CN112813084B - 一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用，属于生物技术领域。该假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1446 bp；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了481个氨基酸残基，可用于制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷。本发明首次在山蚂蝗属植物假地豆中发现一种碳糖基转移酶，具有催化以二羟基柚皮素为底物生成牡荆素、异牡荆素和催化以二羟基柚皮素葡萄糖碳苷为底物生成夏佛塔苷和异夏佛塔苷功能，为在植物体外异源表达牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷提供了高效的生物合成方法。

Description

一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhC GT1基因及在制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷上的应用。

背景技术

药用植物假地豆Desmodium heterocarpon(L.)DC.为豆科(Leguminosae)山蚂蝗属(Desmodium)，在国内外均有分布，我国主要分布于云南和广东等地区。假地豆全草入药，具有止痛、清热、利尿、消炎、平肝、解毒、活血、止咳平喘的功效。据《中华本草》记载假地豆对治疗流行性乙型脑炎、肝炎、腮腺炎效果显著。假地豆中主要含有黄酮苷、生物碱、萜类等药用成分，具有较高的药用价值和饲用价值。相关文献报道，夏佛塔苷和异夏佛塔苷是广泛存在于粮食作物和中草药等高等植物中的具有生物活性的天然产物。它们的生物合成可能与植物防御有关。它们对哺乳动物具有多种生物活性，包括抗呼吸道病毒、抗糖尿病、抗高血压、保肝、抗炎和抗氧化活性，这预示着它们作为药物或膳食补充剂的潜在应用。

目前，针对氧糖基转移酶(OGTs)的研究较为广泛，但对碳糖基转移酶(CGTs)的关注较少。近些年来，黄酮碳苷以其显著的药理活性和不易水解的稳定结构吸引了科研人员对CGTs的广泛关注。目前研究发现CGT基因主要有水稻、玉米、小麦、芒果、葛根、三花龙胆、金橘、蜜柑、石斛、山葵、光果甘草、芦荟、黄芩和金莲花等14种单子叶和双子叶植物中。植物中的大部分CGT能够一步催化2-羟基黄烷酮发生碳糖基化生成相应黄酮的6位和8位单碳糖苷，如牡荆素、异牡荆素、葛根素、红草苷和异红草苷等。目前只有黄芩中SbCGTb能二步发生糖基化反应生成双碳糖苷夏佛塔苷和异夏佛塔苷。有关药用植物假地豆中黄酮碳苷的生物合成途径中关键酶CGTs的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因，可作为牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成调控基因以及应用于制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因，该假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1446bp。

本发明第二方面提供上述假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因的编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了481个氨基酸残基。

本发明第三方面提供含有上述假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因中目的基因的重组质粒。

进一步，优选的是，将假地豆碳糖基转移酶DhCGT1基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a-DhCGT1重组质粒。

具体地，与载体pET28a进行同源重组时，DhCGT1基因则需要使用用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：

5'F：cagcaatgggtcgcggatcccgatggatggaaaactaaaaataatg；(SEQ ID NO.3)

3'R：tggtggtgctcgagtgcggccgcaattaatttggaagggaggc。(SEQ ID NO.4)

本发明第四方面提供一种转基因工程菌，含有上述重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述的碳糖基转移酶DhCGT1基因。

进一步，优选的是，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21DE3。

本发明第四方面提供所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因在制备夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用。

进一步，优选的是，以二羟基柚皮素(2-Hydroxynaringgenin)作为底物，以UDP-葡萄糖和UDP-阿拉伯糖作为糖供体，在由所述的碳糖基转移酶DhCGT1基因编码得到的碳糖基转移酶DhCGT1的催化下能催化生成黄酮碳苷化合物。第一步碳糖基化反应在二羟基柚皮素的C-6位或C-8上连接上葡萄糖生成牡荆素或者异牡荆素，第二步糖基化反应以牡荆素或异牡荆素作为底物在C-6位或C-8接上阿拉伯糖从而生成夏佛塔苷或异夏佛塔苷。

本发明通过重组质粒，在体外表达后获得目标蛋白，经进一步对底物二羟基柚皮素进行催化，第一步糖基化反应生成牡荆素或者异牡荆素，第二步糖基化反应以第一步反应生成的产物作为底物进一步糖基化反应生成夏佛塔苷或异夏佛塔苷。

本发明所述的碳糖基转移酶DhCGT1基因，是从假地豆植物根中提取，通过转录组测序及生物信息学技术分析，经大量试验后筛选后得以鉴定出来；采用RNA试剂盒提取假地豆根RNA，并反转成cDNA后进行PCR扩增获得。所述的碳糖基转移酶DhCGT1基因的扩增引物如下所示：

5'F：atggatggaaaactaaaaataatg；(SEQ ID NO.5)

3'R：ttaatttggaagggaggc。(SEQ ID NO.6)

从假地豆中分离并鉴定的碳糖基转移酶DhCGT1，同时也可作生产夏佛塔苷和异夏佛塔苷的重要候选基因，同时，异夏佛塔苷也是寄生植物独脚金种子萌发的抑制剂。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因，可作为夏佛塔苷和异夏佛塔苷的生物合成调控基因以及应用于制备夏佛塔苷和异夏佛塔苷。利用体外生物异源表达生成夏佛塔苷和异夏佛塔苷，解决了依靠野生药用植物资源提取牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的短板，本发明通过通过异源表达的方法通过微生物生物合成牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷，在保护野生药用植物资源的同时，促进了以牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷药物的发展，为牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷在植物化感方面的推广应用提供了基础。

附图说明

图1为牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷推导的合成路径示意图；

图2为推测CGT催化反应生成夏佛塔苷和异夏佛塔苷合成关键示意图；

图3为重组表达质粒pET28a-DhCGT1的构建示意图(用于表达碳糖基转移酶DhCGT1基因)；

图4为DhCGT1重组后的电泳检测；M：NormalRunTM prestained 250bp-I/II DNAladder DNA Marker(250bp-I/II的核酸Marke)r；1：重组目的基因；

图5为DhCGT1的SDS-PAGE蛋白电泳检测图；其中，M：蛋白质分子质量标准；1为DhCGT1对照试验；2为DhCGT1不经过镍柱纯化的目的蛋白电泳检测；3为经过镍柱纯化的后的DhCGT1蛋白的SDS-PAGE蛋白电泳检测；箭头为纯化目标蛋白；

图6为HPLC检测碳糖基转移酶DhCGT1酶活反应产物检测结果；Ⅰ表示4个化合物混合标准品液相分类图；Ⅱ表示酶反应空白对照试验液相检测图；Ⅲ为DhCGT1酶以二羟基柚皮素为底物和以UDP-glucose为糖供提的酶反应生成黄酮单糖牡荆素和异牡荆素的液相检测图；Ⅳ为DhCGT1以二羟基柚皮素和以UDP-glucose和UDP-arabinose 2个糖供提的酶反应生成黄酮双糖夏佛塔苷和异夏佛塔苷；

图7为LC-MS检测标准品的结果；其中，Ⅰ为LC-MS检测混合标准品牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷图谱；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ为LC-MS对标准品分子量提取图谱；a：夏佛碳苷；b：异夏佛碳苷；c：牡荆素；d：异牡荆素；

图8为LC-MS检测反应产物结果；其中，Ⅰ为LC-MS检测DhCGT1以二羟基柚皮素和以UDP-glucose、UDP-arabinose 2个糖供提的酶反应生成黄酮单糖和双糖牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷的检测结果；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ是对酶反应中提取4个化合物分子量图谱；a：夏佛碳苷；b：异夏佛碳苷；c：牡荆素；d：异牡荆素；

图9为碳糖基转移酶DhCGT1催化二羟基柚皮素(2-hydroxynaringenin)的C-6或者C-8第一步糖基化反应和第二步的以牡荆素或异牡荆素C-6和C-8位上的羟基上的碳糖基化反应步骤；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

基于假地豆转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中进行筛选CGT候选基因，同时，以金莲花植物中鉴定到的碳糖基基转移酶(TcCGT1)，光果甘草中的碳糖基基转移酶(Ggcgt)的基因为线索，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，最后发现11个CGT类型碳糖基基转移酶(T cCGT)。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS检测等一系列工作后，最终鉴定出可以催化二羟基柚皮素C-6或C-8位发生碳糖基化反应生成牡荆素或异牡荆素的目标候选碳糖基转移酶DhCGT1基因(图1)。夏佛塔苷和异夏佛塔苷合成二步碳糖基化推测关键反应(图2)，夏佛塔苷和异夏佛塔苷合成的各阶段操作步骤如下：

(1)cDNA模板的制备

取假地豆的叶鲜样液氮速冻，进行RNA提取。总RNA提取采用Magen(广州美基生物科技有限公司)的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒。按试剂盒的操作步骤提取RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

(2)基因扩增及回收

利用引物设计软件Snapgene3.2.1，设计该基因的引物，之后采用Q5高保真酶进行基因扩增。采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物进行PCR反应程序为：98℃、30S；98℃、10S，58℃、30S，72℃、50min，35个循环；72℃、2min。采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物进行PCR体系扩增体系如表1，PCR结束后，跑胶确认扩增成功后进行目的条带回收。

然后再采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物进行PCR反应程序为：98℃、30S；98℃、10S，58℃、30S，72℃、50min，35个循环；72℃、2min。采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物进行PCR体系扩增体系如表2，PCR结束后，跑胶确认扩增成功后进行目的条带回收，获得带同源臂的基因片段。

基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用。

5'F：atggatggaaaactaaaaataatg；(SEQ ID NO.5)

3'R：ttaatttggaagggaggc。(SEQ ID NO.6)

表1

组分	基因扩增体系μL
		Q5高保真酶	25
5'F(SEQ ID NO.5)10μmol/L	1
		3'R(SEQ ID NO.6)10μmol/L	1
cDNA	1
		ddH<sub>2</sub>O	to 50μL

表2

带同源臂的引物如下：

5'F：cagcaatgggtcgcggatcccgatggatggaaaactaaaaataatg；(SEQ ID NO.3)

3'R：tggtggtgctcgagtgcggccgcaattaatttggaagggaggc。(SEQ ID NO.4)

(3)基因重组载体的构建与鉴定

同源重组的示意图详见图3。首先对载体pET28a进行线性化，使用BamH I酶和Not1进行双酶切获得线性化载体如表3。在PCR仪上37℃，40min。同源重组时则按照同源重组酶的操作说明进行组装，然后根据插入带同源臂的基因片段和载体的浓度，并按照重组说明计算各组分用量；最后在冰上将各组分加入到PCR反应管中如表4，同源重组PCR反应程序为：98℃、30S；98℃、10S，58℃、30S，72℃、50min，35个循环；72℃、2min。组装后对结果检测并送公司测序，组装后的电泳检测结果见图4，表明组装成功。按以下过程重组操作：

表3酶切反应体系

组分	酶切反应体系μL
		pET28a	X
1×Buffer	5
		BamH I	2
Not1	2
		ddH<sub>2</sub>O	to 50μL

其中X＝1000/pET28a质粒提取浓度

表4候选基因重组反应体系

组分	重组反应μL
		线化化pET28a	X
带同源臂的基因片段	Y
		5×CE II Buffer	4
Exnase II	2
		ddH<sub>2</sub>O	to 20μL

其中，X＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/线化化pET28a浓度ng/μL；Y＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/DhCGT1回收浓度ng/μL；

(4)SDS-PAGE蛋白电泳检测

经蛋白表达小试后确定后进行扩大表达，DhCGT1蛋白诱导条件为：16℃、0.1mM的IPTG、220r/min，诱导18h，以未导入目的基因的Pet28a空载体为对照试验；诱导结束后收菌(4℃，5000rpm)、破壁，经离心(4℃，3600rpm)后获得蛋白上清，再经80mM的咪唑洗脱过镍柱后浓缩，采用SDS-PAGE蛋白电泳和检测。检测结果见图5，由图可知，目的DhCGT1基因在与蛋白Marker50KD处有一条带，而对照试验中为发现目的条带，从而初步确定DhCGT1基因已成功表达

(5)酶活反应

DhCGT1酶活性是通过发生碳糖基化反应合成夏佛塔苷和异夏佛塔苷来确定的，在200ul离心管中进行。反应体系中混合物包含：20mM二羟基柚皮素、100mM UDP-葡萄糖、100mM UDP-阿拉伯糖、80mMTris-hcl缓冲液(pH 7.5)中加入40μg纯化的重组蛋白DhCGT1，反应体系总体积为100μL。在30℃下孵育12小时，用100ul甲醇终止反应，之后短暂离心，取上清。通过HPLC和LC-MS分析，进行反应产物检测。

(6)产物检测

HPLC检测条件如下：

HPLC检测所用仪器为安捷伦1290超高效液相色谱仪。色谱柱为ACE AQ C-18column(250mm×4.6mm，5um)，测定夏佛塔苷和异夏佛塔流动相体积浓度为0.01％甲酸水溶液(B)-甲醇(C)-乙腈(D)；梯度洗脱：0～5min，90％B-10％D；5～10min，82％B-18％D；10～17min，80％B-20％C；17～37min，55％B-45％C；37～47min，45％B-55％C；进样量为20ul，检测波长260nm，流速为0.4ml/min，柱温为25℃，检测器为二极管阵列检测器，检测结果见图6，由图可知，DhCGT1酶反应的产物的出峰时间和标准品牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷、异夏佛塔苷的出峰时间一致，初步确定有黄酮碳苷化合物单糖和双糖的的产生。

LC-MS检测条件如下：

为了进一步确认HPLC所检测到的反应产物，采用Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF液相色谱质谱联用仪(LC/MS)进行检测，检测方法如下：质谱条件：离子源采用的是正离子模式，电压：3500V；碎裂电压：135V；锥孔电压：60V；射频电压：750V，扫描范围：100-1000m/z。色谱条件：色谱柱为ACE AQ C-18 column(250mm×4.6mm，5um)，测定夏佛塔苷和异夏佛塔流动相体积浓度为0.01％甲酸水溶液(B)-甲醇(C)-乙腈(D)；梯度洗脱：0～5min，90％B-10％D；5～10min，82％B-18％D；10～17min，80％B-20％C；17～37min，55％B-45％C；37～47min，45％B-55％C；检测波长260nm，流速为0.4ml/min，柱温为25℃，检测器为二极管阵列检测器，检测结果见图7和图9，图8位标准品LC-MS图谱，图9为目标基因酶活反应的LC-MS图谱，从结果中可以看出，反应产物出峰时间和特征峰与标准品牡荆素和异牡荆素；夏佛塔苷和异夏佛塔苷出峰时间和特征峰的结果相吻合，进一步确认生成的产物为夏佛塔苷和异夏佛塔。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQ ID NO.1

SEQ ID NO.2

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggatggaa aactaaaaat aatgtttttg ccgttcctgg gtaaggggca cttgatacca 60

atgagtgaaa tggcgagagc atttagtgga acaagaggag tgaaggcaac catagtgacc 120

acaccactga acgtaggtac tattcgcgcc acaataggaa aaggggatga gtcagagtca 180

gagtcagaga tagaaatcgt aagcgtgaaa ttgccatgtg cagaggcagg cttaccagag 240

ggatgcgaaa atacagagtc cataccatcc ccagacatgg tatttaggtt ctacaaggca 300

acaagcatga tgcaagaacc cttggaacat gtcatccatc aaaaccctcc gcactgcctt 360

attataagtg ctttctaccc gtgggcatct cagttagctg ctaaattaaa aatcccaagc 420

cttgtgttcc acggcaccgg tgccttcgcg ttatgtgcta cagagtgtgt gcaactctac 480

aagcctcaca agaatgtttc ttccgattcg gagtcctttc tgattcctca tcttcccggg 540

gatatccaca tgacaaggat gttgttgcct gactacgcta aaaccgatga cgaaagtgac 600

ttttcaagaa ccttgctaca agtcaaggaa gcagagctcg gaagcttggg ggtcattgtc 660

aacagctttt atgaactgga gaaggtgtac gcagattatt acaaggtact ggggaggagg 720

acctggcata taggtccact ttccctgatc aaccaaaacc aacaggacaa aggcaaccga 780

ggaaagcaag ttgcttccag ttcgattgtt gatgaagcag acattttgaa gtggctcgac 840

tccaagaaac ccaacacggt tgtgtacgtt tgttttggaa gcatagcaaa cttcagcgaa 900

actcagctga cagaaatagc caagggactt gaggattcaa agcaacaatt catatgggtt 960

gtgaggagaa gcaacaggga atggcttccg gaggggtttg agaaaagaat ggaaggaagg 1020

ggaatgatta tatggggttg ggcaccccaa gtgctaatcc ttgaacatca agctgttgga 1080

gcctttgtca cacactgtgg atggaattca actctcgaag cagtgacggc aggggtgccc 1140

atgatcactt ggcccgtctc cgctgaacaa ttttacaatg aaaagtttgt gactgaggta 1200

cttcacatcg gggtccctgt tggtgtcact aaatggtcta gaattttcgg ggacagcata 1260

agcagtcaca aacttgagaa tgcactccat actataatgg ctggctctga atcagatgct 1320

atcagaaaca gagcacgcaa gctttctcaa atggcaagga ctgctgtcca gcaaaacgga 1380

tcttcatact cccaactcac tcatttgata caataccttc gctccattgc ctcccttcca 1440

aattaa 1446

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Asp Gly Lys Leu Lys Ile Met Phe Leu Pro Phe Leu Gly Lys Gly

1 5 10 15

His Leu Ile Pro Met Ser Glu Met Ala Arg Ala Phe Ser Gly Thr Arg

20 25 30

Gly Val Lys Ala Thr Ile Val Thr Thr Pro Leu Asn Val Gly Thr Ile

35 40 45

Arg Ala Thr Ile Gly Lys Gly Asp Glu Ser Glu Ser Glu Ser Glu Ile

50 55 60

Glu Ile Val Ser Val Lys Leu Pro Cys Ala Glu Ala Gly Leu Pro Glu

65 70 75 80

Gly Cys Glu Asn Thr Glu Ser Ile Pro Ser Pro Asp Met Val Phe Arg

85 90 95

Phe Tyr Lys Ala Thr Ser Met Met Gln Glu Pro Leu Glu His Val Ile

100 105 110

His Gln Asn Pro Pro His Cys Leu Ile Ile Ser Ala Phe Tyr Pro Trp

115 120 125

Ala Ser Gln Leu Ala Ala Lys Leu Lys Ile Pro Ser Leu Val Phe His

130 135 140

Gly Thr Gly Ala Phe Ala Leu Cys Ala Thr Glu Cys Val Gln Leu Tyr

145 150 155 160

Lys Pro His Lys Asn Val Ser Ser Asp Ser Glu Ser Phe Leu Ile Pro

165 170 175

His Leu Pro Gly Asp Ile His Met Thr Arg Met Leu Leu Pro Asp Tyr

180 185 190

Ala Lys Thr Asp Asp Glu Ser Asp Phe Ser Arg Thr Leu Leu Gln Val

195 200 205

Lys Glu Ala Glu Leu Gly Ser Leu Gly Val Ile Val Asn Ser Phe Tyr

210 215 220

Glu Leu Glu Lys Val Tyr Ala Asp Tyr Tyr Lys Val Leu Gly Arg Arg

225 230 235 240

Thr Trp His Ile Gly Pro Leu Ser Leu Ile Asn Gln Asn Gln Gln Asp

245 250 255

Lys Gly Asn Arg Gly Lys Gln Val Ala Ser Ser Ser Ile Val Asp Glu

260 265 270

Ala Asp Ile Leu Lys Trp Leu Asp Ser Lys Lys Pro Asn Thr Val Val

275 280 285

Tyr Val Cys Phe Gly Ser Ile Ala Asn Phe Ser Glu Thr Gln Leu Thr

290 295 300

Glu Ile Ala Lys Gly Leu Glu Asp Ser Lys Gln Gln Phe Ile Trp Val

305 310 315 320

Val Arg Arg Ser Asn Arg Glu Trp Leu Pro Glu Gly Phe Glu Lys Arg

325 330 335

Met Glu Gly Arg Gly Met Ile Ile Trp Gly Trp Ala Pro Gln Val Leu

340 345 350

Ile Leu Glu His Gln Ala Val Gly Ala Phe Val Thr His Cys Gly Trp

355 360 365

Asn Ser Thr Leu Glu Ala Val Thr Ala Gly Val Pro Met Ile Thr Trp

370 375 380

Pro Val Ser Ala Glu Gln Phe Tyr Asn Glu Lys Phe Val Thr Glu Val

385 390 395 400

Leu His Ile Gly Val Pro Val Gly Val Thr Lys Trp Ser Arg Ile Phe

405 410 415

Gly Asp Ser Ile Ser Ser His Lys Leu Glu Asn Ala Leu His Thr Ile

420 425 430

Met Ala Gly Ser Glu Ser Asp Ala Ile Arg Asn Arg Ala Arg Lys Leu

435 440 445

Ser Gln Met Ala Arg Thr Ala Val Gln Gln Asn Gly Ser Ser Tyr Ser

450 455 460

Gln Leu Thr His Leu Ile Gln Tyr Leu Arg Ser Ile Ala Ser Leu Pro

465 470 475 480

Asn

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cagcaatggg tcgcggatcc cgatggatgg aaaactaaaa ataatg 46

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tggtggtgct cgagtgcggc cgcaattaat ttggaaggga ggc 43

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atggatggaa aactaaaaat aatg 24

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttaatttgga agggaggc 18

Claims (8)

1.一种假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因，其特征在于，假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因编码的蛋白，其特征在于，该编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的含有假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因的重组质粒，其特征在于，将假地豆碳糖基转移酶DhCGT1基因与pET28a载体同源重组，获得pET28a-DhCGT1重组质粒。

5.一种转基因工程菌，含有权利要求3所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的碳糖基转移酶DhCGT1基因。

6.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21DE3。

7.权利要求1所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因在制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用。

8.根据权利要求7所述的假地豆植物中碳糖基转移酶DhCGT1基因在制备牡荆素、异牡荆素、夏佛塔苷和异夏佛塔苷中的应用，其特征在于：以二羟基柚皮素作为底物，以UDP-葡萄糖和UDP-阿拉伯糖作为糖供体，在由所述的碳糖基转移酶DhCGT1基因编码得到的碳糖基转移酶DhCGT1的催化下催化生成黄酮碳苷化合物；第一步碳糖基化反应在二羟基柚皮素的C-6位或C-8上连接上葡萄糖生成牡荆素或者异牡荆素，第二步糖基化反应以牡荆素或异牡荆素作为底物在C-6位或C-8接上阿拉伯糖从而生成夏佛塔苷或异夏佛塔苷。

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