JP7405836B2 - フラボン７－ｏ－メチル基転移酵素遺伝子及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする新規なポリヌクレオチド、及びその使用に関する。
バラ、ペチュニア、キク、カーネーション等は世界的に産業上重要な花きである。特にバラは最も人気のある花卉植物であり、紀元前から栽培されていた記録があり、数百年にわたり人為的な品種改良がされてきた。しかしながら、交雑可能な近縁種に青系の花色の野生種が無いなどの問題により、従来の交雑育種や突然変異育種では、青系花色を有するバラ品種の作出は困難であった。全く新しい青系花色の創出は、花卉の利用場面の拡大に伴う新たな需要を喚起し、生産や消費の拡大に繋がる。そこで、遺伝子工学的手法により青系花色をもつバラの作出が試みられてきた。
例えば、紫から青色の花には、デルフィニジン、ペチュニジン及びマルビジンを骨格としたデルフィニジン型アントシアニンが多く含まれることが知られているが、バラなどの花卉は、このようなデルフィニジン型アントシアニンを生産できないため、これらの合成に必要なフラボノイド３’，５’－水酸化酵素遺伝子を発現させることにより、デルフィニジンを人為的に生産させる研究が行われている（非特許文献１）。しかしながら、目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させるために植物の代謝を人為的に改変したとしても、しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、目的の物質の蓄積がまったく、あるいはほとんど起こらないことが多い。
さらに、花の色は、アントシアニン自身の構造のほかに、共存するフラボノイド（コピグメントと呼ばれる）や金属イオン、液胞のｐＨなどによっても変化する。フラボンやフラボノールは、代表的なコピグメントであり、アントシアニンとサンドイッチ状に積み重なることにより、アントシアニンを青くし、濃く見えるようにする効果がある（非特許文献２）。これはコピグメント効果として知られている。特にフラボンは強いコピグメント効果を示すことが知られており、たとえば遺伝子組換えカーネーションの解析ではフラボンが有意なコピグメント効果を示すことが報告されている（非特許文献３）。また、ダッチアイリスにおいて、総デルフィニジン量に対する総フラボン量の比が高いほど強いコピグメント効果を示し、色が青くなることが報告されている（非特許文献４）。さらにツユクサではコンメリニン（マロニルアオバニンとフラボコンメリンとマグネシウムイオンによる金属錯体）が形成されることで色が青くなることが報告されている（非特許文献９）。
しかしながら、すべての植物がフラボンを生産できるわけではなく、バラやペチュニアなどはフラボンを蓄積しない。したがって、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をこのような植物で発現させ、花色を改変させる試みが行われている（特許文献１）。
また、植物では、フラボンは遊離形態の他に配糖体としても分布しており、主にフラボンＯ－配糖体とフラボンＣ－配糖体が生成されるが、特にフラボンＣ－配糖体は強いコピグメント効果を示すことが知られている。例えば、フラボンＣ－配糖体の一種であるイソビテキシンは、ハナショウブ（Ｉｒｉｓ ｅｎｓａｔａ Ｔｈｕｎｂ．）においてアントシアニンに対しコピグメント効果を示し、アントシアニンを安定化することにより青い花色を安定化することが報告されている（非特許文献５）。フラボンＣ－配糖体については、これまでに２つの生合成経路が報告されており、１つはフラバノン２－水酸化酵素及びＣ－配糖化酵素、脱水酵素が触媒する反応によりフラバノンから合成される。もう一つは、フラボン合成酵素及びフラボンＣ－配糖化酵素が触媒する反応によりフラバノンから合成される（非特許文献６）。
しかしながら、これらの遺伝子をフラボンＣ－配糖体を生産しない植物に導入したという例はこれまでに報告されていない。さらに、コピグメント効果は、アントシアニンとフラボンとの量比、アントシアニン及びフラボンにおける糖やメチル基、アシル基による修飾などの影響を受けるものと考えられ、単にフラボン合成酵素遺伝子を発現させ、フラボンを蓄積させただけでは、花色を青くできるとは限らない。ペチュニアにおいてトレニアのフラボン合成酵素遺伝子を発現させると、青紫色の花色は薄くなってしまう（非特許文献７）。また、リンドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで発現させたところ、フラボンが合成された（非特許文献８）が、やはり花色は薄くなった。さらに、フラボン及びマルビジンを人為的に含有させることにより、バラの花色を改変する試みが行われているが（特許文献２）、青系花色を有するバラを作出することには成功していない。
実際に、これまでの青系花色を目指したバラの花色改変では、ＲＨＳカラーチャート色相グループ：ＰｕｒｐｌｅグループやＰｕｒｐｌｅ－Ｖｉｏｌｅｔグループ、Ｖｉｏｌｅｔグループが限界であり、Ｖｉｏｌｅｔ－ＢｌｕｅグループやＢｌｕｅグループの花色をもつ青色のバラは作出されていない。したがって、真に青色の花色をもつバラの作出を可能にするための青色発現制御技術の開発が依然として望まれている。
特開２０００－２７９１８２号公報 国際公開第２００８／１５６２０６号
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５，２８３－２９１ Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔｌ．Ｐｒｏｄ．５２ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６３，１５－２３（２００３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．７２，１１６－１２４（２０１３） Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ １１５，１－５（２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８９，１８２－１８７（２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１，３７７－３８６（２００４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ １７：９１－９９（２００６） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎ Ａｃａｄｅｍｙ．Ｓｅｒ．Ｂ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ８４（１０），４５２－４５６，２００８ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６（２），２１９－２２７ （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２（４－５），７１５－７３３（２００６）
本発明が解決しようとする課題は、花色が改変された形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞を提供することである。
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、デルフィニジン型アントシアニンとフラボンＣ－配糖体を植物の花弁で共存させると、従来得られなかった花色を有する形質転換植物、特に、青系花色（ＲＨＳカラーチャート第５版：Ｖｉｏｌｅｔ－Ｂｌｕｅグループ／Ｂｌｕｅグループかつ／または色相角度：３３９．７°～２７０．０°）を有するバラ植物が得られることを発見した。さらに驚くべきことに、本願発明者らは、このたび、様々なフラボンＣ－配糖体の中で、７位の水酸基がメチルされているスウェルティシンとの組み合わせがより青くなることを見出し、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する新規なフラボン７－Ｏ－メチル基転移酵素遺伝子を、ツユクサの変種（栽培種）として知られるオオボウシバナ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ｖａｒ． ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ）から取得することに成功した。このような知見に基づき、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の通りである。
［１］ 以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）配列番号３４の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
［２］ 配列番号３４の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、１に記載のポリヌクレオチド。
［３］ 配列番号３５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、１に記載のポリヌクレオチド。
［４］ １～３のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
［５］ １～３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［６］ フラボン合成酵素（ＦＮＳ）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、５に記載のベクター。
［７］ 前記ＦＮＳ遺伝子又はそのホモログが、
（１－ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１－ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１－ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１－ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１－ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
（２－ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２－ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２－ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２－ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２－ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、６に記載のベクター。
［８］ 前記ベクターが、フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、６又は７に記載のベクター。
［９］ 前記Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
（３－ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３－ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３－ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３－ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３－ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記ＭＴ遺伝子又はそのホモログが、
（４－ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４－ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４－ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４－ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４－ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、８に記載のベクター。
［１０］ 前記ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子由来５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号２３）が付加されている、７～９のいずれかに記載のベクター。
［１１］ フラバノン２－水酸化酵素（Ｆ２Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、フラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（ＦＤＨ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、５に記載のベクター。
［１２］ フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、１１に記載のベクター。
［１３］ 前記Ｆ２Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
（５－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（５－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
（６－ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６－ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６－ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６－ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６－ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記ＦＤＨ遺伝子又はそのホモログが、
（７－ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（７－ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（７－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７－ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７－ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７－ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
（８－ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（８－ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（８－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８－ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８－ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８－ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記ＭＴ遺伝子又はそのホモログが、
（９－ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（９－ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（９－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９－ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９－ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９－ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、１２に記載のベクター。
［１４］ １～３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１５］ 前記植物がバラ、ペチュニア、キク、カーネーション又はユリから選択される、１４に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１６］ 前記植物がバラである、１５に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１７］ １４～１６のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
［１８］ １４～１６のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
［１９］ 花色が改変された形質転換植物を作製するための方法であって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボンＣ－配糖体を植物の細胞内で共存させる工程を含み、ここで、前記フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基がメチルされていることを特徴とする方法。
［２０］ 前記フラボンＣ－配糖体がスウェルティシン又はスウェルティアジアポニンである、１９に記載の方法。
［２１］ 前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン３，５－ジグルコシド、デルフィニジン３，５－ジグルコシド、ペチュニジン３，５－ジグルコシド、アシル化デルフィニジン、アシル化マルビジン及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１９又は２０に記載の方法。
［２２］ ５～１３のいずれかに記載のベクターを植物の細胞内に導入する工程を含む、１９～２１のいずれかに記載の方法。
［２３］ 前記植物がバラ、ペチュニア、キク、カーネーション又はユリから選択される、２２に記載の方法。
［２４］ 前記植物がバラである、２３に記載の方法。
本発明により、従来得られなかった花色を有する植物品種を作出できる。
植物におけるフラボンＣ－配糖体の生合成経路を示す。 ｐＳＰＢ６４８６の構造を示す。 ｐＳＰＢ７０１３の構造を示す。 ＤＮ１３４０６７を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液と、イソビテキシンを酵素反応させた酵素反応液の高速液体クロマトグラムである。 ＤＮ１３４０６７を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液と、イソオリエンチンを酵素反応させた酵素反応液の高速液体クロマトグラムである。 ｐＳＰＢ７６０７の構造を示す。
アントシアニンは、植物において広く存在する色素群であり、赤色、青色、紫色の花色を呈することが知られている。アグリコンであるアントシアニジン部位のＢ環のヒドロキシ基の数により、ペラルゴジニン、シアニジン及びデルフィニジンの３系統に分類される。発色団はアグリコン部分であり、ペラルゴニジン型アントシアニンは橙色、シアニジン型アントシアニンは赤色、デルフィニジン型アントシアニンは紫～青色を呈する。本願明細書中、例えば、「デルフィニジン型アントシアニン」は、デルフィニジン、マルビジン、ペチュニジンを骨格にもつそれらの誘導体が挙げられるが、好ましくはマルビジンである。
デルフィニジン型アントシアニンは、フラボン、フラボノール、有機酸エステル類、タンニン類などの物質と共存することで、それらと分子間相互作用をして青みを帯びた色を発現する場合がある。この現象はコピグメント作用と呼ばれ、このような現象を引き起こす物質はコピグメント（補助色素）と呼ばれる。コピグメント作用には青色の発現を引き起こす深色効果だけで無く、濃色効果や色の安定性向上の効果もある。本発明者らは、デルフィニジン型アントシアニンとフラボンＣ－配糖体とのコピグメント作用により、バラの花弁が青色発現することを確認した。
フラボンは、有機化合物の一種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、植物内では、主に配糖体として存在する。フラボンは、狭義には化学式Ｃ15Ｈ10Ｏ2、分子量２２２．２４の化合物、２，３－ジデヒドロフラバン－４－オンを指すが、広義のフラボン（フラボン類）は、フラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに３位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。本願明細書中、「フラボンＣ－配糖体」は、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体の配糖体のうち、アルドースのアノメリック炭素に直接アグリコンが結合した配糖体を意味する。フラボンＣ－配糖体としては、ルテオリンＣ－配糖体、トリセチンＣ－配糖体、アピゲニンＣ－配糖体、アカセチンＣ－配糖体が挙げられるがこれらに限定されない。フラボンＣ－配糖体はまた、アピゲニン、ルテオリン、トリセチン、アカセチン誘導体の配糖体も含む。植物においては、フラボンＣ－配糖体の生合成経路として２つの経路が知られている（図１）。経路１では、フラバノン２－水酸化酵素（Ｆ２Ｈ）、フラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）、及び脱水酵素（ＦＤＨ）の作用を介して、フラボン６－Ｃ－グルコシド及びフラボン８－Ｃ－グルコシドが産生される。一方、経路２では、フラボン合成酵素（ＦＮＳ）、及びフラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）の作用を介して、フラボン６－Ｃ－グルコシド及びフラボン８－Ｃ－グルコシドが産生される。フラボンＣ－配糖体は、フラボン６－Ｃ－グルコシド、フラボン８－Ｃ－グルコシド及びそれらの組み合せから成る群から選択されることが好ましく、例えば、アピゲニン６－Ｃ－グルコシド（イソビテキシン）、アピゲニン８－Ｃ－グルコシド（ビテキシン）、ルテオリン６－Ｃ－グルコシド（イソオリエンチン）、ルテオリン８－Ｃ－グルコシド（オリエンチン）、トリセチン６－Ｃ－グルコシド、トリセチン８－Ｃ－グルコシド又はそれらの誘導体が挙げられる。
植物の細胞内におけるフラボンＣ－配糖体の蓄積は、経路１における必須遺伝子（すなわち、フラバノン２－水酸化酵素（Ｆ２Ｈ）遺伝子、フラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子、及び脱水酵素（ＦＤＨ）遺伝子）又はそれらのホモログを含むベクター、あるいは、経路２における必須遺伝子（すなわち、フラボン合成酵素（ＦＮＳ）遺伝子、及びフラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子）又はそれらのホモログを含むベクターで宿主植物を形質転換することによって達成できる。
経路１における必須遺伝子であるＦ２Ｈ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはカンゾウ由来のＦ２Ｈ遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
経路１における必須遺伝子であるＣＧＴ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはイネ由来のコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
経路１における必須遺伝子であるＦＤＨ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはミヤコグサ由来のＦＤＨ遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
経路２における必須遺伝子であるＦＮＳ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはトレニア由来のＦＮＳ遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
経路２における必須遺伝子であるＣＧＴ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはリンドウ由来のＣＧＴ遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２－ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２－ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
経路２における必須遺伝子ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログには、シロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子由来５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号２３）が付加されていることが好ましい。
さらに驚くべきことに、本願発明者らは、このたび、フラボンＣ－配糖体の中で、７位の水酸基がメチルされているフラボンＣ－配糖体であるスウェルティシンとの組み合わせがより青くなることを見出し、経路１又は２で得られるフラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する新規なフラボン７－Ｏ－メチル基転移酵素遺伝子を、ツユクサの変種（栽培種）として知られるオオボウシバナから取得することに成功した。
オオボウシバナ由来フラボン７－Ｏ－メチル基転移酵素（ＣｃＦｎ－７ＯＭＴ）遺伝子又はそのホモログは、以下の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）配列番号３４の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
植物の細胞内におけるデルフィニジン型アントシアニンの蓄積は、フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログを宿主植物に組み込むことによって達成できる（特許文献２）。したがって、経路１における必須遺伝子又はそれらのホモログ、又は経路２における必須遺伝子又はそれらのホモログに加えて、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログ、及びＭＴ遺伝子又はそのホモログをさらに含むベクターで宿主植物を形質転換することによって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボンＣ－配糖体を宿主植物の細胞内で共存させることができる。
Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはカンパニュラ由来のＦ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
ＭＴ遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはトレニア由来のＭＴ遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。
本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度１５０～９００ｍＭ、好ましくは６００～９００ｍＭ、ｐＨ６～８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．（Ｅｄ．），Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｉｎ，Ａ．Ｍ．＆Ｇｒｉｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｐａｒｔ Ｉ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８７）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．＆ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．（Ｅｄ．），Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ－Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９１）等参照）。
また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン９．５ Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出される数値である。本発明において、各アミノ酸配列間の「同一性」の程度は、例えば、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上である。
本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
生来の塩基配列を有する遺伝子は、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドが所望の活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された植物にも関する。
また、本発明のベクターは、それらを導入する宿主植物の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域を２つ連結したＥｌ2３５Ｓプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ－１プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主植物の形質転換も常法に従って行うことができる。
現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
本発明中、宿主に用いることができる植物は、特に制限されないが、バラ科バラ属、ナス科ペチュニア属、キク科キク属、ナデシコ科ナデシコ属（カーネーションなど）、ユリ科ユリ属の植物を用いることができ、特に好ましくはバラ科バラ属の栽培バラ（学名：Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ）である。なお本明細書で使用する用語「バラ植物」とは、分類学上の位置づけではバラ科バラ属の栽培バラ（学名：Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ）のことをいう。バラは、樹形と花の大きさにより主にハイブリッド・ティー系、フロリバンダ系、ポリアンサ系などに分けられるが、いずれの系統でも花弁に含まれる主要な色素（アントシアニン）はシアニジン型とペラルゴニジン型の２種類のみである。本発明において宿主に用いられるバラ植物の種類については特に制限されず、これらの品種や系統に好適に用いることができる。例えば、宿主として用いることができるバラ品種としては、オーシャンソング、ノブレス、リタ・パフューメラ、クールウォーター、フェイム、トップレス、ピーチアヴァランチェなどが挙げられる。
本発明により、細胞内でデルフィニジン型アントシアニンとフラボンＣ－配糖体が共存している、花色が改変された形質転換植物、好ましくは、バラ科バラ属、ナス科ペチュニア属、キク科キク属、又はナデシコ科ナデシコ属（カーネーションなど）、特に好ましくはバラ植物が得られる。特に、得られた形質転換植物がバラ植物である場合、ＲＨＳカラーチャートでＢｌｕｅグループもしくはＶｉｏｌｅｔ－Ｂｌｕｅグループ、かつ／又はＣＩＥＬ*ａ*ｂ*表色系の色相角度で３３９．７°～２７０．０°の花色を示す。
さらに、本発明は、上記で得られた形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、それらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞、あるいは切り花から作成された加工品（特に切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
［実施例１：アントシアニンに対するフラボンＣ－配糖体のコピグメント効果のシミュレーション］
アントシアニンに対するフラボンＣ－配糖体のコピグメント効果のシミユレーションを行うため、アントシアニン及びフラボンＣ－配糖体を調整した。本実験に用いたマルビン（マルビジン３，５－ジグルコシド）及びイソビテキシン（アピゲニン６－Ｃ－グルコシド）はフナコシ株式会社より購入した。
このようにして入手したアントシアニン（マルビン）に対してフラボンＣ－配糖体（イソビテキシン）を、ｐＨ４．５の緩衝液中、０、２、４当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。アントシアニンの濃度は０．５ｍＭとした。
フラボンＣ－配糖体の添加により、アントシアニン水溶液の吸光度は増大し、吸収極大（λｍａｘ）はフラボンＣ－配糖体の添加とともに長波長側へシフトした。このことから、マルビンはイソビテキシンのコピグメント効果を受けることが判明した。
Figure 0007405836000001
［実施例２：（経路１）バラ品種「リタ・パフューメラ」へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とカンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来ＣＧＴ遺伝子、カンゾウ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ４７４３は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の４つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＤ８ターミネーター
（２）３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシソ由来ＡＴターミネーター
（３）３５Ｓプロモーターとイネ由来ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号５）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号７）とシソ由来ＡＴターミネーター
本プラスミドは植物においては、パンジーのＦ３’，５’Ｈ＃４０遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、イネのＣＧＴ遺伝子、カンゾウのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ４７４３を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計１６個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、１５個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高９４％（平均８９．５％）であった。さらに、このうち１０個体でフラボンＣ－配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり０．５５ｍｇであった。
形質転換体の分析値を下表２に示す。
Figure 0007405836000002
 宿主：リタ・パフューメラ
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、ＩＶＸ：イソビテキシン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例３：（経路１）バラ品種「ノブレス」へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とカンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来ＣＧＴ遺伝子、カンゾウ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
実施例２と同様にして作製したｐＳＰＢ４７４３を桃色系バラ品種「ノブレス」へ導入し、計２０個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、すべての個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高８８％（平均８３．５％）であった。さらに、このうち１８個体でフラボンＣ－配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり０．０６ｍｇであった。
代表的な形質転換体の分析値を下表３に示す。
Figure 0007405836000003
 宿主：ノブレス
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、ＩＶＸ：イソビテキシン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例４：（経路１）バラ品種「リタ・パフューメラ」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とカンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来ＣＧＴ遺伝子、イネ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ６１８８は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の４つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とＤ８ターミネーター
（２）３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシソ由来ＡＴターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとイネ由来ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号５）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとイネ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１１）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’，５’Ｈ遺伝子とカンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、イネのＣＧＴ遺伝子、イネのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ６１８８を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計７７個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、６８個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高９９．６％（平均９３．３％）であった。さらに、このうち５７個体でフラボンＣ－配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり０．７２ｍｇであった。
代表的な形質転換体の分析値を下表４に示す。
Figure 0007405836000004
 宿主：リタ・パフューメラ
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、ＩＶＸ：イソビテキシン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例５：（経路１）バラ品種「ノブレス」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とカンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来ＣＧＴ遺伝子、イネ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
実施例４と同様にして作製したｐＳＰＢ６１８８を桃色系バラ品種「ノブレス」へ導入し、計５１個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、すべての個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高９９．７％（平均６６．９％）であった。さらに、このうち４８個体でフラボンＣ－配糖体であるイソビテキシンが確認でき、イソビテキシンの生成量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり０．５８ｍｇであった。
代表的な形質転換体の分析値を下表５に示す。
Figure 0007405836000005
 宿主：ノブレス
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、ＩＶＸ：イソビテキシン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例６：（経路１）バラ品種「リタ・パフューメラ」へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とカンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ５５８８は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の４つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＤ８ターミネーター
（２）３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシソ由来ＡＴターミネーター
（３）３５Ｓプロモーターとイネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（４）３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本プラスミドは植物においてはパンジーのＦ３’，５’Ｈ＃４０遺伝子とカンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、イネのコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ５５８８を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計９２個体の形質転換体を得た。色素分析を行った６５個体のうち４４個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高１００％（平均６２．３％）であった。さらに、このうち３７個体でフラボンＣ－配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり２．０２ｍｇという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を下表６に示す。
Figure 0007405836000006
 宿主：リタ・パフューメラ
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、ＩＶＸ：イソビテキシン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例７：（経路１）バラ品種「ノブレス」へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とカンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
実施例４と同様にして作製したｐＳＰＢ５５８８を橙色系バラ品種「ノブレス」へ導入し、計６０個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、４２個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高９６．９％（平均５４．４％）であった。さらに、このうち２９個体でフラボンＣ－配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり１．６０ｍｇという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を下表７に示す。
Figure 0007405836000007
 宿主：ノブレス
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、ＩＶＸ：イソビテキシン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例８：（経路１）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ６４８６は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１７）とＮＯＳターミネーター
（３）３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）３５Ｓプロモーターとイネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５）３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’，５’Ｈ遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、イネのコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ６４８６を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計２７個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、２６個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高７４．５％（平均５７．０％）であった。さらに、本系統においてはフラボンＣ－配糖体としてこれまでのイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン６，８－Ｃ－ジグルコシド）イソオリエンチン（ルテオリン６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン８－Ｃ－グルコシド）についても同定・定量を行った。マルビジンが検出できたすべての個体でフラボンＣ－配糖体が検出でき、その総量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり１．５６３ｍｇと高い含有量であった。また、ほとんどの個体でフラボンＣ－配糖体の総量が花弁新鮮重量１ｇあたり１ｍｇ以上と高い含有量であり、マルビジンに対しても約１０倍以上の生成量であった。
代表的な形質転換体の分析値を下表８に示す。
Figure 0007405836000008
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例９：（経路２）バラ品種 「リタ・パフューメラ」へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、トレニア由来ＦＮＳ遺伝子、リンドウ由来ＣＧＴ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ６４３８は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の４つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）とＮＯＳターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１７）とＮＯＳターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＦＮＳ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１９）とＤ８ターミネーター
（４）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとリンドウ由来ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号２１）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本プラスミドは植物においてはパンジーのＦ３’，５’Ｈ＃４０遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、トレニアのＦＮＳ遺伝子、リンドウのＣＧＴ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ６４３８を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計１２２個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、７１個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高６９．９％（平均２５．９％）であった。さらに、本系統においてはフラボンＣ－配糖体としてこれまでのイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン６，８－Ｃ－ジグルコシド）についても同定・定量を行った。マルビジンが検出できた個体のうち、１６個体でフラボンＣ－配糖体が確認でき、その総量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり０．０２ｍｇであった。一方、フラボン類（アピゲニン、ルテオリン、トリセチン）の総量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり２．０７ｍｇという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を下表９に示す。
Figure 0007405836000009
 宿主：リタ・パフューメラ
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例１０：（経路２）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とトレニア由来ＭＴ遺伝子、トレニア由来ＦＮＳ遺伝子、リンドウ由来ＣＧＴ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ７０１３は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の４つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１７）とＮＯＳターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＦＮＳ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１９）とＤ８ターミネーター
（４）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとリンドウ由来ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号２１）（５’位側にシロイヌナズナ ＡＤＨ遺伝子由来５’－ＵＴＲ（配列番号２３）を付加）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’，５’Ｈ遺伝子とトレニアのＭＴ遺伝子、トレニアのＦＮＳ遺伝子、リンドウのＣＧＴ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ７０１３を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計１５個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、全個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高６７．２％（平均４０．９％）であった。さらに、本系統においてはフラボンＣ－配糖体としてこれまでのイソビテキシン、ビテキシン、ビセニン－２に加え、イソオリエンチン（ルテオリン６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン８－Ｃ－グルコシド）についても同定・定量を行った。マルビジンが検出できたすべての個体でフラボンＣ－配糖体が検出でき、その総量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり１．４１０ｍｇと高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を下表１０に示す。
Figure 0007405836000010
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｍａｌ（％）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合
［実施例１１：フラボンＣ－配糖体を含むバラの花色の評価］
実施例８及び１０において作出された形質転換体（バラ品種「オーシャンソング」を宿主とする）について、（１）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラボンを含まないもの、（２）主な色素としてマルビジンを蓄積し、経路１によって生成されたフラボンＣ－配糖体を含むもの、（３）主な色素としてマルビジンを蓄積し、経路２によって生成されたフラボンＣ－配糖体を含むもの、及び宿主（主な色素としてシアニジンを蓄積）というグループに分類し、それぞれの花弁の色彩について分光測色計ＣＭ－２０２２（ミノルタ株式会社）を用いて１０度視野、Ｄ６５光源で測定し、色彩管理ソフトＳｐｅｃｔｒａＭａｇｉｃＴＭ（ミノルタ株式会社）により解析を行った（ｎ＝５）。
主色素がデルフィニジンタイプのバラにおいても、花弁の色相角度は青色方向へシフトしていた。また、主色素がマルビジンタイプでフラボンＣ－配糖体が共存する場合のバラにおいては、その傾向がより顕著であり、色相角度も青色側へ大きくシフトしていた。また、実施例１０の系統においてその傾向が顕著にみとめられた。以上の結果から、マルビジンとフラボンＣ－配糖体の共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。
結果を表１１に示す。
Figure 0007405836000011
［実施例１２：（経路１）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とラベンダー由来３ＡＴ遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ６４９５は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とＤ８ターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとラベンダー由来３ＡＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号２４）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（３）３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシソ由来ＡＴターミネーター
（４）３５Ｓプロモーターとイネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５）３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’，５’Ｈ遺伝子とラベンダーの３ＡＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、イネのコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ６４９５を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計２２８個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、５９個体でアシル化デルフィンの蓄積を確認できた。さらに、本系統においてはフラボンＣ－配糖体としてイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン６，８－Ｃ－ジグルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン８－Ｃ－グルコシド）についても同定・定量を行った。アシル化デルフィンが検出できたすべての個体でフラボンＣ－配糖体が検出でき、その総量は最高で花弁新鮮重量１ｇあたり１．７２０ｍｇと高い含有量を示す個体もあったが、平均値は０．８３３ｍｇであった。
代表的な形質転換体の分析値を下表１２に示す。
Figure 0007405836000012
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例１３：（経路１）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子とチョウマメ由来３’５’ＧＴ遺伝子、バラ由来５３ＧＴ（ＲＮＡｉ）遺伝子、シソ由来３ＧＴ遺伝子、ダリア由来３マロニル基転移酵素（ＭａＴ）遺伝子、カンゾウ由来Ｆ２Ｈ遺伝子、イネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサ由来ＦＤＨ遺伝子の導入］
ｐＳＰＢ７１８９は、ｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の５つの発現カセットが含まれている。
（１） Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとカンパニュラ由来Ｆ３’５’Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号９）とＮｏｓターミネーター
（２） Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとチョウマメ由来Ａ３’５’ＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号２６）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（３） Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとバラ由来５３ＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号２８）（ＲＮＡｉ）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（４） ＳＡＴプロモーターとシソ由来３ＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３０）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（５） Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとダリア由来３ＭａＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３２）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（６） ３５Ｓプロモーターとカンゾウ由来Ｆ２Ｈ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３）とシソ由来ＡＴターミネーター
（７） ３５Ｓプロモーターとイネ由来コドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（８） ３５Ｓプロモーターとミヤコグサ由来ＦＤＨ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのＦ３’，５’Ｈ遺伝子とチョウマメのＡ３’，５’ＧＴ遺伝子、シソの３ＧＴ遺伝子、ダリアの３ＭａＴ遺伝子、カンゾウのＦ２Ｈ遺伝子、イネのコドンＵｓａｇｅ改変ＣＧＴ遺伝子、ミヤコグサのＦＤＨ遺伝子を構成的に発現し、かつ、バラの内在性の５，３ＧＴ遺伝子の発現を抑制する。
このようにして作製したｐＳＰＢ７１８９を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計１０１個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、１個体でのみデルフィンの蓄積を確認できたが、アシル化は確認できなかった。さらに、本系統においてはフラボンＣ－配糖体としてイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン８－Ｃ－グルコシド）、ビセニン－２（アピゲニン６，８－Ｃ－ジグルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン６－Ｃ－グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン８－Ｃ－グルコシド）についても同定・定量を行った。本個体においてフラボンＣ－配糖体が検出でき、その総量は花弁新鮮重量１ｇあたり１．０２４ｍｇであった。
形質転換体の分析値を下表１３に示す。
Figure 0007405836000013
 宿主：オーシャンソング
Ｄｅｌ：デルフィニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｔ：ペチュニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍａｌ：マルビジン
Ｍ：ミリセチン、Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｔｒｉ：トリセチン、Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、Ｖｉｃ２：ビセニン－２、ＶＸ：ビテキシン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｏｒｉ：オリエンチン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン
Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例１４：フラボンＣ－配糖体を含むバラの花色の評価］
実施例１２及び１３において作出された形質転換体（バラ品種「オーシャンソング」を宿主とする）について、（１）主な色素としてデルフィニジン（一部アシル化）を蓄積し、経路１によって生成されたフラボンＣ－配糖体を含むもの、（２）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、経路１によって生成されたフラボンＣ－配糖体を含むものというグループに分類し、それぞれの花弁の色彩について分光測色計ＣＭ－２０２２（ミノルタ株式会社）を用いて１０度視野、Ｄ６５光源で測定し、色彩管理ソフトＳｐｅｃｔｒａＭａｇｉｃＴＭ（ミノルタ株式会社）により解析を行った（ｎ＝５）。
主色素がデルフィニジンタイプのバラの場合、一部がアシル化されていても、花弁の色相角度は実施例８及び１０において作出された形質転換体に比べて青色方向へのシフトは認められなかった（ただし、アシル化アントシアニン単独の場合よりも青く変化した）。以上の結果から、マルビジンとフラボンＣ－配糖体の共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。
結果を表１４に示す。
Figure 0007405836000014
［実施例１５：アントシアニン（マルビン）に対するフラボンＣ－配糖体のコピグメント効果のシミュレーション］
アントシアニン（マルビン）に対するフラボンＣ－配糖体のコピグメント効果のシミユレーションを行うため、マルビン及びフラボンＣ－配糖体を調整した。本実験に用いたマルビン（マルビジン３，５－ジグルコシド）及びフラボンＣ－配糖体（イソオリエンチン、スウェルティシン）はナカライテスク株式会社より購入した。
このようにして入手したマルビンに対して各フラボンＣ－配糖体（イソオリエンチン、スウェルティシン）を、ｐＨ５．０の緩衝液中、１０当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。マルビンの濃度は０．５ｍＭとした。
フラボンＣ－配糖体の添加により、マルビン水溶液の吸光度は増大し、吸収極大（λｍａｘ）は長波長側へシフトした。また、イソオリエンチンよりもスウェルティシンを添加した場合に吸収極大がより長波長側へシフトした。このことから、マルビンに対してスウェルティシンの方がより高いコピグメント効果を示すことが判明した。
Figure 0007405836000015
［実施例１６：オオボウシバナにおけるスウェルティシンの検出］
ツユクサにはスウェルティシンが含まれていることがすでに報告されている（非特許文献９）。ツユクサは朝早くに開花し、夕方にはしぼむ１日花で、花の大きさは約１ｃｍと小さい。一方、ツユクサの変種（栽培種）として知られるオオボウシバナは、花が４ｃｍほどと大きくサンプルとするには最適であった。そこで、オオボウシバナにてスウェルティシンが検出されるか、またそれがどの器官で蓄積されているかを確認するため色素分析を実施した。
オオボウシバナを以下の器官及びステージに分けて採集した。
花弁ステージ１：未着色のつぼみ（約０．５ｃｍ）
花弁ステージ２：少し着色が始まったつぼみ（約０．５ｃｍ）
花弁ステージ３：着色が進み、開花直前のつぼみ（約１－１．５ｃｍ）
葉
苞
上記の５種のサンプルを凍結後、真空凍結乾燥機 ＶｉｒＴｉｓ ｓｅｎｔｒｙ２．０（ＳＰ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）で一晩乾燥させたのち、スパーテルにて軽く粉砕した。これに０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有５０％アセトニトリルを新鮮重の約８倍量（ｖ／ｗｔ）加え、超音波下で２０分間処理した後、遠心分離（３，６００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、上清を回収した。得られた上清を０．４５μｍフィルター（コスモナイスフィルター（水系）、０．４５μｍ、１３ｍｍ）でろ過した。このうち２００μｌを乾固させ、β－グルコシダーゼ及びナリンギナーゼを加えて３０℃で１晩処理したのち、０．１％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリルを２００μｌ加えて反応を停止させた。次に超音波下で２分間処理したのち、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）し、得られた上清を０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ－ＬＨ ０．４５μｍ、ミリポア）でろ過したものを高速液体クロマトグラフィーに供した。分析条件は以下のとおりである。
＜分析条件＞
装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステム（島津製作所）
検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（２５０－４５０ｎｍ）
カラム：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＦＣ－ＯＤＳ １５０ ｘ ４．６ｍｍ、３μｍ（株式会社島津ジーエルシー）
溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ含有９０％アセトニトリル
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
溶出条件は、溶離液Ａ及びＢの８：２の混合液から３：７の混合液までの１０分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間の３：７の混合液による溶出を行なった。
分析の結果、栽培種であるオオボウシバナでスウェルティシンが検出され、また花弁のみで特異的に検出されることがわかった。特に着色が始まったステージ２で含有量が最も多いことが確認できた。
Figure 0007405836000016
［実施例１７：フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の取得］
＜全ＲＮＡの単離＞
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製造者が推奨する方法に従い、オオボウシバナの花弁（ステージ１～３）、葉、苞から全ＲＮＡを単離した。
＜オオボウシバナ由来ｃＤＮＡの発現量解析＞
上記にて調製した全ＲＮＡからＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｓｔｒａｎｄ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡライブラリ調製キットを用いて製造者が推奨する工程に従い、次世代シークエンサーＮｅｘｔＳｅｑ ５００用ライブラリを調整した。作製したライブラリについてＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて塩基配列を決定後、得られたリードの精査を行った。次に全サンプルのリードを混合し、Ｔｒｉｎｉｔｙ ｖ２．６．６を用いてアセンブルすることによりコンティグ配列を取得した。さらに、得られたコンティグ配列に対し、ＲＳＥＭ １．３．０を用いて各サンプルのペアリードをそれぞれマッピングし、ＦＰＫＭ値を算出することで発現量とした。
＜遺伝子機能の推定＞
上記で得られたコンティグ配列について、ＮＣＢＩ ＮＲとＡｒａｐｏｒｔ１１に対するＢＬＡＳＴ検索を行い、機能アノテーション（遺伝子機能の推定）を行った。
＜フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の候補遺伝子の完全長ｃＤＮＡの取得＞
得られたコンティグ配列の中から「Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」をキーワードとして検索を行い、候補となる遺伝子を４５４個取得した。このうち、発現量が高く、かつ主に花弁で発現しているコンティグ配列を選抜し、候補を３７個に絞った。これらにオオムギのフラボノイド７－Ｏ－メチル基転移酵素遺伝子（Ｆ１－ＯＭＴ、非特許文献１０）、ウマゴヤシのイソフラボン７－Ｏ－メチル基転移酵素遺伝子（ＭｔＩＯＭＴ２、非特許文献１１）など既報のメチル基転移酵素遺伝子３２個を加えて系統樹を作成することにより候補遺伝子としてＤＮ１３４０６７を選抜した。アセンブルによって得られた完全長ｃＤＮＡの配列をもとにプライマーを作製し、以下の方法で完全長ｃＤＮＡクローンを取得した。
上記で単離したオオボウシバナ花弁の全ＲＮＡを鋳型にしてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を用いて製造者が推奨する方法に従い、ｃＤＮＡを合成した。得られたオオボウシバナ花弁ｃＤＮＡを鋳型にして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（ＴＡＫＡＲＡ）により製造業者が推奨する方法に従って、反応体積５０μｌにてＰＣＲ反応を行った（９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃１５秒のサイクルを３０サイクル繰り返したのち、４℃で保持した）。このようにして得られたＤＮ１３４０６７の塩基配列をＤＮＡシークエンサー ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて決定した。
ＤＮ１３４０６７と既知のメチル基転移酵素遺伝子とのアミノ酸レベルでの相同性を調べたところ、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）由来フラボノイド７－Ｏ－メチルトランスフェラーゼとの相同性は２５％であり、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｃｔｕｌａ）由来イソフラボン７－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＭｔＩＯＭＴ１）との相同性は２６％であり、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｃｔｕｌａ）由来イソフラボン／イソフラボン７－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＭｔＩＯＭＴ２）との相同性は２５％であり、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）由来イソフラボンＯ－メチルトランスフェラーゼとの相同性は２６％であり、そして、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｅｃｈｉｎａｔａ）由来ダイゼイン ７－Ｏ－メチルトランスフェラーゼとの相同性は２６％であった。したがって、ＤＮ１３４０６７は、既知のメチル基転移酵素遺伝子とは明確に区別される。
［実施例１８：フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質の大腸菌における酵素活性測定］
＜大腸菌発現用ベクターの作製＞
ＤＮ１３４０６７をフラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質候補とし、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者が推奨する方法に従って、ＤＮ１３４０６７の完全長を含む大腸菌発現用ベクター（ｐＥＴ１５ｂ－ＤＮ１３４０６７）を作製した。
＜メチル基転移酵素の大腸菌での発現＞
ｐＥＴ１５ｂ－ＤＮ１３４０６７を、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、大腸菌株ＢＬ２１へ導入し、形質転換大腸菌を取得した。この大腸菌をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液２ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、５０ｍｌの培養液に加え、１６℃で二晩本培養した。
二晩本培養した大腸菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した菌体をソニックバッファー（組成；ＫＰＢ（ｐＨ７．５）：４０ｍＭ、ジチオスレイトール：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸：５０μＭ、エチレンジアミン四酢酸：５００μＭ、ＭｇＣｌ２：２ｍＭ、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）：１μＭ）に懸濁した。大腸菌１ｇに対して、５ｍｌのソニックバッファーを加えた。懸濁した大腸菌を超音波処理により粉砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して、上清を回収した。その上清を、ＤＮ１３４０６７を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ－２６ＸＰ（ローター：ＪＡ－２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
８μｌの１ｍＭのイソビテキシン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）、２０μｌの１０ｍＭのＳＡＭ、２０μｌの１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０μｌの１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ７．５）を混合して水で５８μｌになるように調整した混合液を３０℃で１０分間保持した後、２μｌのＤＮ１３４０６７を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を加え、酵素反応を行った（３０℃で３０分間）。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて酵素反応を停止させ、その酵素反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））で分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ－Ｍ２０Ａを用いて、３３０ｎｍで検出した。カラムはＳｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の９：１の混合液から８：２の混合液までの２０分間の直線濃度勾配、両者の８：２の混合液から２：８の混合液までの１５分間の直線濃度勾配、両者の２：８の混合液から０：１０の混合液までの５分間の直線濃度勾配とそれにつづく１分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、インサートを挿入しないｐＥＴ１５ｂベクターを導入した大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を用いて同様の実験を行った。
その結果、ＤＮ１３４０６７を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液とイソビテキシンを酵素反応させた酵素反応液から、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基がメチル化されたスウェルティシンのピークが検出された（図４参照）。同じ反応条件下で基質をイソオリエンチン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）として酵素反応を行った場合には、イソオリエンチンの７位の水酸基がメチル化されたスウェルティアジアポニンのピークが検出された（図５参照）。さらに、表１７に記載の各種フラボノイド化合物（サポナリン（イソビテキシン４’－グルコシド）、アピゲニン、ルテオリン、アピゲニン４’－グルコシド、ルテオリン４’－グルコシド、デルフィニジン３－グルコシド、ペチュニジン３－グルコシド、デルフィニジン３，５－ジグルコシド）とＤＮ１３４０６７を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を酵素反応させたところ、酵素反応液から基質以外のピークは検出されなかった。
なお、アントシアニン（デルフィニジン３－グルコシド、ペチュニジン３－グルコシド、デルフィニジン３，５－ジグルコシド）を基質として酵素反応を行ったとき、酵素反応条件を３０℃、１５分とし、停止バッファーとして０．１％ＴＦＡ、０．２４Ｎ塩酸を含む９０％アセトニトリル水溶液を利用した。また、酵素反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））で分析するときには、検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ－Ｍ２０Ａを用いて、５２０ｎｍで検出した。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＤＥ－４１３Ｌ（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの１５分間の直線濃度勾配とそれにつづく５分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。
Figure 0007405836000017
これらの結果より、ＤＮ１３４０６７がフラボンＣ－配糖体の７位の水酸基に特異的にメチル基を転移する活性を示すことが明らかとなり、ＤＮ１３４０６７がフラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である可能性が示された。また、ＤＮ１３４０６７はイソビテキシンに対してもっとも強いメチル基転移活性を示した。
以上の結果から、本遺伝子をフラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子と同定し、ＣｃＦｎ－７ＯＭＴとした。
［実施例１９：フラボンの７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のペチュニアにおける発現］
本発明のＣｃＦｎ－７ＯＭＴ遺伝子が植物にてフラボンの７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するかどうかを確かめるため、ＣｃＦｎ－７ＯＭＴ遺伝子を導入したバイナリーベクターｐＳＰＢ７６０７を構築した。本ベクターはｐＢＩＮＰＬＵＳを基本骨格とし、以下の３つの発現カセットが含まれている。
（１）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとオオボウシバナ由来ＣｃＦｎ－７ＯＭＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号３４）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
（２）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとトレニア由来ＦＮＳ完全長ｃＤＮＡ（配列番号１９）とＤ８ターミネーター
（３）Ｅｌ2３５Ｓプロモーターとリンドウ由来ＣＧＴ完全長ｃＤＮＡ（配列番号２１）とシロイヌナズナ由来ＨＳＰターミネーター
本バイナリーベクターは植物においてはオオボウシバナのＣｃＦｎ－７ＯＭＴ遺伝子とトレニアのＦＮＳ遺伝子、リンドウのＣＧＴ遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したｐＳＰＢ７６０７をペチュニア品種「サフィニア ブーケ レッド」へ導入し、計１９個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、９個体の形質転換体でフラボンＣ－配糖体の７位がメチル化されたスウェルティシン（アピゲニン７－メチル－６－Ｃ－グルコシド）及びスウェルティアジャポニン（ルテオリン７－メチル－６－Ｃ－グルコシド）の蓄積が確認でき、総フラボンＣ－配糖体量に対する７－メチル化体の含有率は最高８８．５％（平均８３．６％）であった（表１８）。
Figure 0007405836000018
宿主：サフィニア ブーケ レッド
Ｑ：クェルセチン、Ｋ：ケンフェロール
Ｌｕｔ：ルテオリン、Ａｐｉ：アピゲニン、ＩＶＸ：イソビテキシン、Ｉｏｒｉ：イソオリエンチン、Ｓｗｅ：スウェルティシン、Ｓｗａｊ：スウェルティアジャポニン
本系統においてこれらの７－メチル化体以外に、２種類のフラボンＣ－配糖体、イソビテキシン（アピゲニン６－Ｃ－グルコシド）とイソオリエンチン（ルテオリン６－Ｃ－グルコシド）が検出された。一方、宿主ではいずれのフラボンＣ－配糖体も検出されなかった。以上のことから、ＣｃＦｎ－７ＯＭＴは植物においてフラボンの７位へのメチル基転移活性を有することが明らかとなった。本遺伝子を利用することにより、植物にてフラボンＣ－配糖体の７－メチル化体を効率的に生成することが可能となる。
［実施例２０：フラボンＣ－配糖体の７－メチル化体を含むペチュニアの花色の評価］
実施例１９で作出されたフラボンＣ－配糖体の７－メチル化体を含む形質転換体（ペチュニア品種「サフィニア ブーケ レッド」を宿主とする）と宿主（主な色素としてシアニジンを蓄積）について、それぞれの花弁の色彩を分光測色計ＣＭ－７００ｄ（コニカミノルタ株式会社）を用いて１０度視野、Ｄ６５光源で測定し、色彩管理ソフトＳｐｅｃｔｒａＭａｇｉｃＴＭ（コニカミノルタ株式会社）で解析を行った。
スウェルティシン及びスウェルティアジャポニンが検出されたすべての個体で花弁の色相角度が青色方向へシフトしていた。また、それらの含有量が多くなるほどその傾向がより顕著で、花色がピンク色（青色方向）に大きく変化した。以上の結果から、ペチュニアにおいてフラボンＣ－配糖体の７－メチル化体の共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。
結果を表１８と１９に示す。
Figure 0007405836000019

Claims (21)

  1. 以下の（ａ）～（ｄ）：
    （ａ）配列番号３４の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボンＣ－配糖体の７位の水酸基にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
  2. 配列番号３４の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 配列番号３５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質。
  5. 請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  6. フラボン合成酵素（ＦＮＳ）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項５に記載のベクター。
  7. 前記ＦＮＳ遺伝子又はそのホモログが、
    （１－ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；

    （１－ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （１－ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦＮＳとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （１－ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦＮＳとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
    前記ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
    （２－ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （２－ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （２－ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＣＧＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （２－ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＣＧＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項６に記載のベクター。
  8. 前記ベクターが、フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項６又は７に記載のベクター。
  9. 前記Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
    （３－ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （３－ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （３－ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦ３’５’Ｈとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （３－ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦ３’５’Ｈとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
    前記ＭＴ遺伝子又はそのホモログが、
    （４－ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （４－ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （４－ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＭＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （４－ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＭＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項８に記載のベクター。
  10. 前記ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）遺伝子由来５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）（配列番号２３）が付加されている、請求項７～９のいずれか１項に記載のベクター。
  11. フラバノン２－水酸化酵素（Ｆ２Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、フラボンＣ－配糖化酵素（ＣＧＴ）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（ＦＤＨ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項５に記載のベクター。
  12. フラボノイドＦ３’５’水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素（ＭＴ）遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項１１に記載のベクター。
  13. 前記Ｆ２Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
    （５－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （５－ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （５－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦ２Ｈとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （５－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦ２Ｈとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
    前記ＣＧＴ遺伝子又はそのホモログが、
    （６－ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （６－ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （６－ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＣＧＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （６－ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＣＧＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
    前記ＦＤＨ遺伝子又はそのホモログが、
    （７－ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （７－ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （７－ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦＤＨとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （７－ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦＤＨとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
    前記Ｆ３’５’Ｈ遺伝子又はそのホモログが、
    （８－ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （８－ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （８－ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦ３’５’Ｈとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （８－ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＦ３’５’Ｈとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
    前記ＭＴ遺伝子又はそのホモログが、
    （９－ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （９－ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （９－ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＭＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （９－ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９－ｂ）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質と同様のＭＴとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項１２に記載のベクター。
  14. 請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換植物（ただし、前記植物がオオボウシバナである場合を除く）、又はその自殖もしくは他殖後代。
  15. 前記植物がバラ、ペチュニア、キク、カーネーション又はユリから選択される、請求項１４に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
  16. 前記植物がバラである、請求項１５に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
  17. 請求項１４～１６のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
  18. 請求項１４～１６のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
  19. 細胞中のフラボンＣ－配糖体の７位の水酸基がメチルされた形質転換植物を作製するための方法であって、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項５～１３のいずれか１項に記載のベクターを植物の細胞内に導入する工程を含む、方法。
  20. 前記植物がバラ、ペチュニア、キク、カーネーション又はユリから選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記植物がバラである、請求項２０に記載の方法。
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