CN107253977B

CN107253977B - 抑制黑色素生成抗氧化的小肽、制备方法及其应用

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Publication number: CN107253977B
Application number: CN201710529205.2A
Authority: CN
Inventors: 于海宁; 冯兰; 王义鹏
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2037-07-03
Also published as: CN107253977A

Abstract

本发明涉及一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽、制备方法及其应用，包括短肽Ansin‑2和短肽Magin‑2，属于生物医学技术领域。两种短肽具有强抗氧化性，能够抑制酪氨酸酶的活性，显著减少黑色素生成，同时还具有分子量小、结构简单、无细胞毒性、无溶血活性、高组织渗透性、制备方法简单等特点。可用于制备抗氧化、抗黑色素生成、淡化色斑的美容护肤品新原料，也可用作制备抗氧化药物、食品添加剂等，具有很好的应用前景。

Description

抑制黑色素生成抗氧化的小肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽、制备方法及其应用，属于生物医药及化妆品技术领域。

背景技术

东方女性历来崇尚“肤如雪，凝如脂”的美白效果，人们一向追求白皙、洁润的肌肤。因此，具有抑制由太阳光线及其他原因引起的色斑、色素沉着的美白剂的研究与开发，一直是化妆品行业关注的焦点。

紫外线引起的皮肤色素沉着主要在角质细胞和黑色素细胞中发生，紫外辐射引发角质细胞DNA损伤，p53上调，最终导致角质细胞α-MSH(α-melanocyte stimulatinghormone)的分泌量增加，当α-MSH与黑色素细胞膜上的MC1R(melanocortin 1receptor)结合后，会激活腺苷酸环化酶产生胞内第二信使环腺苷cAMP，环腺苷酸随后激活PKA(proteinkinase A)，后者通过CREB(cAMP-responsive element binding protein)的磷酸化，从而激活MITF(microphthalmia-associated transcription factor)基因的表达。最后，MITF有效激活与黑色素形成相关蛋白酶的表达，最终促进黑色素的形成。MITF参与黑色素细胞的生存、增殖、分化，是调节黑色素形成的重要调控因子。通过与启动子的结合来调节TYR(tyrosinase)、TRP-1(tyrosinase-related protein1)和TRP-2(tyrosinase-relatedprotein 2)的基因表达。

黑色素的合成是一系列复杂的酶促氧化反应，以酪氨酸或多巴为底物，在酪氨酸酶的催化作用下氧化生产多巴醌，此氧化反应过程是黑色素合成中的关键限速反应，酪氨酸酶的过量表达是导致色素沉着过度的主要原因。因此，抑制该氧化反应或酪氨酸酶的活性可以阻断黑色素的生物合成反应链，减少黑色素的生成，实现美白的效果。近年来，越来越多的化合物被证实能够有效抑制酪氨酸酶的活性，它们被称为酪氨酸酶抑制剂，如曲酸、熊果苷、维生素C衍生物以及一些天然提取物质。但是，维生素C不稳定，不易被皮肤吸收，难以广泛应用；熊果苷是一种含酚基的化合物，虽然安全但对酪氨酸酶的抑制效应缓慢，且吸光性好不适合白天使用；曲酸的美白祛斑效果显著但是具有一定的毒性，不能长期使用。

天然肽类原料具有安全、无毒、高细胞渗透性、高效能、短序列等优点，添加到化妆品中能够从根本上改善、修复皮肤出现的各种问题，特别在保湿、美白、抗皱、抗氧化、抗衰老等方面功效显著。因此，研发一种高效、安全的多肽美白剂，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽、制备方法及其应用。

本发明的技术方案：

一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽，包括短肽Ansin-2和短肽Magin-2；

(1)短肽Ansin-2：一种直链小肽，分子量为971.76Da，等电点是9.00，含有8个氨基酸残基，全序列的一级结构为:Thr-Arg-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Ser；

(2)短肽Magin-2：一种直链小肽，分子量为971.76Da，等电点是9.00，含有8个氨基酸残基，全序列的一级结构为:Phe-Arg-Thr-Cys-Arg-Ser-Val-Cys。

一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽的制备方法，首先，根据小肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成小肽的全序列；再通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％；最后，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定小肽的分子量。

一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽用于制备抗氧化、抗黑色素生成、淡化色斑的美容护肤品。

一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽用作制备抗氧化药物、食品添加剂。

本发明的有益效果在于：本发明提供的一种具有皮肤美白功效的多肽组合物，两种短肽：Ansin-2和Magin-2。该两种短肽具有极强的抗氧化活性，DPPH的清除率高达97.35％；并且具有极强的酪氨酸酶抑制活性，半抑制浓度(IC₅₀)低至54.77μM，而熊果苷的半抑制浓度为922.6μM，能够抑制黑色素的生成，有助于提亮肤色，达到淡化色斑、改善暗哑、增白肤质的目的；并通过MTT法和溶血试验测定多肽的毒性，结果显示该组多肽的毒性极低，即使加药浓度高达160μg/ml，溶血率也不超过1％。并且该组短肽分子量小、结构简单、无细胞毒性、无溶血活性、高组织渗透性、制备方法简单。可用于制备抗黑色素生成、淡化色斑，美白抗氧化美容护肤品新原料，也可用作制备抗氧化药物、食品添加剂，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是Ansin-2和Magin-2对B16细胞的细胞毒性图。

图中：

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1

Ansin-2、Magin-2的化学合成：

(1)Ansin-2、Magin-2的化学合成方法：根据短肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成二者的全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。

(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。

(3)纯化的Ansin-2、Magin-2用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

Ansin-2、Magin-2是直链超短肽，其中，Ansin-2分子量为971.76Da，等电点是9.00，含有8个氨基酸残基，全序列的一级结构为:Thr-Arg-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Ser；Magin-2分子量为971.76Da，等电点是9.00，含有8个氨基酸残基，全序列的一级结构为:Phe-Arg-Thr-Cys-Arg-Ser-Val-Cys。

实施例2

Ansin-2和Magin-2抗氧化活性测定：

(1)DPPH自由基清除活性(DPPH radical scavenging assay)

称取一定量的DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate，Sigma，美国)，用甲醇溶解，配成6×10^-5M的溶液，现配现用。将48μl DPPH溶液和2μl样品(2mg/ml)混合(最终样品与DPPH的质量比为3:1)，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。

DPPH·清除率(％)＝(AB－AA)/A B×100(AB:空白对照组吸光值；AA:样品组吸光值)。

(2)ABTS^·+自由基正离子清除活性

ABTS(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用PBS缓冲液(pH7.4)配成2mM的ABTS储存液。将ABTS储存液和70mM过硫酸钾(K₂S₂O₈)水溶液按体积比250:1混合，于室温避光放置15-16h。试验开始前，将ABTS^·+释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将4μl不样品和96μl上述校正过的ABTS^·+溶液混合，室温放置10min后，于734nm波长处检测反应液的吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行。

ABTS^·+清除率I(％)＝(AB－AA)/AB×100(AB:空白对照组吸光值；AA:样品组吸光值)。

(3)还原力测定

10μl样品(2mg/ml)与50μl磷酸钠缓冲液以及50μl 1％K₃Fe(CN)₆混合，50℃水浴20min；然后加入50μl 10％的三氯乙酸，3000rpm离心10min；取上清50μl，加入50μl去离子水和10μl 1％FeCl₃。于700nm测光吸收。光吸收越强表示还原力越强。

表1.Ansin-2和Magin-2体外抗氧化活性

结果如表1所示，Ansin-2和Magin-2具有极强的抗氧化活性。

实施例3

酪氨酸酶半抑制浓度IC₅₀值的测定：

酪氨酸酶活性抑制实验以L-DOPA为反应底物，检测酪氨酸酶催化后的底物有色物质多巴醌于475nm处的吸光度，间接反映样品对酪氨酸酶的抑制活性。

采用100μL的反应体系，先后加入磷酸盐缓冲液、不同浓度样品(10、25、50、100、200μM)及蘑菇酪氨酸酶加入后于37℃中保温10min，再加入底物，于37℃反应10min，测定475nm波长的OD值。根据测得的OD值计算蘑菇酪氨酸酶相对活性抑制率:抑制率(％)＝(1－实验组OD值/对照组OD值)×100％。

数据采用SPSS软件计算各物质的半抑制浓度IC₅₀。

表2.Arbutin，Ansin-2和Magin-2的IC₅₀值

结果表明，样品Ansin-2和Magin-2的半抑制浓度分别为54.77和85μM，而常用的酪氨酸酶抑制剂熊果苷的半抑制浓度为922.6μM，说明两个样品具有极强的抑制酪氨酸酶的能力，可以减少黑色素的生成，将其应用在化妆品添加剂中，可以提高化妆品的美白效果，具有很好的应用前景。

实施例4

Ansin-2和Magin-2细胞毒性测定：

用MTT法检测样品Ansin-2和Magin-2对小鼠黑色素瘤B16的细胞毒性。

先将细胞于含有10％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/ml)的DMEM中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶消化下来，用上述培养基洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将细胞悬浮液100μl加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数为10³个。过夜待细胞贴壁后，吸出培养基，加入含不同浓度样品的完全培养基，对照组加入相同体积的完全培养基，置37℃、5％CO₂培养箱内培养72h(中途换液一次)。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液(用PBS缓冲液配制)，继续培养4h后,吸出孔中液体，每孔加入150μl DMSO，摇床振荡10min。酶标仪检测光吸收，测定波长为490nm，参考波长630nm。

结果如图1所示，结果表明，样品Ansin-2和Magin-2浓度为160μg/ml时的细胞存活率仍可高达90％，说明样品Ansin-2和Magin-2不具有细胞毒性，对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其在美白化妆品添加剂领域进一步的开发应用。

实施例5

Ansin-2和Magin-2溶血活性测定：

将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液分别与溶解于生理盐水的Ansin-2和Magin-2样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比：H％＝(A_样品-A_阴性对照)/A_阳性对照×100％。

表3.Ansin-2和Magin-2的溶血率(％)

结果表明样品Ansin-2和Magin-2浓度为160μg/ml时的溶血百分比均不超过1％，低于熊果苷的溶血率。说明Ansin-2和Magin-2都不具有的溶血活性，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在美白化妆品添加剂领域进一步的开发应用。

Claims

1.一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽，包括短肽Ansin-2和短肽Magin-2，其特征在于：

所述的短肽Ansin-2：一种直链小肽，分子量为971.76Da，等电点是9.00，含有8个氨基酸残基，全序列的一级结构为:Thr-Arg-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Ser；

所述的短肽Magin-2：一种直链小肽，分子量为971.76Da，等电点是9.00，含有8个氨基酸残基，全序列的一级结构为:Phe-Arg-Thr-Cys-Arg-Ser-Val-Cys。

2.权利要求1所述的一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽的制备方法，其特征在于，首先，根据小肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成小肽的全序列；再通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％；最后，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定小肽的分子量。

3.根据权利要求1所述的一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽用于制备抗氧化、抗黑色素生成、淡化色斑的美容护肤品。

4.权利要求1所述的一组抑制黑色素生成抗氧化的小肽用作制备抗氧化药物、食品添加剂。