低いから
である。
【０１３１】 DNA増幅における当業者は、他の急速増幅手法、例えば、リガーゼ連鎖反応（L
CR）、転写仲介増幅（TMA）、自己持続配列複製（3SR）、核酸配列に基づく増幅
（NASBA）、鎖置換増幅（SDA）、分岐DNA（bDNA）、サイクリングプローブ技術
（CPT）、固相増幅（SPA）、ローリング増幅技術（RCA）、固相RCA、アンカード
SDAおよびヌクレアーゼ依存的シグナル増幅（NDSA）の存在を知っている（Lee他
、1997、Nucleic Acids Amplification Technologies：Application to Di
sease Diagnosis、Eaton Publishing、マサチュセッツ州ボストン；Persing他
、1993、Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applicatio
ns、American Society for Microbiology、ワシントンD.C.；Westin他、2000
、Nat. Biotechnol. 18：199−204）。
【０１３２】 本発明の範囲はPCRによる増幅の使用に限定されず、むしろ任意の急速核酸増
幅法または核酸に基づく診断試験の感受性および／または急速性を増加させるた
めに使用できる任意の他の手法の使用を包含する。また、本発明の範囲は任意の
核酸増幅および検出技術、例えば、実時間または増幅後検出技術、検出と組合わ
せた任意の増幅技術、任意のハイブリダイゼーション核酸チップまたはアレイ技
術、任意の増幅チップまたは増幅およびハイブリダイゼーションチップ技術の組
合わせの使用を包含する。任意の配列決定法による検出および同定もまた本発明
の範囲内に入る。
【０１３３】 また、PCR以外のアプローチによる核酸の増幅に適当であるか、あるいは種特
異的、属特異的および普遍的DNAフラグメントならびにこの明細書の中に含まれ
る選択された抗菌剤耐性遺伝子またはトキシン遺伝子配列に由来するDNAハイブ
リダイゼーションに適当である任意のオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内に入
る。
【０１３４】 増幅生成物の検出 古典的には、増幅の検出は標準臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動に
より実施される。明らかなように、より速くかつ日常的診断についていっそう実
際的である、特定の増幅生成物を検出する他の方法を使用することができる。こ
のような方法は増幅後または間における蛍光の検出に基づくことができる。増幅
されたDNAをモニターする1つの簡単な方法は、インターカレート剤、例えば、臭
化エチジウムまたはSYBRR Green I（Molecular Probe）の蛍光増加を測定す
ることによって、その形成速度を測定することである。いっそう特異的検出を必
要とする場合、蛍光に基づく技術は反応間の特定生成物の出現をモニターするこ
とができる。Taqポリメラーゼの5'−3'エクソヌクレアーゼ活性を利用するTaqMa
nTMシステム（Applied Biosystems）におけるように二重標識化蛍光発生プロー
ブを使用することは、すぐれた例である（Livak K.J.他、1995、PCR Methods Appl. 4：357−362）。
【０１３５】 TaqManTMは増幅間に実行することができ、この「実時間」検出は単一の閉じた
管中で実施することができ、それゆえPCR後の試料の取扱いを排除し、結局アン
プリコンのキャリオーバーの危険を防止することができる。いくつかの他の蛍光
に基づく検出法は実時間に実行することができる。蛍光共鳴エネルギー転移（FR
ET）は、隣接ハイブリダイゼーションプローブ（Wittwer C.T.他、1997、Bio
Techniques 22：130−138）、分子ビーコン（beacons）（Tyagi S.およびKram
er F.R.、1996、Nature Biotechnology 14：303−308）およびスコーピオン
（scorpions）（Whitcomb他、1999、Nature Biotechnology 17：804−807）の
使用の背後に存在する原理である。隣接ハイブリダイゼーションプローブｈａ増
幅プライマーに対して内部に存在するように設計される。
【０１３６】 1つのプローブの3'末端をドナー蛍光体で標識化するが、隣接プローブの5'末
端をアクセプター蛍光体で標識化する。2つのプローブが密接した近接性（1〜5
ヌクレオチドの間隔）で特異的にハイブリダイゼーションされるとき、外部光源
により励起されたドナー蛍光体は光を放射し、この光は第2アクセプターにより
吸収され、このアクセプターはより多くい蛍光を放射し、FRETシグナルを生ずる
。分子ビーコンは幹およびループ構造を有し、ここでループはプローブであり、
幹の下部において、蛍光部分が1端に存在し、クェンチング部分が他端に存在す
る。ビーコンはターゲットに対してハイブリダイゼーションするとき蛍光発生的
コンフォメーション変化を行い、それゆえ蛍光色素をそのクェンチャーから分離
する。また、ビルトイン蛍光光度計を有する空気サーマルサイクラーにおいてFR
ET原理を使用する（Wittwer C.T.他、1997、Bio Techniques 22：130−138）
。
【０１３７】 反応を毛管中の実施するので、増幅および検出は極めて急速である：45サイク
ルを完結するためにわずかに18分を要する。わずかの病原体を検索する場合、そ
れらの技術は特に適当である。LightCyclerTMはBoehringer−Roche Inc.から販
売されており、そしてSmartCyclerはCepheid製である。これらの2つの装置を蛍
光SYBRR Green IまたはFRET検出と組合わせて急速サイクルのPCRを実施するこ
とができる。最近、我々の研究所において、LightCyclerTMにより隣接ハイブリ
ダイゼーションプローブを使用して、10CFUの実時間検出を40分より短い時間を
我々は実現した。蛍光検出に基づく方法は、非常に急速、定量的であり、自動化
することができるので、日常的診断において利用するために特に有望である。
【０１３８】 また、微生物病原体の検出および同定は、増幅生成物に対してハイブリダイゼ
ーションする種特異的内部DNAプローブを使用する固体支持体または低いハイブ
リダイゼーションにより実行することができる。このようなプローブは我々のレ
パートリーからの任意の源から発生させ、本発明の目的であるDNA増幅生成物に
対して特異的にハイブリダイゼーションするように設計することができる。選択
的に、種または属または科または群の検出および同定のための内部プローブは、
普遍的、科特異的、属特異的または種特異的増幅アッセイにより産生されたアン
プリコンから誘導することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、ビオチン
またはジゴキシゲニンまたは任意の他のリポーター分子で標識化することができ
る（より詳細については、ハイブリッド捕捉についての下記節を参照のこと）。
固体支持体上のハイブリダイゼーションは小形化可能である。
【０１３９】 現在、オリゴヌクレオチド核酸ミクロアレイ技術は魅力的である。現在入手可
能な低〜中密度のアレイ（Heller他、An integrated microelectronics hybr
idization system for genomic research and diagnostic ａｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ．：Harrison D.J.、およびvan den Berg A.、1998、Micro tot
al analysis systems '98、Kluwer Academic Publisher、Dordrecht.）は
蛍光標識化アンプリコンを特異的に捕捉することができる。
【０１４０】 ハイブリダイゼーションの検出法は蛍光に限定されない；ポテンシオメトリー
、測色法およびプラスモン共鳴は、別の検出法のいくつかの例である。ハイブリ
ダイゼーションによる検出に加えて、核酸ミクロアレイを使用して、ハイブリダ
イゼーションによる急速配列決定を実行することができる。また、質量分析はア
ンプリコンの急速同定のために、または増幅生成物の配列決定のためにさえ適用
可能である（ChiuおよびCantor、1999、Clinical Chemistry 45：1578；Berke
nkamp他、1998、Science 281：260）。
【０１４１】 我々のアッセイフォーマットの将来のために、また、分子診断ツールの主要な
チャレンジ、すなわち、試料調製、遺伝学的増幅、検出、データ解析および提示
を包含する主要工程の統合を考慮する（Anderson他、ａｄｖａｎｃｅｓ in in
tegrated genetic analysis. In：Harrison D.J.、およびvan den Berg
A.、1998、Micro total analysis systems '98、Kluwer Academic Publis
her、Dordrecht.）。
【０１４２】 PCR効率を確実するために、グリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）ま
たは他の関係する溶媒を使用してPCRの感受性を増加し、高いGC含量を有するか
、あるいは強い二次構造を形成するターゲットDNAの増幅に関連する問題を克服
することができる（DieffenbachおよびDveksler、1995、PCR Primer：A Labor
atory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New
York）。グリセロールおよびDMSOの濃度範囲は、それぞれ、5〜15％（v／v）お
よび3〜10％（v／v）である。
【０１４３】 PCR反応混合物について、増幅プライマーおよびMgCl2の濃度範囲は、それぞれ
、0.1〜1.5μMおよび1.0〜10.0mMである。また、外部およびネステッドプライマ
ー（すなわち、ネステッドPCR）を使用するか、あるいは2以上のプライマー対（
すなわち、多重PCR）を使用する標準PCRプロトコルの変更を使用することができ
る（Persing他、1993、Diagnostic Molecular Microbiology：Principles an
d Applications、American Society for Microbiology、ワシントンD.C.）
。PCRプロトコルおよびアンプリコン検出法の詳細については、実施例を参照の
こと。
【０１４４】 増幅生成物のハイブリッド捕捉および化学発光検出 アンプリコンのハイブリダイゼーションおよび化学発光による検出は、Nikifo
rv他の方法（1994、PCR Methods and Applications 3：285−291および1995
、Anal. Biochem. 227：201−209）およびDIGTMシステムプロトコル（Boehrin
ger Mannheim）に従い実施した。簡単に述べると、50μlのEDC［1−エチル−3
−（3−ジメチルアミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩］中の捕捉プローブの2
5pmol溶液を、、室温において一夜インキュベートすることによって、96ウェル
のプレート（MicrolieteTM 2、Dynex）の各ウェルの中に固定化した。次の日に
、プレートを37℃においてTNTw（10mMのTris−HCl、pH7.5；150mMのNaCl；0.05
％のTweenTM 20）中の1％のBSA溶液と1時間インキュベートした。
【０１４５】 次いでプレートをWellwash AscentTM（Labsystems）上でTNTwで洗浄し、次い
で洗浄緩衝液（100mMのマレイン酸pH7.5；150mMのNaCl；0.3％のTweenTM 20）
で洗浄した。 PCR間にPCR DIG Labelling Mix（Boehringer Mannheim）を製造業者の使
用説明書に従い使用して、アンプリコンをDIG−dUTPで標識化した。捕捉プロー
ブに対するアンプリコンのハイブリダイゼーションを、三重反復実験においてス
トリンジェント温度（一般に、55℃、ストリンジェント温度におけるハイブリダ
イゼーションを可能とするようにプローブを設計する）において、1.5MのNaCl；
10mMのEDTA中で30分間実行する。
【０１４６】 次いでそれを2×SSC；0.1％SDS中で2回洗浄し、次いで0.1×SSC；0.1％SDS中
でストリンジェント温度（55℃）において4回洗浄する。1,2−ジオキセタン化学
発光アルカリ性ホスファターゼ基質、例えば、CSPDR（Tropix Inc.）を使用す
る検出を製造業者の使用説明書に従うが、より短いインキュベーション時間およ
び異なる抗体濃度を使用して実行する。プレートを各工程において撹拌し、ブロ
ッキングインキュベーションをわずかに5分間実行し、抗DIG−AP1を1：1000希釈
で使用し、抗体と15分間インキュベートし、プレートをわずかに5分間2回洗浄す
る。最後に、検出緩衝液中で2分間インキュベートした後、プレートを室温にお
いてCSPDRと5時間インキュベートし、次いで撹拌しないで37℃において10分間イ
ンキュベートする。Dynex Microtiter Plate LuminometerによりRLU（相対光
単位）を使用して、発光シグナルの検出を検出する。
【０１４７】 オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブについての特異性、偏在性およ
び感受性の試験 DNAの増幅によるか、あるいは密接に関係する種および同一解剖病理学的部位
を共有する種を含んでなるパネルから選択した細菌または真菌または寄生生物種
とのハイブリダイゼーションにより、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプ
ローブの特異性を試験した（添付書類および実施例参照）。試験したすべての細
菌、真菌および寄生生物種は、感染または臨床検体から単離することができる潜
在的汚染因子に関連する病原体であるように思われた。
【０１４８】 細胞を溶解する標準的化学的および／または物理的処理を使用して、各ターゲ
ットDNAを微生物細胞から解放することができ（Sambrook他、1989、Molecular
Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY）または選択的に、GONMETM DNAキット（B
io101、カリフォルニア州ビスタ）で精製したゲノムDNAを使用した。引き続いて
、DNAをプライマー対で増幅した。特異的プライマーまたはプローブはターゲッ
ト微生物種、属、科または群のみを増幅した。
【０１４９】 引き続いて増幅により、ターゲット種、属、科または群を特異的に増幅するこ
とが見出されたオリゴヌクレオチドプライマーをそれらの偏在性について試験し
た（すなわち、偏在的プライマーはターゲット種または属または科または群の大
部分またはすべての分離株を効率よく増幅した）。最後に、ターゲッテッド微生
物から精製したゲノムDNAの10倍または2倍希釈物を使用して、プライマーまたは
プローブの感受性を測定した。大部分のアッセイについて、1〜100コピーの範囲
における感受性レベルを得た。直接的に微生物種の培養物からまたは精製した微
生物ゲノムDNAから、選択した増幅プライマーを使用するPCRアッセイの特異性、
偏在性および感受性を試験した。
【０１５０】 前述したように、プローブをハイブリッド捕捉アッセイにおいて試験した。オ
リゴヌクレオチドプローブを選択した種または属または科または群からのDNAに
対してのみオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーションしたとき、オ
リゴヌクレオチドプローブは特異的であると考慮した。引き続いて、特異的であ
ることが見出されたオリゴヌクレオチドプローブを偏在性について試験した（す
なわち、偏在的プローブはターゲット種または属または科または群の大部分また
はすべての分離株を効率よく検出した）。この試験は、ATCC参照株を包含する問
題の種または属または科または群の異なる臨床分離株からの微生物DNAに対する
ハイブリダイゼーションにより実施した。同様に、オリゴヌクレオチドのプライ
マーおよびプローブは本発明の目的である抗菌剤耐性遺伝子またはトキシン遺伝
子から誘導することができる。
【０１５１】 参照株 登録tuf、atpDおよびrecA配列データのサブレパートリーを構築し、ならびに
増幅およびハイブリダイゼーションアッセイを試験するために使用した参照株は
、（i）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cul
ture Collection）（ATCC）、（ii）ラボラトイレ・デ・サンテ・プイク・ヅ・
クエベク（Laboratoire de sant publique du Qu bec（KSPQ）、（iii）
センターズ・フォー・ディジーズ・コントロール・アンド・プリベンション（Ce
nters for Disease Control and Prevention）（CDC）、（iv）ナショナル
・カルチュアー・タイプ・コレクション（National Culture Type Collectio
n）（NCTC）および（v）世界を通じていくつかの他の参照研究所から入手した。
我々の参照株の同一性は表現型試験により確認し、tuf、atpDおよびrecA配列の
分析により再確認した（実施例13参照）。
【０１５２】 耐性遺伝子に対する抗菌剤 抗菌剤耐性は処理を複雑化し、しばしば治療の失敗に導く。さらに、抗生物質
の過剰使用は微生物耐性の出現に導く。我々の目標は、ほぼ1時間で、最適な治
療を処方するために必要な炎症を臨床医に提供することである。普遍的藻類、古
細菌、細菌、真菌および寄生生物検出のためのDNAに基づく試験を使用する陰性
臨床検体の急速同定、および種特異的および／または属特異的および／または科
特異的および／または群特異的DNAに基づく試験を使用する陽性検体における特
異的病原体の存在の同定の外に、臨床医は抗生物質治療に抵抗する微生物病原体
の能力についての時を得た炎症をまた必要とする。
【０１５３】 抗微生物剤に対する微生物の耐性を急速に評価する最も効率よい方法は、最も
普通の臨床医に重要な抗菌剤耐性遺伝子を臨床検体から直接的に検出することで
あること（例えば、抗菌剤耐性遺伝子の特異的検出のためのDNAに基づく試験）
を我々は感じた。最も重要な、普通の抗菌剤耐性遺伝子からの配列は公衆用デー
タベースから入手可能であるので、我々の方法は耐性遺伝子の一部分または全体
からの配列を使用して、感受性かつ急速なDNAに基づく試験を開発する基礎とし
て使用される、特異的オリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブを設計す
ることである。
【０１５４】 臨床的関連性（すなわち、高い発生率および重要性）に基づいて選択した抗菌
剤耐性遺伝子の各々の列挙は第5表に記載されている；設計した増幅プライマー
および内部プローブの説明は添付書類XXXIV−XXXVII、XXXIX、XLV、およびL〜LI
に記載されている。抗菌剤耐性遺伝子の検出および微生物の検出および同定は同
時に、または独立に、または順次に、多重または平行または順次のアッセイにお
いて、均一なPCR増幅条件下に実施可能であるので、我々のアプローチはユニー
クである。また、これらの増幅は別々に実施することができる。
【０１５５】 トキシン遺伝子 トキシン同定は最適な処理を処方するためにしばしば非常に重要である。普遍
的細菌検出のためのDNAに基づく試験を使用する陰性臨床検体の急速同定および
種特異的および／または属特異的および／または科特異的および／または群特異
的DNAに基づく試験を使用する陽性検体中の特異的病原体の存在の同定のほかに
、トキシンを産生するある種の細菌病原体の能力についての時を得た情報を臨床
医は時には必要とする。最も重要な、普通のトキシン遺伝子からの配列は公衆用
データベースから入手可能であるので、我々の方法はトキシン遺伝子の一部分ま
たは全体からの配列を使用して、感受性かつ急速なDNAに基づく試験を開発する
基礎として使用される、特異的オリゴヌクレオチドのプライマーまたはプローブ
を設計することである。
【０１５６】 臨床的関連性（すなわち、高い発生率および重要性）に基づいて選択した細菌
トキシン遺伝子の各々の列挙は第6表に記載されている；設計した増幅プライマ
ーおよび内部プローブの説明は添付書類XXII、XXXIIおよびXXXIIIに記載されて
いる。トキシン遺伝子の検出および微生物の検出および同定は同時に、または独
立に、または順次に、多重または平行または順次のアッセイにおいて、均一なPC
R増幅条件下に実施可能であるので、我々のアプローチはユニークである。また
、これらの増幅は別々に実施することができる。
【０１５７】 普遍的細菌検出 日常的微生物学実験室において、細菌同定のために送られてきた臨床検体の高
い百分率は培養により陰性である。こうして、多数の陰性検体の特異的同定およ
びスクリーニング前に、細菌の存在を検出する普遍的増幅プライマーまたは普遍
的プローブを使用する臨床試料の試験は、コストを減少させ、患者の臨床的管理
を急速に方向づけることができるので、有効である。したがって、tuf、atpDお
よびrecA核酸および／または配列からの細菌配列の高度に保存された部分から、
いくつかの増幅プライマーおよびプローブを合成した。
【０１５８】 普遍的プライマーの選択は、我々のレパートリーからの配列を使用して構築し
た多重配列整列に基づいた。アミノ酸およびヌクレオチド配列のすべてのコンピ
ューター解析は、GCGプログラムを使用して実施された。引き続いて、細菌の普
遍的増幅のための最適なPCRプライマーはOlgoTMの助けを借りて選択した。選択
したプライマーはいくつかのヌクレオチド位置においてデジェネレイトであり、
そしてすべての臨床的に関係する細菌種の増幅を可能とするためにいくつかのイ
ノシンを含有する。イノシンは4つのヌクレオチドA、C、GまたはTの任意のもの
に特異的に結合することができるヌクレオチドアナローグである。
【０１５９】 デジェネレイトオリゴヌクレオチドは、誤対合部位に4つのヌクレオチドA、C
、GまたはTの2以上を有するオリゴヌクレオチド混合物から成る。増幅プライマ
ーの中にイノシンおよび／または塩基の不明確さを含めると、誤対合耐性が可能
となり、これによりターゲットヌクレオチド配列のより広いアレイの増幅が可能
となる（DieffenbachおよびDveksler、1995、PCR Primer：A Laboratory Man
ual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、NY）。
【０１６０】 普遍的プライマーを使用する増幅条件は、アニーリング温度がわずかに低い以
外、種特異的および属特異的増幅アッセイのために使用した条件に非常に類似す
る。我々の譲渡したWO 98／20157に記載されているオリジナルの普遍的PCRアッ
セイ（後者の出願の配列番号23〜24）は特異的であり、細菌検出のためにほとん
ど偏在的である。12の真菌種から単離されたゲノムDNAならびにレイシュマニア
・ドノバリ（Leishmania donovani）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae）およびヒトリンパ球からのゲノムDNAを増幅することによ
って、細菌に対する特異性を確認した。上記真核生物DNA調製物のいずれも普遍
的アッセイにより増幅することができず、これによりこの試験は細菌に対して特
異的であることが示唆される。
【０１６１】 95の最も臨床的に関係する細菌種を表す116の参照株からのゲノムDNAを増幅す
ることによって、普遍的アッセイの偏在性を確認した。これらの種は第4表に列
挙されている細菌種から選択された。これらの株の少なくとも104を増幅するこ
とができることを我々は発見した。しかしながら、このアッセイを改良すること
ができた。なぜなら、オリジナルのtuf核酸および／または配列に基づくアッセ
イで増幅することができた細菌種は、下記の属に属する種を包含したからである
：コリネバクテリウム（Corynebacterium）（11種）およびステノトロフォモナ
ス（Stentrophomanas）（1種）。本発明の範囲内において、普遍的アッセイを改
良するために、これらの細菌種および他の種からのtuf遺伝子の配列決定を実施
したした。この配列決定データを使用して、いっそう偏在性でありかついっそう
感受性であることができる、新しい普遍的プライマーを選択した。
【０１６２】 また、我々のtuf、atpDおよびrecA配列のレパートリーを分析するとき観測さ
れた系統発生を考慮することによって、我々のプライマーおよびプローブを改良
した。GCGパッケージ（Genetics Computer Group，Inc.）のバージョン10から
のPileupコマンドを使用して、3つの主要なサブレパートリー（tuf、atpDおよび
recA）の各々からのデータを基本的系統発生的解析に付した。この解析は配列間
の関係を反映する主要な分岐または門を示した。すべての門に対してハイブリダ
イゼーションすることができるプライマーまたはプローブを設計することを試み
る代わりに、主要な門に対してハイブリダイゼーションすることができるプライ
マーまたはプローブを設計したが、最大の門の可能性を使用することを試みた。
【０１６３】 この方法はデジェネレイトプライマーをよく少なくし、それゆえ感受性を改良
し、多重アッセイにおいてプライマーを組合わせることによって、偏在性を改良
するであろう。tuf配列に基づく普遍的プライマー配列番号643〜645は、アクチ
ノミセテエ（Actinomyceteae）、クロストリジアセエ（Clostridiaceae）および
サイトファガ（Cytophaga）、フレキシバクター（Flexibacter）およびバクテロ
イデス（Bacteroides）門（この門の病原性細菌はバクテロイデス（Bacteroides
）、ポルフィロモナス（Porphyromonas）およびプレボテラ（Provotella）種を
包含する）を除外した、大部分の病原性細菌を増幅するように設計された。
【０１６４】 これらのギャップを満たすプライマーは、またtuf核酸および／または配列に
由来する、アクチノミセテエ（Actinomyceteae）（配列番号646〜648）、クロス
トリジアセエ（Clostridiaceae）（配列番号796〜797、808〜811）、およびサイ
トファガ（Cytophaga）、フレキシバクター（Flexibacter）およびバクテロイデ
ス（Bacteroides）門（配列番号649〜651）について設計された。これらのプラ
イマー組は単独でまたは組合わせを使用して、普遍的アッセイをいっそう偏在的
とすることができる。
【０１６５】 atpD配列に由来する普遍的プライマーは、配列番号562〜565を包含する。これ
らのプライマーの組合わせはヒトDNAを増幅するが、エプシロン再分割（カンピ
ロバクター（Campylobacter）およびヘリコバクター（Helicobacter）に属する
プロテオバクテリア、サイトファガ（Cytophaga）、フレキシバクター（Flexiba
cter）およびバクテロイデス（Bacteroides）群およびいくつかのアクチノミセ
テスおよびコリネバクテリアからの細菌を除外した、すべての病原性細菌種を増
幅するであろう。前者の種からのatpD配列を分析することによって、これらのギ
ャップを特異的に満たすプライマーおよびプローブを設計し、またatpD核酸およ
び／または配列配列に由来するプライマー配列番号562〜565と組合わせて使用す
ることができる。
【０１６６】 さらに、atpD配列由来プライマーをtuf配列由来プライマーと混合することに
よって、アッセイの普遍性を拡張することができる。究極的に、recA配列由来プ
ライマーをさえ添加して普遍的アッセイにおけるギャップを満たすことができる
であろう。 普遍的アッセイの偏在性を試験するために選択した95の細菌種は、コミュニテ
ィーまたは病院（院内感染）において獲得される種々のヒト感染に関連する、大
部分の臨床的に関係する細菌種のすべてを包含することに注意することが重要で
ある。最も臨床的に重要な細菌および真菌の病原体は第1表および第2表に列挙さ
れている。
【０１６７】 tuf、atpDおよびrecA核酸および／または配列に由来するアミノ酸配列 また、tuf、atpDおよびrecA核酸および／または配列のレパートリーから翻訳
されたアミノ酸配列は本発明の目的である。アミノ酸配列は、伸長因子Tu、伸長
因子G、伸長因子1α、ATPアーゼサブユニットベータおよびRecAリコンビナーゼ
の三次元（3D）構造の相同性モデル化に特に有効であろう。すべてのこれらのタ
ンパク質について、結晶からのX線回折データを使用して、少なくとも1つの構造
モデルが発表された。
【０１６８】 これらの構造の情報に基づいて、既知構造とペプチド配列の相同性を有する任
意の他のタンパク質の3Dモデル構造を構築するために、コンピューターのソフト
ウェアを使用することができる（Greer，1991、Methods in Enzymology 202
：239−252；Taylor、1994、Trends Biotechnol. 12（5）154−158；Sali、19
95、Cur. Opin. Biotechnol. 6：437−451；SanchezおよびSali、1997、Cur. Opin. Struct. Biol. 7：206−214；FisherおよびEisenberg、1999、Cur. Opin. Struct. Biol. 9：208−211；Guex他、1999、Trends Biochem. Sc
i. 24：364−367）。リガンドおよびインヒビター、例えば、抗生物質を設計す
るか、あるいはそれらの挙動を予測するために、ターゲットタンパク質のモデル
構造を使用する。
【０１６９】 EF−TuおよびEF−Gは抗生物質のターゲットとして知られている（上を参照）
ので、そしてATPアーゼのベータサブユニットおよびRecAリコンビナーゼは感染
の自然条件における微生物細胞の生存に対して必須であるので、すべての4つの
タンパク質は抗生物質のターゲットであると考えることができるであろう。配列
のデータ、特に我々が発生した新しいデータは所望の活性スペクトルを有する新
しい抗生物質分子の発生を促進するために非常に有効であることがある。さらに
、モデル構造を使用して、商業的目的でタンパク質機能を改良すること、例えば
、微生物株による抗生物質の産生を改良するか、あるいはバイオマスを増加する
ことができるであろう。 本発明の例示的実施例として、下記の詳細な態様および添付図面を提供する。 これらは本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１７０】 図面の説明 図1および図2は、それぞれ、tufおよびATP配列のレパートリーの主再分割を図
解する。プライマーおよびプローブの設計のために、要求に依存して、ピラミッ
ドの上部に図解する完全なデータ組を使用するか、あるいは異なる分岐点により
図解されているサブセットのみを使用ことができる。群、科、属および種を表す
、より小さい再分割をつくって、ピラミッドの下部に伸長することさえできる。
tufおよびatpD配列は高度に保存され、各種とともに進化するので、プライマー
およびプローブの設計はデータベースまたはその再分割内のすべての配列を含む
必要がない。
【０１７１】 添付書類IV〜XX、XXIII〜XXXI、XXXVIIIおよびXLIIに例示されているように、
使用に依存して、制限された数の種からの配列を注意して選択して下記を表すこ
とができる：i）意図するプローブおよびプライマーを分化させる必要がある主
要な系統発生的分岐のみ、およびii) プローブおよびプライマーを合致させるこ
とが必要である種のみ。しかしながら、偏在的目的で、特に種の大きい群を同定
するプローブおよびプライマー（属、科、群または普遍的、または配列決定プラ
イマー）について、より多くのデータを配列分析の中に含めると、プローブおよ
びプライマーは各特定の意図する使用にいっそうよく適するであろう。同様に、
特定の目的のために、より大きいデータ組（またはレパートリー）は、非特異的
オリゴヌクレオチドを使用する機会を減少することによって、プライマーおよび
プローブの設計を最適とする。
【０１７２】 図3は、fusAから、ならびにストレプトマイシン（str）オペロン中のfusAの末
端とtufの開始との間の領域（第7表におけるfusA−tuf遺伝子間スペーサーと呼
ぶ）から、特定の増幅プライマーを設計するアプローチを図解する。 図4〜図6は実施例42に対する図解であるが、図7〜図10は実施例43を図解する
。図11および図12は実施例44を図解する。
【０１７３】 図面の説明文 図3。strオペロン中の普遍的増幅プライマー（配列番号1221〜1229）の概略的
体制化。アンプリコンのサイズは塩基対で与えられいる。fusA−tuf遺伝子間ス
ペーサーのサイズは細菌種に依存して変化するので、縮尺通りに描かれていない
。示されているアンプリコン長さは大腸菌（E. coli）についての長さである。
【０１７４】 図4。プログラムAlscrptを使用して図解された選択した種からの部分的tuf遺
伝子産物の架橋した多重アミノ酸配列整列。細菌において高度に保存された残基
は灰色でボックス化されており、そしてギャップは点で表示されている。裏面印
刷中の残基はエンテロコッカルtufBに対して、ならびにストレプトコッカルおよ
びラクトコッカルtuf遺伝子産物に対してユニークである。ナンバリングは大腸
菌（E. coli）EF−Tuに基づき、そして大腸菌（E. coli）EF−Tuの二次構造要
素は円筒形（α−ヘリックス）および矢印（β−鎖）により表される。
【０１７５】 図5。アミノ酸配列相同性に基づく細菌EF−Tuの距離マトリックス樹。この樹
は隣接結合法により構築された。この樹は外群として古細菌および真核生物EF−
1α遺伝子を使用して根付かせた。目盛りバーは、2つの種に接続する水平線のす
べてを合計することによって決定された、アミノ酸配列中の5％の変化を表す。 図6。プローブとしてエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）のtufAフ
ラグメントを使用する、いくつかのエンテロコッキ（ゲノムDNAをBamHI／PruII
で溶解したエンテロコッカス・カッセリフラブス（E. casseliflavus）および
エンテロコッカス・ガリナルム（E. gallinarum)を除外する）のBglII／XbaI消
化ゲノムのサザンハイブリダイゼーション。ハイブリダイゼーションするフラグ
メントのサイズはキロ塩基で示されている。試験した株は第16表に列挙されてい
る。
【０１７６】 図7。atpD遺伝子におけるパントエ（Pantoea）およびタツメラ（Tatumella）
種特異的特徴インデル（indel）。与えたヌクレオチド位置は大腸菌（E. coli
）ａｐｄ配列（遺伝子バンク受け入れ番号No. V00267）についての位置である
。ナンバリングは開始コドンの第1塩基から開始する。 図8。tuf（左側）およびatpD（右側）からの配列データに基づく樹。隣接結合
法を使用して系統発生分析を実施し、Kimuraの2パラメーター方法を使用して計
算した。各分岐上の値は750ブートストラップド樹における分岐形成順序の発生
率％を示す。
【０１７７】 図9。tuf（a）、atpD（b）、および16S rDNA（c）遺伝子に基づく腸内細菌科
（Enterobacteriaceae）科のメンバーの系統発生樹。隣接結合法を使用して樹を
発生させ、Kimuraの2パラメーター方法を使用して計算した。各分岐上の値は分
岐を支持するブートストラップ複製の百分率である。750のブートストラップ複
製を計算した。 図10。tuf距離 vs 16S rDNA距離（a）、atpD距離 vs 16S rDNA距離（b
）、atpD距離 vs tuf距離（c）のプロット。記号：○、同一種に属する株の対
間の距離；●、大腸菌（E. coli）株とシゲラ[赤痢菌]（Shigella）株と間の距
離；□、同一属に属する対間の距離；「黒正方形」、異なる属に属する対間の距
離；△、異なる属に科する対間の距離。
【０１７８】 実施例および添付書類 明瞭のために、実施例および添付書類のリストを記載する。 実施例1： 細菌atpD（F型およびV型）遺伝子フラグメントの配列決定。 実施例2： 真核生物atpD（F型およびV型）遺伝子フラグメントの配列決定。 実施例3： 真核生物tuf（EF−1）遺伝子フラグメントの配列決定。 実施例4： 真核生物tuf（オルガネラ由来、M）遺伝子フラグメントの配列決
定。 実施例5： tuf配列を使用するストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptoc
occus agalctiae）の特異的検出および同定。 実施例6： atpD配列を使用するストレプトコッカス・アガラクチエ（Strepto
coccus agalctiae）の特異的検出および同定。 実施例7： 属および種レベルにおけるスタフィロコッキの検出および同定の
ためのPCRアッセイの開発。
【０１７９】 実施例8： 2つの密接に関係する酵母種カンジダ・アルビカンス（Candida a
lbicans）とカンジダ・ヅブリニエンシス（Candida dubliniensis）との間の識
別。 実施例9： エンタメバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）の特異的
検出および同定。 実施例10： トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）の感受性検出
および同定。 実施例11：エンテロコッキの属特異的検出および同定。 実施例12： 多重PCR試験によりtuf配列を使用する主要な細菌の血小板汚染物
質の検出および同定。
【０１８０】 実施例13： tufおよびatpD配列データベースの分割力は生化学的細菌同定法
に匹敵する。 実施例14： 臨床検体からの群Bストレプトコッキの検出。 実施例15： ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］（Streptoc
occus pyogenes）およびそのパイロジェンエキソトキシンAの同時検出および同
定。 実施例16： シガ（Shiga）トキシン産生細菌の実時間検出および同定。 実施例17： 属および種レベルにおけるスタフィロコッキおよびその関連する
mecA遺伝子を検出および同定するPCRアッセイの開発。 実施例18： ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］（Streptoc
occus pneumoniae）のpbp1a、pbp2bおよびpbp2xの配列決定。
【０１８１】 実施例19： ストレプトコッカス（Streptococcus）種のhexA遺伝子の配列決
定。 実施例20： ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］（Streptoc
occus pyogenes）およびそのペニシリン耐性遺伝子を検出する多重PCRアッセイ
の開発。 実施例21： バンコマイシン耐性vanA、vanC1、vanC2およびvanC3遺伝子の配
列決定。 実施例22： 属および種レベルにおけるエンテロコッキおよびその関連する耐
性遺伝子vanAおよびvanBを検出および同定するPCRアッセイの開発。
【０１８２】 実施例23： バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス（Enterococc
us faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、
エンテロコッカス・ガリナヌム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカ
ス・カッセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、およびエンテロコッ
カス・フラヴェセンス（Enterococcus flavescens）を検出および同定する多重
PCRアッセイの開発。 実施例24： tuf配列のEF−G（fusA）再分割を包含する普遍的増幅。 実施例25： 任意のプライムドPCRによるスタヒロコッカス・サプロフィチカ
ス（Staphylococcus saprophyticus）からのDNAフラグメントの単離。
【０１８３】 実施例26： 原核生物tuf遺伝子フラグメントの配列決定。 実施例27： 原核生物recA遺伝子フラグメントの配列決定。 実施例28： tuf配列を使用する大腸菌（Escherichia coli）／シゲラ[赤痢
菌]（Shigella）種の特異的検出および同定。 実施例29： atpDを使用するクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneu
moniae）の特異的検出および同定。 実施例30： tuf配列を使用するアシネトバクター・ボゥマニイィ（Acinetoba
cter baumanii）の特異的検出および同定。 実施例31： tuf配列を使用するナイセリア・ゴノレエ［淋菌］（Neisseria
gonorrhaeae）の特異的検出および同定。 実施例32： gyrAおよびparC遺伝子フラグメントの配列決定。
【０１８４】 実施例33： スタヒロコッカス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（Staphyloco
ccus aureus）およびそのキノロン耐性遺伝子gyrAおよびparCを特異的に検出お
よび同定するPCRアッセイの開発。 実施例34： クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）および
そのそのキノロン耐性遺伝子gyrAおよびparCを特異的に検出および同定するPCR
アッセイの開発。 実施例35： ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］（Streptoc
occus pyogenes）およびそのそのキノロン耐性遺伝子gyrAおよびparCを特異的
に検出および同定するPCRアッセイの開発。 実施例36： 大腸菌（Escherichia coli）における拡張スペクトルTEM型β−
ラクタマーゼの検出。
【０１８５】 実施例37： クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）におけ
る拡張スペクトルSHV型β−ラクタマーゼの検出。 実施例38： ナイセリア・ゴノレエ［淋菌］（Neisseria gonorrhaeae）およ
びその関連するテトラサイクリン耐性遺伝子tetMを検出および同定するPCRアッ
セイの開発。 実施例39： シゲラ[赤痢菌]（Shigella）種およびそれらの関連するトリメト
プリン耐性遺伝子を検出および同定するPCRアッセイの開発。 実施例40： アシネトバクター・ボゥマニイィ（Acinetobacter baumanii）
およびその関連するアミノグリコシド耐性遺伝子aph（3'）−VIaを検出および同
定するPCRアッセイの開発。
【０１８６】 実施例41： atpD（V型）配列を使用するバクテロイデス・フラジリス（Bacte
roides fragilis）の特異的検出および同定。 実施例42： エンテロコッキ（Enterococci）における伸長因子Tuの進化にお
ける水平遺伝子移動の証拠。 実施例43： 腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の種の系統発生ツールとして
の伸長因子Tu（tuf）およびF−ATPアーゼベータ−サブユニット（atpD）。 実施例44： 米国特許第6,001,564号の目的である2つの種特異的ゲノムDNAフ
ラグメントから選択されたPCRプライマーの新しい試験用対。 実施例45： 米国特許第6,001,564号の目的であるいくつかのプライマーに由
来するプライマーの修飾された試験用バージョン。
【０１８７】 種々の添付書類は、種々のDNA増幅プライマー、核酸ハイブリダイゼーション
プローブおよび分子ビーコン内部プローブの検出に使用する方法を示す： （i） 添付書類Iはtuf配列からの核酸増幅に使用する増幅プライマーを示す
。 （ii） 添付書類IIはatpD配列からの核酸増幅に使用する増幅プライマーを示
す。 （iii） 添付書類IIIはtuf配列を検出するとき使用する内部ハイブリダイゼ
ーションプローブを示す。 （iv） 添付書類IVはF型のatpD配列に対して特異的な増幅プライマーの選択
に使用する方法を図解する。 （v） 添付書類VはV型のatpD配列に対して特異的な増幅プライマーの選択に
使用する方法を図解する。
【０１８８】 （vi） 添付書類VIはオルガネラ系統のtuf配列特異的な増幅プライマーの選
択に使用する方法を図解する（M、文字Mは、ほとんどの場合において、オルガネ
ラがミトコンドリアであることを示すために使用する）。 （vii） 添付書類VIIは真核生物tuf配列に対して特異的な増幅プライマーの
選択に使用する方法を図解する。 （viii） 添付書類VIIIはtuf配列からのストレプトコッカス・アガラクチエ
（Streptococcus agalctiae）特異的増幅プライマーの選択に使用する方法を図
解する。 （ix） 添付書類IXはtuf配列からのストレプトコッカス・アガラクチエ（Str
eptococcus agalctiae）特異的ハイブリダイゼーションプローブの選択に使用
する方法を図解する。
【０１８９】 （x） 添付書類XはatpD配列からのストレプトコッカス・アガラクチエ（Stre
ptococcus agalctiae）特異的増幅プライマーの選択に使用する方法を図解する
。 （xi） 添付書類XIは、tuf配列からカンジダ・アルビカンス／ヅブリニエ
ンシス（Candida albicans／dubliniensis）特異的増幅プライマー、カンジダ
・アルビカンス（Candida albicans）特異的ハイブリダイゼーションプローブ
およびカンジダ・ヅブリニエンシス（Candida dubliniensis）特異的ハイブリ
ダイゼーションプローブを選択する方法を図解する。 （xii） 添付書類XIIはtuf配列からスタヒロコッカス（Staphylococcus）特
異的増幅プライマーを選択する方法を図解する。 （xiii） 添付書類XIIIはtuf配列からスタヒロコッカス（Staphylococcus）
特異的ハイブリダイゼーションプローブを選択する方法を図解する。
【０１９０】 （xiv） 添付書類XIVは、tuf配列からスタヒロコッカス・サプロフィチカス
（Staphylococcus saprophyticus）特異的およびスタヒロコッカス・ヘモリチ
カス（Staphylococcus haemolyticus）特異的ハイブリダイゼーションプローブ
を選択する方法を図解する。 （xv） 添付書類XVは、tuf配列からスタヒロコッカス・アウレウス［黄色ブ
ドウ球菌］（Staphylococcus aureus）特異的および表皮ブドウ球菌（Staphylo
coccus epidermidis）特異的ハイブリダイゼーションプローブを選択する方法
を図解する。 （xvi） 添付書類XVIはtuf配列からスタヒロコッカス・ホミニス（Staphyloc
occus hominis）特異的ハイブリダイゼーションプローブを選択する方法を図解
する。 （xvii） 添付書類XVIIはtuf配列からエンテロコッカス（Enterococcus）特
異的増幅プライマーを選択する方法を図解する。
【０１９１】 （xviii） 添付書類XVIIIは、tuf配列からエンテロコッカス・フェカリス（E
nterococcus faecalis）特異的ハイブリダイゼーションプローブ、エンテロコ
ッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）特異的ハイブリダイゼーション
プローブおよびエンテロコッカス・カッセリフラブス−エンテロコッカス・フラ
ベセンス−ガリナルム（Enterococcus casseliflavus−flavescens)− gallina
rum)群特異的ハイブリダイゼーションプローブを選択する方法を図解する。 （xix） 添付書類XIXは血小板汚染因子を同定するtuf配列からプライマーを
選択する方法を図解する。 （xx） 添付書類XXはatpD配列から普遍的増幅プライマーを選択する方法を図
解する。 （xxi） 添付書類XXIはrecA配列からの核酸増幅に使用する増幅プライマーを
示す。
【０１９２】 （xxii） 添付書類XXIIはrecA配列からの核酸増幅に使用する特異的および偏
在的プライマーを示す。 （xxiii） 添付書類XXIIIはspeAからストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿
レンサ球菌］（Streptococcus pyogenes）特異的増幅プライマーを選択する第1
方法を図解する。 （xxiv） 添付書類XXIVはspeAからストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レ
ンサ球菌］（Streptococcus pyogenes）特異的増幅プライマーを選択する第2方
法を図解する。 （xxv） 添付書類XXVはtuf配列からストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿
レンサ球菌］（Streptococcus pyogenes）特異的増幅プライマーを選択する方
法を図解する。
【０１９３】 （xxvi） 添付書類XXVIはstx1特異的増幅プライマーおよびハイブリダイゼー
ションプローブを選択する方法を図解する。 （xxvii） 添付書類XXVIIはstx2特異的増幅プライマーおよびハイブリダイゼ
ーションプローブを選択する方法を図解する。 （xxviii） 添付書類XXVIIIはvan配列からvanA特異的増幅プライマーを選択
する方法を図解する。 （xxix） 添付書類XXIXはvan配列からvanB特異的増幅プライマーを選択する
方法を図解する。 （xxx） 添付書類XXXはvanC配列からvanC特異的増幅プライマーを選択する方
法を図解する。 （xxxi） 添付書類XXXIはpbp1a配列からストレプトコッカス・ニゥモニエ［
肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）特異的増幅プライマーを選択
する方法を図解する。
【０１９４】 （xxxii） 添付書類XXXIIはトキシン遺伝子配列から核酸を増幅するとき使用
する特異的および普遍的プライマーを示す。 （xxxiii） 添付書類XXXIIIはトキシン配列を特異的に検出するとき使用する
分子ビーコン内部ハイブリダイゼーションプローブを示す。 （xxxiv） 添付書類XXXIVはvan配列から核酸を増幅するとき使用する特異的
および普遍的プライマーを示す。 （xxxv） 添付書類XXXVはvan配列を特異的に検出するとき使用する内部ハイ
ブリダイゼーションプローブを示す。 （xxxvi） 添付書類XXXVIはpbp配列から核酸を増幅するとき使用する特異的
および普遍的プライマーを示す。 （xxxvii） 添付書類XXXVIIはpbp配列を特異的に検出するとき使用する内部
ハイブリダイゼーションプローブを示す。
【０１９５】 （xxxviii） 添付書類XXXVIIIは、van配列からvanAB特異的増幅プライマーお
よびvanAおよびvanB特異的ハイブリダイゼーションプローブを選択する方法を図
解する。 （xxxix） 添付書類XXXIXはmecAを特異的に検出するとき使用する内部ハイブ
リダイゼーションプローブを示す。 （xl） 添付書類XLはhexA配列から核酸を増幅するとき使用する特異的および
偏在的プライマーを示す。 （xli） 添付書類XLIはhexAを特異的に検出するとき使用する内部ハイブリダ
イゼーションプローブを示す。
【０１９６】 （xlii） 添付書類XLIIは、hexA配列からストレプトコッカス・ニゥモニエ［
肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）特異的増幅プライマーおよび
ハイブリダイゼーションプローブを選択する方法を図解する。 （xliii） 添付書類XLIIIはpcp配列から核酸を増幅するとき使用する特異的
および偏在的プライマーを示す。 （xliv） 添付書類XLIVは、未知のコーディング可能性を有するスタヒロコッ
カス・サプロフィチカス（S. saprophyticus）配列の核酸を増幅するとき使用
する特異的および偏在的プライマーを示す。 （xlv） 添付書類XLVは、抗菌剤耐性遺伝子配列を特異的に検出するとき使用
する分子ビーコン内部ハイブリダイゼーションプローブを示す。
【０１９７】 （xlvi） 添付書類XLVIは、未知のコーディング可能性を有するスタヒロコッ
カス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（S. aureus）遺伝子配列の核酸を増幅す
るとき使用する分子ビーコン内部ハイブリダイゼーションプローブを示す。 （xlvii） 添付書類XLVIIはtuf配列を特異的に検出するとき使用する分子ビ
ーコン内部ハイブリダイゼーションプローブを示す。 （xlviii） 添付書類XLVIIIは、ddlおよびmtl配列を特異的に検出するとき使
用する分子ビーコン内部ハイブリダイゼーションプローブを示す。 （xlix） 添付書類XLIXは、未知のコーディング可能性を有するスタヒロコッ
カス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（S. aureus）遺伝子配列の核酸を特異的
に検出するとき使用する内部ハイブリダイゼーションプローブを示す。
【０１９８】 （l） 添付書類Lは抗菌剤耐性遺伝子配列から核酸を増幅するとき使用する増
幅プライマーを示す。 （li） 添付書類LIは抗菌剤耐性遺伝子配列を特異的に検出するとき使用する
増幅プライマーを示す。 （lii） 添付書類LIIはatpD配列を特異的に検出するとき使用する分子ビーコ
ン内部ハイブリダイゼーションプローブを示す。 （liii） 添付書類LIIIはatpD配列を特異的に検出するとき使用する内部ハイ
ブリダイゼーションプローブを示す。 （liv） 添付書類LIVはddlおよびmtl配列を特異的に検出するとき使用する内
部ハイブリダイゼーションプローブを示す。
【０１９９】 これらの添付書類に示すように、選択された増幅プライマーはイノシンおよび
／または塩基の不明確さを含有する。イノシンは4つのヌクレオチドA、C、Gまた
はTの任意のものに特異的に結合することができるヌクレオチドアナローグであ
る。選択的に、誤対合部位に4つのヌクレオチドA、C、GまたはTの2以上を有する
オリゴヌクレオチド混合物から成るデジェネレイトオリゴヌクレオチドを使用し
た。増幅プライマーの中にイノシンおよび／またはデジェネラシーを含めると、
誤対合耐性が可能となり、これによりターゲットヌクレオチド配列のより広いア
レイの増幅が可能となる（DieffenbachおよびDveksler、1995、PCR Primer：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview
、New York）。
【０２００】 実施例 実施例1．細菌atpD（F型およびV型）遺伝子フラグメントの配列決定 添付書類IVに示すように、公衆に入手可能な種々の細菌種からのatpD（F型）
配列を比較すると、広い範囲の細菌種からatpD配列（F型）を増幅することがで
きるPCRプライマーの設計を可能とする保存された領域が明らかになった。プラ
イマー対配列番号566および567、566および814、568および567、570および567、
572および567、569および567、571および567、700および567を使用すると、atpD
配列配列番号242−270、272−398、673−674、737−767、866−867、942−955、
1245−1254、1256−1265、1527、1576、1577、1600−1604、1640−1646、1649、
1652、1655、1657、1659−1660、1671、1844−1845、および1849−1865を増幅し
、配列決定することができた。
【０２０１】 同様に、添付書類Vは広い範囲の古細菌および細菌種からV型のatpD配列を増幅
することができるPCRプライマーを設計する方法を示す。プライマー配列番号681
−683を使用して、atpD配列配列番号827−832、929−931、958および966を増幅
し、配列決定することができた。いくつかの種について遺伝子を増幅することは
困難であったので、これらの種についての配列情報を得るためにオリジナルのア
ンプリコン（配列番号1203〜1207）の内部に追加の増幅プライマーを設計した。
また、古細菌におけるatpD遺伝子（V型）領域を増幅するために、他のプライマ
ー（配列番号1212、1213、2282−2285）を設計した。
【０２０２】 実施例2．真核生物atpD（F型およびV型）遺伝子フラグメントの配列決定 公衆に入手可能な真菌および寄生生物種からのatpD（F型）配列を比較すると
、広い範囲の真菌および寄生生物種からatpD配列を増幅することができるPCRプ
ライマーの設計を可能とする保存された領域が明らかになった。プライマー対配
列番号568および573、574および573、574および708、および566および567を使用
すると、atpD配列配列番号458−497、530−538、663、667、676、678−680、768
−778、856−862、889−896、941、1638−1639、1647、1650−1651、1653−1654
、1656、1658、1684、1846−1848、および2189−2192を増幅し、配列決定するこ
とができた。
【０２０３】 同様な方法において、添付書類Vに記載されているプライマー（配列番号681−
683）は種々の真菌および寄生生物種からatpD（V型）遺伝子を増幅することがで
きた。この方法により、配列番号834−839、956−957、および959−965を得るこ
とができた。
【０２０４】 実施例3．真核生物tuf（EF−1）遺伝子フラグメントの配列決定 添付書類VIIに示すように、公衆に入手可能な真菌および寄生生物種からのtuf
（EF−1）配列を比較すると、広い範囲の真菌および寄生生物種からtuf配列を増
幅することができるPCRプライマーの設計を可能とする保存された領域が明らか
になった。プライマー対配列番号558および559、813および559、558および815、
560および559、653および559、558および655、および654および559、1999および
2000、2001および2003、2002および2003を使用すると、tuf配列配列番号399−45
7、509−529、622−624、677、779−790、840−842、865、897−903、1266−128
7、1561−1571および1685を増幅し、配列決定することができた。
【０２０５】 実施例4．真核tuf（オルガネラ由来、M）遺伝子フラグメントの配列決定 添付書類VIに示すように、公衆に入手可能な真菌および寄生生物オルガネラか
らのtuf（オルガネラ由来、M）配列を比較すると、広い範囲の真菌および寄生生
物種からtuf配列を増幅することができるPCRプライマーの設計を可能とする保存
された領域が明らかになった。プライマー対配列番号664および652、664および5
61、911および914、912および914、913および915、916および561、664および917
を使用すると、tuf配列配列番号498−508、791−792、843−855、904−910、166
4、1666−1667、1669−1670、1673−1683、1686−1689、1874−1876、1879、195
6−1960、および2193−2199を増幅し、配列決定することができた。
【０２０６】 実施例5．tuf配列を使用するストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococ cus agalctiae）の特異的検出および同定 添付書類VIIIに示すように、種々の細菌種のtuf配列を比較すると、ストレプ
トコッカス・アガラクチエ（S. agalctiae）に対して特異的なPCRプライマーを
選択することができる。PCRプライマーを設計するために使用した方法は、種々
のtuf配列の多重配列整列に基づく。多重配列整列は、ターゲット種からの4つの
細菌種のtuf配列ならびに他の種および細菌種、特に密接に関係する種の代表的
なものからのtuf配列を包含する。この整列を注意して解析すると、ターゲット
種内に保存されるが、他の種および属から、特に密接に関係する種から配列を識
別するオリゴヌクレオチド配列を選択することができ、これによりターゲット細
菌種の種特異的、偏在的および感受的検出が可能となる。
【０２０７】 選択されたプライマー対、オリゴ配列番号549および配列番号550は、252bpの
増幅生成物を与える。0.4μMの各プライマー、2.5mMのMgCl2、0.05mMのBSA、1×
Taq緩衝液（Promega）、0.2mMのdNTP（Pharmingen）、0.5単位のTaqStarTM抗体
（Clontech Laboratories，Inc.、パロアルト）とカップリングした0.5単位のT
aqDNAポリメラーゼ（Promega）、1μgのゲノムDNA試料を20μlの最終体積で使用
して、PTC−200サーマルサイクラー（MJ Research Inc.）により、標準PCRを
実施した。最大の感受性および特異性の最適なサイクリング条件は次の通りであ
った：95℃において3分の初期変性、次いで95℃において1秒および62℃において
30秒から成る2工程の40サイクル、次いで72℃において2分間の末端のエクステン
ション。0.25μg／mlの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（2％）中の電
気泳動により、PCR生成物を検出した。
【０２０８】 第8表に列挙されている細菌種の各々からのゲノムDNAの0.1ngをPCR反応に添加
することによって、アッセイの特異性を試験した。効率よい増幅は列挙した5つ
のストレプトコッカス・アガラクチエ（S. agalctiae）についてのみ観測され
た。膣のフローラを代表する32種および27の他のストレプトコッカル種を包含す
る、他の細菌種のうちで、ストレプトコッカス・アシドミニマス（S. acidomin
imus）のみが増幅を生じた。0.1ngのストレプトコッカス・アシドミニマス（S. acidominimus）ゲノムDNAを使用するシグナルは弱く、この種についての検出
限界は10pg（4000より多いゲノムコピーに対応する）であったが、ストレプトコ
ッカス・アガラクチエ（S. agalctiae）についての検出限界は2.5fg（1ゲノム
コピーに対応する）のゲノムDNAであった。
【０２０９】 アッセイの特異性を増加するために、LigntCyclerTM（Idaho Technology）を
使用するFRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）検出のために、
内部プローブを設計した。添付書類IXに例示されているように、プライマー配列
番号549および配列番号550により増幅された252bpの領域に対応するストレプト
コッカルtuf配列の多重配列整列を使用して、内部プローブTSagHG436（配列番号
582）およびTSagHG465（配列番号583）を設計した。
【０２１０】 内部プローブために選択したアンプリコン領域はストレプトコッカス・アガラ
クチエ（S. agalctiae）に対してユニークでありかつ特異的である配列を含有
した。配列番号583、いっそう特異的なプローブは3'においてフルオレセインで
標識化されるが、配列番号582、より低い識別性のプローブは5'においてCV5で標
識化された、3'においてホスフェート基でブロックされる。しかしながら、両方
のプローブが同一ターゲットアンプリコン上で隣接してハイブリダイゼーション
される場合にのみ、FRETシグナルは放射されるので、検出は高度に特異的である
。
【０２１１】 LigntCyclerTM中で、0.4μMの各プライマー（配列番号549〜550）、0.2μMの
各プローブ（配列番号582〜583）、2.5mMのMgCl2、450μg／mlのBSA、1×PC2緩
衝液（AB Peptides、ミゾリー州セントルイス）、0.2mMのdNTP（Pharmingen）
、TaqStarTM抗体（Clontech Laboratories，Inc.、パロアルト）とカップリン
グした0.5単位のKlenTaq1TMDNAポリメラーゼ（AB Peptides）、0.7μgのゲノム
DNA試料を7μlの最終体積で使用して、LigntCyclerサーマルサイクラー（Idaho Technology）により、PCR生成物の実時間検出を実施した。最大の感受性およ
び特異性の最適なサイクリング条件は次の通りであった：95℃において3分の初
期変性、次いで94℃において0秒（この設定はLigntCyclerがターゲット温度に到
達し、そこに最小量の時間の間止まることを意味する）、62℃において10秒、72
℃において20秒のから成る3工程の40サイクル。
【０２１２】 各アニーリング工程間に蛍光比を使用して、増幅をモニターした。LigntCycle
r中で0.07ngのゲノムDNA／反応を使用して、ストレプトコッカス・アガラクチエ
（S. agalctiae）のtuf配列と密接な配列相同性を有するストレプトコッカル種
（S. acidominimus、S. anginosus、S. bovis、S. dysgalctiae、S. equi
、S. ferus、S. gordonii、S. intermedius、S. parasanguis、S. paraube
ris、S. salivarius、S. sanguis、S. suis）ならびにストレプトコッカス・
アガラクチエ（S. agalctiae）を試験した。ストレプトコッカス・アガラクチ
エ（S. agalctiae）のみが増幅シグナルを生じ、それゆえこのアッセイは種特
異的であることが証明された。内部FRETプローブを使用するLigntCyclerTMアッ
セイでは、ストレプトコッカス・アガラクチエ（S. agalctiae）の検出限界は1
〜2ゲノムコピーのゲノムDNAであった。
【０２１３】 実施例6．atpD配列を使用するストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptoco ccus agalctiae）の特異的検出および同定 添付書類Xに示すように、種々の細菌種からのatpD配列を比較すると、ストレ
プトコッカス・アガラクチエ（S. agalctiae）に対して特異的なPCRプライマー
を選択することができた。プライマーの設計法は、atpD配列を整列において使用
した以外、先行する実施例に記載されている法に類似する。 4つのプライマーを使用した、ASag42（配列番号627）、ASag52（配列番号628
）、Sag206（配列番号625）およびASag371（配列番号626）。これらの4つのプラ
イマーの下記の汚染因子は下記のアンプリコンを与えた：配列番号627＋配列番
号625＝190bp、配列番号628＋配列番号625＝180bp、配列番号627＋配列番号626
＝355bpおよび配列番号628＋配列番号626＝345bp。
【０２１４】 0.4μMの各プライマー、2.5mMのMgCl2、0.05mMのBSA、1×Taq緩衝液（Promega
）、0.2mMのdNTP（Pharmingen）、TaqStarTM抗体（Clontech Laboratories，In
c.、パロアルト）とカップリングした0.5単位のTaqDNAポリメラーゼ（Promega）
、1μgのゲノムDNA試料を20μlの最終体積で使用して、PTC−200サーマルサイク
ラー（MJ Research Inc.）により、標準PCRを実施した。最大の感受性および
特異性の最適なサイクリング条件を各プライマー対について隣接した。95℃にお
いて3分の初期変性、次いで95℃において1秒および62℃において30秒から成る2
工程の40サイクル、次いで72℃において2分間の末端のエクステンション。0.25
μg／mlの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（2％）中の電気泳動により
、PCR生成物を検出した。atpD配列はtuf配列よりも比較的いっそう特異的である
ので、最も密接に関係する種のみ、すなわち、第9表に列挙されているストレプ
トコッカル種を試験した。
【０２１５】 すべての4つのプライマー対は6つのストレプトコッカス・アガラクチエ（S.
agalctiae）のみを増幅した。63℃のアニーリング温度では、プライマー対、配
列番号627＋配列番号625は1〜5fg（1〜2ゲノムコピーに等しい）の感受性を有し
た。55℃において、プライマー対、配列番号628＋配列番号625は2.5fg（1ゲノム
コピーに等しい）の感受性を有した。60℃において、プライマー対、配列番号62
7＋配列番号626は10fg（4ゲノムコピーに等しい）の感受性を有した。58℃にお
いて、プライマー対、配列番号628＋配列番号626は2.5〜5fg（1〜2ゲノムコピー
に等しい）の感受性を有した。
【０２１６】 これにより証明されるように、すべての4つのプライマー対は高い特異性およ
び感受性を有するストレプトコッカス・アガラクチエ（S. agalctiae）を検出
することができる。実施例5と一緒に、この実施例はtufおよびatpD配列の両方が
種レベルにおいて微生物を同定するための適当な、柔軟性あるターゲットである
ことを証明する。atpD配列に基づく4つの異なるプライマー対がストレプトコッ
カス・アガラクチエ（S. agalctiae）の効率よい、特異的増幅に導くという事
実は、課題がこれらのターゲット配列からプライマー対を発見することよりむし
ろ、診断目的に適当なターゲット遺伝子を発見することであることを証明する。
【０２１７】 実施例7．属および種レベルにおけるストレプトコッキを検出および同定するP CRアッセイの開発 材料および方法 細菌種 33のグラム陰性細菌種および47のグラム陽性細菌種から成るATCC（American
Type Culture Collection）およびDSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorg
anismen und Zellkulturen GmbH；微生物および細胞培養のドイツ国コレクシ
ョン）の参照株のパネルを使用することによって、PCRアッセイの特異性を確認
した（第12表）。さらに、微生物学研究所（Centre Hospitalier Unviversita
ire de Qu bec、Pavillon Centre Hospitalier de l'Universit Laval
（CHUL）（Ste−Foy、Qu bec、カナダ国）からのスタフィロコッキの11の異なる
種を代表する295の臨床分離株をまた試験して、スタヒロコッカス（Staphylococ
cus）特異的PCRアッセイを確認した。
【０２１８】 これらの株のすべては（i）慣用法または（ii）陽性BPコンボパンル型6（Posi
tive BP Combo Panel Type 6）（Dade Diagnostics、Mississauga、Ontar
io，カナダ国）を装備した自動化マイクロスキャン・オウトスキャン（MicroSca
n Autoscan）−4システムを使用して同定された。10％のグリセロールを含有す
る脳心臓浸出（BHI）ブロス中で−80℃に保持した凍結ストックからの細菌種を
、ヒツジ血液寒天上で、またはBHIブロス（Quelab Laboratories Inc.、Montr
al、Qu bec、カナダ国）中で培養した。
【０２１９】 PCRプライマーおよび内部プローブ 多重配列整列に基づいて、スタフィロコッキに対してユニークなtuf遺伝子の
領域を同定した。これらの領域から、スタヒロコッカス（Staphylococcus）特異
的PCRプライマーTSaG422（配列番号533）およびTSaG765422（配列番号575533）
を誘導した（添付書類XII）。我々の特許公開WO 98／20157に記載されているオ
リジナルのスタヒロコッカス（Staphylococcus）特異的PCRプライマー（前記特
許公開明細書中の配列番号17および20）に対して比較して、これらのPCRプライ
マーは2つのヌクレオチド位置において置換されている。いくつかの追加のスタ
フィロコッカル種および株において明らかにされた新しいtuf配列のデータに照
らして、プライマー対の特異的および偏在性を確実するために、これらの修飾を
実施した。
【０２２０】 同様に、配列整列分析を実行して属および種特異的内部プローブを設計した（
添付書類XIII〜XVI参照）。スタヒロコッカス（Staphylococcus）に対して特異
的な2つの内部プローブ（配列番号605〜606）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）
に対して特異的な5つのプローブ（配列番号584〜588）、表皮ブドウ球菌（S. e
pidermidis）に対して特異的な5つのプローブ（配列番号589〜593）、スタヒロ
コッカス・ヘモリチカス（S. haemolyticus）に対して特異的な2つのプローブ
（配列番号594〜595）、スタヒロコッカス・ホミニス（S. hominis）に対して
特異的な3つのプローブ（配列番号596〜598）、スタヒロコッカス・サプロフィ
チカス（S. saprophyticus）に対して特異的な4つのプローブ（配列番号599〜6
01および695）、
【０２２１】 および表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、スタヒロコッカス・ホミニス（S
. hominis）、スタヒロコッカス・サプロフィチカス（S. saprophyticus）、
ストレプトコッカス・アウリカラリス（S. auricularis）、ストレプトコッカ
ス・カピチス（S. capitis）、スタヒロコッカス・ヘモリチカス（S. haemoly
ticus）、スタヒロコッカス・ルグヅネンシス（S. lugdunensis）、スタヒロコ
ッカス・シムランス（S. simulans）およびスタヒロコッカス・ワルネリ（S.
warneri）を包含するコアグラーゼ陰性スタヒロコッカス（Staphylococcus）種
に対して特異的な2つのプローブ（配列番号1175〜1176）を設計した。
【０２２２】 スタヒロコッカス（Staphylococcus）特異的な371bpのアンプリコンと20マー
の種特異的内部プローブの各との間のミスマッチの範囲は、可能なときプローブ
の中央において、1〜5であった。分析した11種についての2つのスタヒロコッカ
ス（Staphylococcus）特異的プローブの中にミスマッチは存在しなかった：黄色
ブドウ球菌（S. aureus）、ストレプトコッカス・コーニイ（S. cohnii）、表
皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、スタヒロコッカス・ヘモリチカス（S. hae
molyticus）、スタヒロコッカス・ホミニス（S. hominis）、スタヒロコッカス
・ルグヅネンシス（S. lugdunensis）、スタヒロコッカス・サプロフィチカス
（S. saprophyticus）、スタヒロコッカス・シムランス（S. simulans）およ
びスタヒロコッカス・ワルネリ（S. warneri）。
【０２２３】 ヌクレオチド配列の内部の特異的配列保存を確認するために、5つのATCCおよ
び種黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、ス
タヒロコッカス・ヘモリチカス（S. haemolyticus）、スタヒロコッカス・ホミ
ニス（S. hominis）およびスタヒロコッカス・サプロフィチカス（S. saproph
yticus）の各々の臨床株から371bpのアンプリコンについて配列を獲得した。Oli
goTM（バージョン5.0）プライマー解析ソフトウェア（National Biosciences、
Plymouth、Minn.）を使用して、プライマーまたはプローブ内または間の自己相
補的領域の非存在を確認した。
【０２２４】 必要に応じて、プライマーは1またはそれ以上の可変位置にイノシンまたはデ
ジェネレイトヌクレオチドを含有した。オリゴヌクレオチドのプライマーおよび
プローブをモデル394DNA合成装置（Applied Biosystems、Mississauga、Ontari
o、カナダ国）により合成した。スタヒロコッカス（Staphylococcus）特異的PCR
アッセイを使用して増幅間に組込まれたDIG標識化dUTPを使用して、ハイブリダ
イゼーションを検出し、そして増幅生成物のルミネセンス検出に関する節におい
て前述したように、ハイブリダイゼーションシグナルをルミノメーター（Dynex Technologies）で検出した。いくつかの内部プローブを選択する法は、添付書
類XIII〜XVIに例示されている。
【０２２５】 PCR増幅 すべての細菌種について、精製したゲノムDNAから、または濁り度をほぼ1.5×
108細菌／mlに対応する、0.5McFarland標準のそれに調節した、細菌懸濁液から
、増幅を実行した。1ngのゲノムDNAまたは1μgの標準化細菌懸濁液を19μlのPCR
混合物に直接移した。各PCR反応は、50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH9.0）、0.
1％のトリトンX−100、2.5mMのMgCl2、0.2μM（各々）の2つのスタヒロコッカス
（Staphylococcus）属特異的プライマー（配列番号553および575）、200μM（各
々）の4つのデオキシヌクレオチド三リン酸（Pharmacia Biotech）、3.3μg／
μlのウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma、Aldrich Canada Ltd、Oakville、O
ntario，カナダ国）およびTaqStarTM抗体（Clontech）とカップリングした0.5単
位のTaqDNAポリメラーゼ（Promega）を含有した。
【０２２６】 PCR増幅を次のようにして実施した：94℃において3分の初期変性、次いで95℃
において1秒および55℃において30秒から成る2工程の40サイクル、次いで72℃に
おいて2分間の末端のエクステンション。0.25μg／mlの臭化エチジウムを含有す
るアガロースゲル（2％）中の電気泳動により、PCR生成物を検出した。254nmに
おける紫外線下に、PCR生成物を可視化した。 PCRアッセイの感受性を測定するために、精製したゲノムDNAの2倍希釈物を使
用して、検出できるゲノムコピーの最小数を測定した。
【０２２７】 結果 スタヒロコッカス（Staphylococcus）属特異的PCRアッセイを使用する増幅 第12表に列挙されているグラム陽性（8属から47種）およびグラム陰性（22属
から33種）の細菌種のパネルを使用して30サイクルおよび40サイクルのPCR増幅
を実行することによって、アッセイの特異性を評価した。PCRアッセイは、30サ
イクルおよび40サイクルのPCR増幅において試験した27のスタフィロコッカル種
のうちの27を効率よく検出することができた。30サイクルのPCRについて、スタ
フィロコッキ以外の試験したすべての細菌種は陰性であった。40サイクルのPCR
について、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）およびマ
クロコッカス・カセエオリチカス（Macrococcus caseolyticus）はスタヒロコ
ッカス（Staphylococcus）特異的PCRアッセイに対してわずかに陰性であった。
【０２２８】 試験した他の種は陰性に止まった。微生物学研究所（Centre Hospitalier U
nviversitaire de Qu bec、Pavillon Centre Hospitalier de l'Universi
t Laval（CHUL）により提供された、下記の臨床分離株を包含する、295の臨床
分離株の集合物について偏在性試験を実施した：黄色ブドウ球菌（Staphylococc
us aureus）（ｎ＝34）、ストレプトコッカス・アウリカラリス（S. auricula
ris）（ｎ＝2）、ストレプトコッカス・カピチス（S. capitis）（ｎ＝19）、
ストレプトコッカス・コーニイ（S. cohnii）（ｎ＝5）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）（ｎ＝18）、スタヒロコッカス・ヘモリチカス（S. haemolyti
cus）（ｎ＝21）、スタヒロコッカス・ホミニス（S. hominis）（ｎ＝73）、ス
タヒロコッカス・ルグヅネンシス（S. lugdunensis）（ｎ＝17）、スタヒロコ
ッカス・サプロフィチカス（S. saprophyticus）（ｎ＝6）、スタヒロコッカス
・シムランス（S. simulans）（ｎ＝3）、スタヒロコッカス・ワルネリ（S. w
arneri）（ｎ＝32）およびスタヒロコッカス（Staphylococcus）種（ｎ＝65）。
偏在性試験により、30サイクルのPCRアッセイにおける均一な増幅シグナルおよ
び遺伝子型と古典的同定スキームとの間の完全な関係が示された。
【０２２９】 前述の11のスタフィロコッカル種からの精製したゲノムDNAを使用することに
よって、30サイクルおよび40サイクルのPCRプロトコルによるスタヒロコッカス
（Staphylococcus）特異的アッセイの感受性を測定した。30サイクルのPCRにつ
いて、ゲノムDNAの50コピーの検出限界が終始一貫して得られた。アッセイの感
受性を増強するために、サイクル数を増加した。40サイクルのPCRアッセイにつ
いて、検出限界は、試験したスタフィロコッカル種に依存して、5〜10ゲノムコ
ピーの範囲に低下した。
【０２３０】 スタヒロコッカス（Staphylococcus）特異的371bpのアンプリコンと種特異的
または属特異的内部プローブとの間のハイブリダイゼーション 種間の多形性は、ヒト疾患に関係する主要な種の各々についての種特異的内部
プローブを発生させるために十分であった（黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表
皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、スタヒロコッカス・ヘモリチカス（S. hae
molyticus）、スタヒロコッカス・ホミニス（S. hominis）およびスタヒロコッ
カス・サプロフィチカス（S. saprophyticus））。
【０２３１】 ヌクレオチド配列の種内配列保存を確認するために、5つの無関係のATCCおよ
び5つの主要なスタフィロコッカル種の各々についての臨床株：黄色ブドウ球菌
（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、スタヒロコッカス・ヘ
モリチカス（S. haemolyticus）、スタヒロコッカス・ホミニス（S. hominis
）およびスタヒロコッカス・サプロフィチカス（S. saprophyticus））からの3
71bpのアンプリコンについて、配列を比較した。
【０２３２】 結果は同一種からの異なる無関係の株間のヌクレオチド配列の高いレベルの保
存を示した。この配列情報は、371bpのアンプリコンに対してハイブリダイゼー
ションする種特異的内部プローブを使用するスタフィロコッカル種同定アッセイ
の開発を可能とした。これらのアッセイは、それらの5つのスタフィロコッカル
種に対して特異的でありかつ偏在的である。種特異的内部プローブに加えて、属
特異的内部プローブは試験したすべてまたは大部分のスタヒロコッカス（Staphy
lococcus）特異的種を認識することができた。
【０２３３】 実施例8．2つの密接に関係する酵母種カンジダ・アルビカンス（Candida alb icans）とカンジダ・ヅブリニエンシス（Candida dubliniensis）との間の識別 微生物の2つの非常に密接に関係する種を識別できることは、臨床医にとって
しばしば有効である。カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）は侵入性
ヒト真菌症の最も重要な原因である。最近数年間に、非常に密接に関係する種、
カンジダ・ヅブリニエンシス（Candida dubliniensis）は免疫抑制患者におい
て単離された。これらの2つの種は古典的方法により区別することが困難である
。この実施例において、tuf配列を使用してカンジダ・アルビカンス（Candida
albicans）およびカンジダ・ヅブリニエンシス（Candida dubliniensis）を識
別することを証明する。
【０２３４】 両方の種からのtuf（伸長因子1アルファ型）フラグメントを特異的に増幅する
能力について、以前の特許公開WO 98／20157からのPCRプライマー配列番号11〜
12を選択した（プライマー位置については添付書類XI参照）。tufフラグメント
内で、2つのヌクレオチドによりカンジダ・アルビカンス（C. albicans）およ
びカンジダ・ヅブリニエンシス（C. dubliniensis）を識別する領域を選択し、
各種に対して特異的な2つの内部プローブ（プローブ、配列番号577および578の
設計について添付書類XI参照）。
【０２３５】 増幅生成物の化学発光的検出に関する節において前述したように、DIG−11−d
UTPを使用して、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）およびカンジダ・ヅ
ブリニエンシス（C. dubliniensis）からのゲノムDNAの増幅を実施した。内部
プローブ配列番号577および578を個々にマイクロタイタープレートの底上に固定
化し、増幅生成物の化学発光的検出に関する節において前述したように、ハイブ
リダイゼーションを実施した。ルミノメーターのデータにより、カンジダ・アル
ビカンス（C. albicans）からのアンプリコンはプローブ配列番号577に対して
のみハイブリダイゼーションするが、カンジダ・ヅブリニエンシス（C. dublin
iensis）からのアンプリコンはプローブ配列番号578に対してのみハイブリダイ
ゼーションすることが証明され、これにより各プローブは種特異的であることが
証明された。
【０２３６】 実施例9．エンタメバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）の特異的同
定 tuf（伸長因子1アルファ）配列データを解析すると、エンタメバ・ヒストリチ
カ（Entamoeba histolytica）配列が保存されているままであるが、他の寄生生
物および真核生物種が分岐されている、4つの領域を見出すことができた。配列
番号703が3つの他のプライマーと対合できるように、プライマーTEntG38（配列
番号703）、TEntG442（配列番号704）、TEntG534（配列番号705）およびTEntG76
8（配列番号706）を設計した。PTC−200サーマルサイクラー（MJ Research）に
より、初期感受性および特異性試験のサイクリング条件は次の通りであった：95
℃において3分の初期変性、次いで95℃において1秒および62℃において30秒から
成る2工程の40サイクル、次いで72℃において2分間の末端のエクステンション。
【０２３７】 0.25μg／mlの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（2％）中の電気泳動
により、PCR生成物を検出した。3つのプライマー対を使用して、200より少ない
等価のエンタメバ・ヒストリチカ（E. histolytica）ゲノムコピーを検出する
ことができた。バベシア・ボビス（Babesia bovis）、バベシア・ミクロッチ（
Babesia microtti）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリシ
ディア・ファシクラタ（Crithida fasciculata）、レイシュマニア・メイジャ
ー（Leishmania major）、レイシュマニア・ヘルチギ（Leishmania hertigi）
およびネオスポラ・カニヌム（Neospora canimum）を包含する微生物パネルか
ら精製したゲノムDNAの0.5ngを使用して、特異性を試験した。エンタメバ・ヒス
トリチカ（E. histolytica）DNAのみを増幅することができ、これによりこのア
ッセイは種特異的であることが示唆された。
【０２３８】 実施例10．クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の特異的同 定 tuf配列データを解析すると、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia tracho
matis）配列が保存されているままであるが、他の種が分岐されている、2つの領
域を見出すことができた。プライマーCtr82（配列番号554）およびCtr249（配列
番号555）を設計した。PTC−200サーマルサイクラー（MJ Research）を使用し
て、最大感受性および特異性試験の最適なサイクリング条件は次の通りであるこ
とが決定された：94℃において3分の初期変性、次いで95℃において1秒および60
℃において30秒から成る2工程の40サイクル、次いで72℃において2分間の末端の
エクステンション。0.25μg／mlの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（2
％）中の電気泳動により、PCR生成物を検出した。
【０２３９】 膣フローラにおいて直面する22種を包含する微生物パネルから精製したゲノム
DNAの0.1ngを使用して、特異性を試験した（枯草菌（Bacillus subtilis）、バ
クテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、カンジダ・アルビカン
ス（C. albicans）、クロストリジウム・ディフィサイル（Clostridium diffi
cile）、コリネバクテリウム・セルヴィシス（Corynebacterium cervicis）、
コリネバクテリウム・ウレアリチカム（Corynebacterium urealyticum）、エン
テロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フ
ェシウム（Enterococcus faecium）、大腸菌（Escherichia coli）、フソバク
テリウム・ヌクレアツム（Fusobacterium nucleatum）、ガードネレラ・バギナ
リス（Gardnerella vaginalis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza
e）、
【０２４０】 クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、ラクトバシラス・アシ
ドフィリス（Lactobacillus acidophilus）、ペプトコッカス・ニガー（Peptoc
occus niger）、ペプトストレプトコッカス・プレボチイ（Peptostreptococcus prevotii）、ポルフィロマナス・アサッカロリチカ（Porphyromonas asaccha
rolytica）、プレヴォテラ・メラニノゲニカ（Prevotella melaninogenica）、
プロピニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）、黄色ブドウ球
菌（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・アシドミニマス（Strept
ococcus acidominimus）、およびストレプトコッカス・アガラクチエ（Strepto
coccus agalctiae））。クラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）DNAの
みを増幅することができ、これによりこのアッセイは種特異的であることが示唆
された。
【０２４１】 実施例11．エンテロコッキの属特異的検出および同定 tuf配列データを解析し、tuf配列のレパートリーと比較すると、エンテロコッ
カス（Enterococcus）配列が保存されているままであるが、他の属が分岐されて
いる、2つの領域を見出すことができた（添付書類XVII）。第10表に列挙されて
いる細菌のパネルからの精製したゲノムDNAを使用することによって、プライマ
ー対Encg313dFおよびEncg559c（配列番号1137および1136）をその特異性につい
て試験した。
【０２４２】 PTC−200サーマルサイクラー（MJ Research）を使用して、最大感受性および
特異性試験の最適なサイクリング条件は次の通りであることが決定された：94℃
において3分の初期変性、次いで95℃において1秒および55℃において30秒から成
る2工程の40サイクル、次いで72℃において2分間の末端のエクステンション。0.
25μg／mlの臭化エチジウムを含有するアガロースゲル（2％）中の電気泳動によ
り、PCR生成物を検出した。254nmにおいて紫外線下にPCR生成物を可視化した。
【０２４３】 第10表に列挙されている18のエンテロコッカル種のすべては効率的に増幅され
た。増幅されたわずかの他の種は、3つのグラム陽性種、アビオトロフィア・ア
ジアセンス（Abiotrophia adiacens）、ゲメラ・ヘモリサンス（Gemella haem
olysans）およびゲメラ・モルビロルム（Gemella morbillorum）であった。エ
ンテロコッカス・カッセリフラブス（E. casseliflavus)、エンテロコッカス・
フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）
、エンテロコッカス・フラベセンス（E. flavescens）およびエンテロコッカス
・ガリナルム（E. gallinarum)の種、および第10表に列挙されている各他のエ
ンテロコッカス（Enterococcus）種の1つの種を使用して試験した感受性は、1〜
10コピーのゲノムDNAの範囲であった。
【０２４４】 308bpのアンプリコン内の配列変動は十分であったので、内部プローブを使用
してアンプリコンを種分化させ、アビオトロフィア・アジアセンス（Abiotrophi
a adiacens）、ゲメラ・ヘモリサンス（Gemella haemolysans）およびゲメラ
・モルビロルム（Gemella morbillorum）からのエンテロコッキを識別すること
ができ、これによりきわめてすぐれた特異的を達成することができた。
【０２４５】 種特異的内部プローブを臨床的に重要な種、エンテロコッカス・フェカリス（
E. faecalis）（配列番号1174）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faeciu
m）（配列番号602）の各々、およびエンテロコッカス・カッセリフラブス（E.
casseliflavus)、エンテロコッカス・フラベセンス（E. flavescens）およびエ
ンテロコッカス・ガリナルム（E. gallinarum)（配列番号1122）を包含する群
について発生させた（添付書類XVIII）。種特異的内部プローブは、すべての他
のエンテロコッカス（Enterococcus）種からのそれらのそれぞれのエンテロコッ
カス（Enterococcus）種を識別することができた。これらのアッセイは、それら
の5つのエンテロコッカス（Enterococcus）種について感受的、特異的および偏
在的であった。
【０２４６】 実施例12．多重PCR試験によるtuf配列を使用する主要な細菌の血小板汚染因子 の同定 血液調製物は細菌汚染についてモニターすることが必要である。血小板の17の
重要な細菌汚染因子のtuf配列を整列させた。添付書類XIXに示すように、これら
の配列分析はPCRプライマーの設計を可能とした。血小板濃縮物の汚染の場合に
おいて、すべての種（いっそう頻繁に直面するものではない）の検出は望ましい
ので、プライマーの完全な特異性は設計における問題ではない。しかしながら、
感受性は重要である。なぜなら、選択したプライマーはtuf配列の高度に保存さ
れた領域をターゲットとするので、それらのプライマーがいずれにしても設計に
おいて使用した17より多い種を増幅することができることを知ると、多すぎるデ
ジェネラシーを導入しなくてはならないことを回避するために、最も頻繁な汚染
因子のみをプライマーの設計に含めたからである。
【０２４７】 血小板濃厚物のこれらの17の主要な細菌汚染因子の中に保存されているオリゴ
ヌクレオチド配列を選択し（オリゴTplaq769およびTplaq991、それぞれ配列番号
636および637）これによりこれらの細菌種を検出することができた。しかしなが
ら、ストレプトコッキでは感受性がわずかに欠乏している。すべてのいっそう頻
繁な細菌汚染因子の検出において最大の感受性を保証するために、またスタヒロ
コッカス（Staphylococcus）種をターゲッティングするオリゴヌクレオチドプラ
イマーを包含する多重アッセイ（オリゴStag422、配列番号553；およびStag765
、配列番号575）を開発した。このアッセイで検出された細菌種を第14表に列挙
する。
【０２４８】 プライマー対、245pbの増幅生成物を与えるオリゴ配列番号636および配列番号
637、および368bpの増幅生成物を与えるオリゴ配列番号553および配列番号575を
、多重PCRアッセイにおいて同時に使用した。SYBRR Green I（Molecular Pro
be Inc.）を使用してLigntCyclerサーマルサイクラー（Idaho Technology）に
より、これらのPCR生成物を検出した。SYBRR Green Iは、二本鎖DNAに特異的
に結合する蛍光色素である。
【０２４９】 1.0μMの両方のTplaqプライマー（配列番号636〜637）および0.4μMの両方のT
StaGプライマー（配列番号553および575）、2.5mMのMgCl2、7.5μMのBSA、0.2mM
のdNTP（Pharmacia）、10mMのTris−HCl（pH8.3）、50mMのKCl、TaqStartTM抗体
（Clontech）とカップリングした0.5単位のTaqDNAポリメラーゼ（Boehringer M
annheim）、および0.07ngのゲノムDNA試料を7μlの最終体積でを使用して、Lign
tCyclerによりPCR生成物の蛍光発生検出を実施した。最大感受性および特異性の
最適なサイクリング条件は次の通りであった：94℃において3分の初期変性、次
いで95℃において0秒、60℃において5秒および72℃において9秒から成る3工程の
40サイクル。
【０２５０】 SYBRR Green Iのレベルを測定することによって、各伸長サイクル間の増幅
をモニターした。しかしながら、PCR後に実際の分析を実施する。溶融曲線を各
試料について作成し、溶融ピークの変換によりTmを決定することができた。こう
してプライマー−二量体および特異的PCR生成物が識別される。このアッセイを
使用して、添付書類XIXおよび第14表に列挙されている血小板濃厚物のすべての
顕著な細菌汚染因子が検出された。血小板の9つの最も頻繁な細菌汚染因子につ
いて、感受性試験を実施した。
【０２５１】 検出限界はエンテロコッカス・クロアセ（E. cloacae）、バシラス・セレウ
ス（B. cereus）、サルモネラ・コレレスイス（S. choleraesuis）およびセラ
チア・マルセッセンス（S. marcescens）について20ゲノムコピーより低く：シ
ュードモナス・エルジノーサ（P. aeruginosa）について15ゲノムコピーより低
く；そして黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis
）、大腸菌（E. coli）およびクレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）
について2〜3コピーが検出された。アッセイ条件をさらに改良すると、感受性レ
ベルは増加するであろう。
【０２５２】 実施例13．tufおよびatpD配列データベースの分解能は細菌感染について生化
学的方法に匹敵する 細菌感染についての現在の金標準は、主要な形態学的特性および生化学的試験
の組に主としてに基づく。ここで、tufおよびatpD配列と、これらの配列により
形成されたデータベースの簡単な系統発生分析との組合わせを使用ことは金標準
に匹敵することを我々は証明する。tuf配列についてのデータの獲得プロセスに
おいて、スタヒロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）ATCC35982と
標識されて我々に与えられた株のtuf遺伝子を配列決定した。tuf配列（配列番号
192）をtuf配列データベースの中に組込み、GCGパッケージ（Genetics Compute
r Group）のバージョン10からのPileupコマンドを使用して基本的系統発生解析
に付した。
【０２５３】 この解析により、配列番号192は他のスタヒロコッカス・ホミニス（S. homin
is）株と関連しないが、むしろスタヒロコッカス・ワルネリ（S. warneri）株
と関連することが示された。ATCC35982株を参照研究所（Laboratoire de sant publique Qu bec（LSPQ））に送った。研究所において、スタフィロコッキ
についての古典的同定スキームが使用された（KloosおよびSchleifer、1975、J. Clin. Microbiol. 1：82−88）。それらの結果により、コロニーの形態はス
タヒロコッカス・ホミニス（S. hominis）に対応することがあったが、いっそ
う正確な生化学的アッセイは対応しないことが示された。
【０２５４】 これらのアッセイは識別マンニトール、マンノースおよびリボソーム結合部位
酸性化試験ならびに深いチオグリコレート寒天中の急速かつ密な増殖を包含した
。LSPQ報告はATCC35982株をスタヒロコッカス・ワルネリ（S. warneri）と同定
し、これは我々のデータベース解析を確証する。低い分解能の自動化システム（
MicroScan、AutoScan−4TM）を使用する日常的臨床実験室によりスタヒロコッカ
ス・ヘモリチカス（S. haemolyticus）と最初に同定されたスタヒロコッカス・
ワルネリ（S. warneri）（配列番号187）について、同一のことが起こった。
【０２５５】 再び、tufおよびLSPQ解析はスタヒロコッカス・ワルネリ（S. warneri）とし
ての同定と合致した。多数の他の場合において、種々の種および属からtufおよ
びatpD配列のデータを獲得するとき、我々のtufおよび／またはatpD配列データ
ベースの解析により、誤って標識されたまたは誤って同定された株を正確に同定
することができた。これらの結果が明瞭に証明するように、tufおよびatpD配列
データベースを使用する我々の配列に基づく同定アッセイは有効でありかつ高い
分解能を有する。
【０２５６】 実施例14．臨床検体からの群Bストレプトコッキの感受性 序論 ストレプトコッカス・アガラクチエ（Staphylococcus agalctiae）、群Bスト
レプトコッカル（GBS）は、新生乳児に影響を与える重度の病気の原因となる。
この細菌は出産の間に健康なキャリヤーの母親から子供に移る。この感染を防止
するために、膣／肛門フローラの中にGBSを担持ことが推測される期待の母親を
治療することが推奨される。キャリヤーの状態はしばしば一時的状態であり、そ
して厳密なモニターは培養および出産前の古典的細菌同定週を必要とする。GBS
の検出および同定を改良するために、我々は出産時に正しく実行するために十分
に急速、特異的かつ感受的なPCR試験を開発した。
【０２５７】 材料および方法 GBS臨床検体 病院（Centre Hospitalier Unviversitaire de Qu bec、Pavillon Saint
−Fran ois d'Assise）においてCDC推奨に従い出産のために収容された41人の
同意した妊娠女性から、合計66の二重反復実験の膣／肛門スワブを収集した。膜
の破裂の前または後に試料を得た。スワブ試料を研究所（Centre de Recherch
e en Infectiologie de l'Universit Laval）において収集の24時間以内
に試験した。受け取ると、1つのスワブを切断し、次いでスワブ先端をGNS選択ブ
ロスに添加し、CDCが推奨する標準培養法により群Bストレプトコッカル（GBS）
を同定した。PCR増幅前に、IDI DNA抽出キット（Infectio Diagnotics（IDI）
Inc.）の使用説明書に従い、他のスワブをプロセシングした。
【０２５８】 オリゴヌクレオチド 我々のtuf配列レパートリーを使用する多重配列整列に基づいて、GBSについて
ユニークなtuf遺伝子の領域に対して相補的なPCRプライマー、Tsag340（配列番
号549）およびTsag552（配列番号550）を設計した。オリゴプライマー解析ソフ
トウェア（バージョン5.0）（National Biosciences）を使用して、プライマー
アニーリング温度、二次構造ポテンシャルならびにミスプライミングおよび二量
化を解析した。モデル391DNA合成装置（Applied Biosystems）により、プライ
マーを合成した。
【０２５９】 1対の蛍光標識化した隣接ハイブリダイゼーションプローブSag465−F（配列番
号583）およびSag436−C（配列番号582）を合成し、オペロン・テクノロジー（O
peron Technologies）により精製した。GBSに対して特異的でありかつ偏在的で
ある我々のtuf配列レパートリーを使用して、製造会社（Idaho Technology）の
推奨を満足しかつ多重配列整列分析に基づいて、それらのプローブを設計した。
これらの隣接プローブは、1つのヌクレオチドにより分離されており、蛍光共鳴
エネルギー移動（FRET）を可能とし、両方がそれらのターゲット配列に同時にハ
イブリダイゼーションしたとき、増加した蛍光シグナルを発生する。プローブ配
列番号583をFITCで3プライムにおいて標識化したが、配列番号582をCy5で5プラ
イムにおいて標識化した。Cy5標識化プローブは3'ブロッキングホスフェート基
を含有して、PCR反応間のプローブのエクステンションを防止した。
【０２６０】 PCR増幅 2μlの精製したゲノムDNA調製物または膣／肛門検体の細胞ライゼイトから、
慣用増幅を実行した。20μlのPCR混合物は0.4μMの各GBS特異的プライマー（配
列番号549〜550）、200μMの各デオキシヌクレオチド（Pharmacia Biotech）、
10μMのTris−HCl（pH9.0）、50μMのKCl、0.1％のトリトンX−100、2.5mMのMgC
l2、3.3mg／mlのウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma）、およびTaqStartTM抗体
（Clontech）と結合した0.5単位のTaqDNAポリメラーゼ（Promega）を含有した。
TaqStartTM抗体は、TaqDNAポリメラーゼの中和性モノクローナル抗体であり、す
べてのPCR反応に添加して、増幅効率を増強した。PCR混合物をPTC−200DNAエン
ジンサーモサイクラー（MJ Research）により熱的サイクリングに付した（95℃
において3分、次いで95℃において1秒および55℃において30秒、最後に72℃にお
いて2分のエクステンション）。PCR増幅反応混合物をアガロースゲル電気泳動に
より分割した。
【０２６１】 1μlの精製したゲノムDNA調製物または膣／肛門検体の細胞ライゼイトを使用
して、LigntCyclerTMPCR増幅を実行した。10μlの増幅混合物は、0.4μMの各GBS
特異的（配列番号549〜550）、200μMの各dNTP、0.2μMの各蛍光標識化プローブ
（配列番号582〜583）、300μg／mlのBSA（Sigma）、および1μlの10×PC2緩衝
液（50mMのTris−HCl（pH9.1）、16mMの硫酸アンモニウム、3.5mMのMg2+、およ
び150μg／mlのBSAを含有する）およびTaqStartTM抗体（Clontech）とカップリ
ングした0.5単位のKenTaq1TM（AB Peptides）から成っていた。KenTaq1TMは高
度に活性であり、5'エクソヌクレアーゼ活性を含有しない、いっそう熱安定性DN
Aポリメラーゼである。これは5'→3'エクソヌクレアーゼ活性によるハイブリダ
イゼーションしたプローブの加水分解を防止する。
【０２６２】 7μlの体積のPCR混合物を複合毛管（Idaho Technology）に移した。次いで管
を遠心して反応混合物を毛管先端に動かし、次いで光学銘柄のメタノールでクロ
ーニングした。引き続いて、毛管をLC32 LigntCyclerTM（Idaho Technology）
の円形コンベヤーの中に入れた。LC32 LigntCyclerTMは急速サイクルPCRと蛍光
分析との組合わせであり、増幅を連続的にモニターする計装である。PCR反応混
合物を次のサイクルに付した：94℃において3分の変性工程、次いで94℃におい
て0秒、64℃において20秒および72℃において10秒の45サイクル、20℃／秒の温
度移行速度を使用した。内蔵フルオロメーターに関係する光学的要素の焦点に10
0ミリセカント間各毛管を円形コンベヤー上に順次に位置決定することによって
、蛍光シグナルを得た。完全な増幅および分析には約35分を要した。
【０２６３】 特異性および感受性試験 35の臨床的に関係するグラム陽性種を表すATCC参照株の組から精製したゲノム
DNA（0.1ng／反応）を使用することによって、慣用アッセイおよびLigntCyclerT M PCR増幅を確認した（アビオトロフィア・デフェシヴィア（Abiotrophia defec
tiva）ATCC49176、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifdobacterium breve）AT
CC15700、クロストリジウム・ディフィサイル（Clostridium difficile）ATCC9
689、コリネバクテリウム・ウレアリチカム（Corynebacterium urealyticum）A
TCC43042、エンテロコッカス・カッセリフラブス（Enterococcus casseliflavu
s）ATCC25788、エンテロバクター・デュランス（Enterobacter durans）ATCC19
432、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ATCC29212、エ
ンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ATCC19434、
【０２６４】 エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）ATCC49573、エ
ンテロコッカス・ラフィノーサス（Enterococcus raffinosus）ATCC49427、ラ
クトバシラス・レウテイ（Lactobacillus reuteri）ATCC23273、ラクトコッカ
ス・ラクチス（Lactococcus lactis）ATCC19435、リステリア・モノシトゲネス
（Listeria monocytogenes）ATCC15313、ペプトコッカス・ニガー（Peptococcu
s niger）ATCC27731、ペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Peptostrept
ococcus anaerobius）ATCC27337、ペプトストレプトコッカス・プレヴォチイ（
Peptostreptococcus prevotii）ATCC9321、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus
aureus）ATCC25923、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC1499
0、スタヒロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）ATCC299
70、
【０２６５】 スタヒロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）ATC
C15305、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalctiae）ATCC
27591、ストレプトコッカス・アンギノスス（Streptococcus anginosus）ATCC3
3397、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）ATCC33317、スト
レプトコッカス・コンステラツス（Streptococcus constellatus）ATCC27823、
ストレプトコッカス・ジスガラクチエ（Streptococcus dysgalactiae）ATCC430
78、ストレプトコッカス・ゴルダニイ（Streptococcus gordonii）ATCC10558、
ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）ATCC33399、ストレプト
コッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ATCC25175、ストレプトコッ
カス・オラリス（Streptococcus oralis）ATCC35037、
【０２６６】 ストレプトコッカス・パラウベリス（Streptococcus parauberis）ATCC6631
、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）ATCC6303、
化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サリバリウ
ス（Streptococcus salivarius）ATCC7073、ストレプトコッカス・サングイニ
ス（Streptococcus sanguinis）ATCC10556、ストレプトコッカス・ウベリス（S
treptococcuss uberis）ATCC19436）。これらの微生物種は15種のストレプトコ
ッキおよび正常の膣および肛門フローラの多数のメンバーを包含した。さらに、
ヒト由来の40のGBS分離株の同定はラテックス凝集試験（Streptex、Murex）によ
り確証され、また、アッセイの偏在性をそれらを評価するために使用した。
【０２６７】 慣用アッセイおよびLigntCyclerTMPCRアッセイの感受性（すなわち、検出でき
るゲノムコピーの最小数）を測定するために、5つのGBS ATCC株から精製したゲ
ノムDNAの連続10倍〜2倍希釈物使用した。
【０２６８】 結果 GBS特異的慣用およびLigntCyclerTMPCRアッセイの評価 2つのアッセイの特異性は、GBS株からのDNAのみを増幅できることを証明した
。2つのPCRアッセイは、GBS以外の14のスタフィロコッカル種ならびに属エンテ
ロコッカス（Enterococcus）、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus
）およびラクトコッカス（Lactococcus）に属する系統発生的に関係する種を包
含する、任意の他の細菌種からのDNAを増幅しなかった。コアグラーゼ陰性スタ
フィロコッキ、ラクトバシラス（Lactobacillus）種およびバクテロイデス（Bac
teroides）種を包含する、膣または肛門フローラの重要なメンバーもまたGBS特
異的PCRアッセイで陰性であった。LigntCyclerTMPCRアッセイは増加した蛍光シ
グナルを産生することによってGBS DNAのみを検出した。蛍光シグナルは陽性PC
R結果として解釈された。両方PCR法は40のGBSのすべてを増幅することができ、
表現型同定法と完全な相関関係を示した。
【０２６９】 GBSの5つのATCC株から精製したゲノムDNAを使用することによって、アッセイ
の感受性を測定した。これらの5つの株のすべてについての検出限界は1ゲノムコ
ピーのGBSであった。LigntCyclerTMを使用するアッセイの検出限界は3.5fgの
DNAであった（1〜2ゲノムコピーのGBSに対応する）。これらの結果は我々のGBS
特異的PCRアッセイの高い感受性を確証した。
【０２７０】 膣／肛門検体からのGBSの直接的検出 試験した66の膣／肛門検体のうちで、11は培養およびPCRの両方によりGBSに対
して陽性であった。培養によってのみ陽性である1つの試料が存在した。出産時
の妊娠女性においてコロニー化状態を同定する膣／肛門検体を使用する両方のPC
R法の感受性は、培養結果に比較したとき、91.7％であった。特異性および陽性
の両方の予測値は100％であり、そして陰性予測値は97.8％であった。結果を得
るための時間はLigntCyclerTMPCRについてほぼ45分であり、慣用PCRについてほ
ぼ100分であり、そして培養について48分であった。
【０２７１】 結論 我々はGBSを検出する2つのPCRアッセイ（慣用およびLigntCyclerTM）を開発し
、これらは特異的（すなわち、GBS以外の種々の血液検体からのDNAの増幅なし）
および感受性（すなわち、GBSのいくつかの参照ATCC株について約1ゲノムコピー
を検出することができる）である。両方のPCRアッセイは非常に短い一循時間で
膣／肛門検体から直接GBSを検出することができる。LigntCyclerTMによる実時間
PCRアッセイを使用して、出産時に45分以内に妊娠女性におけるGBS担持を検出す
ることができる。
【０２７２】 実施例15．化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）およびその発熱物質エ
キソトキシンAの同時の検出および同定 化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）およびその発熱物質エキソトキシ
ンAの急速検出は臨床的に重要である。猩紅熱および他の病理学に関連する、発
熱物質トキシン遺伝子を担持する化膿連鎖球菌（S. pyogenes）の株の検出を可
能とする多重アッセイを我々は開発した。
【０２７３】 化膿連鎖球菌（S. pyogenes）を特異的に検出するために、ピロリドンカルボ
キシリルペプチダーゼ（pcp）遺伝子のヌクレオチド配列を整列させてPCRプライ
マーSpy291（配列番号1211）およびSpy473（配列番号1210）を設計した。次に、
発熱物質エキソトキシンAを特異的に検出するためのプライマーを設計した。バ
クテリオファージT12上に担持された、speA遺伝子のヌクレオチド配列を、添付
書類XXIIIに示すように整列させて、PCRプライマーSpytx814（配列番号994）お
よびSpytx927（配列番号995）を設計した。プライマー対：オリゴ配列番号1210
〜1211は207bpの増幅生成物を生じ、そしてオリゴ配列番号994〜995は135bpの増
幅生成物を生じ、これらを多重PCRアッセイにおいて使用した。
【０２７４】 0.4μMのプライマーの両方の対、2.5mMのMgCl2、0.05μMのBSA、0.2μMのdNTP
（Pharmacia）、10mMのTris−HCl（pH9.0）、0.1％のトリトンX−100、2.5mMのK
Cl、2.5mMのMgCl2、TaqStartTM抗体（Clontech Laboratories，Inc.）とカップ
リングした0.5単位のTaqDNAポリメラーゼ（Promega）、および1μlのゲノムDNA
試料を20μlの最終体積で使用して、PCR増幅を実施した。PTC−200サーマルサイ
クラー（MJ Research）を使用して、PCR増幅を実施した。最大特異性および感
受性の最適なサイクリング条件は次の通りであった：94℃において3分の初期変
性、次いで95℃において1秒および63℃において30秒から成る2工程の40サイクル
、次いで72℃において2分間の最終工程。0.25μg／mlの臭化エチジウムを含有す
るアガロースゲル（2％）中の電気泳動により、PCR生成物を検出した。254nmに
おいて紫外線下にPCR生成物を可視化した。
【０２７５】 検出限界は両方の化膿連鎖球菌（S. pyogenes）およびその発熱物質エキソト
キシンAについて5ゲノムコピーであった。このアッセイは発熱物質エキソトキシ
ンA産生化膿連鎖球菌（S. pyogenes）に対して特異的であった：試験したスタ
ヒロコッカス（Staphylococcus）の27他の種、ならびに種々のグラム陽性および
グラム陰性細菌種の20株のすべては陰性であった。 同様なアプローチを使用して、speA特異的プライマーの別の組を設計した（配
列番号996〜998、添付書類XXIV参照）。さらに、tuf遺伝子に基づくプライマー
の他の組（配列番号999〜1001、添付書類XXV参照）を使用して、化膿連鎖球菌（
Streptococcus pyogenes）を特異的に検出することができた。
【０２７６】 実施例16．シガ（Shiga）トキシン産生細菌の実時間検出および同定 シガ（Shiga）トキシン産生大腸菌（Escherichia coli）および志賀赤痢菌（
Shigella dysenteriae）は血液を含む下痢を引き起こす。現在、同定は志賀赤
痢菌（S. dysenteriae）および大腸菌（E. coli）血清型O157：H7の表現型同
定に主として頼る。しかしながら、大腸菌（E. coli）の他の血清型は1型およ
び／または2型シガ（Shiga）トキシンであることの発見が増加している。シガ（
Shiga）トキシン遺伝子stx1およびstx2の各々の中に存在する高度に保存された
領域をターゲッティングする2対のPCRプライマーを設計して、それらの遺伝子の
すべての変異型を増幅した（添付書類XXVIおよびXXVII参照）。
【０２７７】 第1プライマー対、オリゴヌクレオチド1SLT224（配列番号1081）および1SLT38
5（配列番号1080）はstx1遺伝子から186bpの増幅生成物を生ずる。このアンプリ
コンについて、蛍光標識6−カルボキシ−フルオレセインを使用するstx1の特異
的検出のために1SLTB1−Fam（配列番号1084）分子ビーコンを設計した。また、s
tx1の特異的検出の別の法として、1SltS1−FAM（配列番号2012）分子ビーコンを
設計した。PCRプライマーの第2対、オリゴヌクレオチド2SLT537（配列番号1078
）および2SLT678b（配列番号1079）はstx2遺伝子から160bpの増幅生成物を生ず
る。蛍光標識5−テトラクロロ−フルオレセインを使用するstx2の特異的検出の
ために、分子ビーコン2SLTB1−Tet（配列番号1085）を設計した。両方のプライ
マー対を多重PCRアッセイにおいて組合わせた。
【０２７８】 0.8μMのプライマーの対、配列番号1080〜1081、0.5μMのプライマーの対、配
列番号1078〜1079、0.3μMの各分子ビーコン、8mMのMgCl2、490μg／mlのBSA、0
.2μMのdNTP（Pharmacia）、50mMのTris−HCl、16mMのNH4SO4、1×TaqMaster（E
ppendorf）、TaqStartTM抗体（Clontech Laboratories，Inc.）とカップリング
した2.5単位のKenTaq1TMDNAポリメラーゼ（AB Peptides）、および1μlのゲノ
ムDNA試料を25μlの最終体積で使用して、PCR増幅を実施した。SmartCyclerサー
マルサイクラー（Cepheid）を使用して、PCR増幅を実施した。最大感受性および
特異性の最適なサイクリング条件は次の通りであった：95℃において60秒の初期
変性、次いで95℃において10秒、56℃において15秒および72℃において5秒の45
サイクル。分子ビーコンが56℃におけるアニーリング工程の終わりにおいてその
ターゲットに対してハイブリダイゼーションするとき、分子ビーコンが放射する
蛍光シグナルを測定することによって、PCR生成物を実時間に検出した。
【０２７９】 検出限界は5ゲノムコピーより低い等価であった。PCRの結果とシガ（Shiga）
トキシンの各型に対して特異的な抗体を使用して実行した表現型特性決定との間
の完全な相関により証明されるように、このアッセイは両方の毒性の検出に対し
て特異的であった。このアッセイは、10のO157：H7大腸菌（E. coli）、5つの
非O157：H7大腸菌（E. coli）および4つの志賀赤痢菌（S. dysenteriae）を包
含する、世界の種々の地理学的区域から分離された、いくつかのシガ（Shiga）
トキシン産生株について首尾よく実行された。
【０２８０】 実施例17．属および種レベルにおいてスタフィロコッキおよびその関連するme cA遺伝子を検出および同定するPCRアッセイの開発 実施例7に記載されているスタヒロコッカス（Staphylococcus）特異的PCRプラ
イマーを、我々の譲渡された米国特許第5,994,066号（前記特許においてmecAに
ついて配列番号261および262および黄色ブドウ球菌（S. aureus）について配列
番号152および153）に記載されているmecA特異的PCRプライマーおよび黄色ブド
ウ球菌（S. aureus）特異的プライマーと多重に使用した。10の公衆に入手可能
なmecA配列の配列整列分析により、mecAに対して特異的な内部プローブ（配列番
号1177）を設計することができた。
【０２８１】 また、黄色ブドウ球菌（S. aureus）特異的アンプリコンについての内部プロ
ーブを設計した（配列番号1234）。0.4μM（各々）の2つのスタヒロコッカス（S
taphylococcus）特異的プライマー（配列番号553および575）および0.4μM（各
々）のmecA特異的プライマーおよび0.4μM（各々）の黄色ブドウ球菌（S. aure
us）特異的プライマーをPCR混合物において使用した以外、実施例7に記載されて
いるように、PCR増幅および増幅された生成物のアガロースゲル電気泳動を実行
した。5つのメチシリン耐性および15のメチシリン感受性スタフィロコッカル株
から精製したゲノムDNAを使用することによって、40サイクルのPCRプロトコルに
よる多重アッセイの特異性を確認した。
【０２８２】 23のメチシリン耐性および28のメチシリン感受性スタフィロコッカル株から精
製したゲノムDNAを使用することによって、40サイクルのPCRプロトコルによる多
重アッセイの感受性を確認した。検出限界は、試験したスタフィロコッカル株に
依存して、2〜10ゲノムコピーのゲノムDNAであった。さらに、mecA特異的内部プ
ローブ、黄色ブドウ球菌（S. aureus）特異的内部プローブおよびコアグラーゼ
陰性スタフィロコッキ特異的内部プローブ（実施例7に記載されている）は、23
のメチシリン耐性スタフィロコッカル株および28のメチシリン感受性スタフィロ
コッカル株を高い感受性および特異的で認識することができた。
【０２８３】 このアッセイのフォーマットは前述のものに限定されない。当業者は異なるフ
ォーマット、例えば、分子ビーコンプローブを使用する実時間検出のPCRを採用
することができるであろう。このアッセイにおいて使用するように設計された分
子ビーコンプローブは下記のものを包含するが、これらに限定されない：黄色ブ
ドウ球菌（S. aureus）アンプリコンの検出のための配列番号1232、コアグラー
ゼ陰性スタフィロコッキの検出のための配列番号1233およびmecAの検出のための
配列番号1231。
【０２８４】 選択的に、実施例7に記載されているスタヒロコッカス（Staphylococcus）特
異的PCRプライマーおよび我々の譲渡された米国特許第5,994,066号に記載されて
いるmecA特異的PCRプライマー（前記特許における配列番号261および262）を含
有する多重PCRアッセイを開発した。0.4μM（各々）のスタヒロコッカス（Staph
ylococcus）特異的プライマー（配列番号553および575）および0.4μM（各々）
のmecA特異的プライマーおよび0.4μM（各々）の黄色ブドウ球菌（S. aureus）
特異的プライマー我々の譲渡された米国特許第5,994,066号に記載されているmec
A特異的PCRプライマー（前記特許における配列番号261および262）をPCR混合物
において使用した以外、実施例7に記載されているように、PCR増幅および増幅さ
れた生成物のアガロースゲル電気泳動を実行した。
【０２８５】 2つのメチシリン耐性および5のメチシリン感受性スタフィロコッカル株から精
製したゲノムDNAを使用することによって、40サイクルのPCRプロトコルによる多
重アッセイの特異性を測定した。検出限界は、試験したスタフィロコッカル株に
依存して、2〜5ゲノムコピーのゲノムDNAであった。メチシリン耐性黄色ブドウ
球菌（S. aureus）の2つの株、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（S. aureus
）の2つの株およびメチシリン感受性コアグラーゼ陰性スタフィロコッキの7つの
株を使用して、捕捉プローブハイブリダイゼーションとカップリングした多重PC
Rアッセイの特異性を試験した。
【０２８６】 実施例7に記載されているmecA特異的内部プローブ（配列番号1177）および黄
色ブドウ球菌（S. aureus）特異的内部プローブ（配列番号587）は高い特異性
ですべての株を認識することができ、メチシリンに対する感受性と完全な相関を
示した。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（S. aureus）の1つの株を使用して、
捕捉プローブハイブリダイゼーションとカップリングした多重PCRアッセイの感
受性を試験した。検出限界は約10ゲノムコピーのゲノムDNAであった。
【０２８７】 実施例18．ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）
のpbp1a、pbp2bおよびpbp2xのスクリーニング ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）におけるペ
ニシリン耐性は、5までのペニシリン結合性タンパク質（PBP）1A、1B、2A、2Xお
よび2Bのアフィニティーが抗生物質分子に向かって大きく減少されるように法に
おける、それらの順次変更を包含する。関係するスタフィロコッカル種からの種
間組換えの結果として、変更されたPBP遺伝子が発生した。通常ストレプトコッ
カス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）の中に見出されるPBPのうちで、1A、2Bお
よび2Xはペニシリン耐性の発生において最も重要な役割を演ずる。PBP 2Bおよ
び2Xにおける変更はペニシリンに対する低いレベルの耐性を仲介するが、PBP 1
Aにおける追加の変更は完全なペニシリン耐性において有意な役割を演ずる。
【０２８８】 ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）におけるβ−ラクタム耐
性を特異的にかつ偏在的に検出するプライマーおよび／またはプローブを設計す
るために使用できるpbp配列を発生させるために、種々のストレプトコッカス・
ニゥモニエ（S. pneumoniae）株から我々が配列決定したまたは公衆用データベ
ース（遺伝子バンクおよびEMBL）から選択したpbp1a、pbp2bおよびpbp2x DNAフ
ラグメントを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このデータ
ベースはストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）におけるβ−ラク
タム耐性を検出する特異的および偏在的プライマーおよび／またはプローブの設
計に対して必須である。
【０２８９】 なぜなら、β−ラクタム耐性ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoni
ae）の変更されたPBP 1A、PBP 2BおよびPBP 2Xは、耐性分離株間の多数の配
列変動を有するモザイク遺伝子によりコードされるからである。PCRプライマー
はpbp遺伝子の保存された領域の中に位置し、ペニシリンおよび第3世代のセファ
ロスポリンに対して種々の耐性レベルを有するストレプトコッカス・ニゥモニエ
（S. pneumoniae）のいくつかの株のpbp1a、pbp2bおよびpbp2x配列を増幅する
ことができた。プライマー対配列番号1125および1126、配列番号1142および1143
、配列番号1146および1147を使用すると、pbp1a配列、配列番号1004〜1018、164
8、2056〜2060および2062〜2064、pbp2b配列、配列番号1019〜1033、およびpbp2
x配列、配列番号1034〜1048を増幅し、決定することができる。
【０２９０】 また、6つの他のPCRプライマー（配列番号1127〜1128、1144〜1145、1148〜11
49）を設計し、pbp1a、pbp2bおよびpbp2x増幅生成物を配列決定するために使用
した。記載したプライマー（配列番号1125および1126、配列番号1142および1143
、配列番号1146および1147、配列番号1127〜1128、1144〜1145、1148〜1149）は
、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）におけるβ−ラクタム耐
性を検出するプライマーおよび／またはプローブを設計するための新しいpbp配
列を発生させる強力なツールを表す。
【０２９１】 実施例19．スタヒロコッカス（Staphylococcus）種のhexA遺伝子の配列決定 我々の譲渡された米国特許第5,994,066号に記載されているストレプトコッカ
ス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）のhexA配列（前記特許における配列番号31、
本発明における配列番号1183）はPCRプライマー（配列番号1182）の設計を可能
とし、このプライマー我々の譲渡された米国特許第5,994,066号に記載されてい
るプライマーSpn1401（前記特許における配列番号156、本発明における配列番号
1179）とともに使用して、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）
を特異的に同定および検出するプライマーおよび／またはプローブを設計するた
めに使用できる、hexA配列のデータベースを発生させた（添付書類XLI）。
【０２９２】 配列番号1179および配列番号1182（添付書類XLII）を使用して、ストレプトコ
ッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）（4株）（配列番号1184〜1187）、スト
レプトコッカス・ミチス（S. mitis）（3株）（配列番号1189〜1191）およびス
トレプトコッカス・オラリス（S. oralis）（配列番号1188）からhexA配列を増
幅し、決定することができた。
【０２９３】 実施例20．ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）
およびそのペニシリン耐性遺伝子を検出および同定する捕捉プローブハイブリダ イゼーションとカップリングした多重PCRアッセイの開発 ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）およびそのペニシリン耐
性を同定する2つの異なるアッセイを開発した。
【０２９４】 アッセイＩ 細菌種 33のグラム陰性および67グラム陽性細菌種（第13表）から成るATCC（American Type Culture Collection）参照株のパネルを使用することによって、多重P
CRアッセイの特異性を確認した。さらに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（American Type Culture Collection）、微生物学研究所（Centr
e Hospitalier Unviversitaire de Qu bec、Pavillon Centre Hospitalie
r de l'Universit Laval（CHUL）（Ste−Foy、Qu bec、カナダ国）、研究所
（Laboratoire de sant publique Qu bec、Sainte−Anne−de−Bellevue、
Qu bec、カナダ国）、
【０２９５】 収集所（Sunnybrook and Women's College Health Science Centre、Ｔ
ｏｒｏｎｔｏ、カナダ国）、研究所（Infectious Diseases Section、Departm
ent of Veterans Affairs Medical Ceneter、Houston、アメリカ合衆国）
からの合計98株のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）、16株の
ストレプトコッカス・ミチス（S. mitis）および3株のストレプトコッカス・オ
ラリス（S. oralis）をまた試験してストレプトコッカス・ニゥモニエ（Strept
ococcus pneumoniae）特異的PCRアッセイを確認した。NCCLSの推奨されたプロ
トコルに従うブロス希釈法により、ペニシリンMIC（最小阻害濃度）を測定した
。
【０２９６】 PCRプライマーおよび内部プローブ 公衆に入手可能なhexA配列からおよび実施例19に記載されているデータベース
（配列番号1184〜1191）からの種々のスタフィロコッカル種のhexA配列の分析に
より、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）に対して特異的なPC
Rプライマー、配列番号1181を選択することができた。このプライマーをストレ
プトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）特異的プライマー配列番号1179と
ともに使用して、241bpの増幅生成物を発生させ他（添付書類XLII）。
【０２９７】 このPCRプライマー配列番号1181は、我々の譲渡された米国特許第5,994,066号
に記載されているオリジナルのストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoni
ae）特異的プライマーSpn1515（前記特許における配列番号157）に比較して、he
xA配列上の127ヌクレオチド下流に位置する。実施例19に記載されているデータ
ベース（配列番号1184〜1191）からのいくつかのスタフィロコッカル種の新しい
hexA配列に従うストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）特異的内部
プローブの設計を保証するために、これらの修飾を実施した。
【０２９８】 公衆用データベースからおよび実施例18に記載されているデータベースからの
種々のペニシリン耐性レベルを有するストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pn
eumoniae）株からのpbp1a配列を分析すると、高いレベルのペニシリン耐性（MIC
≧1μg／ml）を有する分離株の中に存在するアミノ酸置換Ile−459→MetおよびS
er−462→Ala、およびMIC≧0.25μg／mlを有するすべてのペニシリン耐性分離株
に対して共通のアミノ酸置換Ser−576→Thr、Gln−576→GlyおよびPhe−577→Ty
rを同定することができた。添付書類XXXIに示すように、PCRプライマー対、配列
番号1130および1131を設計して高いレベルのペニシリン耐性（MIC≧1μg／ml）
を検出したが、PCRプライマー対、配列番号1129および1131を設計して、中間お
よび高いレベルのペニシリン耐性（MIC≧0.25μg／ml）を検出した。
【０２９９】 公衆に入手可能hexA配列および実施例19に記載されているデータベースからの
hexA配列を分析すると、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）に
対して特異的な内部プローブ（配列番号1180）を設計することができた（添付書
類XLII）。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）241bpのアンプ
リコン間のミスマッチの範囲は、19bpのプローブの中央において、2〜5であった
。公衆用データベースからおよび実施例18に記載されているデータベースからの
pbp1a配列を分析すると、高いレベルのペニシリン耐性383bpのアンプリコンを検
出するすべての可能な突然変異を含有する5つの内部プローブを設計することが
できた（配列番号1197、1217〜1220）。
【０３００】 選択的に、2つの他のプローブ（配列番号2024〜2025）をまた使用して、高い
レベルのペニシリン耐性383bpのアンプリコンを検出することができる。中間〜
高いレベルのペニシリン耐性を含む157bpのアンプリコンを検出する、すべての
可能な突然変異を含有する5つのプローブをまた設計した（配列番号1094、1192
〜1193、1214および1216）。プライマーおよびプローブの設計および合成、およ
びプローブハイブリダイゼーションの検出は実施例7に記載されているように実
行した。添付書類XXXIにおいて、高いレベルのペニシリン耐性383bpのアンプリ
コンを検出する内部プローブの1つ（配列番号1197）および中間〜高いレベルの
ペニシリン耐性の157bpのアンプリコンを検出する内部プローブの1つ（配列番号
1193）を例示する。
【０３０１】 PCR増幅 すべての細菌種について、PTC−200サーモサイクラー（MJ Research）を使用
して精製したゲノムDNAから増幅を実行した。1μlの0.1ng/μlのゲノムDNA、ま
たは1μlの細菌ライゼイトを19μlのPCR混合物に移した。各PCR反応は、50μMの
KCl、10μMのTris−HCl（pH9.0）、0.1％のトリトンX−100、2.5mMのMgCl2、0.1
μM（各々）のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）特異的プラ
イマー配列番号1179および配列番号1181、0.2μMのプライマー配列番号1129、0.
7μMのプライマー配列番号1131、および0.6μMのプライマー配列番号1130、0.05
mMのウシ血清アルブミン（BSA）、およびTaqStartTM抗体とカップリングした0.5
単位のTaqDNAポリメラーゼ（Promega）を含有した。
【０３０２】 捕捉プローブハイブリダイゼーションのためのジゴキシゲニン（DIG）標識化
アンプリコンを発生させるために、4つのデオキシヌクレオチド三リン酸混合物
（Boehringer Mannheim GmbH）を標識化する0.1×PCR DIG標識を増幅のため
に使用した。 PCRアッセイの感受性を測定するために、精製したゲノムDNAの10倍希釈物を使
用して、検出できるゲノムコピーの最小数を測定した。
【０３０３】 捕捉プローブハイブリダイゼーション 96ウェルのプレートに結合した捕捉プローブに対してDIG標識化アンプリコン
をハイブリダイゼーションさせた。プレートを抗DIGアルカリ性ホスファターゼ
とインキュベートし、CSPDとのインキュベーション後ルミノメーター（MLX、Dyn
ex Technologies Inc.）を使用することによって、化学発光を測定し、相対光
単位（RLU）として記録した。次いで、捕捉プローブを含むおよび含まない試験
した試料のRLU比を計算した。比≧2.0を陽性ハイブリダイゼーションシグナルと
して規定した。
【０３０４】 結果 多重PCRアッセイを使用する増幅 第13表に列挙されているグラム陽性（12属から67種）およびグラム陰性（17属
から33種）細菌種のパネルを使用する40サイクルのPCR増幅により、このアッセ
イの特異性を評価した。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）以
外の試験したすべての細菌種は、ストレプトコッカス・ミチス（S. mitis）お
よびストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）を除外して、陰性であった。
高いレベルのペニシリン耐性（ｎ＝53）、中間の耐性（ｎ＝12）および感受性（
ｎ＝33）株を包含する98のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）
株の収集物を使用して、偏在性試験を実行した。
【０３０５】 33のペニシリン感受性分離株について、PCRと標準感受性試験との間に完全な
相関が存在した。感受性試験に基づいて中間のペニシリン耐性を有する13のスト
レプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）のうちで、11はPCRにに基づい
て中間の耐性を有したが、0.25μg／mlのペニシリンMICを有する1つのストレプ
トコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）分離株は遺伝子型別に基づいて高い
レベルのペニシリン耐性を示した。感受性試験に基づいて高いレベルのペニシリ
ン耐性を有する53の分離株のうちで、51はPCRに基づいて高いレベルのペニシリ
ン耐性を有したが、15μg／mlのペニシリンMICを有する2つの分離株は遺伝子型
別に基づいて中間のペニシリン耐性を示した。一般に、細菌の同定および感受性
試験の遺伝子型法と古典的培養法との間にすぐれた相関が存在した。
【０３０６】 ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）の9つの分離株から精製
したゲノムDNAを使用することによって、40サイクルのPCRプロトコルによりスト
レプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）特異的アッセイの感受性を測定
した。検出限界はそれらのすべてについて約10コピーのゲノムDNAであった。
【０３０７】 内部プローブを使用してPCR後ハイブリダイゼーション 98株のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）、16株のストレプ
トコッカス・ミチス（S. mitis）および3株のストレプトコッカス・オラリス（
S. oralis）を使用して、捕捉プローブハイブリダイゼーションとカップリング
した多重PCRアッセイの感受性を試験した。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S
. pneumoniae）に対して特異的な内部プローブ（配列番号1180）はすべての98
のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）株を検出したが、ストレ
プトコッカス・ミチス（S. mitis）およびストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）アンプリコンに対してハイブリダイゼーションしなかった。高いレベ
ルの耐性アンプリコンに対して特異的な5つの内部プローブ（配列番号1197、121
7〜1220）は、高いレベルの耐性に対応するすべての増幅パターンを検出した。
【０３０８】 PCR増幅に基づいて中間のペニシリン耐性を示したペニシリンMIC＞1μg／mlを
有する2つのストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）株は、また、
プローブハイブリダイゼーションに基づいて中間の耐性であった。同様に、感受
性試験に基づいて中間のペニシリン耐性を有する12の株のうちで、11は中間およ
び高いレベルの耐性アンプリコンに対して特異的な5つの内部プローブ（配列番
号1094、1092〜1193、1214および1216）とのハイブリダイゼーションに基づいて
中間のペニシリン耐性を示した。PCR増幅に基づいて高いレベルのペニシリン耐
性であった0.25μg／mlのペニシリンMICを有する前述の株は、また、プローブハ
イブリダイゼーションに基づいて高いレベルの耐性であった。要約すると、多重
PCRとハイブリダイゼーションアッセイとの組合わせは、ペニシリン耐性ストレ
プトコッカス・ニゥモニエ（Streptococcus pneumoniae）を検出する高度に特
異的試験を生ずる。
【０３０９】 アッセイII： 細菌種 アッセイIの開発に使用した株と同一の株を使用することによって、多重PCRア
ッセイの特異性を確認した。NCCLSの推奨されたプロトコルに従うブロス希釈法
により、MIC（最小阻害濃度）を測定した。
【０３１０】 PCRプライマーおよび内部プローブ 公衆用データベースからおよび実施例18に記載されているデータベースからの
種々のレベルのペニシリン耐性を有するストレプトコッカス・ニゥモニエ（S.
pneumoniae）からのpbp1a配列を分析すると、pbp1aの定常領域の中に位置する2
つのプライマーを設計することができた。PCRプライマー対（配列番号2015およ
び2016）を設計して、すべてのストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoni
ae）株からのpbp1aの888bpの可変領域を増幅した。ストレプトコッカス・ニゥモ
ニエ（S. pneumoniae）におけるペニシリン耐性に関連するpbp1a突然変異を同
定するために、1系列の内部プローブを設計した。
【０３１１】 高いレベルのペニシリン耐性（MIC≧1μg／ml）を検出するために、3つの内部
プローブを設計した（配列番号2017〜2019）。選択的に、また888bpのpbp1a内の
高いレベルの耐性を検出するために使用できる、10の他の内部プローブを設計し
た：（1）モチーフS370TMK内のアミノ酸置換Thr−371→SerまたはAlaを同定する
3つの内部プローブ（配列番号2031〜2033）；（2）モチーフS428RN付近のアミノ
酸置換Ile−459→MetおよびSer−462→Alaを同定する2つの内部プローブ（配列
番号1135および2026）；（3）アミノ酸置換Asn−443→Aspを同定する2つの内部
プローブ（配列番号1134および2027）；および（4）他の領域内のすべての配列
変動を同定する3つの内部プローブ（配列番号2028〜2030）。
【０３１２】 高いレベルおよび中間のペニシリン耐性（MIC≧0.25μg／ml）を検出するため
の、4つの内部プローブをを設計した（配列番号2020〜2023）。選択的に、888bp
のpbp1aアンプリコン内の中間および高いレベルの耐性の検出に使用することも
できるモチーフK557TG付近の4つの保存的アミノ酸置換T577SQF→A574TGYを検出
するために、6つの内部プローブを設計した（配列番号2034〜2039）。
【０３１３】 PCR増幅 すべての細菌種について、PTC−200サーモサイクラー（MJ Research）を使用
して精製したゲノムDNAから増幅を実行した。 アッセイII： 細菌種 アッセイIの開発に使用した株と同一の株を使用することによって、多重PCRア
ッセイの特異性を確認した。NCCLSの推奨されたプロトコルに従うブロス希釈法
により、MIC（最小阻害濃度）を測定した。
【０３１４】 PCRプライマーおよび内部プローブ 公衆用データベースからおよび実施例18に記載されているデータベースからの
種々のレベルのペニシリン耐性を有するストレプトコッカス・ニゥモニエ（S.
pneumoniae）からのpbp1a配列を分析すると、pbp1aの定常領域の中に位置する2
つのプライマーを設計することができた。PCRプライマー対（配列番号2015およ
び2016）を設計して、すべてのストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoni
ae）株からのpbp1aの888bpの可変領域を増幅した。ストレプトコッカス・ニゥモ
ニエ（S. pneumoniae）におけるペニシリン耐性に関連するpbp1a突然変異を同
定するために、1系列の内部プローブを設計した。高いレベルのペニシリン耐性
（MIC≧1μg／ml）を検出するために、3つの内部プローブを設計した（配列番号
2017〜2019）。
【０３１５】 選択的に、また888bpのpbp1a内の高いレベルの耐性を検出するために使用でき
る、10の他の内部プローブを設計した：（1）モチーフS370TMK内のアミノ酸置換
Thr−371→SerまたはAlaを同定する3つの内部プローブ（配列番号2031〜2033）
；（2）モチーフS428RN付近のアミノ酸置換Ile−459→MetおよびSer−462→Ala
を同定する2つの内部プローブ（配列番号1135および2026）；（3）アミノ酸置換
Asn−443→Aspを同定する2つの内部プローブ（配列番号1134および2027）；およ
び（4）他の領域内のすべての配列変動を同定する3つの内部プローブ（配列番号
2028〜2030）。高いレベルおよび中間のペニシリン耐性（MIC≧0.25μg／ml）を
検出するための、4つの内部プローブをを設計した（配列番号2020〜2023）。選
択的に、888bpのpbp1aアンプリコン内の中間および高いレベルの耐性の検出に使
用することもできるモチーフK557TG付近の4つの保存的アミノ酸置換T577SQF→A5
74TGYを検出するために、6つの内部プローブを設計した（配列番号2034〜2039）
。
【０３１６】 PCR増幅 すべての細菌種について、PTC−200サーモサイクラー（MJ Research）を使用
して精製したゲノムDNAから増幅を実行した。1μlの0.1ng/μlのゲノムDNA、ま
たは1μlの細菌ライゼイトを19μlのPCR混合物に移した。各PCR反応は、50μMの
KCl、10μMのTris−HCl（pH9.0）、0.1％のトリトンX−100、2.5mMのMgCl2、0.0
8μM（各々）のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）特異的プラ
イマー配列番号1179および配列番号1181、0.4μMのpbp1a特異的プライマー配列
番号2015、1.2μMのpbp1a特異的プライマー配列番号2016、0.05mMのウシ血清ア
ルブミン（BSA）、およびTaqStartTM抗体とカップリングした0.5単位のTaqDNAポ
リメラーゼ（Promega）を含有した。捕捉プローブハイブリダイゼーションのた
めのジゴキシゲニン（DIG）標識化アンプリコンを発生させるために、4つのデオ
キシヌクレオチド三リン酸混合物（Boehringer Mannheim GmbH）を標識化する
0.1×PCR DIG標識を増幅のために使用した。
【０３１７】 PCRアッセイの感受性を測定するために、精製したゲノムDNAの10倍希釈物を使
用して、検出できるゲノムコピーの最小数を測定した。 捕捉プローブハイブリダイゼーション アッセイIについて記載されているように、96ウェルのプレートに結合した捕
捉プローブに対してDIG標識化アンプリコンをハイブリダイゼーションさせた。
【０３１８】 結果 多重PCRアッセイによる増幅 第13表に列挙されているグラム陽性（12属から67種）およびグラム陰性（17属
から33種）細菌種のパネルを使用する40サイクルのPCR増幅により、このアッセ
イの特異性を評価した。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）以
外の試験したすべての細菌種は、ストレプトコッカス・ミチス（S. mitis）お
よびストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）を除外して、陰性であった。
【０３１９】 高いレベルのペニシリン耐性（ｎ＝53）、中間の耐性（ｎ＝12）および感受性
（ｎ＝33）株を包含する98のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae
）株の収集物を使用して、偏在性試験を実行した。すべての上記ストレプトコッ
カス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）株は、pbp1aに対応する888bpのアンプリコ
ンおよびhexAに対応する241bpのフラグメントを産生した。 ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）の9つの分離株から精製
したゲノムDNAを使用することによって、40サイクルのPCRプロトコルによりスト
レプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）特異的アッセイの感受性を測定
した。検出限界はそれらのすべてについて約10コピーのゲノムDNAであった。
【０３２０】 内部プローブを使用するPCR後ハイブリダイゼーション 98株のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）、16株のストレプ
トコッカス・ミチス（S. mitis）および3株のストレプトコッカス・オラリス（
S. oralis）を使用して、捕捉プローブハイブリダイゼーションとカップリング
した多重PCRアッセイの感受性を試験した。ストレプトコッカス・ニゥモニエ（S
. pneumoniae）に対して特異的な内部プローブ（配列番号1180）はすべての98
のストレプトコッカス・ニゥモニエ（S. pneumoniae）株を検出したが、ストレ
プトコッカス・ミチス（S. mitis）およびストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）アンプリコンに対してハイブリダイゼーションしなかった。
【０３２１】 高いレベルの耐性アンプリコンに対して特異的な3つの内部プローブ（配列番
号2017〜2019）は、感受性試験に基づいて高いレベルの耐性を有するすべての43
株を検出した。感受性試験に基づいて中間のペニシリン耐性を有する12の分離株
のうちで、11は4つのプローブ（配列番号2020〜2023）とのハイブリダイゼーシ
ョンに基づいて中間のペニシリン耐性を示し、そして0.25μg／mlのペニシリンM
ICを有する1つの株は誤って分類された。要約すると、多重PCRとハイブリダイゼ
ーションアッセイとの組合わせは、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニゥモ
ニエ（Streptococcus pneumoniae）を検出する高度に特異的な試験を生ずる。
【０３２２】 実施例21．バンコマイシン耐性vanA、vanC1、vanC2およびvanC3遺伝子の配列
決定 それぞれ、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）からのトランスポ
ゾンvanH−vanA−vanX−vanY遺伝子座の公衆に入手可能な配列、エンテロコッカ
ス・ガリナルム（E. gallinarum)の1つの株からのvanC1配列、種々のエンテロ
コッカス・カッセリフラブス（E. casseliflavus)およびエンテロコッカス・フ
ラベセンス（E. flavescens）株からのvanC2およびvanC3配列は、いくつかのエ
ンテロコッカス（Enterococcus）種のvanA、vanC1、vanC2およびvanC3配列を増
幅することができるPCRプライマーの設計を可能とした。
【０３２３】 プライマー対van6877およびvan9106（配列番号1150および1155）、vanC1−122
およびvanC1−1315（配列番号1110および1109）、およびvanC2C3−1およびvanC2
C3−1064（配列番号1108および1107）を使用して、vanA配列、配列番号1049〜10
57、vanC1配列、配列番号1058〜1059、vanC2配列、配列番号1060〜1063およびva
nC3配列、配列番号1064〜1066を増幅し、決定することができた。また、4つの他
のPCRプライマー（配列番号1151〜1154）を設計し、vanA増幅生成物の配列決定
を完結するために使用した。
【０３２４】 実施例22．属及び種のレベルにおける腸球菌、ならびにその関連耐性遺伝子で あるvanA及びvanBの検出及び同定に関するPCRアッセイの開発 vanA及びvanB配列の比較より、vanA及びvanB配列の両方に特異的なPCRプライ
マーの設計を可能にする保存領域が明らかにされた（補遺XXXVIII）。PCRプライ
マーペアvanAB459及びvanAB830R（配列番号1112及び1111）は実施例11記載のエ
ンテロコッカス（Enterococcus）（腸球菌）−特異的プライマーEncg313dF及びE
ncg599c（配列番号1137及び1136）と共に複合的に使用した。vanA及びvanB配列
の配列アラインメント分析より、vanAに特異的であるもの（配列番号1170）とva
nBに特異的である（配列番号1171）内部プローブの設計に適した領域が明らかに
なった。PCR増幅及び増幅産物のアガロースゲル電気泳動は実施例11記載の如く
に実施された。
【０３２５】 最大の感度及び特異性を得る最適サイクリング条件は、94℃、3分間に続いて9
5℃、1秒と62℃、30秒の2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分間の末端伸長を
行うものである。この40サイクルPCRによる複合アッセイの特異性は、第10表掲
載の細菌のパネルより得た0.1ナノグラムの精製DNAを用いて検証された。40サイ
クルPCRによる複合アッセイの感度は、3株のエンテロコッカス・カセリフラブス
（E.casseliflavus）、8株のエンテロコッカス・ガリナルム（E.gallinarum）、
2株のエンテロコッカス・フラベセンス（E.flavescens）、2株のエンテロコッカ
ス・フェカリス（E.faecalis）のバンコマイシン−耐性株及び1株のエンテロコ
ッカス・フェカリス（E.faecalis）のバンコマイシン感受性、3株のエンテロコ
ッカス・フェカリス（E.faecium）のバンコマイシン耐性株、1株のE.faeciumの
バンコマイシン感受性株、及び第10表掲載の他腸球菌種それぞれからの1株を用
いて検証された。
【０３２６】 検出限界は試験した腸球菌の種により異なるが、1ないし10ゲノミックDNAコピ
ーであった。vanA−及びvnaB−特異的内部プローブ（配列番号1170及び1171）、
並びにE.faecalis−及びE.faecium−特異的内部プローブ（配列番号1174及び602
）、そして実施例11に記載のエンテロコッカス・カセリフラブス（E.casselifla
vus）、エンテロコッカス・ガリナルム（E.gallinarum）及びエンテロコッカス
・フラベセンス（E.flavescnes）（配列番号1122）を含む群に対し特異的な内部
プローブは、高い感度、特異性および遍在性にてバンコマイシン耐性腸球菌種を
認識でき、遺伝子型分析及び表現形分析間に完全な相関性を示した。
【０３２７】 アッセイの形状は上記記載の形状に限定されない。当業者はアッセイを分子ビ
ーコンプローブを利用してリアルタイムに検出するPCRの様な異なる形状に適合
できるだろう。このアッセイに使用するために設計された分子ビーコンプローブ
は、エンテロコッカス・フェカリス（E.faecalis）の検出に関する配列番号1236
、E.faeciumの検出に関する配列番号1235、vanAの検出に関する配列番号1240、v
anBの検出に関する配列番号1241を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３２８】 実施例23．バンコマイシン耐性Enterococcus faecalis、Enterococcus faeciu m、及びEntrococcus gallinarum、Enterococcus casseliflavus及びEnterococcu s flavescensを含む群の検出及び同定に関する複合PCRアッセイの開発 vanA及びvanB配列の分析は、vanA配列に特異的なPCRプライマーペア（配列番
号1089）（補遺XXVIII）及びvanB配列に特異的なPCRプライマーペア（配列番号1
095及び1096）（補遺XXIX）の設計を可能にする保存領域を明らかにした。vanA
−特異的PCRプライマーペア（配列番号1089及び1090）は、我々に譲渡された米
国特許第5,994,066号に記載のvanB−特異的PCRプライマーペア（本発明での配列
番号1095及び1096、並びに前記特許での配列番号231及び232）と共に複合的に使
用された。
【０３２９】 vanC1、vanC2及びvanC3配列の比較は、F.gallinarum、E.casseliflavus及びE.
flavescensを含む群に特異的な158-bpのアンプリコンを生成できるPCRプライマ
ー（配列番号1101及び1102）の設計を可能にする保存領域を明らかにした。vanC
−特異的PCRプライマーペア（配列番号1101及び1102）は我々に譲渡された米国
特許5,994,066号に記載のE.faecalis−特異的PCRプライマーペア（前記特許の配
列番号40及び41）及び我々の特許公報WO98/20157（前記公報の配列番号1及び2）
と共に複合的に使用された。両複合に関する最大感度及び特異性に関する最適サ
イクリング条件は、94℃、3分間に続いて95℃、1秒と58℃、30秒の2段階を40サ
イクル行い、更に72℃、2分間の末端伸長を行うものであった。
【０３３０】 PCR産物の検出は0.25μg/mlのエチジウムブロマイドを含むアガロースゲル（2
%）による電気泳動にて行われた。vanA−特異的PCRプライマーペア（配列番号10
89及び1090）、vanB−特異的プライマーペア（配列番号1095及び1096）、及びva
n-C特異的プライマーペア（配列番号1101及び1102）に関し、その特異性につい
て5種類のバンコマイシン感受性Enterococcus種、3種類のバンコマイシン耐性En
terococcus種、13種類のその他グラム陽性細菌及び1種類のグラム陰性細菌から
成るパネルより得た生成ゲノミックDNA、0.1ngを用い試験した。
【０３３１】 特異性試験は、我々の特許公報WO98/20157に記載されているE.faecium−特異
的PCRプライマーペア（前記公報の配列番号1及び2）及び我々に譲渡された米国
特許第5,994,066号に記載のE.faecalis−特異的PCRプライマーペア（前記特許の
配列番号40及び41）とを使用し、37種類のグラム陽性細菌種のパネルについて行
われた。全てのEnterococcus株は高い特異性をもって増幅され、遺伝子型分析と
表現形分析間に完全な相関性を示した。アッセイの感度は、E.gallinarum、E.ca
sseliflavus、E.flavescens及びバンコマイシン耐性E.faecalis及びE.faeciumの
数株について決定された。各E.faecalis−及びE.caecium−特異的PCRプライマー
ペア、並びにvanA−、vanB−及びvanC−特異的PCRプライマーペアを単独、ある
いは上記の如くに複合的に使用した場合、感度はゲノミックDNA1ないし10コピー
の範囲であった。
【０３３２】 アッセイの形状は上記記載の形状に限定されない。当業者はアッセイを、分子
ビーコンプローブを利用してリアルタイムに検出するPCRの様な異なる形状に適
合できるだろう。このアッセイに使用するために設計された分子ビーコンプロー
ブは、E.faecalisの検出に関する配列番号1238、E.faeciumの検出に関する配列
番号1237、vanAの検出に関する配列番号1239、vanBの検出に関する配列番号1241
を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３３３】 別の方法としてバンコマイシン−耐性E.faecium及びバンコマイシン−耐性E.f
aecalisの検出に関する別のPCRアッセイが開発された。このアッセイは次の2種
類の複合系を包含する:（1）vanA−特異的プライマーペア（配列番号1090-1091
）及び我々に譲渡された米国特許第5,994,066号に記載のvan-B特異的プライマー
ペア（本特許での配列番号1095及び1096、前記特許での配列番号231及び232）を
含む第一複合系、及び（2）我々に譲渡された米国特許第5,994,066（前記特許で
の配列番号40及び41）に記載のE.faecalis−特異的プライマーペア及び我々の特
許公報WO98/20157に記載のE.faecium−特異的プライマーペア（前記公報中の配
列番号1及び2）を含む第2複合系。
【０３３４】 両複合系では、最大感度及び特異性に関する条件は、94℃、3分間、それに続
く95℃、1秒と58℃、30秒の2段階から成る40サイクルに72℃、2分間の末端伸長
を加えたものであった。PCR産物の検出は0.25μg/mlのエチジウムブロマイドを
含むアガロースゲル（2%）による電気泳動にて行われた。この2種類の複合系に
関し、その特異性について2種類のバンコマイシン感受性E.faecalis株、2種類の
バンコマイシン耐性E.faecalis株、2種類のバンコマイシン感受性E.faecium株、
2種類のバンコマイシン耐性E.faecium株、16種類のその腸球菌種及びその他31種
類のグラム陽性細菌から成るパネルより得た生成ゲノミックDNA、0.1ngを用い試
験した。
【０３３５】 全てのE.faecium及びE.faecalis株は高い特異性をもって増幅され、遺伝子型
分析とグリコペプチド系抗生物質（バンコマイシン及びテイコプラニン）に対す
る感受性の間に完全な相関性を示した。アッセイの感度は2種類のバンコマイシ
ン耐性E.faecalis及び2種類のバンコマイシン耐性E.faecium株について決定され
た。検出限界は、全ての株についてゲノミックDNA5コピーであった。
【０３３６】 この複合PCRアッセイはキャプチャープローブハイブリダイゼーションと組み
合わされる。4種類の内部プローブが設計された:vanAアンプリコン特異的（配列
番号2292）、vanBアンプリコン特異的（配列番号2294）、E.faecalisアンプリコ
ン特異的（配列番号2291）及びE.faeciumアンプリコン特異的（配列番号2287）
である。各内部プローブは、高い特異性と感度でそれら特異的アンプリコンを検
出した。
【０３３７】 実施例24．tuf配列のEF-G（fusA）区画を含む遍在増幅。 図3に示す如く、プ
ライマー配列番号1228及び1229は、fusAの末端からstrオペロン内のtuf遺伝子の
開始部までの間の領域を増幅する様に設計された。35種類の株から成るパネルよ
り得たゲノミックDNAについて、これらプライマーによるPCR増幅を試験した。
【０３３８】 初回実験では、以下の株が陽性結果を示した:Abiotrophia adiacens ATCC 491
75、Abiotrophia defectiva ATCC 49176、Bacillus subtilis ATCC 27370、Clos
ridium difficile ATCC 9689、Enterococcus avium ATCC 14025、Enterococcus
casseliflavus ATCC 25788、Enterococcus cecorum ATCC 43198、Enterococcus
faecalis ATCC 29212、Enterococcus faecium ATCC 19434、Enterococcus flave
scens ATCC 49996、Enterococcus gallinarum ATCC 49573、Enterococcus solit
arius ATCC 49428、Escherichia coli ATCC 11775、Haemophilus influenzae AT
CC 9006、Lactobacillus acidophilus ATCC 4356、Peptococcus niger ATCC 277
31、Proteus mirabilis ATCC 25933、Staphylococcus aureus ATCC 43300、Stap
hylococcus auricularis ATCC 33753、
【０３３９】 Staphylococcus capitis ATCC 27840、Staphylococcus epidemidis ATCC 1499
0、Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970、Staphylococcus hominis ATCC 2
7844、Staphylococcus lugdunensis ATCC 43809、Staphylococcus saprophyticu
s ATCC 15305、Staphylococcus simulans ATCC 27848、及びStaphylococcus war
neri ATCC 27836。
【０３４０】 このプライマーペアは更に別の細菌種も増幅できた;しかし幾つかの種につい
ては増幅が認められず、PCRのサイクル条件が最適化できること、又はプライマ
ーの変更が可能なことが示差された。例えば配列番号1227はより広範囲の種を増
幅する様に工夫された。
【０３４１】 fusA及びtufをカバーする領域を増幅するためのその他可能なプライマーの組
合せに加え、図3はfusA断片の遍在的増幅に使用できる増幅プライマー配列番号1
221-1227の位置を示している。上記プライマーの全て（配列番号1221-1229）は
細菌の遍在的及び/又は特異的検出に使用できるだろう。 更に、プライマー配列番号1221-1229の異なる組合せは、時にtuf配列分析用プ
ライマー配列番号697と組合せて、遺伝子間領域を含むstrオペロン部分の配列分
析に用いられた。この様にして、以下の配列が生成された:配列番号1518-1526、
1578-1580、1786-1821、1822-1834、1838-1843、2184、2187、2188,2214-2249及
び2255-2269。
【０３４２】 実施例25．任意ムライム型PCRを利用したStaphylococcus saprophyticusから
のDNA断片の単離 任意プライム型PCR法（AP-PCR）を用いて、Staphylococcus saprophyticusの
種特異的検出及び同定に利用できる可能性を持った未知のDNA配列を得た。 AP-PCRは微生物に適した特異的DNAプローブを作るのに利用できる方法である
（Faniら、1993、Molecular Ecology 2:243-250）。Staphylococcus saprophyti
cusから種特異的ゲノミックDNA断片を単離するのに使用したAP-PCRのプロトコー
ルを以下説明する。長さ10ヌクレオチドの20種類のオリゴヌクレオチドプライマ
ー（全てAP-PCRキットOPAD（オペロンテクノロジー（Operon Technologies、Inc
.）アラミダ（Alameda）、カリフォルニア州（CA））に含まれている）は、5種
類のStaphylococcus saprophyticus株由来のDNA及び27種類のその他ブドウ球菌
株（非S.saprophyticus）種由来のDNAと共に計画的に試験された。
【０３４３】 全ての細菌種について、増幅は精製ゲノミックDNA1μL（0.1ng/μL）から直接
行った。25μLのPCR反応混合液には50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1% T
ritonX-100、2.5mM MgCl2、20種類のAP-PCRプライマーOPADより1種類1.2μM、4
種類のdNTPそれぞれ200μM、TaqStartTM抗体（クローンテックラボラトリーズ社
、パロアルト、カリフォルニア（Clontech Laboratories Inc.、Palo Alto、CA
））が組み合わされたTaqDNAポリメラーゼ（プロメガ、マジソン、ウイスコンシ
ン州（Promega Corp.、Madison、Wis））0.5Uを含んだ。
【０３４４】 PCR反応は、MJリサーチPTC―200サーマルサイクラーを使い、以下のサイクル
にかけて行った:96℃、3分に続き94℃、1分間の変性段階、31℃、1分間のアニー
リング段階及び72℃、2分間の伸長段階のサイクルを42回行った。42サイクル終
了後に72℃、7分間の最終伸長段階を行い、PCR産物を完全に伸長した。続いて20
マイクロリットルのPCR増幅混合液を0.25μg/mlのエチジウムブロマイドを含む1
.5%アガロースゲルを用いた電気泳動にかけ分析した。増幅産物の大きさは50bp
−分子量ラダーと比較して推定された。
【０３４５】 AP-PCRプライマーOPAD-16（配列:5’-AACGGGCGTC-3’）に伴ってStaphylococc
us saprophyticus特異的増幅パターンが観察された。このプライマーを使った増
幅は試験した全てのStaphylococcus saprophyticus株について約380bpのDNA断片
に相当するバンドを示したが、試験したその他ブドウ球菌種についてはこれを示
さなかった。
【０３４６】 AP-PCRをベースとしたStaphylococcus saprophyticusに特異的且つ遍在性であ
る380bpアンプリコンに相当するバンドをアガロースゲルより切り出し、QIAquic
kTMゲル抽出キット（キアゲン社（QIAGEN Inc.））を用い精製した。ゲル精製し
たDNA断片はT4DNAリガーゼ（ニューイングランドバイオラブス（New England Bi
oLabs）を用い、pCR2.1TMプラスミドベクターのT/Aクローニングサイト内にクロ
ーニングされた。組み換え体プラスミドは通常の方法によりE.coliDH5αコンペ
テント細胞内に形質導入された。全ての反応はメーカー指示書に従い行われた。
プラスミドDNAの単離は諸規模スケール調整の場合にはBimboimとDolyの方法（Nu
cleic Acid Res.,1979、7:1513-1523）によって行われた。全てのプラスミドDNA
標本はEcoRI制限エンドヌクレアーゼで消化され、プラスミド内に約380bpのAP-P
CR挿入体が存在することが確認された。
【０３４７】 続いて大規模及び高精製プラスミドDNAの調整は、AP-PCR挿入体を持つことを
示した、選択された2クローンからQIAGENプラスミド精製キット（中型）を使っ
て行われた。これら大規模プラスミド標本は自動DNA配列分析に使用された。 380bpのヌクレオチド配列は3株のS.saprophyticus（配列番号74、1093及び1198
）について決定された。選択された2クローン由来のAP-PCR挿入体の鎖は共に、
アプライドバイオシステムス（Applied Biosystems）自動DNAシークエンサー（
モデル373A）を同社PRISMTMSequenaseRTMターミネーターダブルストランドDNAシ
ークエンシングキット（アプライドバイオシステムス、フォスターシティー、カ
リフォルニア（Foster City、CA））と共に使用し、SP6及びT7を利用するジデオ
キシヌクレオチドチェインターミネーション配列分析法により配列決定された。
【０３４８】 最適な種特異的増幅プライマー（配列番号1208及び1209）は、プライマー分析
ソフトウエアーOligoTM5.0（ナショナルバイオサイエンス社（National BioScie
nces Inc.））を使って、配列分析されたAP-PCRStaphylococcus saprophyticusD
NA断片より選択された。選択されたプライマーはPCRアッセイで試験され、それ
らの特異性と遍在性が実証された。28種類のブドウ球菌を含む49種類のグラム陽
性菌と31種類のグラム陰性菌から成る参考ATCC株のDNA標本について得たデータ
は、試験したその他のブドウ球菌又は細菌のDNAについては増幅シグナルが観察
されないことから、選択されたプライマーペアがStaphylococcus saprophyticus
に特異的であることを示した。このアッセイは試験した各種材料より60株全ての
S.saprophyticusからのDNAを効率的に増幅できた。3株のS.saprophyticus参考株
について得られた感度レベルは約6ゲノムコピーであった。
【０３４９】 実施例26．前核生物tuf遺伝子断片の配列決定 各種細菌種の公開tuf配列の比較より、広範囲の細菌種のtuf配列を増幅できる
PCRプライマーの設計が可能となる保存領域が明らかにされた。プライマーペア
配列番号664と697を使用した場合に配列番号1-73、75-241,607-618、621、662、
675、717-736、868-888、932、967-989、992、1002、1572-1575、1662-1663、17
15-1733、1835-1837、1877-1878、1880-1881、2183、2185、2200、2201及び2270
-2272のtuf配列を増幅し、決定することができた。
【０３５０】 実施例27．前核生物recA遺伝子断片の配列決定 各種細菌種の公開recA配列の比較より、広範囲の細菌種のrecA配列を増幅でき
るPCRプライマーの設計が可能となる保存領域が明らかにされた。プライマーペ
ア配列番号921-922と1605-1606を使用した場合に、配列番号990-991、1003、128
8-1289、1714、1756-1763、1866-1873及び2202-2212のrecA配列を増幅し、決定
することができた。
【０３５１】 実施例28．tuf配列を用いたEscherichia coli/Shigella sp.の特異的検出及び 同定 各種細菌種のtuf配列の分析よりEscherichia coli/Shigell sp.に特異的なPCR
プライマー（配列番号1661及び1665）及び内部プローブ（配列番号2168）の選択
が可能となった。PCRプライマーの設計に用いたストラテジーは各種tuf配列の複
数配列アラインメントに基づいた。複数配列アラインメントにはEscherichia co
li/Shigella sp.並びにその他の種及び細菌属、特に密に関連した種を代表する
もののtuf配列を含んだ。このアラインメントを注意深く分析することで、標的
種では保存されているが、その他の種、特に密に関連する種の配列を識別するオ
リゴヌクレオチドを選別することができ、これにより標的細菌種の種特異的且つ
遍在的検出及び同定が可能となる。
【０３５２】 選択されたプライマーペアのオリゴ配列番号1661及び1665は、219bpの増幅産
物を与えた。標準的PCRは、最終容積20μl中に各プライマー0.4μM、2.5mM MgCl 2 、0.005mM BSA、50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1% TritonX-100、dNTP
s 0.2mM（ファルマシア（Pharmaica））、TaqStartTM抗体（クローンテックラボ
ラトリーズ）と組み合わせられた0.5U TaqDNAポリメラーゼ（プロメガ）、1μl
のゲノミックDNAサンプルを使い、PTC-200サーもサイクラー（MJリサーチ）によ
り実施された。最大感度と特異性を得る最適サイクリング条件は、初期変性の95
℃、3分、続いて95℃、1秒間と60℃、30秒間より成る2段階を40サイクル行い、
更に72℃、2分間の最終伸長段階を行うものであった。PCR産物の検出は0.25μg/
mlのエチジウムブロマイドを含むアガロースゲル（2%）を用いた電気泳動により
行われた。PCR産物は254nmのUV下に視覚化された。
【０３５３】 アッセイの特異性は以下の細菌種それぞれのゲノミックDNA、0.1ngをPCR反応
液に加え試験された:Escherichia coli（7株）、Shigella sonnei、Shigella fl
exneri、Shigella dysenteriae、Salmonella typhimyurium、Salmonella typhi
、Salmonella enteritidis、Tatumella ptyseos、Klebsiella pneumoniae（2株
）、Enterobacter aerognes、Citrobacter farmeri、Campylobacter jejuni、Se
rratia marcescens。増幅は掲載のEscherichia coli及びShigella種及びEscheri
chia faegusoniiについてのみ観察された。40サイクルのPCRを利用したアッセイ
の感度は、E.coliの1株及びShigella種の3株について検証された。E.coli及びSh
igella種の検出限界は、試験した株により異なるが1ないし10ゲノミックDNAコピ
ーであった。
【０３５４】 実施例29．atpD配列を用いたKlebsiella pneumoniaeの特異的検出及び同定 各種細菌種からのatpD配列の分析によりK.pneumoiaeに特異的なPCRプライマー
の選択が可能となった。プライマー設計のストラテジーは、アラインメントにat
pD配列が用いられている以外は実施例28記載のストラテジーと同様であった。 115bpの増幅産物を提供する2種類のK.pneumoniae−特異的プライマー（配列番
号1331及び1332）が選択された。実施例28記載の様な0.4Mの各プライマーを用い
、PTC-200（KJリサーチ）により標準的PCRが実施された。最大感度及び特異性に
関する最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初期変性に続いて95℃、1秒と55
℃、30秒の2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分間の末端伸長を行うものであ
った。
【０３５５】 アッセイの特異性はPCR反応液に以下の細菌種それぞれのゲノミックDNA、0.1n
gを加え試験された:Klebsiella pneumoniae（2株）、Klebsiella ornitholytica
、Klebsiella oxytoca（2株）、Klebsiella planticola、Klebsiella terrigena
、Citrobacter freundii、Escherichia coli、Salmonella cholerasuis Serrati
a marcescens、Enterbacter aerogenes、Proteus vulgaris、Kluyvera ascorbat
a、Kluyvera georgiana、Kluyvera cryocrescens及びYersinia enterolitica。
増幅は試験した2株のK.pneumoniae、K.planticola、K.terrigena及び3種のKluyv
era種について検出された。atpD遺伝子の複数アラインメント配列分析より、Kle
bsiella pneumoniaeとその他Klebsiella種及びKluyvera種とを識別できる配列番
号2167の内部プローブの設計が可能になった。40サイクルのPCRを利用したアッ
セイの感度は1株のK.pneumoinaeを用い検証された。K.pneumoniaeの検出限界は
約10ゲノミックDNAコピーであった。
【０３５６】 実施例30．atpD配列を用いたAcinetobacter baumanniiの特異的検出及び同定 各種細菌種からのatpD配列の分析によりAcinetobacter baumanniiに特異的なP
CRプライマーの選択が可能となった。プライマー設計のストラテジーは、アライ
ンメントにatpD配列が用いられている以外は実施例28記載のストラテジーと同様
であった。 233bpの増幅産物を提供する2種類のA.baumannii−特異的プライマー（配列番
号1690及び1691）が選択された。実施例28記載の様な0.4Mの各プライマーを用い
、PTC-200（KJリサーチ）により標準的PCRが実施された。最大感度及び特異性に
関する最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初期変性に続き、95℃、1秒と55
℃、30秒から成る2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分間の末端伸長するもの
であった。
【０３５７】 アッセイの特異性はPCR反応液に以下の細菌種それぞれのゲノミックDNA、0.1n
gを加え試験された:Acinetobacter baumannii（3株）、Acinetobacter anitratu
s、Acinetobacter lwoffi、Serratia marcescens、Enterobacter cloacae、Ente
rococcus faecalis、Pseudomonas aeruginosa、Psychrobacter phenylpyruvicus
、Neisseria gonorrheoae、Haemophilus haemoliticus、Yersinia enterolitica
、Proteus vulgaris、Eikenella corrodens、Escherichia coli。増幅はA.bauma
nnii、Aanitratus及びA.lwoffiについてのみ検出された。40サイクルのPCRを利
用したアッセイの感度は2株のA.baumanniiを用い検証された。試験した2株のA.b
aumanniiの検出限界はゲノミックDNA5コピーであった。atpD遺伝子の複数アライ
ンメント配列分析より、A.baumannii特異的内部プローブ（配列番号2169）の設
計が可能になった。
【０３５８】 実施例31．tuf配列を用いたNeisseria gonorrhoeae特異的検出及び同定 各種細菌種からのtuf配列の分析によりNeisseria gonorrhoeaeに特異的なPCR
プライマーの選択が可能となった。プライマー設計のストラテジーは実施例28記
載のストラテジーと同様であった。 139bpの増幅産物を提供する配列番号551及び552の2種類のN.gonorrhoeae−特
異的プライマーが選択された。PCR増幅は、実施例28記載の如くに0.4Mの各プラ
イマーを用い、PTC-200（KJリサーチ）によって実施された。最大感度及び特異
性に関する最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初期変性に続き、95℃、1秒
と65℃、30秒から成る2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分間の末端伸長する
ものであった。
【０３５９】 アッセイの特異性はPCR反応液に以下の細菌種それぞれのゲノミックDNA、0.1n
gを加え試験された:Neisseria gonorrhoeae（19株）、Neisseria meningitidis
（2株）、Neisseria lactamica、Neisseria flavescens、Neisseria animalis、
Neisseria canis、Neisseria cuniculi、Neisseria elongata、Neisseria mucos
a、Neisseria polysaccharea、Neisseria sicca、Neisseria subflava、Neisser
ia 。増幅はN.gonorrhoeae、N.sicca及びN.polysacchareaについてのみ検出され
た。40サイクルのPCRを利用したアッセイの感度は2株のN.gonorrhoeaeを用い検
証された。試験したN.gonorrhoeaeの検出限界はゲノミックDNA5コピーであった
。tuf遺伝子の複数アラインメント配列分析より、N.gonorrhoeaeをN.sicca及びN
.polysacchareaと識別できる配列番号2166の内部プローブの設計が可能となった
。
【０３６０】 実施例32．細菌性gyrA及びparC遺伝子断片の配列分析。細菌性gyrA及びparC断 片の配列分析 各種細菌種に於けるキノロン耐性の主要機序の一つは、標的変化（DNAジャイ
レース及び/又はトポイソメラーゼIV）により仲介されている。これら酵素はDNA
のトポロジーを制御し、染色体の機能や複製にとって重要である。これら酵素は
それぞれ2種類のサブユニットから成る4量体である:GyrA及びGyrBはDNAジャイレ
ースのA2B2複合体を形成し;そしてParC及びParEはDNAトポイソメラーゼIVのC2E2 複合体を形成する。これらはDNAジャイレースのGyrAサブユニットをコードするg
yrA及びトポイソメラーゼIVのparCサブユニットをコードしているparC内にある
、キノロン−耐性−決定領域（QRDR）と呼ばれる突然変異に関するホットスポッ
トである。
【０３６１】 各種細菌のキノロン耐性を特異的に検出するためのプライマー及び/又はプロ
ーブの設計に利用できるgyrA及びparC配列に関するデータベースを構築するため
に、各種細菌に由来する公開データベース（GenBank及びEMBL）から選択されたg
yrA及びparCDNA断片を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。 プライマーペア配列番号1297及び1298を使用することでKlebsiella oxytoca（
配列番号1764）、Klebsiella pneumoniae亜種ozaneae（配列番号1765）、Klebsi
ella planticola（配列番号1766）、Klebsiella pneumoniae（配列番号1767）、
Klebsiella pneumoniae亜種pneumoniae（2株）（配列番号1768-1769）、Klebsie
lla pneumoniae亜種（配列番号1770）、Klebsiella terrigena（配列番号1771）
、Kluyvera ascorbata（配列番号2013）、Kluyvera georgiana（配列番号2014）
及びEscherichia coli（4株）（配列番号2277-2280）のgyrA配列を増幅、決定す
ることができた。
【０３６２】 配列番号1291及び1292のプライマーペアを使うことで、Legionella pneumophi
la亜種pneumophila（配列番号1772）、Proteus mirabilis（配列番号1773）、Pr
ovidencia rettgeri（配列番号1774）、Proteus vulgaris（配列番号1775）及び
Yersinia enterolitica（配列番号1776）からのgyrA配列を増幅し、決定するこ
とができた。配列番号1340及び1341のプライマーペアを利用すると、Staphyloco
ccus aureus由来のgyrA配列（配列番号1255）を増幅、決定できた。
【０３６３】 配列番号1318及び1319のプライマーを使用すると、K.oxytoca（2株）（配列番
号1777-1778）、Klebsiella pneumoniae亜種ozaenae（配列番号1779）、Klebsie
lla planticola（配列番号1780）、Klebsiella pneumoniae（配列番号1781）、K
lebsiella pneumoniae亜種pneumoniae（2株）（配列番号1782-1783）、Klebsiel
la pneumoniae亜種rhinoscleromatis（配列番号1784）及びKlebsiella terrigen
a（配列番号1785）由来のparC配列を増幅、決定できた。
【０３６４】 実施例33．Staphylococcus aureus及びそのキノロン耐性遺伝子gyrA及びparC
の特異的検出及び同定に関するPCRアッセイの開発 各種細菌のgyrA及びparC配列分析よりStaphylococcus aureusのgyrA及びparC
のキノロン耐性決定領域（QRDR）に特異的なPCRプライマーの設計を可能にする
保存領域が明らかになった。配列番号1340及び1341のPCRプライマーペアはS.aur
eusのgyrA配列を増幅する様に設計されたが、一方配列番号1342及び1343のPCRプ
ライマーペアはS.aureusのparCを増幅することを目的に設計された。各種レベル
のキノロン耐性を示すS.aureusのgyrA及びparC配列を比較することで、gyrAによ
りコードされたDNAジャイレースのGyrAサブユニット内におけるSer-84からLeuへ
の、Glu-88からGly又はLysへのアミノ酸置換及びparCにコードされたトポイソメ
ラーゼIVParCサブユニット内でのSer-80からPhe又はTyrへの、及びAla-116からG
luへのアミノ酸置換を同定することができた。
【０３６５】 GyrA及びParCサブユニット内のこれらアミノ酸置換は中−又は高−レベルのキ
ノロン耐性を示す分離株に起こっている。野生型S.aureusのgyrA（配列番号1940
）及び野生型S.aureusのparC（配列番号1941）の特異的検出に好適な内部プロー
ブ、並びにキノロン−耐性S.aureus内に同定された各gyrA（配列番号1333-1335
）及びparC突然変異（配列番号1336-1339）の特異的検出に好適な内部プローブ
が設計された。
【０３６６】 gyrA−及びparC−特異的プライマーペア（配列番号1340-1341及び配列番号134
2-1343）は複合的に使用された。PCR増幅は各プライマー0.3、0.3、0.6及び0.6
μMを用い、実施例28同様にPTC-200サーもサイクラー（MJリサーチ）にて実施さ
れた。最大感度及び特異性に関する最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初
期変性に続き95℃、1秒と62℃、30秒の2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分
間の末端伸長を行うものであった。PCR産物の検出は0.25μg/mlのエチジウムブ
ロマイドを含むアガロースゲル（2%）による電気泳動にて行われた。この40サイ
クルPCRによる複合アッセイの特異性は、グラム陽性菌のパネル由来の精製ゲノ
ミックDNAを用いて検証された。
【０３６７】 リストには以下の菌が含まれていた:Abiotrophia adiacens、Abiotrophia def
ectiva、Bacillus cereus、Bacillus mycoides、Enterococcus faecalis（2株）
、Enterococcus flavescens、Gemella morbillorum、Lactococcus lactis、List
eria innocua、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus（5株）、Stap
hylococcus auricalis、Staphylococcus capitis亜種urealyticus、Staphylococ
cus carnosus、Staphylococcus chromogenes、Staphylococcus epidermidis（3
株）、Staphylococcus gallinarum、Staphylococcus haemolyticus（2株）、Sta
phylococcus hominis、Staphylococcus hominis亜種hominis、Staphylococcusle
ntus、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus saccharolyticus、Staphy
lococcus saprophyticus（3株）、Staphylococcus simulans、Staphylococcus w
arneri、Staphylococcus xylosus、Streptococcus agalactiae、Streptococcus
pneumoniae。gyrA及びparC遺伝子の強い増幅は試験したS.aureus株にのみ検出さ
れた。40サイクルPCRを利用したこの複合アッセイの感度は、1種類のキノロン感
受性S.aureus及び4種類のキノロン耐性S.aureus株を用いて検証された。検出限
界は試験株により異なるが、2ないし10ゲノミックDNAコピーであった。
【０３６８】 内部プローブによるハイブリダイゼーションの検出は、実施例7記載の如くに
実施された。S.aureusの野生型gyrA及びparC、及びS.aureusのgyrA及びparC変異
体に特異的な内部プローブは、2種類のキノロン−耐性型及び1種類のキノロン−
感受性型S.aureus株を認識でき、キノロンに対する感受性と完璧な相関性を示し
た。 S.aureusの特異的検出、及びキノロンに対するその感受性に関する完全なアッ
セイは、実施例7記載のStaphylococcus−特異的プライマー（配列番号553及び57
5）及びS.aureus gyrA−及びparC−特異的プライマーペア（配列番号1340-1341
及び配列番号1342-1343）を含む複合系を含んでいる。増幅は実施例7記載のS.au
reus特異的内部プローブ（配列番号587）及び、野生型S.aureus gyrAとparC特異
的（配列番号1940-1941）及びS.aureus gyrAとparC変異体特異的（配列番号1333
-1338）内部プローブとによるポストPCRハイブリダイゼーションと組み合わされ
ている。
【０３６９】 またSmartCycler（Cepheid）を利用したキノロン−耐性S.aureusを検出するた
めのアッセイも開発された。リアルタイム検出はS.aureus parC−特異的プライ
マー（配列番号1342及び1343）と実施例7記載のStaphylococcus−特異的プライ
マー（配列番号尾553及び575）を使用することのに基づいている。内部プローブ
は、S.aureus parC（配列番号1938及び1955）によりコードされたParC内のSer-8
0からTyr又はPheへのアミノ酸置換の検出を目的として、野生型S.aureus parC（
配列番号1939）の分子ビーコン検出に関し設計された。
【０３７０】 実施例34．Klebsiella neumoniae及びそのキノロン耐性遺伝子gyrA及びparCの 特異的検出及び同定に関するPCRアッセイの開発 公開データベース及び実施例32記載のデータベースに由来する各種細菌のgyrA
及びparCの配列分析より、K.pneumoniaeのgyrA及びparCのキノロン耐性決定領域
（QRDR）に特異的なPCRプライマーの設計を可能にする保存領域が明らかになっ
た。配列番号1936及び1937のPCRプライマーペアは、又は配列番号1937と1942の
プライマーペアは、K.pneumoniaeのgyrA配列を増幅する様に設計されたが、一方
配列番号1934及び1935のPCRプライマーペアはK.pneumoniaeのparCを増幅するこ
とを目的に設計された。別のペアである配列番号1935と1936もK.pneumoniae par
Cを増幅できる。
【０３７１】 各種レベルのキノロン耐性を示すK.pneumoniaeのgyrA及びparC配列を比較する
ことで、gyrAによりコードされたDNAジャイレースのGyrAサブユニット内でのSer
-83からTyr又はPhe及びSsp-87からGly又はAlaへの、そしてAsp87からAsnへのア
ミノ酸置換と、parCにコードされたトポイソメラーゼIVのParCサブユニット内に
おけるSer-80からIle又はArgへの、及びGlu-84からGly又はLysへのアミノ酸置換
を同定することができた。GyrA及びParCサブユニット内のこれらアミノ酸置換は
中−又は高−レベルのキノロン耐性を示す分離株で生じた。野生型K.pneumoniae
のgyrA（配列番号1943）及び野生型K.pneumoniaeのparC（配列番号1944）の特異
的検出に好適な内部プローブ、並びにキノロン−耐性K.pneumoniae内に同定され
た各gyrA（配列番号1945-1949）及びparC突然変異（配列番号1950-1953）の特異
的検出に好適な内部プローブが設計された。
【０３７２】 K.pneumoniae gyrA−及びparC−特異的プライマーペアを使用する2種類の複合
系が用いられた:第1複合系はK.pneumoniae gyrA−特異的プライマー（配列番号1
937及び1942）とK.pneumoniae parC−特異的プライマー（配列番号1934及び1935
）を含み、第2複合系はK.pneumoniae gyrA/parC−特異的プライマー（配列番号1
936）、K.pneumoniae gyrA−特異的プライマー（配列番号1937）及びK.pneumoni
ae parC−特異的プライマー（配列番号1935）を含んだ。第1複合系については標
準的PCRの増幅がそれぞれ0.6、0.6、0.4及び0.4μMの各プライマーを用いPTC-20
0サーもサイクラー（MJリサーチ）にて実施され、第2複合系についてはそれぞれ
0.8、0.4及び0.4μMのプライマーが用いられ実施された。
【０３７３】 PCR増幅及び増幅産物のアガロースゲル電気泳動は実施例28記載の様に実施さ
れた。最大感度及び特異性に関する最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初
期変性に続き95℃、1秒と62℃、30秒の2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分
間の末端伸長を行うものであった。40サイクルPCRを利用した2種類の複合系アッ
セイの特異性は、グラム陰性菌パネルより得た0.1ngの精製ゲノミックDNAを使っ
て検証された。
【０３７４】 リストには以下の菌が含まれていた:Abiotrophia baumannii、Citrobacter fr
eundii、Eikenella corrodens、Enterobacter cloacae、Escherichia coli（10
株）、Haemophilus influenzae、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella arnithol
ytica、Klebsiella oxytoca（2株）、Klebsiella planticola、Klebsiella terr
igena、Kluyvera ascorbata、Kluyvera cryocrescens、Kluyvera georgiana、Ne
isseria gonorrhoeae、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Pseudomonas ae
ruginosa、Salmonella chloeraesuis亜種typhimurium、Salmonella enteritidis
、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens及びYersinia enterocolytica
。両複合系に関しては、gyrA及びparC遺伝子の強い増幅は、試験したK.pneumoni
ae株にのみ検出された。40サイクルPCRを利用したこの複合アッセイの感度は、1
種類のキノロン感受性K.pneumoniae株を用いて検証された。検出限界は約10ゲノ
ミックDNAコピーであった。
【０３７５】 K.pneumoniaeの特異的検出、及びキノロンに対するその感受性に関する完全な
アッセイは、実施例29記載のKlebsiella−特異的プライマー（配列番号1331及び
1332）及びK.pneumoniae gyrA−及びparC−特異的プライマーペア（配列番号193
5、1936、1937）を含む複合系、又はK.pneumoniaeをgyrA−及びparC−特異的プ
ライマー（配列番号1934、1937、1939、1942）を含む混合系のいずれかを含んで
いる。増幅は実施例29記載のK.pneumoniae特異的内部プローブ（配列番号2167）
及び、野生型K.pneumoniae gyrA及びparC特異的（配列番号1943、1944）、及びK
.pneumoniae gyrAとparCの変異体に特異的（配列番号1333-1338）な内部プロー
ブとを用いるポストPCRハイブリダイゼーションと組み合わされている。
【０３７６】 またSmartCycler（Cepheid）を利用したキノロン−耐性K.pneumoniaeを検出す
るためのアッセイも開発された。リアルタイム検出は耐性型K.pneumoniae gyrC
−特異的プライマー（配列番号1936及び1937）と実施例29記載のK.pneumoniae−
特異的プライマー（配列番号尾1331及び1332）を使用することのに基づいている
。内部プローブはgyrA（配列番号2250）によりコードされたDNAジャイレースのG
yrサブユニット内のSer-83からTyr又はPheへの、及び/又はAsp-87からGly又はAs
nへのアミノ酸置換を検出するため及びK.pneumoniae（配列番号2281）を検出す
ることを目的として、野生型K.pneumoniae gyrA（配列番号2251）の分子ビーコ
ン検出に関し設計された。
【０３７７】 実施例35．S.pneumoniae及びそのキノロン耐性遺伝子gyrA及びparCの特異的検 出及び同定に関するPCRアッセイの開発 各種細菌のgyrA及びparCの配列分析より、全てのS.pneumoniae株のgyrA及びpa
rCのキノロン耐性決定領域（QRDR）を増幅できるPCRプライマーの設計を可能に
する保存領域が明らかになった。配列番号2040及び2041のPCRプライマーペアはS
.pneumoniaeのgyrA配列を増幅する様に設計されたが、一方配列番号20444及び20
45のPCRプライマーペアはS.pneumoniaeのparCを増幅することを目的に設計され
た。各種レベルのキノロン耐性を示すS.pneumoniaeのgyrA及びparC配列を比較す
ることで、gyrAによりコードされたDNAジャイレースのGyrAサブユニット内にお
けるSer-81からPhe又はTyrへのアミノ酸置換、及びparCにコードされたトポイソ
メラーゼIVのParCサブユニット内におけるSer-79かPheへのアミノの変化を同定
することができた。
【０３７８】 GyrA及びParCサブユニット内のこれらアミノ酸置換は中−又は高−レベルのキ
ノロン耐性を示す分離株で生じた。キノロン−耐性S.pneumoniae内に同定された
gyrA（配列番号2042及び2043）及びparC（配列番号2046）それぞれの特異的検出
に好適な内部プローブが設計された。 全ての細菌種について、増幅は精製ゲノミックDNAより実施された。0.1ng/μL
のゲノミックDNA1μlが19μlのPCR混合液に直接移された。各PCR反応液は50mM K
Cl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1%TritonX-100、2.5mM MgCl2、0.4μM（それぞ
れ）の上記配列番号2040,2041、2044及び20.45のプライマー、0.05mMウシ血清ア
ルブミン（BSA）及びTaqStartTM抗体と組み合わされた0.5UのTaqポリメラーゼを
含んだ。
【０３７９】 最大感度及び特異性に関する最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初期変
性に続き95℃、1秒と58℃、30秒の2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分間の
末端伸長を行うものであった。捕捉プローブハイブリダイゼーション用ジゴキシ
ゲニン（DIG）−標識アンプリコンを作製するために、増幅には0.1XPCR DIGラベ
リング4デオキシヌクレオシド3リン酸混合液（ベーリンガーマンハイム社（Boeh
ringer Mannheim GmbH））を使用した。
【０３８０】 DIG−標識アンプリコンは96−ウエルプレートに結合された捕捉ブロー部にハ
イブリダイズされた。プレートは抗−DIG−アルカリホスファターゼと共にイン
キュベーションされ、CSPDとインキュベーションした後ルミノメーター（MLX、D
ynex Technologies Inc）を用い化学発光が測定され、相対光単位（RLU）として
記録された。続いて捕捉プローブ有り無しでの試験サンプルのRLU比を計算した
。比が2.0以上の場合を陽性ハイブリダイゼーションシグナルとした。全ての反
応は二重測定で行われた。
【０３８１】 40サイクルPCRを利用した複合系アッセイの特異性は、第13表掲載の細菌パネ
ルより得た0.1ngの精製ゲノミックDNAを使って検証された。gyrA及びparC遺伝子
の強い増幅は、試験したS.pneumoniae株にのみ検出された。Staphylococcus sim
ulansには弱いgyrA及びparC遺伝子の増幅が検出された。5株のS.pneumoniae株の
精製ゲノミックDNAを使って試験された検出限界は、1ないし10ゲノミックDNAコ
ピーであった。更に5株のキノロン−耐性及び2株のキノロン−感受性S.pneumoni
ae臨床分離株についても試験し、捕捉プローブハイブリダイゼーションアッセイ
と組み合わせ開発された複合PCRについて検証を行った。S.pneumoniae gyrA及び
parC突然変異の検出とキノロンに対する感受性との間には完全な相関性が認めら
れた。
【０３８２】 S.pneumoniaeの特異的検出、及びキノロンに対するその感受性に関する完全な
アッセイは、実施例20記載のS.pneumoniae−特異的プライマー（配列番号1179及
び1181）、及びS.pneumoniae gyrA−及びparC−特異的プライマーペア（配列番
号2040及び2041、並びに配列番号2044及び2045）を含む複合系を含んでいる。増
幅は実施例記載のS.pneumoniae特異的内部プローブ（配列番号1180）及び、S.pn
eumoniae gyrA及びparC変異体特異的（配列番号2042、2043及び2046）内部プロ
ーブを用いるポストPCRハイブリダイゼーションと組み合わされている。
【０３８３】 実施例36．Escherichia coliにおけるの広域スペクトルTEM−型βラクタマー
ゼの検出 第三世代セファロスポリン及びβ−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を付与す
るTEM配列の分析より、Met-69からIle又はLeu又はValへの、又はSer-130からGly
への、Arg-164からSer又はHisへの、Gly-238からSerへの、Glu-240からLys及びA
rg-244からSer又はCys又はThr又はHis、又はLeuへのアミノ酸置換を同定するこ
とができた。配列番号1907及び1908のPCRプライマーは、TEM配列を増幅するため
に設計された。第三世代セファロスポリン及びβ−ラクタマーゼ阻害剤に対する
耐性を検出するために、野生型TEM（配列番号241）及びTEM変異体に同定された
各アミノ酸置換（配列番号1909-1926）の特異的検出を目的とした内部プローブ
が設計された。プライマー及びプローブの設計及び合成、ならびにハイブリダイ
ゼーションの検出は実施例7記載の如くに行われた。
【０３８４】 全ての細菌種について、増幅は精製ゲノミックDNAより実施された。0.1ng/μL
のゲノミックDNA1μlが19μlのPCR混合液に直接移された。各PCR反応液は50mM K
Cl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1%TritonX-100、2.5mM MgCl2、0.4μMの配列番
号1907及び1908のTEM−特異的プライマー、200μM（それぞれ）の4種類のデオキ
シヌクレオシド3リン酸、0.05mMウシ血清アルブミン（BSA）及びTaqStartTM抗体
と組み合わされた0.5UのTaqポリメラーゼを含んだ。PCR増幅及び増幅産物のアガ
ロースゲル分析は実施例28記載の如くに実施された。最大感度及び特異性に関す
る最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初期変性に続き95℃、5秒と55℃、30
秒及び72度30秒の3段階からなるサイクルを40回、更に72℃、2分間の末端伸長を
行うものであった。
【０３８５】 40サイクルPCRを利用したTEM−特異的プライマーの特異性は、次の細菌より得
た0.1ngの精製ゲノミックDNAを使って検証された:3種類の第三世代セファロスポ
リン−耐性Escherichia coli株（1株がTEM-10、1株がTEM-28、残りがTEM-49）、
2種類の第三世代セファロスポリン−感受性Escherichia coli株（1株がTEM-1で
残りがTEM無し）、1株の第三世代セファロスポリン耐性Klebsiella pneumoniae
株（TEM-47）及び1株のβ−ラクタマーゼ−阻害剤−耐性Proteus mirabilis（TE
M-39）。TEM特異的プライマーによる増幅は、TEMを含む4株についてのみ検出さ
れた。 TEM-1、又はTEM-10又はTEM-49を含む3株のE.coli株の、TEM-47を含む1株のK.p
neumoniae株及びTEM-39を含む1株のP.mirabilisを使い40サイクルのPCRを利用し
たアッセイの感度が検証された。ゲノミックDNAの検出限界は、試験したTEM−含
有株により異なるが5ないし100ゲノミックDNAコピーであった。
【０３８６】 配列番号1907及び1908のTEM−特異的プライマーは、実施例28記載の配列番号1
661及び1665のEscherichia coli/Shigella種−特異的プライマーと複合的に利用
されることで、Escherichia coli/Shigella種及びβ−ラクタマーゼ感受性を完
全に同定することができた。0.4μMの各プライマーを用いたPCR増幅と、増幅産
物のアガロースゲル分析は上記同様に実施された。 40サイクルPCRを用いた複合系の特性は、次の細菌からの0.1ngの精製ゲノミッ
クDNAを用い、検証された:3株の第三世代セファロスポリン耐性Escherichia col
i株（1株がTEM-10、1株がTEM-28、残りがTEM-49）、2種類の第三世代セファロス
ポリン−感受性Escherichia coli株（1株がTEM-1で残りがTEM無し）、1株の第三
世代セファロスポリン耐性Klebsiella pneumoniae株（TEM-47）及び1株のβ−ラ
クタマーゼ−阻害剤−耐性Proteus mirabilis（TEM-39）。複合系はTEMを含むEs
cherichia coliに高い特異性を示した。
【０３８７】 TEM−型E.coliの検出に関する完全なアッセイは、TEM−特異的プライマー（配
列番号1907及び1908）、及びEscherichia coli/Shigella種特異的プライマー（
配列番号1661及び1665）を含む複合系を利用し、かつ野生型TEM（配列番号2141
）及びTEM変異体（配列番号1909-1926）に特異的な内部プローブ用いるポストPC
Rハイブリダイゼーションと組み合わされたPCR増幅を含んでいる。
【０３８８】 実施例37．Klebsiella pneumoniaeにおける広域スペクトルTEM−型βラクタマ ーゼの検出 第三世代セファロスポリン及びβ−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を付与す
るSHVM配列の比較より、Ser-130のGlyへの、Asp-179のAla又はAsnへの、Gly-238
からSerへの、及びGlu240からLysへのアミノ酸置換を同定することができた。SH
V配列を増幅するために、配列番号1884及び1885のPCRプライマーが設計された。
第三世代セファロスポリン及びβ−ラクタマーゼ阻害剤に対する耐性を検出する
ために、野生型SHV（配列番号1896）及びSHV変異体に同定された各アミノ酸置換
（配列番号1886-1895及び1897-1898）を特異的にするための内部プローブが設計
された。プライマー及びプローブの設計及び合成、ならびにハイブリダイゼーシ
ョンの検出は実施例7記載の如くに行われた。
【０３８９】 全ての細菌種について、増幅は精製ゲノミックDNAより実施された。0.1ng/μL
のゲノミックDNA1μlが19μlのPCR混合液に直接移された。各PCR反応液は50mM K
Cl、10mM Tris-HCl（pH9.0）、0.1%TritonX-100、2.5mM MgCl2、0.4μMの配列番
号1884及び1885のSHV−特異的プライマー、200μM（それぞれ）の4種類のデオキ
シヌクレオシド3リン酸、0.05mMウシ血清アルブミン（BSA）及びTaqStartTM抗体
と組み合わされた0.5UのTaqポリメラーゼを含んだ。PCR増幅及び増幅産物のアガ
ロースゲル分析は実施例28記載の如くに実施された。最大感度及び特異性に関す
る最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初期変性に続き95℃、5秒と55℃、30
秒及び72度30秒の3段階からなるサイクルを40回、更に72℃、2分間の末端伸長を
行うものであった。
【０３９０】 40サイクルPCRを利用したSHV−特異的プライマーの特異性は、次の細菌より得
た0.1ngの精製ゲノミックDNAを使って検証された:2種類の第三世代セファロスポ
リン−耐性Klebsiella pneumoniae株株（1株がSHV-2aを有し、その他はSHV-12）
、1種類の第三世代セファロスポリン−感受性Klebsiella pneumoniae株（SHV-1
）、2株の第三世代セファロスポリン耐性Escherichia coli（1株がSHV-8及び残
りがHSV-7）及び2株の第三世代セファロスポリン感受性Escherichia coli株（1
株がSHV-1で、残りがSHVなし）。SHV−特異的プライマーによる増幅は、SHVを含
む株についてのみ検出された。
【０３９１】 40サイクルのPCRを利用したアッセイの感度はSHVを含む4種類の株を使って検
証された。検出限界は、試験したSHV−含有株により異なるが、10ないし100ゲノ
ミックDNAコピーであった。 増幅は、野生型SHVの同定に特異的な内部プローブ（配列番号1896）及びaSHV
変異体に同定された各アミノ酸置換に特異的な内部プローブ（配列番号1886-189
5及び1897-1898）を使ったポスト−PCRハイブリダイゼーションと組み合わされ
ている。プローブの特異性は各種SHV酵素を含む6種類の株、SHV-1を含む1種類の
Klebsiella pneumoniae株、SHV-2aを含む1種類のKlebsiella pneumoniae株、SHV
-12を含む1種類のKlebsiella pneumoniae株、SHV-1を含む1種類のEscherichia c
oli株、SHV-7を含む1種類のEscherichia coli株及びSHV-8を含む1種類のEscheri
chia coli株。プローブは各SHV遺伝子およびそれらの特異的突然変異を検出した
。株のSHV遺伝子型とβ−ラクタム系抗生物質に対する感受性との間には完璧な
相関性があった。
【０３９２】 配列番号1884及び1885のSHV−特異的プライマーは、実施例29記載の配列番号1
331及び1332のK.pneumoniae株−特異的プライマーと複合的に利用されることで
、K.pneumoniae及びβ−ラクタマーゼ感受性を完全に同定することができた。0.
4μMの各プライマーを用いたPCR増幅と、増幅産物のアガロースゲル分析は上記
同様に実施された。 40サイクルPCRを用いた複合系の特性は、次の細菌からの0.1ngの精製ゲノミッ
クDNAを用い、検証された:3株のSHV-1を含むKlebsiella pneumoniae株、SHV-2a
を含む1株のK.pneumoniae、1株のSHV-12を含むK.pneumoniae、SHV-1を含む1株の
K.rhinoscleromatis及びSHVを持たない1株のEscherichia coli。複合系はSHVを
含むK.pneumoniae株に非常に高い特異性を示した。
【０３９３】 実施例38．Neisseria gonorrhoeae及びそれに関連したテトラサイクリン耐性
遺伝子tetMの特異的検出及び同定に関するPCRアッセイの開発 公開されているtetM配列の分析により、tetMに対し特異的なPCRプライマーの
設計を可能とする保存領域が明らかになった。配列番号1588及び1589のPCRプラ
イマーペアは実施例31記載の配列番号551及び552のNeisseria gonorrhoeae−特
異的配列と複合的に用いられた。tetM配列の配列アラインメント分析より、tetM
（配列番号2254）に特異的な内部プローブの設計に好適な領域が明らかになった
（配列番号2254）。PCR増幅はPTC-200サーモサイクラー（MJリサーチ）にて、実
施例28記載同様0,4μMの各プライマーを用い行われた。最大感度及び特異性に関
する最適サイクリング条件は、95℃、3分間の初期変性に続き、95℃、1秒と60℃
、30秒より成る2段階を40サイクル行い、更に72℃、2分間の末端伸長を行うもの
であった。
【０３９４】 40サイクルPCRを利用した複合PCRアッセイの特異性は、次のより得た0.1ngの
精製ゲノミックDNAを使って検証された:2種類のテトラサイクリン−耐性Escheri
chia coli株（テトラサイクリン−耐性遺伝子tetBを含む1株と、テトラサイクリ
ン−耐性遺伝子tetCを含む1株）、1株のテトラサイクリン−耐性Pseudomonas ae
ruginosa株（テトラサイクリン−耐性遺伝子tetAを含む）、9種類のテトラサイ
クリン−耐性Neisseria gonorrhoeae株、2種類のテトラサイクリン−感受性Neis
seria meningitidis株、1株のテトラサイクリン−感受性Neisseria polysacchar
ea株、1株のテトラサイクリン−感受性Neisseria sicca株及び1株のテトラサイ
クリン−感受性Neisseria subflava株。
【０３９５】 tet−特異的及びNeisseria gonorrhoeae特異的プライマーを用いた増幅は、te
tMを含むN.gonorrhoeae株についてのみ検出された。以下の種についてはNeisser
ia gonorrhoeae−特異的プライマーを使用した場合に弱い増幅が認められた:Nei
sseria sicca、Neisseria polysaccharea及びNeisseria meningitidis。試験し
たNeisseria gonorrhoeae株のtetM遺伝子型とテトラサイクリン感受性のパター
ンとの間には完璧な相関性が認められた。実施例31記載の配列番号2166のN.gono
rrhoeaeに特異的な内部プローブは、Neisseria gonorrhoeaeをその他のNeisseri
a種より識別できた。 40サイクルPCRを利用したアッセイの感度は、2種類のN.gonorrhoeaeのテトラ
サイクリン耐性株を使って検証された。検出限界は両株とも5コピーのゲノミッ
クDNAであった。
【０３９６】 実施例39．Shigella種及びそれに関連したトリメトプリム耐性遺伝子dhfrIaの 特異的検出及び同定に関するPCRアッセイの開発 公開されているdhfrIa及びその他dhfr配列の分析より、dhfrIa配列に特異的な
PCRプライマーの設計を可能にする領域が明らかになった。PCRプライマーペア（
配列番号1459及び1460）は、実施例28記載の配列番号1661及び1665のEscherichi
a coli/Shigella種−特異位的プライマーと共に複合的に用いられた。dhfrIa配
列の配列アラインメント分析は、dhfrIaに特異的な内部プローブの設計に好適な
領域を明らかにした（配列番号2253）。PCR増幅及び増幅産物のアガロースゲル
分析は60℃のアニーリング温度を利用し、実施例28記載の如くに実施された。40
サイクルPCRを利用した複合系の特異性は、細菌パネルより得た0.1ngの精製ゲノ
ミックDNAを使って検証された。
【０３９７】 リストは以下のトリメトプリム感受性株、Salmonella typhimyurium、Salmone
lla typhi、Salmonella enteritidis、Tatumella ptyseos、Klebsiella pneumon
iae、Enterobacter aerogenes、Citrobacter farmeri、Campylobacter jejuni、
Serratia marcescens、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella s
onnei、6種類のトリメトプリム−耐性Escherichia coli株（dhfrIa又はdhfrV又
はdhfrVII又はdhfrXII、又はdhfrXIII又はdhfrXVを含む）、4種類のdhfrIaを含
むトリメトプリム−耐性株（Shigella sonnei、Shigella flexneri、Shigella d
ysenteriae及びEscherichia coli）を含んだ。試験したEscherichia coli及びSh
igella種のdhfrIa遺伝子型とトリメトプリム感受性パターンとの間には、完璧な
相関性が認められた。40サイクルPCRを利用したこの複合アッセイの感度は、3種
類のトリメトプリム−耐性Shgella種を用い検証された。検出限界は試験したShi
gella種の株により異なるが、5又は10ゲノミックDNAコピーであった。
【０３９８】 実施例40．Acinetobacter baumannii及びそれに関連したアミノグリコシド耐
性遺伝子aph（3’）-VIaの特異的検出及び同定に関するPCRアッセイの開発 公開されているaph（3’）-VIa配列の比較より、aph（3’）-VIa配列に特異的
なPCRプライマーの設計を可能にする領域が明らかになった。PCRプライマーペア
（配列番号1404及び1405）は、実施例30記載の配列番号1692及び1693のAcinetob
acter baumannii-特異位的プライマーと共に複合的に用いられた。aph（3’）-V
Ia配列の分析は、aph（3’）-VIa配列に特異的な内部プローブの設計に好適な領
域を明らかにした（配列番号2252）。PCR増幅及び増幅産物のアガロースゲル分
析は60℃のアニーリング温度を利用し、実施例28記載の如くに実施された。
【０３９９】 40サイクルPCRを利用した複合系の特異性は、以下を含む細菌パネルより得た0
.1ngの精製ゲノミックDNAを使って検証された:2種類のアミノグリコシド−耐性A
.baumanni株（apha（3’）-VIaを含む）、1株のアミノグリコシド−耐性A.bauma
nni株A.baumani株、以下のアミノグリコシド耐性バクテリア各1株、アミドグリ
コシド−耐性遺伝子aacCIを含むSerratia marcescens株、アミドグリコシド−耐
性遺伝子aacC4を含むSerratia marcescens株、アミドグリコシド−耐性遺伝子aa
cC2を含むSEnterobacter cloacae株、アミドグリコシド−耐性遺伝子aacA-aphD
を含むEnterococcus株、アミドグリコシド−耐性遺伝子aac6IIaを含む1種類のPs
eudomonas aeruginosa株及び以下のアミノグリコシド−感受性細菌種各1株、
【０４００】 Acinetobacter anitratus、Acinetobacter lwoffi、Psychobbacter phenylpyr
uvian、Neisseria gonorrhoeae、Haemophilus haemolyticus、Haemophilus infl
uenzae、Yersinia enterolitica、Proteus vulgaris、Eikenella corrodens、Es
cherichia coli。試験したA.baumannii株のaph（3‘）-VIa遺伝子型と亜民度グ
リコシド感受性パターンとの間には、完璧な相関性が認められた。aph（3’）-V
Ia−特異的プライマーはaph（3‘）-VIa遺伝子に特異的であり、試験したその他
のアミノグリコシド−耐性遺伝子は増幅しなかった。40サイクルPCRを利用した
この複合アッセイの感度は、2種類のA.baumanniiのアミノグリコシド−耐性株を
用い検証された。検出限界は試験した両A.baumannii株とも5ゲノムコピーDNAで
あった。
【０４０１】 実施例41．atpD（V-型）配列を用いたBacteroides fragilisの特異的検出及び 同定 各種細菌種からのatpD（V-型）配列の比較より、Bacteroides fragilis用PCR
プライマーの選択が可能となった。プライマー設計のストラテジーは、B.fragil
is由来の各種atpD配列及び関連種であるB.disparの細菌属及び古細菌、特に系統
学的に関係するatpD配列を代表するものより得たatpDは配列の複数配列アライン
メントの分析に基づいた。このアラインメントを注意深く分析することで、標的
種内では保存されているが他の種、特に密接に関係している種B.disparの配列と
は区別されるオリゴヌクレオチド配列の選択が可能となり、これによって標的細
菌種の種特異的及び遍在的検出及び同定が可能になった。
【０４０２】 配列番号2134-2135の選択プライマーペアは、231bpの増幅産物を生じる。実施
例28記載の様にして、各プライマーペア0.4μMを使ってPTC-200サーモサイクラ
ー（MJリサーチ）により標準的PCRを行った。最大感度及び特異性に関する最適
サイクル条件は、95℃、3分間に続いて95℃、1秒と60℃、30秒の2段階を40サイ
クル行い、更に72℃、2分間の末端伸長を行うものであった。 本アッセイの形式は上記のものに限定されるわけではない。当業者はアッセイ
を分子ビーコンプローブを使ったリアルタイム検出を利用するPCRの様な、異な
る形式に適合することができるだろう。本アッセイでの使用に合わせ設計された
分子ビーコンプローブには、B.fragilisアンプリコンの検出に関する配列番号21
36が含まれるが、これに限定されない。
【０４０３】 実施例42．腸球菌における伸長因子Tuの進化での水平遺伝子移動に関する証拠 要約 tuf遺伝子によりコードされている伸長因子Tuは、蛋白質合成において中心的
役割を果たすGTP結合蛋白質である。tuf遺伝子の数は細菌種によりゲノム当たり
1ないし3個である。最も低いG＋Cグラム陽性細菌はtuf遺伝子を1個だけ持ってい
る。我々はtuf遺伝子のコンセンサス配列から縮重PCRプライマーを設計し、17種
類の腸球菌種及びその他系統学的に関係する種よりtufの部分配列を増幅した。
増幅されたDNA断片は直接配列分析するか、又は推定アンプリコンを含むクロー
ン化挿入体を配列分析することで配列決定された。
【０４０４】 Enterococcus avium、E.casseliflavus、E.dispar、E.durans、E.faecium、E.
gallinarum、E.hirae、E.malodoratus、E.mundtii、E.pseudoavium及びE.raffin
osusを含む11種類の腸球菌から2種類のtuf遺伝子（tufA及びtufB）が見いだされ
た。その他6種類の腸球菌（E.cecorum、E.columbae、E.faecalis、E.sulfureus
、E.saccharolyticus及びE.solitarius）についてはtufA遺伝子のみが存在した
。16SrRNA遺伝子配列分析に拠れば、2種類のtuf遺伝子を有する11種は共通の祖
先を持つが、1コピーのみを有する6種は共通祖先の前に腸球菌系統から分岐した
ものである。
【０４０５】 腸球菌内にtuf遺伝子が1又は2コピー存在することはサザンハイブリダイゼー
ションにより確認された。tuf配列の系統分析は、腸球菌tufA遺伝子がBacillus
、Listeria及びStaphylococcus属と共に分岐したが、腸球菌tufB遺伝子はAtrept
ococcus及びLactococcus属とクラスターを形成することが示された。1次構造分
析は、配列決定された領域内にある4個のアミノ酸残基が保存され且つ腸球菌tuf
B遺伝子及び連鎖球菌とL.lactisのtuf遺伝子に特有であることを示した。これら
データは先祖の連鎖球菌又は連鎖球菌関連種が、現在2種類のtuf遺伝子を持つ11
種類の腸球菌種の共通祖先にtuf遺伝子を水平移動させたことを示差している。
【０４０６】 序 伸長因子Tu（EF-Tu）は蛋白質合成に於いて中心的役割を果たしているGTP結合
蛋白質である。それはアミノアシル-tRNAの認識と移動及びリボソームのA-部位
へそれらの配置を仲介する。極めて強く保存された機能と遍在分布により、伸長
因子は真性細菌内及びさらに古生菌から真核生物界を通じ有益な系統発生マーカ
ーとなっている。伸長因子Tuをコードしているtuf遺伝子は細菌ゲノムあたり様
々なコピー数存在している。大部分のグラム陰性細菌は2個のtuf遺伝子を含む。
Escherichia coliに見られる様に、配列は殆ど同一である2個の遺伝子は細菌染
色体の異なる部分に局在している。
【０４０７】 しかし、細菌完全解明された微生物ゲノムによれば、Helicobacter pylori、
及びBorrelia burgdorferi、Rickettsia prowazekii及びTreponema pallidumの
様なその他偏性寄生細菌、そして幾種かのシアノバクテリアでは1個のtuf遺伝子
のみが見いだされている。研究されている限り大部分のグラム陽性細菌では、1
個のtuf遺伝子のみが見いだされている。サザンハイブリダイゼーションは、幾
つかのクロストリジア並びにStreptomyces coelicolorとS.lividansではtuf遺伝
子が2個あることを示した。S.ramocissimusでは最大3個までのtuf−用遺伝子が
同定されている。
【０４０８】 大型の原核生物遺伝子の移動が細菌ゲノムの進化をもたらす因子の1つである
ことが示唆されているが、翻訳機構の構成成分をコードしている遺伝子は高度に
保存的されており、それらの相互作用の複雑さ故に水平移動することは困難であ
ると考えられている。しかし幾つかの最近の研究は、翻訳装置、即ち16S rRNAや
幾つかのアミノアシル−tRNA合成酵素をコードしている幾つかの遺伝子の進化に
於いて遺伝子の水平移動が生じている証拠を示した。この様な機序が伸長因子の
進化に関係することを示唆する更なるデータはない。これまでの研究は幾つかの
最近のゲノムにある2コピーのtuf遺伝子は、古代に起こった遺伝子複製の結果生
じたものであると結論した。更に、R.prowazekiiのtuf遺伝子の研究は、染色体
内組み換えがこの生物のゲノムの進化で起こった事を示唆した。
【０４０９】 現在腸球菌種のtuf遺伝子については殆ど知られていない。本研究で我々は17
種の腸球菌、即ちE.avium、E.casseliflavus、E.cecorum、E.columbae、E.dispa
r、E.durans、E.faecalis、E.faecium、E.gallinarum、E.hirae、E.malodoratus
、E.mundtii、E.pseudoavium、E.raffinosus、E.saccharolyticus、E.solitariu
s、E.sulfureusのtuf遺伝子の部分配列を分析した。今回我々はこれら腸球菌種
のうち11種に2種類のtug遺伝子コピーが存在することを報告する。残りの6種類
は単一のtuf遺伝子を有した。進化との関連性について論ずる。
【０４１０】 材料と方法 細菌株 本研究では米国標準培養株コレクション（American Type Culture Collection
（ATCC、マナサス、バージニア州）より得た17種類の腸球菌株およびグラム陽性
細菌株を使用した（第16表）。全ての株はDNA単離前にヒツジ血球寒天培地又は
脳−心臓滲出物ブロスを使い増殖された。 DNA単離 細菌DNAは記述の如くにG NOME DNA抽出キット（Bio101、ビスタ、カリフォル
ニア州）を使い調整された。
【０４１１】 推定tuf遺伝子の配列分析 腸球菌及びその他グラム陽性菌のtuf遺伝子配列を得るために、2種類の配列分
析手段;1）クローン化PCR産物の配列分析及び2）PCR産物の直接配列分析を用い
た。縮重プライマーのペア（配列番号664及び697）を用い、前述の腸球菌及びそ
の他グラム陽性菌よりtuf遺伝子を増幅した。E.avium、E.casseliflavus、E.dis
par、E.durans、E.faecium、E.gallinarum、E.hirae、E.malodoratus、E.mundti
i、E.pseudoavium及びE.raffinosusについては、アンプリコンは記述の如くにオ
リジナルTAクローニングキット（インビトロゲン、カールスバッド、カリフォル
ニア州（Invitrogen、Carlsbad、Calif））を用いクローン化された。
【０４１２】 それぞれの種より5クローンを選び、配列分析した。E.cecorum、E.faecalis、
E.saccharolyticus及びE.solitariusならびにその他グラム陽性細菌については
、直接配列分析により886-bpのアンプリコン配列を得た。初期の配列分析より得
た結果から、直接配列分析によりその他腸球菌種由来の部分tuf配列を得るのに
好適なプライマーペア2組を設計した。プライマーペアの1組（配列番号543及び6
60）を用いE.avium、E.malodoratus及びE.pseudoaviumから第2tuf遺伝子断片を
増幅した。
【０４１３】 直接配列分析の前に、PCR産物は1%アガロースゲル上にて、120Vで2時間電気泳
動にかけられた。次にゲルは0.02%のメチレンブルーで30分間染色され、オート
クレーブした蒸留水にて15分間、2回の洗浄を受けた。予想サイズのPCR産物を含
むゲルスライスを切りだし、QIAquickゲル抽出キット（QIAgen Inc、ミシソーガ
、オンタリオ州、カナダ）をメーカー指示書に従い使って精製した。配列分析用
のPCR混合体は記述の如くに調整された。DNA配列分析は、377DNAシークエンサー
（PEアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティー
、カリフォルニア州）を使いBigDyeTMターミネーターレディーリアクション（Te
rminator Ready Reaction）サイクルシークエンシングキットを利用して行った
。増幅されたDNAは両鎖とも配列決定された。配列データはSequencerTM3.0ソフ
トウエアー（ジーンコーズ社（Gene Codes Corp.,）アンアーバー、ミシガン州
）を用い検証された。
【０４１４】 配列分析及び系統発生研究 E.faecalis、Staphylococcus aureus及びStreptococcus pneumoniaeに関するt
uf遺伝子及びそれらの各フランキング領域のヌクレオチド配列はTIGR微生物ゲノ
ムデータベースより、そしてS.pyrogenesのそれはオクラホマ大学データベース
より検索された。本研究で得たDNA配列および演繹された蛋白質配列はBLAST及び
FASTAプログラムを用い全ての公開データベースと比較された。特記無い限り配
列分析はGGGパッケージ（バージョン10;ジェネティックコンピュータグループ（
Genetic Computer Group）、マジソン、ウイスコンシン州）を使い行われた。3
生物界を代表する74種のtuf遺伝子の配列アラインメント（第16表及び17）はPil
eupを用い行われ、視覚分析により補正を加えた。配列のN−及びC−末先端部は2
01アミノ酸配列の共通ブロックを生じる用に終止され、意味が曖昧な残基は取り
除かれた。
【０４１５】 系統発生分析はDr.David L.Swoffordにより書かれたPAUP4.0b4（Sinauer Asso
ciates、Inc.,Publishers、サンダーランド、マサチューセッツ州）を使って行
われた。距離マトリックスと最大節減を利用して系統樹を作製し、分析毎に500
及び100回反復し、ブートストラップ再標本抽出作業を行った。
【０４１６】 蛋白質構造分析 （i）Phe-tRNAPhe及びGTP類似体と複合体を形成したThermus aquaticusEF-Tu
及び（ii）GDPと複合体を形成したE.coliのEF-Tuの結晶構造を、腸球菌EF-Tuに
関する同等モデル構築のための鋳型として用いた。蛋白質構造の相同性モデリン
グをSWISS-MODELサーバーを用い行い、SWISS-PDBビュワーバージョン3.1を使っ
て調べた。
【０４１７】 サザンハイブリダイゼーション これまでの研究で我々は803-bpのE.faciumのtuf遺伝子断片のPCR産物を増幅し
、クローン化した。我々がtufA及びtufB遺伝子と推測した2種類の挿入体配列を
得た。tufA又はtufB配列を持つ組換え体プラスミドを用い、メーカー指示書に従
ってPCR取り込みを行い、ジゴキシゲニン（DIG）-11-dUTP（ベーリンガーマンハ
イム、ラヴェル、ケベック州、カナダ）で標識された2種類のプローブを作製し
た。腸球菌のゲノミックDNAサンプル（1-2μg）を販売会社（アマシャムファル
マシアバイオテック、ミシソーガ、オンタリオ州、カナダ）の指示通りに制限エ
ンドヌクレアーゼBglII及びXbaIにより消化した。これら制限酵素は、大部分の
腸球菌の増幅tuf遺伝子断片内に制限部位がないことから選択された。
【０４１８】 サザンブロッティング及びフィルターハイブリダイゼーションを、プラスに荷
電したナイロン膜（ベーリンガーマンハイム）及びQuikHybハイブリダイゼーシ
ョン液（ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、カリフォルニア州
）を用い、メーカー指示書に改良を加え実施した。各消化物20μlを2時間、120V
にて0.8%アガロースゲル上で電気泳動した。DAN断片を0.5MのNaOHにて変性し、
サザンブロッティングによりプラスに荷電したナイロンメンブレン（ベーリンガ
ーマンハイム）上に移した。
【０４１９】 フィルターを15分間プレハイブリダイゼーションしてから2時間、QuikHyb液内
にて68℃でDIG−標識プローブとハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼ
ーション後の洗浄は室温にて0.5xSSC、1%SDSを用い15分間、2回行われ、更に60
℃にて15分間同一液を用い行われた。結合プローブの検出は2ナトリウム3-（4-
メトキシスピロ（1,2−ジオキセタン−3,2‘-（5’-クロロ）トリシクロ（3、3
、1、13.7）デカン）-4-イル）フェニルリン酸エステル（CSPD）（ベーリンガー
マンハイム）をメーカー指示通りに用い、行われた。
【０４２０】 ジーンバンクへの寄託 本研究で得た部分tuf遺伝子配列のGenBank登録番号は第16表に示す。 結果 配列決定及びヌクレオチド配列分析。本研究では配列番号664及び697のプライ
マーを用いると、腸球菌以外の全てのグラム陽性細菌が886bpの単一のtuf配列を
生じた（第16表）。E.cecorum、E.faecalis、E.saccharolyticus及びE.solitari
usを含む4種類の腸球菌はそれぞれも886-bpのtuf配列を生じた。一方E.avium、E
.casseliflavus、E.dispar、E.durans、E.faecium、E.gallinarum、E.hirae、E.
mundtii、E.pseudoavium及びE.raffinosusについては、それらのクロマトグラム
に従い重複するピークを示す886-bpの断片を直接配列決定した結果、追加のtuf
遺伝子のコピーが存在することが示唆された。
【０４２１】 これを受けこれら10種のtuf遺伝子断片をまずクローン化し、続いて配列決定
した。配列データはこれら種のうちE.caseliflavus、E.dispar、E.durans、E.fa
ecium、E.gallinarum、E.hirae、E.mundtii及びE.raffinosusを含む8種に2種類
のtuf配列（tufA及びtufB）が見いだされることを示した。E.aviumとE.pseudoav
ium由来の5クローンは単一のtuf配列のみ生じた。これら新規配列データより腸
球菌のtufA又はtufB配列に特異的な新規プライマーの設計が可能となった。配列
番号543及び660のプライマーは腸球菌tufA配列のみを増幅するように設計され、
17種の腸球菌から694-bpの断片が増幅された。
【０４２２】 E.columbae、E.malodoratus、及びE.sulfureus由来のtufA遺伝子の694-bp配列
は、これらプライマーを使用した直接配列分析より得た。配列番号664及び661の
プライマーは、tufB遺伝子の730-bp部分を増幅するために設計され、E.malodora
ntus及び不均質tuf配列がまず発見された10種類の腸球菌種を含む11種の腸球菌
より予想断片が生じた。E.avium、E.malodoratus及びE.pseudoaviumのtufBの配
列は配列番号664及び661のプライマーを使用する直接配列分析により決定された
。まとめると、tufA遺伝子断片は17種全ての腸球菌から得られたが、tufB遺伝子
断片は11種の腸球菌からのみ得られた（第16表）。
【０４２３】 各腸球菌種に於けるtufAとtufBとの間の同一性はヌクレオチドレベルで68―79
%、アミノ酸レベルで81ないし89%であった。tufA遺伝子は全ての腸球菌で良く保
存されており、DNAの同一性は87%ないし99%であり、アミノ酸の同一性は93%ない
し99%であったが、一方腸球菌のtufB遺伝子の同一性はDNAで77%ないし92%、アミ
ノ酸配列に関しては91%ないし99%であり、その起源と進化が異なることを示唆し
た（第18表）。E.solitariusはやはり低G＋C型グラム陽性細菌であるTetragenoc
occus属に移されたことから、我々の配列比較にはこの種を腸球菌として加えな
かった。腸球菌のtufA配列のG＋C含有量は40.8%ないし43.1%の範囲であり、一方
腸球菌tufB配列のそれは37.8%ないし46.3%の範囲であった。アミノ酸配列比較に
よれば、腸球菌のtufA遺伝子産物はAbiotrophia adiacens、Bacillus subtilis
、Listeria monocytogenes、S.aureus及びS.epidermidisの産物と高い同一性を
有している。一方腸球菌のtufB遺伝子産物はS.pneumoniae、S.pyrogenes及びLac
tococcus lactisのtuf遺伝子と高いパーセンテージのアミノ酸同一性を有してい
る（第18表）。
【０４２４】 種類の腸球菌tuf配列が真のEF-Tuをコードしているか推測するために、両遺伝
子から演繹されたアミノ酸配列をSWISSPROT（38版）より入手した他EF-Tu配列と
並置した。配列アラインメントは、両遺伝子の産物が非常に保存されており、真
核生物EF-Tuの相当領域内にある保存残基を全て保有していることを示した（図4
）。従って、両遺伝子産物はEF-Tuの機能を満たすことができると考えられた。t
uf遺伝子部分配列は、E.coliでの番号付けに準じた場合の残基117ないし317に相
当するEF-Tu部分をコードしている。既知のE.coliのEF-Tu構造に拠れば、この部
分はドメインIの少なくとも4個のα螺旋と2個のβ鎖、前ドメインII及びドメイ
ンIIIのN−末端部分を構成する。
【０４２５】 演繹されたアミノ酸配列に拠れば、腸球菌のtufB遺伝子は連鎖球菌やL.lactis
にも保存されているが、その他の細菌では保存されていない特有の保存残基Lys1
29、Leu140、Ser230及びAsp234（E.coliでの番号付け）を有している（図4）。
これらの残基はSer230を除いて全てループ内に局在している。その他細菌では残
基Ser230は、ドメインII第3β−鎖の5番目の残基となる、高度に保存的であるTh
rに置換されている。この領域は一部は、20種類の天然アミノ酸に関するディー
プポケットの形成を通し、EF-Tuとアミノアシル−tRNA間の相互作用に関係して
いる。我々の3次元モデルによれば（未提示）、EF-TuドメインII内のThr230から
Serへの置換はこのポケットのアミノ酸収納能に殆ど影響しない。しかし、連鎖
球菌と11種類の腸球菌にのみ見いだされる特異的Serの置換に比しThr230が高い
保存性を持つことは、この残基が微妙な機能を持つことを示唆しているかもしれ
ない。
【０４２６】 E.faecalis、S.aureus、S.pneumoniae及びS.pyogenesについて得られたtuf遺
伝子配列は、それらの不完全ゲノム配列と比較された。99%以上の同一性を持つ
コンティグが同定された。E.faecalisのゲノムデータの分析は、単一のE.faecal
isのtuf遺伝子が、tufの前方に伸長因子Gをコードするfusが存在しているstrオ
ペロン内に局在していることを示した。このstrオペロンはS.aureus及びB.subti
lisには存在するが、調べた2種類の連鎖球菌には存在しない。700-bpの又はその
配列の上流では、S.pneumoniaetuf遺伝子は既知遺伝子配列との間に相同性を持
たない。S.pyogenesでは、tufの上流遺伝子は細胞分裂遺伝子であるftsWに類似
しており、連鎖球菌のtuf遺伝子がstrオペロン内に配置されていないことが示唆
されている。
【０４２７】 系統発生分析 ネイバージョイニング法（neighbor-joining）とマキシマムパーサモニー法（
maximum parsimony）を用いた真性細菌、古生菌及び真核細胞例に関するtufアミ
ノ酸配列の系統発生分析は、3生物界を代表する3つの主要クラスターを示した。
いずれの方法もrRNA遺伝子データに一致する、同様のトポロジーを提供する（デ
ータ未提示）。細菌クレード内では、系統樹は多系統的であるが、全ての腸球菌
種由来のtufAは常に低G＋Cグラム陽性菌（連鎖球菌及び乳酸球菌を除く）以外の
もとのクラスターを形成するが、11種の腸球菌種のtufB遺伝子は連鎖球菌及びL.
klactisと別のクラスターを形成している（図5）。同一生物由来の複製遺伝子は
一つのクラスターを形成せず、それにより進化が最近の遺伝子複製によるもので
ないことが示唆された。
【０４２８】 サザンブロッティング 試験された12種類の腸球菌種由来のゲノミックDNAをBglII/XbaI消化し、tufA
プローブを使ったサザンハイブリダイゼーションにかけると、9種で異なる大き
さを持つ2種類のバンドが生じ、配列データよりそれらもまた2種類のtuf配列を
有していた。E.faecalis及びE.solitariusでは単一のバンドが観察され、1個のt
uf遺伝子が存在していることを示唆している（図6）。S.aureus、S.pneumoniae
及びS.pyogenes由来の消化済みゲノミックDNAをtufAプローブとハイブリダイズ
させた場合も、単一バンドが認められた（データ未提示）。E.faeciumでは3本の
バンドが存在するが、これはtufAの中央部にXbaI制限部位があることから説明で
き、配列分析データから確認された。tufB（E.faeciumのDIG標識tufB断片）によ
るハイブリダイゼーションは、tufAプローブで得られたバンドプロフィールと同
様のプロフィールを示した（データ未提示）。
【０４２９】 考察 本研究で我々は、幾つかの腸球菌種では伸長因子Tuをコードしている2種類の
コピーが存在することを示した。配列データは両遺伝子がアミノ酸レベルにおい
て強く保存されていることを示した。いずれの腸球菌には1つのコピー（tufA）
が存在しているが、もう一方（tufB）は研究対象となった17株の腸球菌中11株に
ついてのみ存在している。16S rRNA配列分析に拠れば、これら11種は3種類の腸
球菌の亜群（E.avium、E.faecium及びE.gallinarum種群）及び別の1種（E.dispa
r）のメンバーである。更に16S rDNAの系統発生はこれら2種類のtuf遺伝子を持
つ11種は全てそれらが更に進化し、現代の種になる前には共通の祖先を持ってい
ることを示唆する。1コピーのみを持つその他6種は共通疎背員の前に腸球菌系統
から分岐したため、これら6種が1つのtuf遺伝子を持つことは遺伝子の消失に拠
るものでは無いと考えられている。
【０４３０】 tuf遺伝子の系統樹には2種類の低G＋Cグラム陽性細菌のクラスターが観察され
た:1つは主要な低G＋Cグラム陽性細菌を含むものであり、もう一つは乳酸球菌及
び連鎖球菌を含む。このことは16S rRNA遺伝子及び特異的な熱ショック制御蛋白
質をコードしているhrcA遺伝子の系統発生分析を基礎とする見解に類似している
。腸球菌tufA遺伝子は多くの低G＋Cグラム陽性細菌を伴い分岐していることから
、それらが共通の祖先を持つことが示唆される。一方腸球菌tufB遺伝子は他低G
＋Cグラム陽性細菌とは別の系統を形成するStreptococcus及びLactococcus属と
共に分岐している（図5）。これらEF-Tu蛋白質がこの分岐に特異的な幾つかの保
存アミノ酸残基を共有しているという発見は、それらが共通の祖先をもつという
考えを支持するものである。
【０４３１】 これら保存残基は特定機能により収斂進化した結果であろうが、配列レベルで
のこの様な収斂は、たとえ僅かな残基に限っても稀なことであり考え難いことで
ある。更に、例え存在したとしても、細菌中での1種類対2種類のtuf遺伝子の維
持に関わる選択圧については現在のところ知られていない。腸球菌tufA及びtufB
配列のG＋C含有量は類似していることから、系統発生分析によれば、これらが共
に低G＋Cグラム陽性細菌を起源とするものであることを示している。
【０４３２】 tuf遺伝子は各種細菌中に様々なコピー数で存在している。更に2種類のtuf遺
伝子は通常は特徴的なフランキング遺伝子を伴っている。グラム陰性細菌内に一
般的に認められる2種類のtuf遺伝子のコピーは、それぞれ細菌性strオペロン及
びtRNA-tufBオペロンの一部である。strオペロン中のtufAの配置は、配列決定さ
れた中の最も古い細菌であるThermotoga maritima、Aquifex aeolicus、シアノ
バクテリア、Bacillus種、Micrococcus Iuteus、Mycobacterium tuberculosis及
びStreptomyces種を含む各種細菌にも見いだされている。更にtRNA-tufBオペロ
ンはAquifex aeolicus、Thermus thermophilus及びChlamydia trachomatisにも
同定された。
【０４３３】 2種類のtuf遺伝子が広範囲に存在することは、それらが共通の起源を持つこと
を支持している。Mycoplasma種、R.prowazekii、B.burgdorferi及びT.pallidum
の様な大部分の偏性細胞内寄生生物がtuf遺伝子を1つだけしか含まないことは注
目に値する。それらのフランキング配列は、ゲノム内組み換え及び再配置による
ゲノムサイズの徹底した削減により効率的な伝播について選択を受けた結果、2
つある保存パターンとは異なっている。
【０４３４】 これまでに配列決定された低G＋C含有グラム陽性細菌の大部分はstrオペロン
の一部として単一コピーのtuf遺伝子だけを含んでいる。このことはB.subtilis
、S.aureus及びE.faecalisに当てはまる。fus遺伝子の保存領域を標的とするプ
ライマー及び配列番号660のtufA−特異的プライマーを用いたPCR増幅は調べた17
種全ての腸球菌種について予想通りのアンプリコンを生じたが、配列番号661のt
ufB特異的プライマーではこれを生じないことから、全ての腸球菌でfus-tuf機構
が存在していることが示された（データ未提示）。
【０４３５】 しかしS.pneumoniae及びS.pyogenesのゲノムでは、tuf遺伝子自体は強く保存
されているもののtuf遺伝子に隣接する配列は多様である。腸球菌tufB遺伝子は
連鎖球菌とクラスターを形成するが、現時点に於いて我々は腸球菌tufB遺伝子に
隣接する遺伝子を同定するに十分なデータを持っていない。更に、腸球菌tufB遺
伝子の機能的役割については不明のままである。唯一2種類の遺伝子コピーが異
なる条件で発現されることが推測できる。
【０４３６】 腸球菌tufAとtufB遺伝子間のアミノ酸配列同一性は、i）腸球菌tufAとその他
低G＋Cグラム陽性細菌（連鎖球菌及び乳酸球菌を除く）tuf遺伝子との間の同一
性、又はii）腸球菌tufBと連鎖球菌及び乳酸球菌tuf遺伝子間の同一性に比べ低
い。この様な発見は、腸球菌tufA遺伝子は単純な垂直進化を通し他の低G＋Cグラ
ム陽性細菌と共通の祖先を持つが、一方腸球菌tufB遺伝子は連鎖球菌及び乳酸球
菌の祖先により近いことを示唆している。幾つかの腸球菌が別のtuf遺伝子を持
つこと、及び単一の連鎖球菌tuf遺伝子が他の低G＋Cグラム陽性細菌とクラスタ
ーを形成しないという事実は、遺伝子複製又は染色体内組み換えだけでは説明で
きない。
【０４３７】 配列分析及び系統発生分析に基づき、我々は11種の腸球菌種に追加のtuf遺伝
子のコピーが存在することは水平遺伝子移動に拠るものであると提言している。
現在tufB遺伝子を持つ11種の腸球菌種の共通の祖先は、腸球菌の進化の間、現在
の腸球菌に分岐する前に遺伝子移動を介して連鎖球菌の祖先又は連鎖球菌関連種
からtuf遺伝子を獲得した。遺伝子のフランキング領域の更なる研究は、腸球菌
におけるこの遺伝子の起源と機能についてより多くの手がかりを提供するだろう
。
【０４３８】 遺伝子及びゲノムの最近の研究は、生物に関する3つの界の全てでアミノアシ
ル−tRNA合成酵素の進化に於いて水平移動が少なからず起こっていることを示し
ている。16S rRNAの異質性はまたStreptomyces、Thermomonospora chromogena及
びMycobacterium celatumの様な複数の最近における遺伝子の水平移動に関係し
ている。本研究で我々は、伸長因子であるTuをコードしているtuf遺伝子でも水
平移動が起こることを支持する例を提供している。厳格な機能的束縛があるため
、他の遺伝子同様にtuf遺伝子に於いても水平移動の頻度は高くないことから、
この事は例外的なことであろう。しかしStreptomycesのtuf遺伝子の系統学は、
腸球菌に比べ同等か又はそれ以上複雑であることが知られており、腸球菌のtuf
遺伝子がこの様な例外の唯一の例ではない。
【０４３９】 例えば高G＋Cグラム陽性細菌、S.ramocissimusの3種類のtuf−様遺伝子は、細
菌系統発生学的に分岐した群のtuf遺伝子と共に分岐した（図5）。別の例は系統
発生学的に極めて広範な生物相を表し、非常に多数の各種複雑性及び深度を持つ
系統と群とを形成しているクロストリジアのtuf遺伝子であろう。Clostridium属
内の3種類のクラスターに属する4種類の種が2コピーのtuf遺伝子を持つことが、
サザンハイブリダイゼーションにより示されている。更なる配列データと系統発
生分析は、これらグラム陽性細菌における伸長因子Tuの進化を解釈する上で役立
つだろう。
【０４４０】 tuf遺伝子及び16S rRNA遺伝子はよく系統発生学の研究に利用されることから
、側部より得た遺伝子コピーがこれら分析に利用できる場合には、水平遺伝子移
動に由来する複製遺伝子の存在が微生物の系統発生を変える可能性がある。従っ
て系統発生データの解釈には注意が必要である。更に腸球菌の2種類のtuf遺伝子
は別々に進化し、相互に系統発生的には離れた関係にある。腸球菌のtufB遺伝子
の保存性はより低く、11種類の腸球菌種だけに特有のものである。我々はこれま
でに腸球菌のtufA遺伝子が腸球菌同定を目的としたDNAベースのアッセイ開発の
標的として利用できることを示した。腸球菌のtufB遺伝子もまたこれら11種類の
腸球菌の同定にとって有用であろう。
【０４４１】 実施例43．Enterobacteriaceae科の種に関する系統発生学的ツールとしての伸 長因子Tu（tuf）及びF-ATPaseベータ−サブユニット（atpD） 要約 臨床サンプルに良く見られる腸内細菌種の系統を、それらの伸長因子Tu（tuf
）遺伝子及びF-ATPaseベータ−サブユニット（atpD）遺伝子の部分配列を比較す
ることで解析した。25種類の腸内細菌属の72種、88株についてtufの884-bpの断
片及びatpDの884−又は871−断片の配列を決定した。atpD配列分析の結果、これ
ら2属の間の密接な系統発生的な関係を最初に示したPantoea及びTatumella種に
特異的なインデルが示された。統合的なtuf及びatpD系統樹が構築されたけっか
、それらは相互に一致した。
【０４４２】 系統発生上の属はYersinia、Pantoea、Edwardsiella、Cedecea、Salmonella、
Serratia、Proteus及びProvidenciaであった。データベースから利用できる16S
rDNA配列に基づき同様の系統樹を得た。tuf及びatpDの系統発生はその解像度は
小さいものの、16S rDNAの分析と一致する。実際に、距離の比較はEnterobacter
iaceae科に属する種のペアに関して、tuf及びatpD遺伝子がより高い解像度を提
供することを示した。しかし16S rDNAの距離は異なる科に属する種のペアについ
ては、より高い解像度を示した。結論としてtuf及びatpD保存遺伝子は、Enterob
acteriaceae科内の種の識別するのに十分な多様性を有しており、腸内細菌種を
同定するためのDNAに基づく診断テストの開発に関する可能性を提供する。
【０４４３】 序 Enterobacteriaceae科のメンバーは条件的嫌気性グラム陰性桿菌であり、カタ
ラーゼ陽性及びオキシダーゼ陽性である（Brenner、1984）。それらは土壌中、
水中、植物中及び動物中に見いだされ、昆虫からヒトに移る。多くの腸内細菌は
日和見感染菌である。実際この科のメンバーは米国での日和見感染症の約50%に
関わっている（Brenner、1984）。従ってこの科は臨床的に非常に重要な菌であ
る。
【０４４４】 Enterobacteriaceae科に関する主要な分類研究は生化学的反応や生理学的性質
といった表現形の特質に基づいている（Brennerら、1999;Brennerら、1980;Dick
eyとZumoff、1988;Farmer IIIら、1980;Farmer IIIら、1985b;Farmer IIIら、19
85a）。しかし表現形上距離のある株が遺伝子型の基準では密に関係し、そして
同一の遺伝子種に属することもある（Bercovierら、1980;HartlとDykhuizen、19
84）。また、例えばKlebsiella pneumoniaeとEnterobacter aerogenesの様に表
現形上近い株（生物群）が異なる遺伝子種に属することもある（Brenner、1984
）。従って表現形試験に基づく技術の場合、ある種の同定と分類が不明瞭になる
ことがある（Jandaら、1999;Kitchら、1994;Sharmaら、1990）。
【０４４５】 より進歩的なEnterobacteriaceae科のメンバーの分類はDNA-DNAハイブリダイ
ゼーション研究による（Brennerら、1993;Brennerら、1986;Brennerら、1980;Fa
rmer IIIら、1980;Farmer IIIら、1985b;Izardら、1982;Steigerwaltら、1976）
。さらに多くの研究者により16S rDNA配列に基づく細菌分類の系統発生上の意義
が認められている（StackebrandtとGoebel、1994;Wayneら、1987）。しかしEnte
robacteriaceae科のメンバーについては16S rRNAによる徹底した系統発生解析は
行われていない（Sproerら、1999）。事実この分子はその保存性が極めて高いこ
とから種に密接に関係した分類学上の問題の解決には不適と考えられていた（Br
enner、1992;Sproerら、1999）。
【０４４６】 16S rDNA遺伝子の持つ別の欠点は、ゲノム内に複数のコピーが存在することで
ある（Escherichia coli及びSalmonella typhimuriumでは7個）（HillとHarnish
、1981）。遺伝子コピー間に配列の相違があるため、代表的な配列を得るために
PCR産物を直接配列分析することが不適当であることが多い（Ciliaら、1996;Hil
lとHarnish、1981）。腸内細菌の系統発生を解明するために、gap及びompA（Law
renceら、1991）、rpoB（Molletら、1997）及びinfB（Hedegaardら、1999）とい
ったその他遺伝子が用いられた。しかしこれら研究のうち相当数の種を対象とし
たものはなかった。
【０４４７】 tuf及びatpDはそれぞれ伸長因子Tu（EF-Tu）及びF-ATPaseベータ−サブユニッ
トをコードする遺伝子である。EF-Tuはペプチド鎖形成に関係している（Ludwig
ら、1990）腸内細菌に見いだされた2コピーのtuf遺伝子（tufA及びtufB）はSalm
onella typhimurium及びE.coliに見いだされるものと高い同一性レベル（99%）
を示した。2コピー間の配列の均一化は組み換え現象により説明できるだろう（A
bdulkarimとHughes、1996;Grunberg-Manago、1996）。F-ATPaseは真性細菌の原
形質膜上に存在している（NelsonとTaiz、1989）。
【０４４８】 それは主にATPの合成に機能し（NelsonとTaiz、1989）、そしてベータサブユ
ニットが酵素の触媒部位を含んでいる。EF-Tu及びF-ATPaseは進化を通じ良く保
存され、機能恒常性を示す（Amannら、1988;Ludwigら、1990）。最近EF-Tu及びF
-ATPaseベータ−サブユニットの蛋白質配列に基づく系統発生が、相互のデータ
及びrDNAデータとの間が良好に一致することを示した（Ludwigら、1993）。 我々は25種類の属の72種を表す88種類の臨床腸内細菌株に由来する、tuf及びa
tpDの884-bpの断片を配列分析にかけた。これら配列を用い系統樹を作製し、16S
rRNAの系統樹と比較した。これら系統樹は相互に良好な一致を示し、種のレベ
ルに於いてtuf及びatpD系統発生が高い解像度を持つことを示した。
【０４４９】 材料と方法 細菌株とゲノミック材料 本研究で使用した全ての株は米国標準培養株コレクション（American Type Cu
lture Collection（ATCC、マナサス、バージニア州）又はドイツ微生物及び細胞
培養コレクション（DSMZ）より得た。これら腸内細菌は全て臨床検体より回収す
ることができるが、全てが病原性ではない。可能な限り我々は標準株を選択した
。全ての株の同定結果は、自動化システム、ネガティブBPコンボパネル、タイプ
15を装備したマイクロスキャンウォーカウェイ（MicroScan WalkAway）−96シス
テムを使った古典的な生化学試験により確認された。ゲノミックDNAはG NOME DN
Aキット（Bio101）を使い精製された。Yersinia pestis由来のゲノミックDNAは
好意によりDr.Robert R.Brubakerから提供された。本研究に使用した株及びそれ
らの説明は第19表に示す。
【０４５０】 PCRプライマー 公開データベースより利用可能な真性細菌のtuf及びatpD遺伝子の配列を、GCG
パッケージ（バージョン8.0）（ジェネティクスコンピューターグループ）を用
い解析された。複数配列アラインメントにより、各遺伝子について2カ所の高保
存性領域を選び出し、オリゴプライマー合成ソフトウエアー（バージョン5.0）
（ナショナル バイオサイエンス（National Biosciences））を利用しこれら領
域よりPCRプライマーを得た。第1プライマーセットでは増幅が難しい小数の腸内
細菌については、遺伝子atpDを増幅するために第2の5‘プライマーを設計した。
必要に応じてプライマーは変異位置に関しイノシン又は縮重を含んだ。オリゴヌ
クレオチドプライマーはモデル394DNA/RNA合成装置（PEアプライドバイオシステ
ムズ）を使い合成された。本研究で使用したPCRプライマーは第20表に掲載され
ている。
【０４５１】 DNA配列決定 第19表の第1株欄に掲載されている全ての腸内細菌について、tuf遺伝子の884b
p−部分、及びatpD遺伝子の884-bp部分（又は代替として小数の腸内細菌株につ
いては871bp部分）の配列を決定した。増幅は4ngのゲノミックDNAを用い実施さ
れた。配列決定用のPCR産物の生成に用いられた40μlのPCR混合液は、各プライ
マー1.0μM、各デオキシリボヌクレオシド3リン酸（ファルマシアバイオテク）
を200μM、10mMのTris-HCl（25℃にてpH9.0）、50mM KCl、0.1%（w/v）TritonX-
100,2.5mM MgCl2、0.05mM BSA、TaqStartTM抗体（クローンテックラボラトリー
ズ）が結合した0.3UのTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ）を含んだ。増幅効率を
高めるために全てのPCR混合液にTaqDNAポリメラーゼに関するTaqStartTM中和抗
体が加えられた（Kelloggら、1994）。PCRプライマーペア混合液はPTC-200 DNA
エンジンサーマルサいくらー（MJ リサーチ）を使ってサーマルサイクリング（9
5℃、3分間後、95℃、1分間とtufについては55℃、1分間、あるいはatpDについ
ては50℃、1分と72℃、1分間のサイクルを35回行い、最後に72℃での伸長を7分
間）にかけられた。
【０４５２】 予想サイズを持つPCR産物はアガロースゲルより回収され、15分間0.02%メチレ
ンブルーで染色されてから滅菌蒸留水にて15分間、2回洗浄された（Floresら、1
992）。続いて予想サイズを持つPCR産物はQUIAquickゲル抽出キット（キアゲン
）を用い、ゲルより回収された。 精製されたアンプリコンの両方の鎖は、ABI Prism BigDyeターミネーターサイ
クルシークエンシングレディーリアクションキット（PEアプライドバイオシステ
ムズ）を用いた自動DNAエンジンサーマルサいくらーシークエンサー（モデル377
）にかけられ、配列決定された。各株について、別々に実施されたPCR増幅より
得た2個のアンプリコンについて配列を決定し、Taq DNAポリメラーゼを原因とす
る、誤ったヌクレオチドの取り込みによる配列決定の誤りが無いことを確認した
。配列の組み立てはSequencher3.0ソフトウエアー（ジーンコード）の支援を受
け、行った。
【０４５３】 系統発生分析 GCGパッケージ（バージョン10.0）（ジェネティクスコンピューターグループ
）のPileUPを使って複数配列アラインメントを行い、必要に応じて配列の編集を
行うエディターであるSeqLabを使って目視によりチェックを行い、どの領域を系
統発生分析より除外するか記録した。Vibrio chloerae及びShewanella putrefac
iensは外集団として利用した。ブーツストラップサブセット（750セット）及び
系統樹は、Dr.David SwoffordのPAUP（フィロジェネティクス・アナリシス・ユ
ージング・パリシモニー（Phylogenetic Analysis Using Parsimony）ソフトウ
エアー、バージョン4.0b4（Sinauer Associates）と系統樹2分ブランチ−交換を
用いて作製された。使用した距離モデルはKimura（1980）の2パラメータであっ
た。相対率試験はPhyltestプログラム、バージョン2.0を用い行われた。
【０４５４】 結果及び考察 DNA増幅、配列決定及び配列アラインメント 試験した全ての細菌よりtufについては884bpの、そしてatpDについては884又
は871bpの予想サイズを持ったPCR産物を得た。偏在プライマー領域及び不明確な
単鎖データを差し引いた後、少なくともtufに関し721bpの、そしてatpDに関して
713bpの配列が系統発生分析にかけられた。これら配列はデータベース内にあるt
uf及びatpD配列と並置され、ヌクレオチド配列が実際に試験された遺伝子の一部
をコードしていることを実証した。系統発生分析を行うためにギャップは除かれ
た。
【０４５５】 シグニチャー配列 試験された両遺伝子より得た配列アラインメントからは1種類のみ挿入が観察
された。5個のアミノ酸の挿入がE.coli株K-12のatpD遺伝子位置325と326の間に
存在しており（Sarasteら、1981）、そしてTatumella ptyseos及びPantoea spec
ise（図7）のシグニチャー配列と考えることができる。特定の長さと配列を持っ
た保存域に隣接する保存インデルの存在は、特にある分類のメンバーがこのイン
デルを共有する場合には祖先を共有することを示唆するものだろう（Cupta、199
8）。我々の知る限りでは、TatumellaとPantoea属の間に始めて同族関係が示さ
れた。
【０４５６】 Enterobacter agglomeransATCC27989配列は5アミノ酸インデルを持たない（図
7）。このインデルはEnterobacter agglomerans及びPantoea分類の識別を助ける
有用なマーカーになるだろう。実際Gavininらにより1989年にEnterobacter aggl
omeransからPantoea agglomeransへの変更が提言された（Gaviniら、1989）。変
更が提言されたが、ATCCデータベース内の全てのEnterobacter agglomeransにつ
いて命名変更はまだ行われていない。この5アミノ酸インデルが存在しないこと
は、Enterobacter agglomeransの幾つかの株がPantoea属には恐らく属さないこ
とを示唆している。
【０４５７】 Enterobacteriaceaeのメンバーの部分的tuf配列、atpD配列及び公開16S rDNA
データに基づく系統樹 ネイバージョイニング法を使いtuf及びatpD配列より構築された系統樹の例を
図8に示す。部分的tuf配列及びatpD配列より作製された系統樹はよく似ている。
しかしatpDの系統樹は、同一属の種に対応したより単元発生的な群を示す。これ
らの群は、実際の分類とより良く一致する。両遺伝子とも幾つかの属は単元発生
的ではなかった。この様な結果は、遺伝子gap及びompA（Lawrenceら、1991）、r
poB（Molletら、1997）及びinfB（Hedgaardら、1999）に基づく従来の系統樹を
支持し、いずれもがEscherichia属及びKlebsiella属が多元発生的であることを
示している。tuf遺伝子とatpD遺伝子との間に、分岐に関し殆ど差は認められな
かった。
【０４５８】 Pantoea agglomerans及びPantoea dispersaインデルを系統発生分析から除い
た場合でさえ、これら2種は1つにまとめられEnterobacter agglomernasATCC2798
9とは距離を置くことから、後者の種が不均一であり、そしてこの種の全てのメ
ンバーがPantoea属に属するものではないことがさらに立証される。実際E.agglo
merans株ATCC2789は両遺伝子を持つ他のEnterobacter種と同様の分岐長を示す。
従って我々はEnterobacter属が再分類されるまではこの株がEnterobacter属に属
することを提言する。
【０４５９】 tuf及びatpDの系統樹は、臨床上の理由から分離された種を含め、同一遺伝種
に属する分類間では非常に短い距離を示す。まず該当するものは、ハイブリダイ
ゼーション研究（Brennerら、1972;Brennerら、1972;Brennerら、1982）及び16S
rDNA（Wangら、1997）とrpoB遺伝子（Molletら、1997）に基づく系統発生より
同一遺伝種であることが確認されたE.coli及びShigella種である。ハイブリダイ
ゼーション研究（Bercovierら、1980）及び16S rDNA遺伝子（Ibrahimら、1994）
に基づく系統発生は同時にYersinia pestisとY.pseudotuberculosisiが同一種で
あることも示した。Yersinia pestis及びY.pseudotuberculosis、3種類のKlebsi
ella pneumoniae亜種、E.coli-Shigella種、及びSalmonella choleraesuis亜種
の中では、Salmonellaは他の遺伝種に比べ緊密関係にある種が少ない。同様のこ
とはE.coli及びShigella種にも当てはまる。
【０４６０】 Escherichia fergusoniiはE.coli-Shigella遺伝種に非常に近い。この観察は1
6S rDNA系統発生により確認された（McLaughilinら、2000）がDNAハイブリダイ
ゼーションでは確認されていない。実際E.fergusoniiはE.coli-Shgellaとは49%
ないし63%しか相関していない（Farmer IIIら、1985b）。最近分岐した種につい
ては、DNAハイブリダイゼーションでは異なる種として確立するものでも16S rDN
A配列ではこれが認識されないことが従来より観察されていた（Foxら、1992）。
従ってE.fergusoniiは新規の“準種”であろう。
【０４６１】 atpD系統発生はSalmonella亜種分類が実際の分類と一致することを明らかにし
た。この結果は既にChristensenらにより観察されていた（ChristensenとOlsen,
1998）。しかしatpDに比べtuf部分配列はSalmonella亜種間を識別しない。 全体としてtuf及びatpD系統発生は、有効な識別を保証するに足る種の分岐を
示している。従ってKlebsiella pneumoniaeとEnterobacter aerogenesの様な異
なる遺伝種に属する系統的に近い腸内細菌を、用意に識別することができるだろ
う。
【０４６２】 Salmonella、E.coli及びC.freundii間の系統発生関係はよく分かっていない。
16S rDNA及び23S rDNA配列データはSalmonellaとE.coliの間は、SalmonellaとC.
freundii間より近い関係にあることを示す（Christensenら、1998）が、DNA相同
性研究（Selanderら、1996）及びinfB系統発生（Hedegaardら、1999）は、Salmo
nellaはE.coliよりC.freundiiにより近い関係にあることを示した。この点に関
しては、tuf及びatpD系統発生は16S rDNA及び23S rDNA配列分析に近い。
【０４６３】 系統発生分析はまたアミノ酸配列を利用してもおこなわれた。アミノ酸に基づ
くtuf系統樹は核酸をベースとする系統樹に比べ分類学的な外集団と分類学的内
集団（腸内細菌）をより良く識別することを特徴とするが、アミノ酸及び核酸に
基づくatpD系統樹は外集団分類群と内集団分類群について殆ど同一の解像度を提
供する（データ未提示）。
【０４６４】 相対率試験（又は2クラスター試験（Takezakiら、1995））は、2分類群間で進
化が一定であるかについて調べる。試験を行う前に、定常率を仮定しないまま系
統樹構築法により系統樹のトポロジーを決定する。従って2分類群（又は2グルー
プの分類群）は、前記2分類群の外集団である第3分類群と比較される（Takezaki
ら、1995）。ある分岐点での分岐長に大きな違いを示す少数の分類群ペアを選ん
で試験を行う。この試験はEnterobacteriaceae科内ではtufとatpDの進化が一定
でないことを示す。tufに関しては、例えば定常率に関する仮説（Z値が1.96より
高い）はYersinia種間では廃棄される。Proteus種も同様である。atpDに関して
は、例えばProteus種間、Proteus種とProvidencia種間、及びYersinia種とEsche
richia coliの間では進化は一定ではない。16S rDNAの場合は、例えば2種類のE.
coli間、E.coliとEnterobacter aerogenes間、及びE.coliとProteus vulgaris間
で進化は一定ではない。これらの結果は、tuf、atpD及び16S rDNAがEnterobacte
riaceae科を対象とした分子時計としては機能しないことを示唆している。
【０４６５】 分類群の数及び性質は系統樹のトポロジーに影響することから、tuf及びatpD
からの系統樹は、その16S rDNA遺伝子がGenEMBL内に確立されている株の配列を
用い構築された。これら系統樹は16S rDNAを利用し作られた系統樹に類似してい
た（図9）。しかし、16S rDNA系統樹はtuf及びatpD遺伝子系統樹に比べ解像度が
不良であった。更にこれら後者の系統樹は16S rDNA系統樹に比べ多分岐（ポリト
ミー）が少なかった。
【０４６６】 tuf、atpD及び16S rDNAデータに基づく距離の比較 各株のペアについて、tuf、atpD及び16S rDNA距離（即ちヌクレオチド部位当
たりの違いの数）を相互に比較し合った。我々はtuf及びあtpD距離が16S rDNA距
離に比べそれぞれ2.268±0.965及び2.927±0.896倍長いことを見いだした（図10
a及びb）。atpD距離はtuf距離に比べ1.445±0.570倍長かった（図10c）。図10は
また同一属内にある、異なる種のメンバー間のtuf、atpD及び16S rDNA距離（そ
れぞれ0.053±0.034、0.060±0.020及び0.024±0.010）が平均すると同一科内の
異なる属間の距離（それぞれ0.103±0.053、0.129±0.051及び0.044±0.013）に
比べ小さいことも示している。
【０４６７】 しかし標準偏差による重なりが見られることから、幾つかの腸内細菌属につい
ては定義が不十分であることが更に示された（Brenner、1984）。実際、特にEsc
herichia、Shigella、Enterobacter、Citrobacter、Klebsiella及びKluyvera属
に属する種のペアに関する距離の多くが、同一属に属する種のペアの距離に重な
っている（図10）。例えばCitrobacterの種とKlebsiellaの種から成るペア間の
距離は、2種類のCitorobacter種、又はKlebsiella種で構成されたペア間の距離
に重なる。 距離分布を見ると、実際にはVibrionaceaeは遺伝的にはEnterobacteriaceaeに
非常に近いにもかかわらず、16S rDNAの距離はEnterobacteriaceae科とVibriona
ceae科の間を明瞭に分離している（図10a及びb）。それでもtuf及びatpDは科よ
り低いレベルでより高い分解能を示す（図10a及びb）。
【０４６８】 研究対象とした2遺伝子間についても、同一分類群ペアに関する相対距離に幾
つか違いが認められる。まずYersinia種間の距離はtufに比べatpDで少なくとも2
倍短い（図10）。同様に科のレベル（EnterobacteriaceaeとVibrionaceae間）の
距離については、Enterobacteriaceaeは、tuf遺伝子に比べatpD遺伝子を用いた
時より密接な科となる（Proteus属を除く）。両遺伝子とも同一種に属する分類
群を良く画定している。atpDについては1例の例外がある:Klebsiella planticol
aとK.ornithinolithicaは同一属に属知るが、同一種に属する分類に適合する（
図10a及びc）。
【０４６９】 これら2種はtufによれば遺伝子型としても極めて密接な関係にある。このこと
はKlebsiella platicola及びK.ornithinolithicaが2種類の新生種である可能性
を示唆している。tufとatpD遺伝子はEscherichia fergusonii及びe.coli-Shigel
la種間については殆ど距離を示さない。残念なことにE.fergusoniiの16S rDNA配
列はまだGenEMBLデータベースで利用できないことから、16S rDNAとの比較は行
うことができなかった。即ち、表現形上近い関係にある腸内細菌の多くは、tuf
及びatpD遺伝子配列を利用することで、容易に遺伝子型識別できる。
【０４７０】 結論としてtuf及びatpD遺伝子は16S rDNA遺伝子系統樹に一致する系統樹を示
す。例えばそれらはEnterobacteriaceae科が単元系統であることを明らかにする
。さらにtuf及びatpD距離は、16s DNA距離よりも高い解像能を提供する。実際tu
f及びatpD遺伝子は異なる遺伝子種を良く識別し、そして同一遺伝子種の株間で
保存されているため診断プロセスに適したプライマー及び分子プローブを設計す
ることができた。予備研究はこれら観察を支持しており、そしてtufとatpD配列
データに基づく腸内細菌同定用診断試験が開発されつつある。
【０４７１】 実施例44．我々の米国特許6,001,564号の目的である2種類の種特異的ゲノミッ クDNA断片から選択された新規PCRプライマーペアの試験 目的: これら実験の目的は、各種微生物の検出及び同定に適した標的として使
用される種特異的断片から別のPCRプライマーペアを見いだすことが、当業者に
とって比較的容易であることを示すことである。実際我々は、我々のグループに
より以前試験され、そして本出願特許の目的でもあるPCRプライマーが診断目的
に関する唯一可能な良好な選択ではないことを証明することを望んでいる。本実
施例では、我々は我々の譲渡米国特許第6,001,564号に記載されている診断標的
を使用した。
【０４７２】 実験ストラテジー:我々は本実験のために無作為に2種類の種特異的ゲノミック
DNA断片を選らんだ。第1の断片はStaphylococcus epidermidisに特異的な705-bp
の断片（米国特許第6,001,564号の配列番号36）であり、第二の断片はMoraxella catarrhalisに特異的な466-bpの断片（米国特許第6,001,564号の配列番号29）
である。引き続き我々はこれら2種類の断片より、これまでに試験された以外のP
CRプライマーペアを複数選んだ。これら2配列それぞれから、これらDNA断片上に
うまく分散している5種類の新規プライマーペアを選び出した（図11及び12）。
これらプライマーペアをその特異性について試験し、以前試験した元のプライマ
ーと比較した。
【０４７３】 特異性試験に関して我々は、3種類の保存遺伝子（rRNA遺伝子、tuf及びatpD）
を用いた系統発生分析を利用して標的種に密接に関連した全ての細菌を試験した
。新規プライマーペアの特性評価で細菌種の数を限定した理由は、ヌクレオチド
レベルでより類似している密接な関係にある種の検出にDNAベースアッセイが特
異性に欠けることが影響するという事実に基づいている。系統発生分析に基づき
、我々は（i）S.epidermidis特異的PCRアッセイの特異性を試験するために、近
い関係にある属Staphylococcus、Enterococcus、Streptococcus及びListeriaよ
り、そして（ii）M.catarrhalis特異的PCRアッセイの特異性を試験するためには
、近い関係にある属Moraxella、Kingella及びNeisseriaより種を選択した。
【０４７４】 材料と方法 細菌株 これら実験に使用した全ての細菌株は米国標準培養株コレクション（ATCC、ロ
ックビル、メリーランド）より得た。 DNA単離 ゲノミックDNAはG-nome DNAキット（Bio101、ビスタ、カリフォルニア州）を
使い、ATCC標準株より精製された。 オリゴヌクレオチド設計及び合成。PCRプライマーはOligoTMプライマー分析ソ
フトウエアーバージョン4.0（ナショナルバイオサイエンス社、プリマス、ミネ
ソタ州）を用い設計され、モデル391DNA合成装置（アプライドバイオシステムズ
社、フォスターシティー、カリフォルニア州）を用い合成された。
【０４７５】 PCRアッセイ 全てのPCRアッセイはATCCより得た標準株より精製されたゲノミックDNAを用い
実施された。ゲノミックDNA1μl（1μl当たり0.01ないし1ngのDNAを含む）がPCR
混合液に直接加えられた。20μLのPCR反応液は最終濃度50mMのKCl、10mM Tris-H
Cl（pH9.0）、0.1%TritonX-100、2.5mM MgCl2、0.4μMの各プライマー、200μM
の各dNTPs及びTaqStartTM抗体（クローンテックラボラトリーズ、パロアルト、
カリフォルニア州）と組み合わされた0.5UのTaqポリメラーゼを含んだ。
【０４７６】 増幅反応の効率を検証し、重大なPCR阻害がないことを確認するために、全て
の増幅反応に内部コントロールが加えられた。内部コントロールの提供には、各
増幅反応に加えられたコントロールプラスミドより252bpの領域を増幅するプラ
イマーが利用された。次にPCR反応液をPTC-200サーマルサイクラー（MJリサーチ
社、ウォータータウン、マサチューセッツ州）を用いたサーマルサイクリング（
95℃、3分間の後95℃、1秒の変性段階及び50ないし65℃、30秒のアニーリング−
伸長段階を30サイクル）に欠けた。次にPCR増幅産物は標準的なアガロースゲル
（2%）電気泳動により分析された。増幅産物は0.25μg/mLのエチジウムブロマイ
ドを含むアガロースゲル内にて、254nmUV下に視覚化された。
【０４７７】 結果 第21表及び22はそれぞれ配列番号29（米国特許第6,001,564号のM.catarrhalis
特異的）及び配列番号36（米国特許第6,001,564号のS.epidermidis特異的）より
選択された5種類の新規プライマーペアを用いた特異性試験の結果を示す。これ
ら新規プライマーペアの性能を評価することを目的とし、我々は以前試験した元
のプライマーペアとも平行して比較した。 M.catarrhalisに関しては、近い関係にある種を増幅できなかったことから選
択された5種類全てのPCRプライマーペアが標的種特異的であった（第21表）。実
際配列番号118＋配列番号119（米国特許第6,001,564号）の元のプライマーとの
比較は、新規ペア全てが特異性及び感度に関し同一の結果を示すことを明らかに
しており、これらが診断目的に好適であることが示唆された。
【０４７８】 S.epidermidisに関しては選択した5種類のPCRペアの内4種類が標的種特異的で
あった（第22表）。これら4種類のプライマーペアの内3種類については、S.epid
ermidisに対する特異性を獲得するためにはアニーリング温度を55℃から60ない
し65℃に上昇させる必要があった。この場合も配列番号145＋配列番号146（米国
特許第6,001,564号より）の元プライマーペアとの比較は、これら4種類のプライ
マーペアが元ペア同様に良好であることを明らかにした。
【０４７９】 PCRアッセイの特異性を改善する極めて有効な方法として、PCR増幅に関するア
ニーリング温度を上昇させることは当業者周知である（Persingら、1993、診断
分子微生物学:原理と応用（Diagnostic Molecular Microbiology;Principles an
d Applications）、米国微生物学会（American Society for Microbiology）、
ワシントン（Washington、D.C.）;Ehrlich及びGreenberg、1994、感染症のPCRベ
ース診断法（PCR-based Diagnostics in Infectious Disease）、Blackwell Sci
entific Publications、ボストン、マサチューセッツ州（Boston、MA））。実際
には、PCRアッセイの最適化にとってアニーリング温度が重要でるという事実は
当業者周知である。プライマーペアVBsep3＋VBsep4はブドウ球菌種S.capitis、S
.cohnii、S.aureus、S.haemolyticus及びS.hominisを含むS.epidermidis以外の
細菌種を増幅した（第22表）。
【０４８０】 この非特異的プライマーペアに関しては、アニーリング温度を55から65℃に上
昇させても求める特異性を得ることはできなかった。S.epidermidisに比べM.cat
arrhalisに関する種特異的プライマーの選別の法が若干簡単に思われるこの事実
について可能な1つの説明は、M.ctarrhalisがS.epidermidisに比べて系統樹中よ
り隔離されているからであるというものである。S.epidermidisの様なコアグラ
ーゼ陰性ブドウ球菌種が多数この統計樹クラスター形成に大きく関係している。
【０４８１】 結論 これら実験は、同定に適した標的として選択された種特異的DNA断片より、こ
れまでに試験された以外の診断目的に好適なPCRプライマーペアを選び出すこと
が当業者にとって比較的容易であることを明確に示している。増幅条件はアニー
リング温度の様な重要変数を変えることで最適化し、求める特異性と感度を得る
ことができる。即ち我々は種特異的断片より選択される可能なプライマー配列を
クレームすることは正当であり、そしてこれまでに試験されたプライマーに関す
るクレームのみしか認められないことは不当であると考えている。換言すれが、
これら結果は当業者にとっても種特異的DNA断片よりこれまでに試験されたもの
に比べ診断目的に好適なDNAプローブを選択することが比較的容易であることも
強く示している。
【０４８２】 実施例45．米国特許第6,001,564号の目的である複数のプライマー配列より得
たPCRプライマーの修飾バージョンの試験 目的 このプロジェクトの目的は、これまでに試験されたプライマーより得られる改
良型PCRプライマーによる増幅効率を検証することである。試験対象のプライマ
ー修飾には、（i）1又はそれより多いヌクレオチド位置での配列変化、及び（ii
）プライマー長の延長又は短縮が含まれる。本実施例に関して我々は米国特許第
6,001,564号記載の診断標的を使用した。
【０４８３】実験ストラテジー: a）ヌクレオチド変更されたプライマーの試験 我々は米国特許第6,001,564号より、S.epidermidis−特異的配列番号146に由
来する13種類の新規プライマーを設計した（第23表）。これらプライマーは1ま
たはそれより多いヌクレオチド位置が変更されている。第23表に見られる様に、
ヌクレオチドの変更はプライマー配列全体に導入された。更にインビボでの潜在
的遺伝変化をより良く反映するために、随意のヌクレオチド位置でプライマー修
飾を行う代わりに各コドンの第3位置にヌクレオチド変更を加えた。
【０４８４】 3’末端の不適合は避けるべきであるという事実は当業者周知であることから
（Persingら、1993、診断分子微生物学:原理と応用（Diagnostic Molecular Mic
robiology;Principles and Applications）、米国微生物学会（American Societ
y for Microbiology）、ワシントン（Washington、D.C.）、オリゴヌクレオチド
プライマーの3’末端にはヌクレオチド変化は加えられなかったことの注意すべ
きである。これら修飾プライマーは全て米国特許第6,001,564号の配列番号145と
組合せたPCRアッセイで試験され、増幅効率は米国特許第6,001,564号にて既に試
験された元プライマーペア配列番号145＋配列番号146と比較された。
【０４８５】 b）短縮又は延長型プライマーの試験 我々は米国特許第6,001,564号より、元のS.epidermidis−特異的PCRプライマ
ーペア配列番号145＋146の短縮及び延長バージョン（第24表）、並びに米国特許
第6,001,564号より、元のP.aeruginosa−特異的PCRプライマーペア配列番号83＋
84の短型バージョンを設計した（第25表）。第24表及び25に見られる様に各ペア
の両プライマーは同一長まで短縮、又は延長されている。また、PCRに有害であ
る1プライマー結合部位への優先的を避けるためには、ペアを構成する両プライ
マーの融解温度は同様でなければならない（Persingら、1993、診断分子微生物
学:原理と応用（Diagnostic Molecular Microbiology;Principles and Applicat
ions）、米国微生物学会（American Society for Microbiology）、ワシントン
（Washington、D.C.）。これら短縮型又は延長型プライマーバージョンはPCRア
ッセイにて試験され、増幅効率は配列番号145及び146の元プライマーペアと比較
された。
【０４８６】 材料と方法 実施例44の材料と方法の項を参照のこと 結果 a）ヌクレオチド変更プライマーの試験 米国特許第6,001,564号の配列番号146の13種類の修飾バージョンを用いるPCR
アッセイの結果を第23表に示す。変更が1ヌクレオチドである8種類の修飾プライ
マーは、ゲノミックDNAの3種類の希釈体を用いた試験では、元プライマーと同一
の増幅効率を示した。2カ所のヌクレオチド変更を持つ4種類のプライマーと、3
カ所のヌクレオチド変更を持つプライマーVBmut12もまた元プライマーで得られ
たものと同一のPCR結果を示した。最後に4カ所のヌクレオチド変更を持つプライ
マーVBmut13は、元プライマーペアに比べると感度が約1桁低下していた。
【０４８７】 しかしアニーリング温度を55から50℃に下げると、元プライマーペアで観察さ
れたものと極めて近い増幅効率が得られた（第23表）。実際にPCRサイクルのア
ニーリング温度を下げることはプライマーに関するハイブリダイゼーションの厳
密性を低下させる効果的な方法であり、その結果ミスマッチを持つプローブの結
合が可能になる（Persingら、1993、診断分子微生物学:原理と応用（Diagnostic Molecular Microbiology;Principles and Applications）、米国微生物学会（A
merican Society for Microbiology）、ワシントン（Washington、D.C.）。引き
続き我々は第22表掲載のS.epidermidisに近い関係にある全細菌種について増幅
を行うことで、米国特許第6,001,564号由来の配列番号146に関するこれら13種類
の修飾バージョンをそれぞれ用いたPCRアッセイの特異性について確認した。
【０４８８】 b）短縮又は延長バージョンプライマーの試験 これらの実験に関しては以下2種類のプライマーペアが選択された:i）米国特
許第6,001,564号由来の（S.epidermidis特異的）ATに富む配列番号145＋146、及
びii）GCに富む配列番号83＋84（P.aeruginosa特異的）。ATに富む配列に関して
は長さ15ないし30ヌクレオチドのプライマーを設計し（第24表）、GCに富む配列
については長さ13ないし19ヌクレオチドのプライマーを設計した（第25表）。
【０４８９】 第24表は、アニーリング温度55℃に関しては、米国特許6,001,564号の配列番
号145及び146の30−、25−、20−及び17−ヌクレオチドバージョンの全てが元プ
ライマーペアと比較し同等の結果を示したが、17−ヌクレオチドバージョンのみ
S.epidermidisDNAの増幅効率が若干低かった。17−ヌクレオチドバージョンにつ
いてアニーリング温度を55から45℃に下げると、増幅効率は元プライマーペア（
米国特許第6,001,564号の配列番号145＋146）のものと極めて高いレベルまで上
昇した。15−ヌクレオチドバージョンに関しては、アニーリング温度を45℃に下
げた場合にのみS.epidermidisDNAの増幅が認められた。これらPCR条件ではアッ
セイはS.epidermidis特異的を維持したが、S.epidermidisDNAの増幅シグナルは
元プライマーペアに比べ若干低かった。引き続き我々は第22表掲載のS.epidermi
disに近い関係にある全ての細菌種より得たDNAを増幅することで、短縮型又は延
長型バージョンの特性を確認した。
【０４９０】 第25表は、55℃のアニーリング温度に関しては米国特許第6,001,564号の配列
番号83及び84に由来する全ての短縮バージョン元プライマーペアと同等のPCR結
果を示すことを示している。予想通り、これらの結果はATに富む場合に比べGCに
富む場合の方が長さの短縮が簡単であることを示している。このことは、GC結合
がAT結合に比べより安定であるという事実に拠る。
【０４９１】 結論 a）ヌクレオチド変更を伴うプライマーの試験 上記実験は、PCRプライマーペアプライマーがPCRアッセイの特異性や感度に影
響することなく、1またはそれより多いヌクレオチド位置で変更できることを明
確に示している。これらの結果は、あるオリゴヌクレオチドが標的種由来の変異
型ゲノム配列を検出できることを強く示唆している。実際、ゲノミックDNAでの
ヌクレオチド変異を模擬するために、選択プライマー内の各コドン第3位置に合
目的に変更が導入された。これより我々は、i）本出願発明の目的である断片及
びオリゴヌクレオチドの入れる番号について、及びii）標的種の遺伝的変異につ
いて、“その変異体”をクレームすることが正当であると結論した。
【０４９２】 b）プライマーの短縮又は延長バージョンの試験 上記実験はPCRプライマーがPCRアッセイの特異性及び感度に影響することなく
短縮又は延長できることを明瞭に示している。我々は13ないし30ヌクレオチドの
大きさの範囲にあるオリゴヌクレオチドが、それらが由来した元プライマーペア
と同等に特異的且つ感受性であることを示した。即ち、これらの結果は少なくと
も12ヌクレオチド長を有する配列をクレームすることが拡大ではないことを示唆
するものである。 本発明は上記記載されているが、本発明の精神を逸脱することなくこれに変更
を加えることができることは容易に明らかである。これら変更は添付のクレーム
に規定される本発明の範囲内である。
【０４９３】
【表１】
【０４９４】
【表２】
【０４９５】
【表３】
【０４９６】
【表４】
【０４９７】
【表５】
【０４９８】
【表６】
【０４９９】
【表７】
【０５００】
【表８】
【０５０１】
【表９】
【０５０２】
【表１０】
【０５０３】
【表１１】
【０５０４】
【表１２】
【０５０５】
【表１３】
【０５０６】
【表１４】
【０５０７】
【表１５】
【０５０８】
【表１６】
【０５０９】
【表１７】
【０５１０】
【表１８】
【０５１１】
【表１９】
【０５１２】
【表２０】
【０５１３】
【表２１】
【０５１４】
【表２２】
【０５１５】
【表２３】
【０５１６】
【表２４】
【０５１７】
【表２５】
【０５１８】
【表２６】
【０５１９】
【表２７】
【０５２０】
【表２８】
【０５２１】
【表２９】
【０５２２】
【表３０】
【０５２３】
【表３１】
【０５２４】
【表３２】
【０５２５】
【表３３】
【０５２６】
【表３４】
【０５２７】
【表３５】
【０５２８】
【表３６】
【０５２９】
【表３７】
【０５３０】
【表３８】
【０５３１】
【表３９】
【０５３２】
【表４０】
【０５３３】
【表４１】
【０５３４】
【表４２】
【０５３５】
【表４３】
【０５３６】
【表４４】
【０５３７】
【表４５】
【０５３８】
【表４６】
【０５３９】
【表４７】
【０５４０】
【表４８】
【０５４１】
【表４９】
【０５４２】
【表５０】
【０５４３】
【表５１】
【０５４４】
【表５２】
【０５４５】
【表５３】
【０５４６】
【表５４】
【０５４７】
【表５５】
【０５４８】
【表５６】
【０５４９】
【表５７】
【０５５０】
【表５８】
【０５５１】
【表５９】
【０５５２】
【表６０】
【０５５３】
【表６１】
【０５５４】
【表６２】
【０５５５】
【表６３】
【０５５６】
【表６４】
【０５５７】
【表６５】
【０５５８】
【表６６】
【０５５９】
【表６７】
【０５６０】
【表６８】
【０５６１】
【表６９】
【０５６２】
【表７０】
【０５６３】
【表７１】
【０５６４】
【表７２】
【０５６５】
【表７３】
【０５６６】
【表７４】
【０５６７】
【表７５】
【０５６８】
【表７６】
【０５６９】
【表７７】
【０５７０】
【表７８】
【０５７１】
【表７９】
【０５７２】
【表８０】
【０５７３】
【表８１】
【０５７４】
【表８２】
【０５７５】
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【０５７６】
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【０５７７】
【表８５】
【０５７８】
【表８６】
【０５７９】
【表８７】
【０５８０】
【表８８】
【０５８１】
【表８９】
【０５８２】
【表９０】
【０５８３】
【表９１】
【０５８４】
【表９２】
【０５８５】
【表９３】
【０５８６】
【表９４】
【０５８７】
【表９５】
【０５８８】
【表９６】
【０５８９】
【表９７】
【０５９０】
【表９８】
【０５９１】
【表９９】
【０５９２】
【表１００】
【０５９３】
【表１０１】
【０５９４】
【表１０２】
【０５９５】
【表１０３】
【０５９６】
【表１０４】
【０５９７】
【表１０５】
【０５９８】
【表１０６】
【０５９９】
【表１０７】
【０６００】
【表１０８】
【０６０１】
【表１０９】
【０６０２】
【表１１０】
【０６０３】
【表１１１】
【０６０４】
【表１１２】
【０６０５】
【表１１３】
【０６０６】
【表１１４】
【０６０７】
【表１１５】
【０６０８】
【表１１６】
【０６０９】
【表１１７】
【０６１０】
【表１１８】
【０６１１】
【表１１９】
【０６１２】
【表１２０】
【０６１３】
【表１２１】
【０６１４】
【表１２２】
【０６１５】
【表１２３】
【０６１６】
【表１２４】
【０６１７】
【表１２５】
【０６１８】
【表１２６】
【０６１９】
【表１２７】
【０６２０】
【表１２８】
【０６２１】
【表１２９】
【０６２２】
【表１３０】
【０６２３】
【表１３１】
【０６２４】
【表１３２】
【０６２５】
【表１３３】
【０６２６】
【表１３４】
【０６２７】
【表１３５】
【０６２８】
【表１３６】
【０６２９】
【表１３７】
【０６３０】
【表１３８】
【０６３１】
【表１３９】
【０６３２】
【表１４０】
【０６３３】
【表１４１】
【０６３４】
【表１４２】
【０６３５】
【表１４３】
【０６３６】
【表１４４】
【０６３７】
【表１４５】
【０６３８】
【表１４６】
【０６３９】
【表１４７】
【０６４０】
【表１４８】
【０６４１】
【表１４９】
【０６４２】
【表１５０】
【０６４３】
【表１５１】
【０６４４】
【表１５２】
【０６４５】
【表１５３】
【０６４６】
【表１５４】
【０６４７】
【表１５５】
【０６４８】
【表１５６】
【０６４９】
【表１５７】
【０６５０】
【表１５８】
【０６５１】
【表１５９】
【０６５２】
【表１６０】
【０６５３】
【表１６１】
【０６５４】
【表１６２】
【０６５５】
【表１６３】
【０６５６】
【表１６４】
【０６５７】
【表１６５】
【０６５８】
【表１６６】
【０６５９】
【表１６７】
【０６６０】
【表１６８】
【０６６１】
【表１６９】
【０６６２】
【表１７０】
【０６６３】
【表１７１】
【０６６４】
【表１７２】
【０６６５】
【表１７３】
【０６６６】
【表１７４】
【０６６７】
【表１７５】
【０６６８】
【表１７６】
【０６６９】
【表１７７】
【０６７０】
【表１７８】
【０６７１】
【表１７９】
【０６７２】
【表１８０】
【０６７３】
【表１８１】
【０６７４】
【表１８２】
【０６７５】
【表１８３】
【０６７６】
【表１８４】
【０６７７】
【表１８５】
【０６７８】
【表１８６】
【０６７９】
【表１８７】
【０６８０】
【表１８８】
【０６８１】
【表１８９】
【０６８２】
【表１９０】
【０６８３】
【表１９１】
【０６８４】
【表１９２】
【０６８５】
【表１９３】
【０６８６】
【表１９４】
【０６８７】
【表１９５】
【０６８８】
【表１９６】
【０６８９】
【表１９７】
【０６９０】
【表１９８】
【０６９１】
【表１９９】
【０６９２】
【表２００】
【０６９３】
【表２０１】
【０６９４】
【表２０２】
【０６９５】
【表２０３】
【０６９６】
【表２０４】
【０６９７】
【表２０５】
【０６９８】
【表２０６】
【０６９９】
【表２０７】
【０７００】
【表２０８】
【０７０１】
【表２０９】
【０７０２】
【表２１０】
【０７０３】
【表２１１】
【０７０４】
【表２１２】
【０７０５】
【表２１３】
【０７０６】
【表２１４】
【０７０７】
【表２１５】
【０７０８】
【表２１６】
【０７０９】
【表２１７】
【０７１０】
【表２１８】
【０７１１】
【表２１９】
【０７１２】
【表２２０】
【０７１３】
【表２２１】
【０７１４】
【表２２２】
【０７１５】
【表２２３】
【０７１６】
【表２２４】
【０７１７】
【表２２５】
【０７１８】
【表２２６】
【０７１９】
【表２２７】
【０７２０】
【表２２８】
【０７２１】
【表２２９】
【０７２２】
【表２３０】
【０７２３】
【表２３１】
【０７２４】
【表２３２】
【０７２５】
【表２３３】
【０７２６】
【表２３４】
【０７２７】
【表２３５】
【０７２８】
【表２３６】
【０７２９】
【表２３７】
【０７３０】
【表２３８】
【０７３１】
【表２３９】
【０７３２】
【表２４０】
【０７３３】
【表２４１】
【０７３４】
【表２４２】
【０７３５】
【表２４３】
【０７３６】
【表２４４】
【０７３７】
【表２４５】
【０７３８】
【表２４６】
【０７３９】
【表２４７】
【０７４０】
【表２４８】
【０７４１】
【表２４９】
【０７４２】
【表２５０】
【０７４３】
【表２５１】
【０７４４】
【表２５２】
【０７４５】
【表２５３】
【０７４６】
【表２５４】
【０７４７】
【表２５５】
【０７４８】
【表２５６】
【０７４９】
【表２５７】
【０７５０】
【表２５８】
【０７５１】
【表２５９】
【０７５２】
【表２６０】
【０７５３】
【表２６１】
【０７５４】
【表２６２】
【０７５５】
【表２６３】
【０７５６】
【表２６４】
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【表２６５】
【０７５８】
【表２６６】
【０７５９】
【表２６７】
【０７６０】
【表２６８】
【０７６１】
【表２６９】
【０７６２】
【表２７０】
【０７６３】
【表２７１】
【０７６４】
【表２７２】
【０７６５】
【表２７３】
【０７６６】
【表２７４】
【０７６７】
【表２７５】
【０７６８】
【表２７６】
【０７６９】
【表２７７】
【０７７０】
【表２７８】
【０７７１】
【表２７９】
【０７７２】
【表２８０】
【０７７３】
【表２８１】
【０７７４】
【表２８２】
【０７７５】
【表２８３】
【０７７６】
【表２８４】
【０７７７】
【表２８５】
【０７７８】
【表２８６】
【０７７９】
【表２８７】
【０７８０】
【表２８８】
【０７８１】
【表２８９】
【０７８２】
【表２９０】
【０７８３】
【表２９１】
【０７８４】
【表２９２】
【０７８５】
【表２９３】
【０７８６】
【表２９４】
【０７８７】
【表２９５】
【０７８８】
【表２９６】
【０７８９】
【表２９７】
【０７９０】
【表２９８】
【０７９１】
【表２９９】
【０７９２】
【表３００】
【０７９３】
【表３０１】
【０７９４】
【表３０２】
【０７９５】
【表３０３】
【０７９６】
【表３０４】
【０７９７】
【表３０５】
【０７９８】
【表３０６】
【０７９９】
【表３０７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、tuf配列のレパートリーの主再分割を図解する。プライマーおよびプロ
ーブの設計のために、要求に依存して、ピラミッドの上部に図解する完全なデー
タ組を使用するか、あるいは異なる分岐点により図解されているサブセットのみ
を使用ことができる。群、科、属および種を表す、より小さい再分割をつくって
、ピラミッドの下部に伸長することさえできる。tufおよびatpD配列は高度に保
存され、各種とともに進化するので、プライマーおよびプローブの設計はデータ
ベースまたはその再分割内のすべての配列を含む必要がない。添付書類IV〜XX、
XXIII〜XXXI、XXXVIIIおよびXLIIに例示されているように、使用に依存して、制
限された数の種からの配列を注意して選択して下記を表すことができる：i）意
図するプローブおよびプライマーを分化させる必要がある主要な系統発生的分岐
のみ、およびii) プローブおよびプライマーを合致させることが必要である種の
み。しかしながら、偏在的目的で、特に種の大きい群を同定するプローブおよび
プライマー（属、科、群または普遍的、または配列決定プライマー）について、
より多くのデータを配列分析の中に含めると、プローブおよびプライマーは各特
定の意図する使用にいっそうよく適するであろう。同様に、特定の目的のために
、より大きいデータ組（またはレパートリー）は、非特異的オリゴヌクレオチド
を使用する機会を減少することによって、プライマーおよびプローブの設計を最
適とする。
【図２】 図2は、ATP配列のレパートリーの主再分割を図解する。プライマーおよびプロ
ーブの設計のために、要求に依存して、ピラミッドの上部に図解する完全なデー
タ組を使用するか、あるいは異なる分岐点により図解されているサブセットのみ
を使用ことができる。群、科、属および種を表す、より小さい再分割をつくって
、ピラミッドの下部に伸長することさえできる。tufおよびatpD配列は高度に保
存され、各種とともに進化するので、プライマーおよびプローブの設計はデータ
ベースまたはその再分割内のすべての配列を含む必要がない。添付書類IV〜XX、
XXIII〜XXXI、XXXVIIIおよびXLIIに例示されているように、使用に依存して、制
限された数の種からの配列を注意して選択して下記を表すことができる：i）意
図するプローブおよびプライマーを分化させる必要がある主要な系統発生的分岐
のみ、およびii) プローブおよびプライマーを合致させることが必要である種の
み。しかしながら、偏在的目的で、特に種の大きい群を同定するプローブおよび
プライマー（属、科、群または普遍的、または配列決定プライマー）について、
より多くのデータを配列分析の中に含めると、プローブおよびプライマーは各特
定の意図する使用にいっそうよく適するであろう。同様に、特定の目的のために
、より大きいデータ組（またはレパートリー）は、非特異的オリゴヌクレオチド
を使用する機会を減少することによって、プライマーおよびプローブの設計を最
適とする。
【図３】 図3は、fusAから、ならびにストレプトマイシン（str）オペロン中のfusAの末
端とtufの開始との間の領域（第7表におけるfusA−tuf遺伝子間スペーサーと呼
ぶ）から、特定の増幅プライマーを設計するアプローチを図解する。
【図４】 図4は実施例42の図解である。
【図５】 図5は実施例42の図解である。
【図６】 図6は実施例42の図解である。
【図７】 図7は実施例43を図解する。
【図８】 図8は実施例43を図解する。
【図９】 図9は実施例43を図解する。
【図１０】 図10は実施例43を図解する。
【図１１】 図11は実施例44を図解する。
【図１２】 図12は実施例44を図解する。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月２４日（２００２．４．２４）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/04 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 31/04 31/10 ４Ｈ０４５ 31/10 33/00 33/00 Ｃ０７Ｋ 7/00 Ｃ０７Ｋ 7/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ボワスィノ，モーリス カナダ国，ケベック ジー３エー ２エヌ ２，サン−オーギュスタン−ドゥ−デスモ ーレ，ジャン ブルシェズィ 109 (72)発明者 ユレツキ，アン カナダ国，ケベック ジー１エス ４ジェ イ３，スィレリー，デ パン アブニュ 1231 (72)発明者 メナール，クリスティアン カナダ国，ケベック ジー０エス ２ダブ リュ０，サン−ランベール−ドゥ−レビ， デュ ポン 1174 (72)発明者 ウエレット，マルク カナダ国，ケベック ジー１エス ３エス １，スィレリー，ドゥ プロエルメル 1035 (72)発明者 ピカール，フランソワ ジ． カナダ国，ケベック ジー１ワイ １エー １，カプ−ルージュ，ドゥ ラ サピニエ ール 1245 (72)発明者 ロワイ，ポール アッシュ． カナダ国，ケベック ジー２エー ２エッ クス８，ロレットビル，シャルレ ガルニ エール 28 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 CA04 CA09 DA06 EA04 HA14 4B063 QA01 QA07 QA13 QQ05 QQ42 QR32 QR39 QR40 QR55 QR62 QS34 4B065 AA01X AA58X AA72X AA83X AA99Y AB01 BA02 CA46 4C084 AA13 NA14 ZB09 ZB32 ZB35 ZB37 ZB38 4C085 AA03 BA02 BA07 BA49 BB11 CC07 CC08 CC21 CC31 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB35 ZB37 ZB38 4H045 AA10 BA15 BA16 CA11 CA15 EA52 FA74 (54)【発明の名称】 高度に保存された遺伝子、および種特異的、属特異的、科特異的、群特異的および普遍的核酸プ ローブおよび増幅プライマーを発生させて、診断の臨床検体からの藻類、古細菌、細菌、真菌お よび寄生生物の微生物を急速に検出しかつ同定するためのそれらの使用

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複数の決定された藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物
    の種の核酸を配列番号543、556−574、636−655、664、681−683、694、696−69
    7、699−700、708、812−815、911−917、919−922、935−938、1203−1207、12
    12−1213、1221−1229、1605−1606、1974−1984、1999−2003、2282−2285によ
    り規定されるプライマー対の任意の組合わせで増幅する工程を含む、藻類、古細
    菌、細菌、真菌および寄生生物から選択されるグループの1つ、2以上の関係する
    微生物、または実質的にすべての微生物の検出に有用なプローブまたはプライマ
    ー、または両方が由来されるtuf、fus、atpDおよび／またはrecA遺伝子の1レパ
    ートリーの核酸を発生する方法。
  2. 【請求項２】 請求項1に記載の方法を再現する工程、および前記核酸を配
    列決定する追加の工程を含む、1レパートリーの核酸配列を発生させる方法。
  3. 【請求項３】 請求項2に記載の方法を再現する工程、および 前記レパートリーの核酸配列のサブセットを整列させ、 前記グループの前記1つ、2以上の関係する微生物、または実質的にすべての微
    生物の株または代表的なものの核酸の中に存在するが、他の微生物の核酸配列の
    中に存在しない核酸ストレッチを捜し出し、そして 前記ストレッチからプローブまたはプライマーとして有効なコンセンサス核酸
    配列を誘導する、 追加の工程を含む、藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物から選択されるグ
    ループ1つ、2以上の関係する微生物、または実質的にすべての微生物の検出に有
    用なプローブまたはプライマー、または両方の配列を発生させる方法。
  4. 【請求項４】 請求項1に記載の方法から得られた核酸のレパートリーを含
    んでなる核酸バンク。
  5. 【請求項５】 請求項2に記載の方法から得られた核酸のレパートリーを含
    んでなる核酸バンク。
  6. 【請求項６】 請求項5において規定された核酸配列のサブセットを整列さ
    せ、 前記グループの前記1つ、2以上の関係する微生物、または実質的にすべての微
    生物の株または代表的なものの核酸の中に存在し、かつ他の微生物の核酸配列の
    中に存在しない核酸ストレッチを捜し出し、そして 前記ストレッチからプローブまたはプライマーとして有用なコンセンサス核酸
    配列を誘導する、 工程を含む、藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物から選択されるグループ
    1つ、2以上の関係する微生物、または実質的にすべての微生物の検出に有用なプ
    ローブまたはプライマー、または両方の配列を発生させる方法。
  7. 【請求項７】 請求項3または6に記載の方法を再現する工程、およびその核
    酸配列上に前記プローブまたはプライマーを合成する追加の工程を含む、藻類、
    古細菌、細菌、真菌および寄生生物から選択されるグループの1つ、2以上の関係
    する微生物、または実質的にすべての微生物の検出に有用なプローブまたはプラ
    イマー、または両方を発生させる方法。
  8. 【請求項８】 請求項7に記載の方法から得られた藻類、古細菌、細菌、真
    菌および寄生生物の任意の1つの普遍的検出に使用する核酸。
  9. 【請求項９】 前記藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の任意の1つ
    と、および配列番号543、556−574、636−655、658−661、664、681−683、694
    、696、697、699、700、708、812−815、911−917、919−922、935−938、1203
    −1207、1212−1213、1221−1229、1605−1606、1974−1984、1999−2003、2282
    −2285の任意の1つと、ハイブリダイゼーションすることができる少なくとも12
    のヌクレオチドの核酸配列を有する、請求項8に記載の普遍的検出に使用する核
    酸。
  10. 【請求項１０】 藻類、古細菌、細菌、真菌および寄生生物の種、属、科お
    よび群の任意の1つ特異的および普遍的検出、および同定に使用する核酸。
  11. 【請求項１１】 マイコバクテリアセエ（Mycobacteriaceae）科の検出およ
    び／または同定のための配列番号539、540、シュードモナドス（Pseudomonads）
    群の検出および／または同定のための配列番号541、542、544、2121、コリネバ
    クテリウム（Corynebacterium）種の検出および／または同定のための配列番号5
    45、546、ストレプトコッカス（Streptococcus）種の検出および／または同定の
    ための種547、548、1202、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalctiae）の検出および／または同定のための配列番号549、550、582、583
    、625、626、627、628、1199、ナイセリア・ゴノレエ［淋菌］（Neisseria gon
    orrhaeae）の検出および／または同定のための配列番号551、552、2166、2173、
    2174、2175、2176、2177、2178、2179、スタヒロコッカス（Staphylococcus）種
    の検出および／または同定のための配列番号553、575、605、606、707、1175、1
    176、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）の検出および／または
    同定のための配列番号554、555、2213、カンジダ（Candida）種の検出および／
    または同定のための配列番号576、631、632、633、634、635、1163、1164、1167
    、2076、2108、2109、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の検出お
    よび／または同定のための配列番号577、1156、1160、2073、カンジダ・ヅブリ
    ニエンシス（Candida dubliniensis）の検出および／または同定のための配列
    番号578、1166、1168、2074、大腸菌（Escherichia coli）の検出および／また
    は同定のための配列番号579、2168、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococ
    cus faecalis）の検出および／または同定のための580、603、1174、1236、123
    8、2289、2290、2291、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の検出お
    よび／または同定のための配列番号581、スタヒロコッカス・アウレウス［黄色
    ブドウ球菌］（Staphylococcus aureus）の検出および／または同定のための配
    列番号584、585、586、587、588、1232、1234、2186、表皮ブドウ球菌（Staphyl
    ococcus epidermidis）の検出および／または同定のための配列番号589、590、
    591、592、593、スタヒロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyti
    cus）の検出および／または同定のための配列番号594、595、スタヒロコッカス
    ・ホミニス（Staphylococcus hominis）の検出および／または同定のための配
    列番号596、597、598、スタヒロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）の検出および／または同定のための配列番号599、600、601、
    695、1208、1209、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の
    検出および／または同定のための配列番号602、1235、1237、1696、1697、1698
    、1699、1700、1701、2286、2287、エンテロコッカス・ガリナヌム（Enterococc
    us gallinarum）の検出および／または同定のための配列番号604、エンテロコ
    ッカス・カッセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカ
    ス・フラベセンス（E. flavescens）およびエンテロコッカス・ガリナルム（E. gallinarum）の検出および／または同定のための配列番号620、1122、クラミ
    ジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）の検出および／または同定のた
    めの配列番号629、630、2085、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、少
    なくともアビオトロフィア・アジアセンス（Abiotrophia adiacens）、アビオ
    トロフィア・デフェシヴィア（Abiotrophia defectiva）、アシネトバクター・
    ボゥマニイィ（Acinetobacter baumanii）、アシネトバクター・ルオフィイ（A
    cinetobacter lwofii）、エロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）
    、バシラス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バシラス・セレウス（Bac
    illus cereus）、バシラス・サチリス［枯草菌］（Bacillus subtilis）、ブ
    ルセラ・アボルタス（Brucella abortus）、バーコルデリア・セパシア（Burkh
    olderia cepacia）、シトロバクター・ダイバーサス（Citrobacter diversus
    ）、シトロバクター・フロインディイ（Citrobacter freundii）、エンテロバ
    クター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・アグ
    ロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・クロアケ（Ent
    erobacter cloacae）、エンテロバクター・アビウム（Enterobacter avium）
    、エンテロバクター・カセリフラブス（Enterobacter casselifavus）、エンテ
    ロバクター・ジスパー（Enterobacter dispar）、エンテロバクター・デュラン
    ス（Enterobacter durans）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus
    faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エン
    テロコッカス・フラヴェセンス（Enterococcus flavescens）、エンテロコッカ
    ス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・ムンチイ（
    Enterococcus mundtii）、エンテロコッカス・ラフィノーサス（Enterococcus raffinosus）、エンテロコッカス・ソリタリウス（Enterococcus solitarius
    ）、大腸菌（Escherichia coli）、ゲメラ・モルビロルム（Gemella morbillo
    rum）、ヘモフィルス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi）、ヘモフィルス・
    ヘモリチカス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・インフルエンゼ
    （Haemophilus influenzae）、ヘモフィルス・パラヘモリチカス（Haemophilus parahaemolyticus）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus par
    ainfluenzae）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、ハフニア・アルベイ（Haf
    nia alvei）、キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）、クレブシエラ・オキシ
    トカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pne
    umoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Klebsiella pneumohpila）、メガノ
    マス・ハイパーメガレ（Meganomas hypermegale）、モラクセラ・アトランテ（
    Moraxella atlantae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）
    、モルガネラ・モルガニイ（Morganella morganii）、ナイセリア・ゴノレエ［
    淋菌］（Neisseria gonorrhaeae）、ナイセリア・メニンジティディス［髄膜炎
    菌］（Neisseria meningitidis）、パスツレラ・エロゲネス（Pasteurella ae
    rogenes）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ペプトスト
    レプトコッカス・マグヌス（Peptostreptococcus mugnus）、プロテウス・ミラ
    ビリス（Proteus mirabilis）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Prov
    idencia alcalifaciens）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettg
    eri）、プロビデンシア・ラスチギアニイ（Providencia rustigianii）、プロ
    ビデンシア・スチュアルティイ（Providencia stuartii）、シュードモナス・
    エルジノーサ［緑膿菌］（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フル
    オレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・スタッツエリ（
    Pseudomonas stutzeri）、サルモネラ・ボンゴリ（Salmonella bongori）、サ
    ルモネラ・コレレスイス［豚コレラ菌］（Salmonella choleraesuis）、サルモ
    ネラ・エンテリティディス［腸炎菌］（Salmonella enteritidis）、サルモネ
    ラ・ガリナルム［トリチフス菌］（Salmonella gallinarum）、サルモネラ・テ
    ィフィムリウム［ネズミチフス菌］（Salmonella typhimurium）、セラチア・
    リクエファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（
    Serratia marcescens）、シゲラ・フルクスネリ［フレクスナー赤痢菌］（Shig
    ella flexneri）、シゲラ・ソンネイ［ソンネイ赤痢菌］（Shigella sonnei）
    、スタヒロコッカス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（Staphylococcus aureus
    ）、スタヒロコッカス・カピティス（Staphylococcus capitis）、スタヒロコ
    ッカス・エピデルミディス［表皮ブドウ球菌］（Staphylococcus epidermidis
    ）、スタヒロコッカス・ヘモリティカス（Staphylococcus haemolyticus）、ス
    タヒロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、スタヒロコッカス・
    ラグダネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタヒロコッカス・サプロ
    フィティカス（Staphylococcus saprophyticus）、スタヒロコッカス・シミュ
    ランス（Staphylococcus simulanns）、スタヒロコッカス・ワーネリ（Staphyl
    ococcus warneri）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomon
    as maltophilia）、ストレプトコッカス・アシドミニマス（Streptococcus ac
    idominimus）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalact
    iae）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、
    ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・
    コンステラータス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・ク
    リセツス（Streptococcus cricetus）、ストレプトコッカス・クススタツス（S
    treptococcus cristatus）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Strep
    tococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equ
    i）、ストレプトコッカス・フェルス（Streptococcus ferus）、ストレプトコ
    ッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・イン
    ターメディウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・マカケ
    （Streptococcus macacae）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ス
    トレプトコッカス・オラーリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカ
    ス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス
    ・パラウベリス（Streptococcus parauberis）、ストレプトコッカス・ニゥモ
    ニエ［肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス
    ・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコ
    ッカス・ラッチ（Streptococcus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス
    （Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・サングイニス（Strepto
    coccus sanguinis）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobr
    inus）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプ
    トコッカス・ベスチブラリス（Streptococcus vestibularis）、ビブリオ・コ
    レレ（Vibrio cholerae）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia entero
    colitica）、エルシニア・ペスティス［ペスト菌］（Yersinia pestis）、エル
    シニア・シュードツベロクローシス［仮性結核菌］（Yersinia pseudotubercul
    osis）の検出および／または同定のための配列番号636、637、638、639、640、6
    41、642、エンテロコッカス（Enterococcus）種の検出および／または同定のた
    めの種656、657、271、1136、1137、レイシュマニア（Leishmania）種の検出お
    よび／または同定のための配列番号701、702、エンタモエバ（Entamoeba）種の
    検出および／または同定のための703、704、705、706、793、トリパノソーマ・
    クルジ（Trypanosoma cruzi）の検出および／または同定のための配列番号794
    、795、クロストジウム（Clostridium）種の検出および／または同定のための79
    6、797、808、809、810、811、クリプトスポリジウム・パルヴム（Cryptosporid
    ium parvum）種の検出および／または同定のための798、799、800、801、802、
    803、804、805、806、807、ギアルジア（Giardia）種の検出および／または同定
    のための配列番号816、817、818、819、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosom
    a brucei）の検出および／または同定のための配列番号820、821、822、トリパ
    ノソーマ（Trypanosoma）種の検出および／または同定のための配列番号823、82
    4、ボルデテラ（Bordetella）種の検出および／または同定のための配列番号825
    、826、トリパノソーマチデ（Trypanosomatide）科の検出および／または同定の
    ための配列番号923、924、925、926、927、928、エンテロバクデリアセエ［腸内
    細菌科］（Enterobacteriaceae）群の検出および／または同定のための配列番号
    933、934、ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］Streptococcus pyogenes）の検出および／または同定のための配列番号994、995、996、997、
    998、999、1000、1001、1200、1210、1211、カンジダ・パラプシロシス（Candid
    a parapsilosis）の検出および／または同定のための配列番号1157、2079、211
    8、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）の検出および／または同定のた
    めの配列番号1158、1159、2078、2110、2111、カンジダ・トロピカリス（Candid
    a tropicalis）の検出および／または同定のための配列番号1160、2077、2119
    、2120、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）の検出および／または同定の
    ための配列番号1161、2075、2112、2113、2114、カンジダ・グイリエルモンディ
    イ（Candida guilliermondii）の検出および／または同定のための配列番号116
    2、カンジダ・ルシタニエ（Candida lusitaniae）の検出および／または同定の
    ための配列番号1162、2080、2115、2116、2117、カンジダ・ゼイラノイデス（Ca
    ndida zeylanoides）の検出および／または同定のための配列番号1165、ストレ
    プトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）
    の検出および／または同定のための配列番号1201、スタヒロコッカス・アウレウ
    ス［黄色ブドウ球菌］（S. aureus）以外のスタヒロコッカス（Staphylococcus
    ）種の検出および／または同定のための配列番号1233、クレブシエラ・ニューモ
    ニエ（Klebsiella pneumoniae）の検出および／または同定のための配列番号13
    29、1330、1331、1332、2167、2281、大腸菌（Escherichia coli）およびシゲ
    ラ[赤痢菌]（Shigella）種の検出および／または同定のための配列番号1661、16
    65、アシネトバクター・バウマニイ（Acinetobacter baumanii）の検出および
    ／または同定のための配列番号1690、1691、1692、1693、2169、シュードモナス
    ・エルジノーサ［緑膿菌］（Pseudomonas aeruginosa）の検出および／または
    同定のための配列番号1694、1695、2122、クリプトコッカス（Cryptococcus）種
    の検出および／または同定のための配列番号1971、1972、1973、レジオネラ（Le
    gionella）種の検出および／または同定のための配列番号2081、2082、2083、レ
    ジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）の検出および／または
    同定のための配列番号2084、マイコプラズマ・ニゥモニエ（Mycoplasma pneumo
    niae）の検出および／または同定のための配列番号2093、2094、2095、2096、ク
    リプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）の検出および
    ／または同定のための配列番号2106、2107、カンピロバクター・ジェジュニ（Ca
    mpylobacter jejuni）およびカンピロバクター・コリ（C. coli）の検出およ
    び／または同定のための配列番号2131、2132、2133、バクテロイデス・フラジリ
    ス（Bacteroides fragilis）の検出および／または同定のための配列番号2134
    、2135、2136、アビオトロフィア・アジアンス（Abiotrophia adiacens）の検
    出および／または同定のための配列番号2170、ゲメラ（Gemella）種の検出およ
    び／または同定のための配列番号2171、エンテロコッカス（Enterococcus）種、
    ゲメラ（Gemella）、アビオトロフィア・アジアンス（A. adiacens）の検出お
    よび／または同定のための配列番号2172、ボルデデラ・プロンキセプチカ［百日
    咳菌］（Bordetella pertussis）の検出および／または同定のための配列番号2
    180、2181、2182により規定されるヌクレオチド配列の任意の1つを有する請求項
    10に記載の核酸。
  12. 【請求項１２】 工程： a） 任意の試験試料のtufまたはatpDまたはrecAの核酸と、核酸プライマーお
    よび／またはプローブとを接触させ、前記プライマーおよび／またはプローブは
    十分に相補的であって、前記微生物群に対して特異的である1または2以上のtuf
    またはatpDまたはrecAに対してハイブリダイゼーションするように選択されてお
    り； b） プライマーおよび／またはプローブと、任意の試験試料のtufまたはatpD
    またはrecAの核酸を特定された条件下にハイブリダイゼーションさせ、前記条件
    は前記プライマーおよび／またはプローブが前記微生物のtufまたはatpDまたはr
    ecAの核酸にハイブリダイゼーションするが、他の微生物からのtufまたはatpDま
    たはrecA配列と検出可能にハイブリダイゼーションしないような条件であり；そ
    して c） 任意の試験試料のtufまたはatpDまたはrecAの核酸に対する前記プライマ
    ーおよび／またはプローブのハイブリダイゼーションについて試験する； を含む、試験試料中の藻類、古細菌、細菌、真菌または寄生生物である微生物の
    存在を決定する方法。
  13. 【請求項１３】 c）が核酸ターゲットの増幅法に基づく、請求項12に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 c）がシグナル増幅法に基づく、請求項12に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 十分に相補的である前記プライマーおよび／またはプロー
    ブが完全に相補的である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 十分に相補的である前記プライマーおよび／またはプロー
    ブが完全には相補的でない、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 プローブまたは増幅プライマーまたは両方のパネルを使用
    し、各個々のプローブまたはプライマーが少なくとも12ヌクレオチド長さを有す
    る核酸に由来し、藻類、古細菌、細菌、真菌または寄生生物の種、属、科または
    群である微生物の核酸とイブリダイゼーションし、かつ下記の配列番号により規
    定されるヌクレオチド配列の任意の1つを有する核酸とハイブリダイゼーション
    することができる、前記微生物を特異的に検出しおよび／または同定する方法：
    マイコバクテリアセエ（Mycobacteriaceae）科の検出および／または同定のため
    の配列番号539、540、シュードモナドス（Pseudomonads）群の検出および／また
    は同定のための配列番号541、542、544、2121、コリネバクテリウム（Corynebac
    terium）種の検出および／または同定のための配列番号545、546、ストレプトコ
    ッカス（Streptococcus）種の検出および／または同定のための種547、548、120
    2、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalctiae）の検出お
    よび／または同定のための配列番号549、550、582、583、625、626、627、628、
    1199、ナイセリア・ゴノレエ［淋菌］（Neisseria gonorrhaeae）の検出および
    ／または同定のための配列番号551、552、2166、2173、2174、2175、2176、2177
    、2178、2179、スタヒロコッカス（Staphylococcus）種の検出および／または同
    定のための配列番号553、575、605、606、707、1175、1176、トラコーマクラミ
    ジア（Chlamydia trachomatis）の検出および／または同定のための配列番号55
    4、555、2213、カンジダ（Candida）種の検出および／または同定のための配列
    番号576、631、632、633、634、635、1163、1164、1167、2076、2108、2109、カ
    ンジダ・アルビカンス（Candida albicans）の検出および／または同定のため
    の配列番号577、1156、1160、2073、カンジダ・ヅブリニエンシス（Candida du
    bliniensis）の検出および／または同定のための配列番号578、1166、1168、207
    4、大腸菌（Escherichia coli）の検出および／または同定のための配列番号57
    9、2168、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の検出お
    よび／または同定のための580、603、1174、1236、1238、2289、2290、2291、イ
    ンフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の検出および／または同定のため
    の配列番号581、スタヒロコッカス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（Staphyloc
    occus aureus）の検出および／または同定のための配列番号584、585、586、58
    7、588、1232、1234、2186、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）
    の検出および／または同定のための配列番号589、590、591、592、593、スタヒ
    ロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）の検出および／ま
    たは同定のための配列番号594、595、スタヒロコッカス・ホミニス（Staphyloco
    ccus hominis）の検出および／または同定のための配列番号596、597、598、ス
    タヒロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）の検出
    および／または同定のための配列番号599、600、601、695、1208、1209、エンテ
    ロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）の検出および／または同定
    のための配列番号602、1235、1237、1696、1697、1698、1699、1700、1701、228
    6、2287、エンテロコッカス・ガリナヌム（Enterococcus gallinarum）の検出
    および／または同定のための配列番号604、エンテロコッカス・カッセリフラブ
    ス（Enterococcus casseliflavus）、エンテロコッカス・フラベセンス（E. f
    lavescens）およびエンテロコッカス・ガリナルム（E. gallinarum）の検出お
    よび／または同定のための配列番号620、1122、クラミジア・ニューモニエ（Chl
    amydia pneumoniae）の検出および／または同定のための配列番号629、630、20
    85、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、少なくともアビオトロフィア
    ・アジアセンス（Abiotrophia adiacens）、アビオトロフィア・デフェシヴィ
    ア（Abiotrophia defectiva）、アシネトバクター・ボゥマニイィ（Acinetobac
    ter baumanii）、アシネトバクター・ルオフィイ（Acinetobacter lwofii）、
    エロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）、バシラス・アンスラシス
    （Bacillus anthracis）、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）、バシラ
    ス・サチリス［枯草菌］（Bacillus subtilis）、ブルセラ・アボルタス（Bruc
    ella abortus）、バーコルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、シト
    ロバクター・ダイバーサス（Citrobacter diversus）、シトロバクター・フロ
    インディイ（Citrobacter freundii）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ent
    erobacter aerogenes）、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
    agglomerans）、エンテロバクター・クロアケ（Enterobacter cloacae）、エン
    テロバクター・アビウム（Enterobacter avium）、エンテロバクター・カセリ
    フラブス（Enterobacter casselifavus）、エンテロバクター・ジスパー（Ente
    robacter dispar）、エンテロバクター・デュランス（Enterobacter durans）
    、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカ
    ス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フラヴェセン
    ス（Enterococcus flavescens）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococc
    us gallinarum）、エンテロコッカス・ムンチイ（Enterococcus mundtii）、
    エンテロコッカス・ラフィノーサス（Enterococcus raffinosus）、エンテロコ
    ッカス・ソリタリウス（Enterococcus solitarius）、大腸菌（Escherichia c
    oli）、ゲメラ・モルビロルム（Gemella morbillorum）、ヘモフィルス・デュ
    クレイ（Haemophilus ducreyi）、ヘモフィルス・ヘモリチカス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae
    ）、ヘモフィルス・パラヘモリチカス（Haemophilus parahaemolyticus）、ヘ
    モフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィ
    ルス・パラインフルエンゼ、ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）、キンゲラ
    ・キンゲ（Kingella kingae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxyt
    oca）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ
    ・ニューモフィラ（Klebsiella pneumohpila）、メガノマス・ハイパーメガレ
    （Meganomas hypermegale）、モラクセラ・アトランテ（Moraxella atlantae
    ）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）、モルガネラ・モルガ
    ニイ（Morganella morganii）、ナイセリア・ゴノレエ［淋菌］（Neisseria g
    onorrhaeae）、ナイセリア・メニンジティディス［髄膜炎菌］（Neisseria men
    ingitidis）、パスツレラ・エロゲネス（Pasteurella aerogenes）、パスツレ
    ラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ペプトストレプトコッカス・マグ
    ヌス（Peptostreptococcus mugnus）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mir
    abilis）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifacie
    ns）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシ
    ア・ラスチギアニイ（Providencia rustigianii）、プロビデンシア・スチュア
    ルティイ（Providencia stuartii）、シュードモナス・エルジノーサ［緑膿菌
    ］（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudom
    onas fluorescens）、シュードモナス・スタッツエリ（Pseudomonas stutzeri
    ）、サルモネラ・ボンゴリ（Salmonella bongori）、サルモネラ・コレレスイ
    ス［豚コレラ菌］（Salmonella choleraesuis）、サルモネラ・エンテリティデ
    ィス［腸炎菌］（Salmonella enteritidis）、サルモネラ・ガリナルム［トリ
    チフス菌］（Salmonella gallinarum）、サルモネラ・ティフィムリウム［ネズ
    ミチフス菌］（Salmonella typhimurium）、セラチア・リクエファシエンス（S
    erratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens
    ）、シゲラ・フルクスネリ［フレクスナー赤痢菌］（Shigella flexneri）、シ
    ゲラ・ソンネイ［ソンネイ赤痢菌］（Shigella sonnei）、スタヒロコッカス・
    アウレウス［黄色ブドウ球菌］（Staphylococcus aureus）、スタヒロコッカス
    ・カピティス（Staphylococcus capitis）、スタヒロコッカス・エピデルミデ
    ィス［表皮ブドウ球菌］（Staphylococcus epidermidis）、スタヒロコッカス
    ・ヘモリティカス（Staphylococcus haemolyticus）、スタヒロコッカス・ホミ
    ニス（Staphylococcus hominis）、スタヒロコッカス・ラグダネンシス（Staph
    ylococcus lugdunensis）、スタヒロコッカス・サプロフィティカス（Staphylo
    coccus saprophyticus）、スタヒロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulanns）、スタヒロコッカス・ワーネリ（Staphylococcus warneri）、ス
    テノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ス
    トレプトコッカス・アシドミニマス（Streptococcus acidominimus）、ストレ
    プトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコ
    ッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・
    ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・コンステラータス（St
    reptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・クリセツス（Streptococc
    us cricetus）、ストレプトコッカス・クススタツス（Streptococcus cristat
    us）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactia
    e）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ストレプトコッカ
    ス・フェルス（Streptococcus ferus）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（St
    reptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Strepto
    coccus intermedius）、ストレプトコッカス・マカケ（Streptococcus macaca
    e）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ストレプトコ
    ッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・オラ
    ーリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（S
    treptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・パラウベリス（Strepto
    coccus parauberis）、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（
    Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス［化膿レンサ
    球菌］（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ラッチ（Streptoco
    ccus ratti）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivari
    us）、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）、スト
    レプトコッカス・ソブリナス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカ
    ス・ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス・ベスチブラリ
    ス（Streptococcus vestibularis）、ビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）
    、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、エルシニア・
    ペスティス［ペスト菌］（Yersinia pestis）、エルシニア・シュードツベロク
    ローシス［仮性結核菌］（Yersinia pseudotuberculosis）の検出および／また
    は同定のための配列番号636、637、638、639、640、641、642、エンテロコッカ
    ス（Enterococcus）種の検出および／または同定のための種656、657、271、113
    6、1137、レイシュマニア（Leishmania）種の検出および／または同定のための
    配列番号701、702、エンタモエバ（Entamoeba）種の検出および／または同定の
    ための703、704、705、706、793、トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruz
    i）の検出および／または同定のための配列番号794、795、クロストジウム（Clo
    stridium）種の検出および／または同定のための796、797、808、809、810、811
    、クリプトスポリジウム・パルヴム（Cryptosporidium parvum）の検出および
    ／または同定のための798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、ギ
    アルジア（Giardia）種の検出および／または同定のための配列番号816、817、8
    18、819、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）の検出および／ま
    たは同定のための配列番号820、821、822、トリパノソーマ（Trypanosoma）種の
    検出および／または同定のための配列番号823、824、ボルデテラ（Bordetella）
    種の検出および／または同定のための配列番号825、826、トリパノソーマチデ（
    Trypanosomatide）科の検出および／または同定のための配列番号923、924、925
    、926、927、928、エンテロバクデリアセエ［腸内細菌科］（Enterobacteriacea
    e）群の検出および／または同定のための配列番号933、934、ストレプトコッカ
    ス・ピオゲネス［化膿レンサ球菌］Streptococcus pyogenes）の検出および／
    または同定のための配列番号994、995、996、997、998、999、1000、1001、1200
    、1210、1211、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）の検出お
    よび／または同定のための配列番号1157、2079、2118、カンジダ・グラブラタ（
    Candida glabrata）の検出および／または同定のための配列番号1158、1159、2
    078、2110、2111、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）の検出およ
    び／または同定のための配列番号1160、2077、2119、2120、カンジダ・クルセイ
    （Candida krusei）の検出および／または同定のための配列番号1161、2075、2
    112、2113、2114、カンジダ・グイリエルモンディイ（Candida guilliermondii
    ）の検出および／または同定のための配列番号1162、カンジダ・ルシタニエ（Ca
    ndida lusitaniae）の検出および／または同定のための配列番号1162、2080、2
    115、2116、2117、カンジダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）の検出
    および／または同定のための配列番号1165、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［
    肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）の検出および／または同定の
    ための配列番号1201、スタヒロコッカス・アウレウス［黄色ブドウ球菌］（S.
    aureus）以外のスタヒロコッカス（Staphylococcus）種の検出および／または同
    定のための配列番号1233、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoni
    ae）の検出および／または同定のための配列番号1329、1330、1331、1332、2167
    、2281、大腸菌（Escherichia coli）およびシゲラ[赤痢菌]（Shigella）種の
    検出および／または同定のための配列番号1661、1665、アシネトバクター・バウ
    マニイ（Acinetobacter baumanii）の検出および／または同定のための配列番
    号1690、1691、1692、1693、2169、シュードモナス・エルジノーサ［緑膿菌］（
    Pseudomonas aeruginosa）の検出および／または同定のための配列番号1694、1
    695、2122、クリプトコッカス（Cryptococcus）種の検出および／または同定の
    ための配列番号1971、1972、1973、レジオネラ（Legionella）種の検出および／
    または同定のための配列番号2081、2082、2083、レジオネラ・ニューモフィラ（
    Legionella pneumophila）の検出および／または同定のための配列番号2084、
    マイコプラズマ・ニゥモニエ（Mycoplasma pneumoniae）の検出および／または
    同定のための配列番号2093、2094、2095、2096、クリプトコッカス・ネオフォル
    マンス（Cryptococcus neoformans）の検出および／または同定のための配列番
    号2106、2107、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）およ
    びカンピロバクター・コリ（C. coli）の検出および／または同定のための配列
    番号2131、2132、2133、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis
    ）の検出および／または同定のための配列番号2134、2135、2136、アビオトロフ
    ィア・アジアンス（Abiotrophia adiacens）の検出および／または同定のため
    の配列番号2170、ゲメラ（Gemella）種の検出および／または同定のための配列
    番号2171、エンテロコッカス（Enterococcus）種、ゲメラ（Gemella）、アビオ
    トロフィア・アジアンス（A. adiacens）の検出および／または同定のための配
    列番号2172、ボルデデラ・プロンキセプチカ［百日咳菌］（Bordetella pertus
    sis）の検出および／または同定のための配列番号2180、2181、2182、前記方法
    は試料の核酸を前記プライマーまたはプローブとハイブリダイゼーションまたは
    増幅の条件下に接触させ、そして前記特定の藻類、古細菌、細菌、真菌または寄
    生生物の種、属、科または群の存在の同定としてハイブリダイゼーションしたプ
    ローブまたは増幅された生成物の存在を検出する工程を含む。
  18. 【請求項１８】 プローブまたは増幅プライマーまたは両方のパネルを使用
    し、各個々のプローブまたはプライマーが請求項8または9に記載の核酸に由来し
    、試料中の細菌、真菌または寄生生物の普遍的検出法であって、試料の核酸を前
    記プローブまたはプライマーとハイブリダイゼーションまたは増幅の条件下に接
    触させ、そして藻類、古細菌、細菌、真菌または寄生生物の存在を検出する工程
    を含む方法。
  19. 【請求項１９】 少なくとも1種の抗菌剤耐性遺伝子を検出するプローブま
    たはプライマー、または両方をさらに含む、請求項17または18に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 少なくとも1種のトキシン遺伝子を検出するプローブまた
    はプライマー、または両方をさらに含む、請求項18、18または19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記抗菌剤耐性遺伝子またはトキシン遺伝子を検出するプ
    ローブまたはプライマーが少なくとも12ヌクレオチド長さを有し、下記の配列番
    号から選択される抗菌剤耐性遺伝子および／またはトキシン遺伝子とハイブリダ
    イゼーションすることができる、請求項19または20に記載の方法：大腸菌（E.
    coli）シゲラ[赤痢菌]（Shigella）様トキシン2（stx2）遺伝子の検出および／
    または同定のための配列番号1078、1079、1085、大腸菌（E. coli）シゲラ[赤
    痢菌]（Shigella）様トキシン1（stx1）遺伝子の検出および／または同定のため
    の配列番号1080、1081、1084、2012、大腸菌（E. coli）シゲラ[赤痢菌]（Shig
    ella）様トキシン1および2（stx）遺伝子の検出および／または同定のための配
    列番号1082、1083、vanA耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号
    1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1170、1239、1240、2292、vanB耐
    性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1095、1096、1171、1241、
    2294、2295、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1118、1119、1120、1121、
    1123、1124、vanC1耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1103
    、1104、1109、1110、vanC2およびvanC3耐性遺伝子の検出および／または同定の
    ための配列番号1105、1106、1107、1108、vanC1、vanC2およびvanC3耐性遺伝子
    の検出および／または同定のための配列番号1097、1098、1099、1100、1101、11
    02、vanAXY耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1150、1153、
    1154、1155、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（S. pneumo
    niae）pbp1a遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1094、1125、112
    6、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1192、1193、119
    4、1195、1196、1197、1214、1216、1217、1218、1219、1220、2015、2016、201
    7、2018、2019、2020、2021、2022、2023、2024、2025、2026、2027、2028、202
    9、2030、2031、2032、2033、2034、2035、2036、2037、2038、2039、ストレプ
    トコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（S. pneumoniae）pbp2b遺伝子の
    検出および／または同定のための配列番号1142、1143、1144、1145、ストレプト
    コッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（S. pneumoniae）pbp2x遺伝子の検
    出および／または同定のための配列番号1146、1147、1148、1149、mecA耐性遺伝
    子の検出および／または同定のための配列番号1177、1231、gyrA耐性遺伝子の検
    出および／または同定のための配列番号1290、1291、1292、1293、1294、1295、
    1296、1297、1298、1333、1334、1335、1340、1341、1936、1937、1940、1942、
    1943、1945、1946、1947、1948、1949、2040、2041、2042、2043、2250、2251、
    gyrB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1301、1302、1303、
    1304、1305、1306、parC耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号
    1308、1309、1310、1311、1312、1313、1314、1315、1316、1317、1318、1319、
    1336、1337、1338、1339、1342、1343、1934、1935、1938、1939、1941、1944、
    1950、1951、1952、1953、1955、2044、2045、2046、parE耐性遺伝子の検出およ
    び／または同定のための配列番号1322、1323、1324、1325、1326、1327、aac（2
    '）−Ia耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1344、1345、134
    6、1347、aac（3'）−Ib耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号
    1349、1350、aac（3'）−IIb耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列
    番号1352、1353、1354、1355、aac（3'）−IVa耐性遺伝子の検出および／または
    同定のための配列番号1357、1358、1359、1360、aac（3'）−VIa耐性遺伝子の検
    出および／または同定のための配列番号1362、1363、1364、1365、aac（6'）−I
    a耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1367、1368、1369、137
    0、aac（6'）−Ic耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1372、
    1373、1374、1375、ant（3'）−Ia耐性遺伝子の検出および／または同定のため
    の配列番号1377、1378、1379、1380、ant（4'）−Ia耐性遺伝子の検出および／
    または同定のための配列番号1382、1383、1384、1385、aph（3'）−Ia耐性遺伝
    子の検出および／または同定のための配列番号1387、1388、1389、1390、aph（3
    '）−IIa耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1392、1393、13
    94、1395、aph（3'）−IIIa耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列
    番号1397、1398、1399、1400、aph（3'）−VIa耐性遺伝子の検出および／または
    同定のための配列番号1402、1403、1404、1405、2252、blaCARB耐性遺伝子の検
    出および／または同定のための配列番号1407、1408、1409、1410、blaCMY−2耐
    性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1412、1413、1414、1415、
    blaCTX−M−1およびblaCTX−M−2耐性遺伝子の検出および／または同定のための
    配列番号1417、1418、blaCTX−M−1耐性遺伝子の検出および／または同定のため
    の配列番号1419、1420、1421、1422、blaCTX−M−2耐性遺伝子の検出および／ま
    たは同定のための配列番号1424、1425、1426、1427、blaIMP耐性遺伝子の検出お
    よび／または同定のための配列番号1429、1430、1431、1432、blaOXA2耐性遺伝
    子の検出および／または同定のための配列番号1434、1435、blaOXA10耐性遺伝子
    の検出および／または同定のための配列番号1436、1437、blaPER−1耐性遺伝子
    の検出および／または同定のための配列番号1440、1441、blaPER−2耐性遺伝子
    の検出および／または同定のための配列番号1443、1444、blaPER−1およびblaPE
    R−2耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1446、1447、1448、
    1449、dfrA耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1450、1451、
    dhfrIaおよびdhfrXV耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1453
    、1454、1455、1456、dhfrIa耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列
    番号1457、1458、1459、1460、2253、dhfrIbおよびdhfrV耐性遺伝子の検出およ
    び／または同定のための配列番号1462、1463、1464、1465、dhfrIb耐性遺伝子の
    検出および／または同定のための配列番号1466、1467、1468、1469、dhfrV耐性
    遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1471、1472、1473、1474、dh
    frVI耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1476、1477、1478、
    1479、dhfrVIIおよびdhfrXVII耐性遺伝子の検出および／または同定のための配
    列番号1481、1482、1483、1484、dhfrVII耐性遺伝子の検出および／または同定
    のための配列番号1485、1486、1487、1488、dhfrVIII耐性遺伝子の検出および／
    または同定のための配列番号1490、1491、1492、1493、dhfrIX耐性遺伝子の検出
    および／または同定のための配列番号1495、1496、1497、1498、dhfrXII耐性遺
    伝子の検出および／または同定のための配列番号1500、1501、1502、1503、dhfr
    XIII耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1505、1506、dhfrXV
    耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1508、1509、1510、1511
    、dhfrXVII耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1513、1514、
    1515、1516、ereAおよびereA2耐性遺伝子の検出および／または同定のための配
    列番号1528、1529、ereB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号
    1531、1532、1533、1534、linAおよびlinA'耐性遺伝子の検出および／または同
    定のための配列番号1536、1537、1538、1539、linB耐性遺伝子の検出および／ま
    たは同定のための配列番号1541、1542、1543、1544、mefA耐性遺伝子の検出およ
    び／または同定のための配列番号1546、1547、mefE耐性遺伝子の検出および／ま
    たは同定のための配列番号1549、1550、mefAおよびmefE耐性遺伝子の検出および
    ／または同定のための配列番号1552、1553、1554、1555、mphAおよびmphK耐性遺
    伝子の検出および／または同定のための配列番号1556、1557、1558、1559、satG
    耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1581、1582、1583、1584
    、tetM耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1586、1587、1588
    、1589、2254、vanD耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1591
    、1592、1593、2297、vanE耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番
    号1595、1596、1597、1598、vatB耐性遺伝子の検出および／または同定のための
    配列番号1609、1610、1611、1612、vatC耐性遺伝子の検出および／または同定の
    ための配列番号1614、1615、1616、1617、vga耐性遺伝子の検出および／または
    同定のための配列番号1619、1620、1621、1622、vgaB耐性遺伝子の検出および／
    または同定のための配列番号1624、1625、1626、1627、vgbおよびvgh耐性遺伝子
    の検出および／または同定のための配列番号1629、1630、1631、1632、vgbB耐性
    遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1634、1635、1636、1637、bl
    aSHV耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1883、1884、1885、
    1886、1887、1888、1889、1890、1891、1892、1893、1894、1895、1896、1897、
    1898、blaTEM耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1906、1907
    、1908、1909、1910、1911、1912、1913、1914、1915、1916、1917、1918、1919
    、1920、1921、1922、1923、1924、1925、1926、2006、2007、2008、2009、2141
    、sulII耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1961、1962、196
    3、1964、tetB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1966、196
    7、1968、1969、rpoB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号206
    5、2066、2067、2068、2069、2070、2071、inhA耐性遺伝子の検出および／また
    は同定のための配列番号2098、2099、2100、embB耐性遺伝子の検出および／また
    は同定のための配列番号2102、2103、2104、C. difficile cdtAトキシン遺伝
    子の検出および／または同定のための配列番号2123、2124、2125、C. difficil
    e cdtBトキシン遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2126、2127
    、2128、mupA耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2142、2143
    、catI耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2145、2146、catI
    I耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2148、2149、catIII耐
    性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2151、2152、catP耐性遺伝
    子の検出および／または同定のための配列番号2154、2155、cat耐性遺伝子の検
    出および／または同定のための配列番号2157、2158、2160、2161、ppflo様耐性
    遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2163、2164。
  22. 【請求項２２】 細菌、真菌または寄生生物種、属、科または群に対して特
    異的である，請求項10または11に記載の特異的核酸と、あるいは細菌、真菌また
    は寄生生物に対して普遍的である請求項8または9に記載の核酸と、あるいは両方
    の特異的または普遍的核酸と、抗菌剤耐性遺伝子および／またはトキシン遺伝子
    とハイブリダイゼーションすることができる、少なくとも2つの12ヌクレオチド
    の核酸配列とを含んでなる組成物。
  23. 【請求項２３】 抗菌剤耐性遺伝子および／またはトキシン遺伝子とハイブ
    リダイゼーションすることができる核酸が下記の任意の1つである、請求項22に
    記載の組成物：：大腸菌（E. coli）シゲラ[赤痢菌]（Shigella）様トキシン2
    （stx2）遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1078、1079、1085、
    大腸菌（E. coli）シゲラ[赤痢菌]（Shigella）様トキシン1（stx1）遺伝子の
    検出および／または同定のための配列番号1080、1081、1084、2012、大腸菌（E. coli）シゲラ[赤痢菌]（Shigella）様トキシン1および2（stx）遺伝子の検出
    および／または同定のための配列番号1082、1083、vanA耐性遺伝子の検出および
    ／または同定のための配列番号1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、11
    70、1239、1240、2292、vanB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列
    番号1095、1096、1171、1241、2294、2295、1111、1112、1113、1114、1115、11
    16、1118、1119、1120、1121、1123、1124、vanC1耐性遺伝子の検出および／ま
    たは同定のための配列番号1103、1104、1109、1110、vanC2およびvanC3耐性遺伝
    子の検出および／または同定のための配列番号1105、1106、1107、1108、vanC1
    、vanC2およびvanC3耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1097
    、1098、1099、1100、1101、1102、vanAXY耐性遺伝子の検出および／または同定
    のための配列番号1150、1153、1154、1155、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［
    肺炎レンサ球菌］（S. pneumoniae）pbp1a遺伝子の検出および／または同定の
    ための配列番号1094、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133
    、1134、1135、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1214、1216、1217、1218
    、1219、1220、2015、2016、2017、2018、2019、2020、2021、2022、2023、2024
    、2025、2026、2027、2028、2029、2030、2031、2032、2033、2034、2035、2036
    、2037、2038、2039、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（S. pneumoniae）pbp2b遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1142、1
    143、1144、1145、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（S. p
    neumoniae）pbp2x遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1146、1147
    、1148、1149、mecA耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1177
    、1231、gyrA耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1290、1291
    、1292、1293、1294、1295、1296、1297、1298、1333、1334、1335、1340、1341
    、1936、1937、1940、1942、1943、1945、1946、1947、1948、1949、2040、2041
    、2042、2043、2250、2251、gyrB耐性遺伝子の検出および／または同定のための
    配列番号1301、1302、1303、1304、1305、1306、parC耐性遺伝子の検出および／
    または同定のための配列番号1308、1309、1310、1311、1312、1313、1314、1315
    、1316、1317、1318、1319、1336、1337、1338、1339、1342、1343、1934、1935
    、1938、1939、1941、1944、1950、1951、1952、1953、1955、2044、2045、2046
    、parE耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1322、1323、1324
    、1325、1326、1327、aac（2'）−Ia耐性遺伝子の検出および／または同定のた
    めの配列番号1344、1345、1346、1347、aac（3'）−Ib耐性遺伝子の検出および
    ／または同定のための配列番号1349、1350、aac（3'）−IIb耐性遺伝子の検出お
    よび／または同定のための配列番号1352、1353、1354、1355、aac（3'）−IVa耐
    性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1357、1358、1359、1360、
    aac（3'）−VIa耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1362、13
    63、1364、1365、aac（6'）−Ia耐性遺伝子の検出および／または同定のための
    配列番号1367、1368、1369、1370、aac（6'）−Ic耐性遺伝子の検出および／ま
    たは同定のための配列番号1372、1373、1374、1375、ant（3'）−Ia耐性遺伝子
    の検出および／または同定のための配列番号1377、1378、1379、1380、ant（4'
    ）−Ia耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1382、1383、1384
    、1385、aph（3'）−Ia耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1
    387、1388、1389、1390、aph（3'）−IIa耐性遺伝子の検出および／または同定
    のための配列番号1392、1393、1394、1395、aph（3'）−IIIa耐性遺伝子の検出
    および／または同定のための配列番号1397、1398、1399、1400、aph（3'）−VIa
    耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1402、1403、1404、1405
    、2252、blaCARB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1407、1
    408、1409、1410、blaCMY−2耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列
    番号1412、1413、1414、1415、blaCTX−M−1およびblaCTX−M−2耐性遺伝子の検
    出および／または同定のための配列番号1417、1418、blaCTX−M−1耐性遺伝子の
    検出および／または同定のための配列番号1419、1420、1421、1422、blaCTX−M
    −2耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1424、1425、1426、1
    427、blaIMP耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1429、1430
    、1431、1432、blaOXA2耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1
    434、1435、blaOXA10耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号143
    6、1437、blaPER−1耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1440
    、1441、blaPER−2耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1443
    、1444、blaPER−1およびblaPER−2耐性遺伝子の検出および／または同定のため
    の配列番号1446、1447、1448、1449、dfrA耐性遺伝子の検出および／または同定
    のための配列番号1450、1451、dhfrIaおよびdhfrXV耐性遺伝子の検出および／ま
    たは同定のための配列番号1453、1454、1455、1456、dhfrIa耐性遺伝子の検出お
    よび／または同定のための配列番号1457、1458、1459、1460、2253、dhfrIbおよ
    びdhfrV耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1462、1463、146
    4、1465、dhfrIb耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1466、1
    467、1468、1469、dhfrV耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号
    1471、1472、1473、1474、dhfrVI耐性遺伝子の検出および／または同定のための
    配列番号1476、1477、1478、1479、dhfrVIIおよびdhfrXVII耐性遺伝子の検出お
    よび／または同定のための配列番号1481、1482、1483、1484、dhfrVII耐性遺伝
    子の検出および／または同定のための配列番号1485、1486、1487、1488、dhfrVI
    II耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1490、1491、1492、14
    93、dhfrIX耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1495、1496、
    1497、1498、dhfrXII耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号150
    0、1501、1502、1503、dhfrXIII耐性遺伝子の検出および／または同定のための
    配列番号1505、1506、dhfrXV耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列
    番号1508、1509、1510、1511、dhfrXVII耐性遺伝子の検出および／または同定の
    ための配列番号1513、1514、1515、1516、ereAおよびereA2耐性遺伝子の検出お
    よび／または同定のための配列番号1528、1529、ereB耐性遺伝子の検出および／
    または同定のための配列番号1531、1532、1533、1534、linAおよびlinA'耐性遺
    伝子の検出および／または同定のための配列番号1536、1537、1538、1539、linB
    耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1541、1542、1543、1544
    、mefA耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1546、1547、mefE
    耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1549、1550、mefAおよび
    mefE耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1552、1553、1554、
    1555、mphAおよびmphK耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号15
    56、1557、1558、1559、satG耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列
    番号1581、1582、1583、1584、tetM耐性遺伝子の検出および／または同定のため
    の配列番号1586、1587、1588、1589、2254、vanD耐性遺伝子の検出および／また
    は同定のための配列番号1591、1592、1593、2297、vanE耐性遺伝子の検出および
    ／または同定のための配列番号1595、1596、1597、1598、vatB耐性遺伝子の検出
    および／または同定のための配列番号1609、1610、1611、1612、vatC耐性遺伝子
    の検出および／または同定のための配列番号1614、1615、1616、1617、vga耐性
    遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1619、1620、1621、1622、vg
    aB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1624、1625、1626、16
    27、vgbおよびvgh耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号1629、
    1630、1631、1632、vgbB耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号
    1634、1635、1636、1637、blaSHV耐性遺伝子の検出および／または同定のための
    配列番号1883、1884、1885、1886、1887、1888、1889、1890、1891、1892、1893
    、1894、1895、1896、1897、1898、blaTEM耐性遺伝子の検出および／または同定
    のための配列番号1906、1907、1908、1909、1910、1911、1912、1913、1914、19
    15、1916、1917、1918、1919、1920、1921、1922、1923、1924、1925、1926、20
    06、2007、2008、2009、2141、sulII耐性遺伝子の検出および／または同定のた
    めの配列番号1961、1962、1963、1964、tetB耐性遺伝子の検出および／または同
    定のための配列番号1966、1967、1968、1969、rpoB耐性遺伝子の検出および／ま
    たは同定のための配列番号2065、2066、2067、2068、2069、2070、2071、inhA耐
    性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2098、2099、2100、embB耐
    性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2102、2103、2104、C. di
    fficile cdtAトキシン遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2123
    、2124、2125、C. difficile cdtBトキシン遺伝子の検出および／または同定
    のための配列番号2126、2127、2128、mupA耐性遺伝子の検出および／または同定
    のための配列番号2142、2143、catI耐性遺伝子の検出および／または同定のため
    の配列番号2145、2146、catII耐性遺伝子の検出および／または同定のための配
    列番号2148、2149、catIII耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番
    号2151、2152、catP耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2154
    、2155、cat耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2157、2158
    、2160、2161、ppflo様耐性遺伝子の検出および／または同定のための配列番号2
    163、2164。
  24. 【請求項２４】 少なくとも12ヌクレオチド長さを有し、下記の配列番号に
    より規定されるtuf配列の任意の1つのヌクレオチド配列とハイブリダイゼーショ
    ンすることができる核酸：1−73、75−241、399−457、498−529、612−618、62
    1−624、675、677、717−736、779−792、840−855、865、868−888、897−910
    、932、967−989、992、1266−1287、1518−1526、1561−1575、1578−1580、16
    62−1664、1666−1667、1669−1670、1673−1683、1685−1689、1786−1843、18
    74−1881、1956−1960、2183−2185、2187−2188、2193−2201、2214−2249、22
    55−2272。
  25. 【請求項２５】 少なくとも12ヌクレオチド長さを有し、下記の配列番号に
    より規定されるatpD配列の任意の1つのヌクレオチド配列とハイブリダイゼーシ
    ョンすることができる核酸：242−270、272−398、458−497、530−538、663、6
    67、673、674、676、678−680、737−778、827−832、834−839、856−862、866
    −867、889−896、929−931、941−966、1245−1254、1256−1265、1527、1576
    −1577、1600−1604、1638−1647、1649−1660、1671、1684、1844−1848、1849
    −1865、2189−2192。
  26. 【請求項２６】 少なくとも12ヌクレオチド長さを有し、下記の配列番号に
    より規定されるrecA配列の任意の1つのヌクレオチド配列とハイブリダイゼーシ
    ョンすることができる核酸：990−991、1003、1288−1289、1714、1756−1763、
    1866−1873および2202−2212。
  27. 【請求項２７】 少なくとも12ヌクレオチド長さを有し、下記の配列番号に
    より規定される抗菌剤耐性遺伝子の任意の1つのヌクレオチド配列と選択的にハ
    イブリダイゼーションすることができる核酸：1004−1075、1255、1607−1608、
    1648、1764−1785、2013−2014、2056−2064、2273−2280。
  28. 【請求項２８】 請求項24〜27のいずれか一項に記載の核酸の核酸配列。
  29. 【請求項２９】 少なくとも12ヌクレオチド長さを有し、下記の配列番号に
    より規定される抗菌剤耐性遺伝子の任意の1つのヌクレオチド配列とハイブリダ
    イゼーションすることができる核酸の微生物種を検出および同定するための使用
    ：1607−1608、1648、1764−1785、2013−2014、2056−2064、2273−2280。
  30. 【請求項３０】 少なくとも12ヌクレオチド長さを有し、下記の配列番号に
    より規定されるトキシン遺伝子の任意の1つのヌクレオチド配列とハイブリダイ
    ゼーションすることができる核酸の微生物種を検出および同定するための使用：
    1078−1085、2012および2123−2128。
  31. 【請求項３１】 任意のスタヒロコッカス（Staphylococcus）種の核酸をプ
    ライマー配列番号1179、1181および1182の任意の組合わせで増幅することによっ
    てつくられた、ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（Streptoc
    occus pneumoniae）の検出および／または同定に使用するhexA核酸のレパート
    リー。
  32. 【請求項３２】 配列番号1184〜1191により規定されるヌクレオチド配列を
    有する核酸を含んでなる、請求項31に記載のレパートリー。
  33. 【請求項３３】 請求項31または32に記載のレパートリーに由来する核酸配
    列のレパートリー。
  34. 【請求項３４】 請求項31に記載のレパートリーに由来する、ストレプトコ
    ッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（Streptococcus pneumoniae）の特異
    的および偏在的検出および同定に使用する核酸。
  35. 【請求項３５】 前記任意のストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ
    球菌］（Streptococcus pneumoniae）および配列番号1184〜1187の任意の1つと
    ハイブリダイゼーションすることができる、少なくとも12ヌクレオチドの核酸配
    列を有する、請求項34に記載の核酸。
  36. 【請求項３６】 ストレプトコッカス・ニゥモニエ［肺炎レンサ球菌］（St
    reptococcus pneumoniae）の核酸および配列番号1179、1180、1181、1182の任
    意の1つとハイブリダイゼーションすることができる、少なくとも12ヌクレオチ
    ドの核酸配列を有する、請求項34に記載の核酸。
  37. 【請求項３７】 請求項1、31または32に記載の方法から得られたレパート
    リーの核酸、または請求項24〜27、35および36のいずれか一項に記載の核酸の翻
    訳から誘導されたペプチド。
  38. 【請求項３８】 請求項37に記載ののペプチドに由来するペプチド配列。
  39. 【請求項３９】 請求項1、31または32に記載の方法から、または請求項24
    〜27、35および36のいずれか一項に記載の核酸から得られた核酸を含んでなる組
    換えベクター。
  40. 【請求項４０】 発現ベクターである、請求項39に記載の組換えベクター。
  41. 【請求項４１】 請求項39または40に記載の組換えベクターを含んでなる組
    換え宿主細胞。
  42. 【請求項４２】 前記微生物に対して有効である治療剤を設計するための、
    請求項38または33に記載の核酸配列または請求項2に記載の方法から得られた核
    酸配列の使用および前記核酸配列から推定されたタンパク質の使用。
  43. 【請求項４３】 前記治療剤が抗菌剤、ワクチンまたは遺伝子治療剤である
    、請求項42に記載の使用。
  44. 【請求項４４】 工程： a） 微生物のtuf、atpD、および／またはrecA遺伝子の核酸配列を獲得し、そ
    して b） 前記核酸配列を請求項5に記載のバンクの核酸配列と比較し、前記レパー
    トリーは前記微生物の核酸から得られた核酸配列を含んでなり、これにより前記
    比較により前記配列が合致したとき、前記微生物が同定される、 を含む、試験試料中の微生物を同定する方法。
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