JP6348890B2 - 分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤 - Google Patents
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Description
収穫後、凍結保存されたオオボウシバナ(青花)およびオオボウシバナの変種体(白花)のそれぞれの花弁1kgを、2Lの50%エタノールに浸漬し、4℃の冷蔵庫に1週間保持し、ろ過し、それぞれの50%エタノールエキス原液を得た。それぞれのエキス原液は、メタノールで吸着担体を洗浄し、水に置換したDiaion HP−20(三菱化学(株)製)が加えられ、溶媒が留去され、吸着担体に吸着された。吸着担体をクロマト管内に移し、溶出溶媒として水、50%エタノール、100%エタノールの順に加え、それぞれの溶出成分を得た。これらのうち、水分画のみ、溶媒留去し、次いで、凍結乾燥した。乾燥粉末として、それぞれ17.5gのオオボウシバナの抽出物(非フラボノイド成分)を得た。
得られたオオボウシバナ(青花)の抽出物を、非フラボノイド成分の濃度が250(μg/mL)となるよう精製水で希釈し、実施例1の分解抑制剤を調製した。
非フラボノイド成分の濃度が500(μg/mL)となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例1と同様の方法により、実施例2の分解抑制剤を調製した。
非フラボノイド成分の濃度が1000(μg/mL)となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例1と同様の方法により、実施例3の分解抑制剤を調製した。
得られたオオボウシバナの変種体(白花)の抽出物を、非フラボノイド成分の濃度が250(μg/mL)となるよう精製水で希釈し、実施例4の分解抑制剤を調製した。
非フラボノイド成分の濃度が500(μg/mL)となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例1と同様の方法により、実施例5の分解抑制剤を調製した。
非フラボノイド成分の濃度が1000(μg/mL)となるよう希釈濃度を変更した以外は、実施例1と同様の方法により、実施例6の分解抑制剤を調製した。
MMP−1酵素(Human recombinant MMP−1 in E.coli(リコンビナント)(sigma社製))、および、基質(MOCAc−Pro−Leu−Gly−Leu−A2pr(Dnp)−Ala−Arg−NH2(ペプチド研究所(株)製)を準備した。これらは、TNCBバッファー(50mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.05% Briji−35、pH7.5)で適宜希釈した。まず、試料溶液50μLに、酵素溶液を100μL添加し、37℃で10分間、遮光下でインキュベートし、その後、基質溶液50μLを添加し、37℃遮光下でさらに60分間インキュベートした。終了後、速やかに蛍光光度計で励起波長320nm、蛍光波長405nmにて蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を元に、阻害率(%)=100−[(A−B)/(C−D)]×100
A:被験溶液の405nmにおける蛍光強度
B:被験溶液ブランクの405nmにおける蛍光強度
C:対照溶液の405nmにおける蛍光強度
D:対照溶液ブランクの405nmにおける蛍光強度
の式に従い、MMP−1活性阻害効果(阻害率(%))を算出した。なお、ブランク(比較例1)の分解抑制剤として、非フラボノイド成分を含まないTNCBバッファーを用いた。
60mmディッシュに正常ヒト真皮線維芽細胞(NHDF)(クラボウ(株)製)を6.3×104cells/cm2の密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩培養した。その後、PBS(−)で2回洗浄し、0.5%のTriton X−100を325μLずつ添加して室温で30分間放置し細胞を溶解させた。細胞溶解液を回収し、15秒間の超音波破砕を2回行い、粗酵素抽出液とした。培地には、5%ウシ血清(FBS)含有ダルベッコ変性イーグル(DMEM)(日水製薬(株)製)培地を用いた。N−サクシニル−Ala−Ala−Ala−p−ニトロアニリドをジメチルスルホキシド(DMSO)で0.1Mとなるように溶解し、0.1MのTris−HCl(pH8.0)で5mMに希釈したものを基質溶液とした。96ウェルプレートを用い、試料溶液50μLに粗酵素溶液を50μL添加した後、基質溶液100μLを添加し、37℃で2時間インキュベートした。反応終了後、速やかに分光光度計にて405nmの吸光度を測定した。エラスターゼ活性阻害率は次式で算出した。なお、ブランク(比較例2)の分解抑制剤として、酵素溶液の代わりに0.5%Triton X−100を50μL添加した以外は同様の方法により調製し、エラスターゼ活性阻害効果を確認した。
阻害率(%)=100−[(A−B)/(C−D)]×100
A:被験溶液の405nmにおける吸光度
B:被験溶液ブランクの405nmにおける吸光度
C:対照溶液の405nmにおける吸光度
D:対照溶液ブランクの405nmにおける吸光度
(培養)
24ウェル マイクロプレートにNHDFを1.2×106cells/cm2の密度で播種し、5%CO2、37℃で24時間培養後、サンプル添加培地交換を行った。培地交換の際にはPBS(−)で2回洗浄し、適量のFBSもしくはウシ血清アルブミン(BSA)を含有させたものに置き換え、さらに24〜48時間培養した。MMPs産生誘導はIL−1α(sigma:I2778)を添加した。培地には、1%FBS含有DMEM培地を用いた。
(タンパク質抽出方法)
各ウェルより培地上清を回収し、等量の2×サンプルバッファー(125mMのTris−HCl(pH8.8)、20%グリセロール、4%SDS、0.01%ブロモフェノールブルー、200mM DTT(ジチオスレイトール))を加え、98℃で15分間煮沸した。なお、標準化を行うため細胞のタンパク定量を行った。ウェルの培地を除去し、PBS(−)で2回洗浄、除去後2%SDSを200μL加え、ピペットで回収し、15秒間、2回、超音波破砕し、BCA Protein Assay Kit(Thermo scientific社製)を用いて定量した。
(SDS−PAGE)
10%アクリルアミドゲル(分離ゲル:10%ポリアクリルアミド(BioRad社製)、0.375MのTris−HCl(pH8.8)、0.1%のSDS(ラウレス硫酸ナトリウム)、0.033%のAPS(過硫酸アンモニウム)および0.05%のTEMED(N,N,N’,N’−テトラメチルエタン−1,2−ジアミン)、濃縮ゲル:4.75%のポリアクリルアミド、0.125MのTris HCl(pH6.8)、0.1%のSDS、0.033%のAPSおよび0.05%のTEMED)を用いた。2枚のガラス板にランニングゲルとスタッキングゲルを重層し、10%アクリルアミドゲルとした。泳動は、SDS−PAGEバッファー(25mM Tris、192mM グリシン、0.1% SDS)を用い、定電流20mAで90分間行った。
(ブロッティング)
タンク式のブロッティング装置を用い、定電流200mAで2時間転写した。転写にはトランスファーバッファー(124mMのTris、30mMのGlycine、0.01%のSDSおよび20%MeOH)を用い、PVDF膜(GE Healthcare社製)に転写した。
(抗体反応および検出)
1次抗体として、抗MMP−1抗体(abcam:EP1247Y、R&D:AF901)、抗MMP−3抗体(abcam:EP1186Y)を用いた。2次抗体として、抗ウサギIgG−HRP(GE Healthcare:NA934)および抗ヤギIgG−HRP(santa cruz:2033)を用いた。抗体検出試薬はECL prime(GE Healthcare社製)を用いた。
次に、本発明の分解抑制剤を用いた処方例を例示する。これら分解抑制剤は、いずれも常法により調製することができる。また、これら処方例の分解抑制剤は、いずれも真皮のマトリックス成分の分解を抑制し、皮膚の老化等が抑制し得ることをあらかじめ確認した。
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 2.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
グリセリルモノステアレート 3.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 3.0
セタノール 2.0
スクワラン 3.0
2−エチルヘキサン酸グリセリル 10.0
グリセリン 7.0
エチルパラベン 0.1
精製水 残部
合計 100.0
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 1.0
ステアリン酸 10.0
セタノール 2.0
ラノリン 1.0
ミリスチン酸イソプロピル 3.0
モノステアリン酸ポリエチレングリコール 1.5
トリエタノールアミン 0.8
ソルビトール(70%) 4.0
メチルパラベン 0.1
香料 0.01
精製水 残部
合計 100.0
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 0.1
ヒアルロン酸 0.01
グリセリルモノステアレート 2.0
ポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテルリン酸ナトリウム 0.5
ステアリン酸 5.0
ベヘニルアルコール 1.0
ラノリン 2.0
スクワラン 5.0
2−エチルヘキサン酸グリセリル 4.0
顔料 10.0
プロピレングリコール 7.0
トリエタノールアミン 1.0
エチルパラベン 0.1
精製水 残部
合計 100.0
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 0.1
ラノリン 2.0
流動パラフィン 5.0
ステアリン酸 2.0
セタノール 1.0
グリセリン 2.0
スクワラン 5.0
2−エチルヘキサン酸グリセリル 4.0
顔料 10.0
プロピレングリコール 7.0
トリエタノールアミン 1.0
エチルパラベン 0.1
香料 0.01
精製水 残部
合計 100.0
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 0.5
ヒアルロン酸 0.01
ステアリン酸 2.0
エタノール 0.5
流動パラフィン 10.0
ラノリン脂肪酸イソプロピル 3.0
ラノリン 4.0
スクワラン 5.0
セスキイソステアリン酸ソルビタン 1.0
プロピレングリコール 5.0
トリエタノールアミン 0.6
エチルパラベン 0.1
香料 0.01
精製水 残部
合計 100.0
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 0.5
ステアリン酸 3.5
エタノール 0.5
流動パラフィン 3.0
ラノリン 0.5
スクワラン 2.0
プロピレングリコール 3.0
トリエタノールアミン 0.8
エチルパラベン 0.1
カルボキシビニルポリマー1%液(アルカリ中和) 8.0
香料 0.01
精製水 残部
合計 100.0
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 0.05
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン 1.0
1,3−ブチレングリコール 3.0
ソルビトール(70%) 2.0
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 3.0
エタノール 15.0
アスコルビン酸 0.1
メチルパラベン 0.1
香料 0.01
精製水 残部
合計 100.0
青花もしくは白花花弁エキス
(非フラボノイド成分の凍結乾燥品) 0.05
モノラウリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン 1.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
ソルビトール(70%) 2.0
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 3.0
エタノール 15.0
アスコルビン酸 0.1
メチルパラベン 0.1
色素 0.01
香料 0.01
精製水 残部
合計 100.0
Claims (5)
- 真皮のマトリックス成分の分解を抑制する分解抑制剤であり、
オオボウシバナの変種体である白花の花に由来する非フラボノイド成分を含有し、
前記非フラボノイド成分は、前記白花の花弁をアルコールに浸漬し、得られたエキス原液をカラムクロマトグラフィにて、水を溶出溶媒として溶出し、得られた水分画を乾燥した乾燥粉末に含まれる成分である、分解抑制剤。 - 前記マトリックス成分を分解するマトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制する、請求項1記載の分解抑制剤。
- 前記マトリックス成分に含まれるエラスチンを分解する酵素エラスターゼの活性を阻害する、請求項1または2記載の分解抑制剤。
- 真皮のマトリックス成分の分解を抑制する抗老化剤であり、
オオボウシバナの変種体である白花の花に由来する非フラボノイド成分を含有し、
前記非フラボノイド成分は、前記白花の花弁をアルコールに浸漬し、得られたエキス原液をカラムクロマトグラフィにて、水を溶出溶媒として溶出し、得られた水分画を乾燥した乾燥粉末に含まれる成分である、抗老化剤。 - 真皮のマトリックス成分の分解を抑制する皮膚外用剤であり、
オオボウシバナの変種体である白花の花に由来する非フラボノイド成分を含有し、
前記非フラボノイド成分は、前記白花の花弁をアルコールに浸漬し、得られたエキス原液をカラムクロマトグラフィにて、水を溶出溶媒として溶出し、得られた水分画を乾燥した乾燥粉末に含まれる成分である、皮膚外用剤。
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JP2015182942A JP6348890B2 (ja) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | 分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤 |
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JP2015182942A Active JP6348890B2 (ja) | 2015-09-16 | 2015-09-16 | 分解抑制剤、抗老化剤および皮膚外用剤 |
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