CN113520898B

CN113520898B - 水蛭肽he-d在护肤美白中的应用

Info

Publication number: CN113520898B
Application number: CN202111090304.8A
Authority: CN
Inventors: 宋淑亮; 陈锚; 王珂; 赵延霞; 马士玉; 刘云飞
Original assignee: Weihai Institute Of Industrial Technology Shandong University; Huitai Bohai Fisheries Co ltd
Current assignee: Bohai Aquatic Food Shandong Co ltd; Weihai Institute Of Industrial Technology Shandong University
Priority date: 2021-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-09-17
Also published as: CN113520898A

Abstract

本发明涉及护肤品领域，具体而言，提供了一种水蛭肽HE‑D在护肤美白中的应用。本发明提供水蛭肽HE‑D的如下用途：抑制酪氨酸酶活性、抑制细胞黑色素生成、美容美白，以及精华液、爽肤水或润肤乳。HE‑D作为多肽，稳定性好，并且对细胞的毒性弱，作为天然活性肽，易于被人体吸收，抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成的效率高，可广泛应用于护肤品的相关领域，可以作为科学研究目的的试剂使用。

Description

水蛭肽HE-D在护肤美白中的应用

技术领域

本发明涉及护肤品领域，具体而言，涉及一种水蛭肽HE-D在护肤美白中的应用。

背景技术

在经济高度发展的今天，人们更加注重对自己皮肤进行养护。拥有白皙光滑的皮肤也成为了许多人的梦想，对美白类护肤品的追求也越来越多。黑色素是美白最大的敌人，但它也是一种广泛存在在动物皮肤或者毛发中的色素，产生黑色素的细胞叫做“色素母细胞”。色素母细胞会分泌麦拉宁色素。麦拉宁色素被紫外线照射后会激活酪氨酸酶。酪氨酸酶与血液中的酪氨酸反应，生成多巴、多巴醌。最后经氧化释放出黑色素。

现在最主流的美白成分，是通过降低酪氨酸酶的活性，或者还原“多巴”阻止黑色素生成。目前被证明有效的可以降低酪氨酸酶活性的成分有：曲酸、鞣花酸、杜鹃花酸、熊果苷等。对于已经生成的黑色素，或者组织黑色素转移至角质层（常见有效成分是VB3），或者加速黑色素代谢(水杨酸，果酸等)。抗坏血酸是一种被广泛应用的皮肤增白剂，但会快速发生氧化还原反应而失效。熊果苷具有高度光敏感性、不稳定，添加在美白化妆品中易变色。总之这一类化学美白剂的缺陷都大大影响了产品的美白效果及外观。因此，寻找天然、无毒且稳定高效的新型酪氨酸酶抑制剂具有重要的意义。活性肽天然、安全、高效、易于人体吸收，具有良好的皮肤美白功效。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供水蛭肽HE-D的应用。

本发明的第二目的在于提供一种精华液、爽肤水，以及润肤乳及其制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

水蛭肽HE-D在如下（a）-（d）任一种的应用：

（a）抑制酪氨酸酶活性；

（b）抑制细胞黑色素生成；

（c）美容美白；

（d）精华液、爽肤水或润肤乳；

其中，水蛭肽HE-D的氨基酸序列如EAGSAKELEGDPVAG（SEQ ID NO.1）所示。

进一步地，水蛭肽HE-D的浓度为0-0.4 mg/ml，同时不包括0。

进一步地，（a）中水蛭肽HE-D的浓度为0.015-0.15 mg/ml。

进一步地，（b）中水蛭肽HE-D的浓度为0.1-0.2 mg/ml。

进一步地，d）中用于制备精华液、爽肤水或润肤乳的水蛭肽HE-D的性状包括颗粒状、粉末状或溶于水的液态状。

一种精华液，由以下组分构成：质量比为96:（3-5）:（0.2-0.5）的1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、海藻糖和杰马BP，其中，水蛭肽HE-D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种爽肤水，由以下组分构成：质量比为6:（1.5-2）:（25-28）:（0.3-0.7）：（65-66）的20%维生素原B5、24小时保湿因子、1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、杰马BP和水，其中，水蛭肽HE-D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种润肤乳，由以下组分构成：

油相：质量比为7:（3-5）:（5-7）:（1-3）的橄榄乳化蜡、霍霍巴油、葡萄籽油和油溶维生素E；

水相：蒸馏水，水相与油相的质量比为60:（16-22）；

添加成分：质量比为38:（4-6）:（2-4）:（0.5-0.7）的1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、40%氨基酸保湿剂、24小时保湿因子和杰马BP，其中，水蛭肽HE-D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

润肤乳的制备方法，包括如下步骤：先将油相加热至78-82℃，完全融化后倒入温度相同的水相中，混合至出现乳状，再降温到38-40℃，接着加入添加成分，混合乳化得到润肤乳。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供水蛭肽HE-D的如下用途：抑制酪氨酸酶活性、抑制细胞黑色素生成、美容美白，以及精华液、爽肤水或润肤乳。发明人在研发工作中意外发现从水蛭中提取的水蛭肽HE-D可以抑制酪氨酸酶活性，并且抑制细胞的黑色素生成，而目前水蛭肽HE-D的已知作用却为抑制巨噬细胞迁移活性、预防动脉粥样硬化。同时，HE-D作为多肽，稳定性好，并且对细胞的毒性弱，作为天然活性肽，易于被人体吸收，抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成的效率高，可广泛应用于护肤品的相关领域，可以作为科学研究目的的试剂使用。

含有该水蛭肽HE-D的护肤品，精华液、爽肤水和润肤乳，具有美白效果，安全性好，性状稳定，有效期长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中细胞毒性试验结果；

图2为实施例2中水蛭肽HE-D细胞黑色素抑制合成实验结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

发明人在研发工作中意外发现从水蛭中提取的水蛭肽HE-D可以抑制酪氨酸酶活性，并且抑制细胞的黑色素生成，而目前水蛭肽HE-D的已知作用却为抑制巨噬细胞迁移活性、预防动脉粥样硬化。

基于此，本发明提出水蛭肽HE-D的如下用途：

（a）抑制酪氨酸酶活性；

（b）抑制细胞黑色素生成；

（c）美容美白；

（d）精华液、爽肤水或润肤乳；

需要说明的是，水蛭肽HE-D可通过固相全合成技术制备得到。

本发明提供的水蛭肽HE-D用于机体时，有效含量至少在0.4 mg/ml时对细胞不存在毒性。

水蛭肽HE-D浓度在0.015-0.15 mg/ml范围内均可对酪氨酸酶的活性起到抑制，这种抑制作用随着水蛭肽HE-D浓度的增加而显著增强，当水蛭肽HE-D浓度为0.12 mg/ml时，抑制率高达46.78%。

水蛭肽HE-D浓度在0.1-0.2 mg/ml范围内均可对黑色素的合成起到有效抑制，这种抑制作用随着水蛭肽HE-D浓度的增加而显著增强，当水蛭肽HE-D浓度为0. 2 mg/ml时，抑制率高达45.17%。

由于水蛭肽HE-D具有酪氨酸酶活性抑制和抑制黑色素合成的作用，所以，其具有美白活性，而且美白活性较好，稳定性强，天然易吸收，所以可以用于护肤品中，具有活性高、生物相容性好、安全无毒副作用等优点，护肤品例如可以为润肤乳、面霜、爽肤水、精华液、洗面奶或面膜等等。

可以将水蛭肽HE-D制备成颗粒状、粉末状或溶于水的液态状，将其作为原料用于护肤品的生产，满足不同类型护肤品生产需求。

同时，本申请提供含有水蛭肽HE-D的如下护肤品：

一种精华液，由以下组分构成：质量比为96:（3-5）:（0.2-0.5）的1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、海藻糖和杰马BP。

一种爽肤水，由以下组分构成：质量比为6:（1.5-2）:（25-28）:（0.3-0.7）：（65-66）的20%维生素原B5、24小时保湿因子、1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、杰马BP和水。

一种润肤乳，由以下组分构成：

水相：蒸馏水，水相与油相的质量比为60:（16-22）；

添加成分：质量比为38:（4-6）:（2-4）:（0.5-0.7）的1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、40%氨基酸保湿剂、24小时保湿因子和杰马BP。

氨基酸保湿剂化学名为三甲基甘氨酸（trimethylglycine），是一种天然结构物质两性离子型保湿成分，广泛应用于个人护理产品中。

24小时保湿因子，又名天然保湿因子（natural moisturizing factor，NMF），包括透明质酸、胶原蛋白、氨基酸和维生素B6中的至少一种，广泛应用于化妆品领域，具有保湿功效。

润肤乳的制备方法如下：先将油相加热至78-82℃，完全融化后倒入温度相同的水相中，混合至出现乳状，再降温到38-40℃，接着加入添加成分，混合乳化得到润肤乳。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1 酪氨酸酶抑制活性检测

（1）不同浓度的水蛭肽HE-D溶液对酶的活性抑制作用

水蛭肽HE-D配制五个不同浓度梯度的溶液(0.0075 mg/ml，0.015 mg/ml，0.03mg/ml，0.06 mg/ml，0.12mg/ml)。向A、B、C、D试管中分别加入PBS、酪氨酸酶溶液、水蛭肽HE-D，具体添加信息如下。先置25℃恒温水浴10 min 后，立刻添入2w/v% L-Dopa 溶液1 mL，混匀。再25 ℃恒温水浴5 min 后，立刻于475 nm 处测吸光度。各组重复一次。

A：2 mL PBS+1 mL 酪氨酸酶溶液；

B：3 mLPBS；

C：1 mL 样品溶液+1 mL PBS+1 mL 酪氨酸酶溶液；

D：1 mL样品溶液+2 mL PBS；

酪氨酸酶活性抑制率（%）=[(A-B)-(C-D)]×100/(A-B)；

A为不加样品的加酶混合液；B未加样品和酶的提取液；C为加样品和酶的混合液；D加样品而未加酶的混合液。

不同浓度水蛭肽HE-D溶液的检测作3组平行试验，结果如下表1所示。

上述数据结果表明，水蛭肽HE-D具有较好的酪氨酸酶抑制作用，且其抑制作用与肽的浓度有关。实验中，水蛭肽HE-D对酪氨酸酶的抑制作用随着其自身浓度的下降而下降，其抑制率由46.78%降低至0.58%。在0.0075mg/ml时，抑制活性基本丧失。

（2）不同含量的维生素c溶液对酶的活性抑制作用

参照（1）中的检测方法检测0.2 mg/ml、0.1 mg/ml、0.05 mg/ml、0.025 mg/ml和0.0125 mg/ml的维生素C溶液对酪氨酸酶的活性抑制率，结果如下表2所示。

上述数据表明维生素c对酪氨酸酶具有很好的抑制作用。浓度为0.2mg/ml的维生素c抑制率高达98.8%。以0.1mg/ml的维生素c溶液为阳性对照，实验组中水蛭肽HE-D最高达到了46.78%，说明了水蛭肽HE-D具有较好酪氨酸酶抑制作用。

活性肽HE-D能够高效抑制酪氨酸酶的活性，因此可作为美白功能成分用于化妆品中，具有良好的应用前景。

实施例2抑制黑色素的合成

1、MTT法检测水蛭肽HE-D对B16黑色素瘤细胞的毒性

（1）细胞培养：细胞密度为10⁵/ml，每孔100μl细胞悬液，边缘孔100μl的PBS。

（2）加药处理：分别加入25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL的水蛭HE-D，设置5个复孔，并设置一组空白对照。

（3）MTT法：避光条件下，每孔10μlMTT。培养箱培养二十四小时后，吸净培养液，每孔加入100μl DMSO。酶标仪570nm处测量OD值，计算细胞存活率。结果如图1所示，结果表明在测试浓度0-400μg/ml范围内，水蛭肽HE-D在24h内对B16细胞没有毒性。

2、NaOH裂解法测定B16黑色素瘤细胞内的黑色素含量

（1）细胞培养：用含有10%（v/v）胎牛血清的1640培养基培养B16细胞，将细胞密度为5×10⁵/ml，处于对数生长期的B16细胞接种于6孔板中，37℃、5%CO₂培养。

（2）加药：实验被分为六组：空白组，Vc阳性对照组，给药组（水蛭肽HE-D溶液200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL）。细胞培养12h后弃掉培养基，空白组正常更换培养基，阳性对照组加入100μg/mL Vc，给药组分别加入水蛭肽HE-D溶液200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL培养72h。

（3）取样：72h后，弃上清液，PBS洗涤，每孔加入0.25%胰酶0.5ml消化细胞1.5min，加2ml含0.4%FBS的维持液终止消化，分别计数每组细胞。细胞悬液离心弃上清，沉淀中加入1mol/L NaOH溶液，80℃加热30min。

（4）检测：分光光度计检测475nm的吸光度

黑色素合成量=药物孔（或对照孔）吸光度值/药物孔细胞数*100%。

实验结果如图2所示，以0.10mg/ml的维生素c溶液为阳性对照，实验组中水蛭肽HE-D最高达到了45.17%，说明了水蛭肽HE-D具有较好抑制黑色素合成的作用。

实施例3 精华液

按照表3中配方，搅拌使配方中物料溶解均匀，装瓶即得。

实施例4 爽肤水

按照表4中配方，搅拌使配方中物料溶解均匀，装瓶即得。

实施例5 润肤乳

按照表5中配方，首先将油相水浴加热至80℃，搅拌使物料完全融化，待用。同样将水相加热至80℃待用。

趁热将油相倒入水相，不停搅拌出现乳状，直至温度降到40℃。

分次把添加成分多次加入已经搅拌乳化的试样，每加一次都要搅拌均匀充分乳化，直至加完。待温度降至室温后，静置，装瓶即得。

表5、水蛭肽HE-D润肤乳

油相：

水相：蒸馏水60g。

添加成分：

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

序列表

<110> 汇泰渤海水产有限责任公司

山东大学威海工业技术研究院

<120> 水蛭肽HE-D在护肤美白中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Ala Gly Ser Ala Lys Glu Leu Glu Gly Asp Pro Val Ala Gly

1 5 10 15

Claims

1.水蛭肽HE-D在如下（a）-（d）任一种的应用：

（a）制备抑制酪氨酸酶活性组合物，水蛭肽HE-D的浓度为0.015-0.15 mg/ml；

（b）制备抑制细胞黑色素生成组合物，水蛭肽HE-D的浓度为0.1-0.2 mg/ml；

（c）制备美容美白组合物，水蛭肽HE-D的浓度为0.015-0.2 mg/ml；

（d）精华液、爽肤水或润肤乳，水蛭肽HE-D的浓度为0.015-0.2 mg/ml；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，（d）中用于制备精华液、爽肤水或润肤乳的水蛭肽HE-D的性状包括颗粒状、粉末状或溶于水的液态状。

3.一种精华液，其特征在于，由以下组分构成：质量比为96:（3-5）:（0.2-0.5）的1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、海藻糖和杰马BP，其中，水蛭肽HE-D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，水蛭肽HE-D的浓度为0.015-0.2 mg/ml。

4.一种爽肤水，其特征在于，由以下组分构成：质量比为6:（1.5-2）:（25-28）:（0.3-0.7）：（65-66）的20%维生素原B5、24小时保湿因子、1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、杰马BP和水，其中，水蛭肽HE-D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，水蛭肽HE-D的浓度为0.015-0.2 mg/ml。

5.一种润肤乳，其特征在于，由以下组分构成：

水相：蒸馏水，水相与油相的质量比为60:（16-22）；

添加成分：质量比为38:（4-6）:（2-4）:（0.5-0.7）的1w/v%水蛭肽HE-D水溶液、40%氨基酸保湿剂、24小时保湿因子和杰马BP，其中，水蛭肽HE-D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，水蛭肽HE-D的浓度为0.015-0.2 mg/ml。

6.权利要求5所述润肤乳的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：先将油相加热至78-82℃，完全融化后倒入温度相同的水相中，混合至出现乳状，再降温到38-40℃，接着加入添加成分，混合乳化得到润肤乳。