CN113088502B

CN113088502B - 一种珠子参的糖基化转移酶基因及其应用

Info

Publication number: CN113088502B
Application number: CN202110446073.3A
Authority: CN
Inventors: 张绍鹏; 蒋鹏; 任瑞芳; 左天; 张祚; 张瑞; 史梦华; 郑涵予; 陈平; 程水源
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113088502A

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，公开了一种珠子参的糖基化转移酶基因及其应用。PjmUGT基因为一种从珍稀药用植物珠子参中分离克隆出的一个GT1家族的UDP‑糖基转移酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。将该基因构建原核表达载体，并通过体外酶活实验对其催化的糖基化反应进行了生物学功能验证，表明本发明所克隆的PjmUGT基因具有催化原人参二醇型皂苷单体Rd产生Rb1的功能。该基因的发现，为揭示珠子参皂苷的糖基化修饰机制，并为最终基于合成生物学实现珠子参皂苷的体外合成提供理论科学依据。

Description

一种珠子参的糖基化转移酶基因及其应用

技术领域

本发明属于药用植物的生物技术领域。具体涉及从珠子参(Panax japonicusC.A.Mey.var.major)中分离、克隆得到一个GT1家族的UDP-糖基转移酶基因PjmUGT，还涉及该基因在皂苷苷元的糖基化过程中的应用，将该基因进行体外的蛋白表达和酶促反应，发现皂苷单体Rd能被该糖基转移酶催化形成Rb1。

背景技术

珠子参，是五加科人参属植物珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Burk)C.Y.Wu et K.M.Feng)的干燥根茎，为《中国药典》的收载品种。因其根茎部位的形态呈串珠状，故得名为珠子参。历史上珠子参根茎是我国土家族、苗族等少数民族地区长期使用的名贵中药材，其性温，味甘微苦，临床上以抗炎、镇痛、治疗风湿、保护心脑血管为主(陈龙全等，2003；贾占红等，2011；魏娜等，2013；郑琦等，2015)。

三萜皂苷是决定珠子参药理活性的主要成分。三萜皂苷的生物合成途径以2，3-氧化角鲨烯为中心可以分为上游MVA途径和MEP途径，以及下游环化、羟基化和糖基化步骤。糖基化反应是皂苷合成途径中的最后一步，也是决定单体皂苷活性的关键一步(Augustin JMet al.,2011)。因此，对皂苷合成途径中的糖基转移酶的研究是当下的研究热点。

根据氨基酸序列的相似性和化学反应形式，糖基转移酶可以划分为99个家族。在这99个家族里面，GT1是植物界里面最大的一个糖基转移酶家族，GT1家族的糖基转移酶都是以活化的尿苷二磷酸糖类作为糖基供体，因此被称为UGTs(Uridine diphosphateglycosyltr ansferases)(Lim CE et al.,2006)。植物中GT1家族的氨基酸序列大部分在C端有一个比较保守的PSPG(plant secondary product glucosyltransferase)盒，它是由44个氨基酸残基组成，是糖基转移酶与UDP糖基供体识别的潜在结合位点(Yi XY et al.,2015)。

近年来，国内外学者对人参属植物中的糖基转移酶基因做了许多研究。但迄今为止，对珠子参中的皂苷糖基基转移酶基因的研究却鲜有报道。我们在前期已经完成了珠子参根茎不同部位的比较转录组分析，并从中筛选到大量具有PSPG盒的UGT候选基因。因此，进一步克隆和鉴定珠子参中特有的UGT基因对阐明珠子参皂苷的糖基化修饰机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种皂苷骨架的糖基化转移酶基因，该基因是从珍稀人参属植物的珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.major)中分离、克隆出的一个GT1家族的UDP-糖基转移酶，该蛋白拥有一个保守的PSPG保守域，是典型的植物GT1蛋白，申请人将其命名为PjmUGT，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。

本发明另一个目的在于提供了珠子参UDP-糖基转移酶基因PjmUGT在皂苷单体修饰反应中的应用，将该基因进行体外原核表达，表达蛋白具有皂苷单体的糖基转移功能。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人基于本实验室的珠子参转录组数据，利用PCR克隆技术从珠子参克隆得到一个新基因PjmUGT，申请人利用原核表达、蛋白纯化及体外酶活鉴定分析了该基因的表达功能，结果表明PjmUGT基因的表达蛋白具有以原人参二醇型皂苷Rd为底物，以UDP-Glc为糖供体，催化形成Rb1的功能。说明PjmUGT对于皂苷单体的糖基化修饰有一定的调控作用，表明PjmUGT基因是一个负责皂苷糖基化修饰的基因。所述基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，它包含1362bp的开放阅读框，编码453个氨基酸，等电点为6.01，预测的分子量为51.22kDa。以引物(5’-GGATCCCATGGATACCGAAAAGCTTCAT-3’和5’-CTCGAGTTAAATTAATTTTTTTAACCTCCT-3’)，以珠子参根茎部位的cDNA为模板，利用PCR技术克隆得到上述基因PjmUGT的cDNA全长序列。

利用本发明提供的原核表达载体，通过体外酶促反应，表明本发明所克隆的PjmUGT基因具有在皂苷Rd上添加糖基化的功能。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次在珠子参中克隆得到一个皂苷苷元的糖基转移酶基因，该基因的编码序列与其他序列的最高相似度仅为73.67％，因此本领域技术人员是难以通过设计简并引物或者通过保守序列设计引物获得的。该基因参与皂苷Rd糖基化修饰，明确了其糖基化修饰的功能；该基因的发现，为人参属植物的皂苷的体外合成提供了新的基因元件，为揭示珠子参皂苷的糖基化修饰机制，提供理论科学依据。

附图说明

图1为一种PjmUGT基因的PCR扩增电泳图。

其中：M为DL 5000Marker，泳道1-4均为PCR产物电泳结果

图2为PjmUGT基因的PCR产物回收电泳图。

其中：M为DL 1500Marker，泳道1-3为回收目的片段。

图3为PjmUGT基因连接到克隆载体pMD18-T的双酶切验证电泳图。

图4为PjmUGT基因连接到表达载体的双酶切验证电泳图。

其中：泳道1为pET-28a的重组载体酶切样，泳道2为pET-22b的重组载体酶切样。

图5为重组质粒导入表达工程菌BL21后的表达蛋白SDS-PAGE电泳图。

其中：框内为目的蛋白条带。

图6为PjmUGT基因表达蛋白的体外酶促反应的HPLC图。

其中，A图为糖供体UDP-Glc标准品的HPLC图；B图为反应底物Rd标准品的HPLC图；C图为Rb1标准品的HPLC图；D图为酶促反应后的底物和产物的HPLC图。

图7为人参皂苷Rd通过PjmUGT蛋白的糖基化修饰反应添加一个Glc糖基后形成皂苷Rb₁的示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：珠子参PjmUGT基因全长cDNA的克隆

以珠子参cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列为：5’-GGATCCCATGGATACCGAAAAGCTTCAT-3’和5’-CTCGAGTTAAATTAATTTTTTTAACCTCCT-3’，扩增条件的电泳结果见图1.

采用3S柱离心式琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒对扩增得到产物进行纯化回收，纯化产物与

18-T载体(TaKaRa,Japan)进行连接，连接体系见表3，16℃孵育30min后转化大肠杆菌JM109感受态细胞。

表1基因扩增体系

表2基因扩增PCR程序

转化后12-16h挑取平板上单克隆于1.5mL离心管，加入含相应抗生素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养至菌液浑浊，而后进行菌液PCR鉴定(图2)。

获得阳性克隆后，将阳性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司测序，根据测序结果，获得PjmUGT的基因全长序列。

表3

18-T载体连接体系

测序结果发现该基因含一个ORF，长度为1362bp，编码453个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量为51.22kDa，等电点为6.01，将该基因命名为PjmUGT，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白的核苷酸为SEQ ID NO.1所示序列。通过FIMO(Find Individual MotifOccurrences)软件分析发现，该蛋白序列具有PSPG motif:WAPQAKILGHSSTGGFVSHCGWSSVTESSSYGVPVIAIPMNFDQ(p＝4.49e-21)。

实施例2：珠子参PjmUGT基因的原核表达载体的构建

在完成序列的克隆操作后，进一步通过双酶切的手段，将目的片段以特异的两个酶切位点切除下来，以便后续原核表达工作，本申请选取的双酶切位点为BamH I和Xhol，而双酶切体系如表4。配置完成后，将样品置于37℃恒温培养箱中两个小时，保证其充分酶切，随后对样品进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压125V)(图3)。

表4双酶切体系

使用限制性内切酶BamHI及Xhol对表达载体pET-28a及pET-22b进行酶切(本发明尝试了两种表达载体对目的蛋白的表达)，酶切条件为于恒温(37℃)培养箱中静置2小时，酶切体系见表5。

表5表达载体的酶切体系

并将已被上述两种内切酶酶切后的PjmUGT-18T质粒与酶切完成后的表达载体进行酶连，酶连体系见表6。

将上述酶连体系置于16℃冰浴中过夜18小时，将所得产物转化至BL21感受态细胞中，随后同样通过LB固体培养基获得单一的大菌落后，进行挑斑培养，获得目的菌液，在超净台中，使用无菌枪头，蘸取平板上生长较好的较大的单一菌落，随后将枪头蘸取菌种一端置于2mL的液体LB培养基(Ka抗性)中，通常挑取4-6个菌落，后置于37℃摇床中180rpm条件下培养8-14个小时，后进行菌液PCR鉴定，筛选出成功连接上的阳性克隆，随后提取质粒，并对提取的质粒进行双酶切鉴定(图4)。

表6表达载体的酶连体系

实施例3：珠子参PjmUGT基因的诱导表达及蛋白纯化

1，蛋白诱导表达

从实施例2中培养完成的固体培养基中挑取单一的大菌落，接种至含有2mL的LB液体培养基(Ka抗性)的10mL离心管中，置于37℃恒温振荡培养箱中培养过夜，第二天将培养完成的2mL菌液加入至含200mL的LB液体培养基(Ka抗性)的锥形瓶中，置于37℃恒温振荡培养箱中培养3-4小时，待OD值位于0.6-0.8之间，将锥形瓶取出，置于无菌冰箱中降温至4-6℃，随后加入200ul的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，在16℃，180rpm条件下诱导表达18小时。

2，蛋白提取

培养完成的200mL菌液在5000rpm，4℃条件下离心十分钟，弃上清后，使用配置完成的Lysis Buffer对沉淀菌体进行洗涤裂解，终体积为40ul，随后对溶解的菌液进行冰浴超声破碎(注意超声柱头不可以碰到管壁)，超声条件为：超声功率500W，超声时间10S，间隔时间15s，破碎全时长30分钟，待菌液变成较为清澈透明状后，取1mL作电泳备用，剩余溶液在4℃，15000g条件下进行超高速离心，后取上清弃沉淀，上清即为提取的蛋白质，并留取1mL上清做电泳验证。

3，蛋白纯化

将破碎后的菌液用干净无菌的注射器经0.45um的滤膜过滤。首先用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。随后使用至少5倍柱床体积的Lysis Buffer平衡色谱柱。平衡完成后，将提取的蛋白上样至Ni柱中，上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积可能会造成很大的反压，导致无法顺利过柱子，样品全部过完注资后，用Wash Buffer冲洗柱子，随后再使用Elution Buffer采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中，通常5倍柱体积洗脱液就足够了。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多，来分离不同结合强度的蛋白质。

4，蛋白浓缩

将纯化后的蛋白质倒入超速离心滤管中，通过高速离心机在25℃，4000g的条件下离心30分钟，进行超滤浓缩。使用酶标仪对蛋白浓度进行测定(表7)。

表7原核表达纯化蛋白样吸光度

对破碎前的全菌液蛋白、破碎后菌液取样、破碎后取上清样品以及蛋白纯化后样品，对pET-22b及pET-28a的分别取全菌、上清、破碎、纯化蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，结果如图5所示，所使用的两种载体均表达出相应的目的蛋白，其大小位于55KDa处左右，与预测结果蛋白大小51.22KDa基本一致，二载体的蛋白表达除上清取样中无明显目的蛋白条带，其余蛋白样品表达量均达到后续的酶活实验要求标准。

实施例4：珠子参PjmUGT基因表达蛋白的体外酶活检测

PjmUGT蛋白候选底物分别为人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rd等，并分别以UDP-Glc及UDP-GlcA作为糖供体，进行了相应的酶活实验，对酶活实验后的产物进行高效液相色谱分析，检测是否有新的产物生成。

酶活样品处理：将反应的各组分按如下体系配制完成(表8)。配制混匀后，将上述体系置于37℃中反应2.5小时，反应完成后，置于100℃中加热灭活残余酶，将反应产物在12000rpm条件下离心3-5分钟，随后使用色谱级乙酸乙酯进行萃取，取有机相放入新的RNase free离心管中，置于50℃水浴中挥发蒸干，再使用300ul色谱级甲醇溶解，经过0.22um的有机滤膜过滤后，注入液相进样瓶中待用。

表8酶促反应体系

高效液相色谱检测条件为：使用色谱柱型号为TC-C18(4.6×250mm，5um)，检测柱温35℃，检测波长203nm，进样量10ul，流速为1.0mL/min，使用流动相为超纯水和乙腈。洗脱程序为：0-25min(水：10％-19％，乙腈：90％-81％)，25-50min(水：19％-29％，乙腈：81％-71％)。

最后结果发现，仅当糖供体为UDP-Glc，底物为人参皂苷Rd时，本发明的PjmUGT蛋白可发生催化作用，将人参皂苷Rd催化为Rb₁，糖基修饰过程如图7所示。

高效液相色谱图的结果见图6。图6中A为糖供体UDP-Glc在同一检测条件下的出峰时间，为2.710分钟；图6中B为人参皂苷Rd标准品，Rd出峰时间为12.820分钟；图6中C为，人参皂苷Rb1标准品，Rb1出峰时间为8.570分钟。如图6中D所示，在加入Pj mUGT蛋白进行反应后，糖供体以及反应底物人参皂苷Rd的峰值显著下降，同时在8.5分钟的位置，出现了一组新峰。对照Rb₁标品的峰图，新的酶活产物即为Rb₁。

序列表

<110> 武汉轻工大学

<120> 一种珠子参的糖基化转移酶基因及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccactg aggaagctag tttgagagtt atgatgttcc catggctagg ctatggacac 60

gtatcaccat ttttagagct agccaaaaaa ctctccgcca aaaacttcca tatttacttt 120

tgctccacac ccatcaacct caattccatc aaaaacagaa ttgattcact ctcctcctcc 180

atagaactag tagaattcca cttgccctct tcccctgaac ttcctcctca ttatcacacc 240

accaatggcc taccacacca tcttcacaag acccttttac aggcattcaa tatgtccaaa 300

cccaattttt cagatatttt gaacaatttg aaaccaaatc tcctgatata cgatacttac 360

cagccatggg taccggaaat agcatcttcc catcatattc cggccgtcaa tttccactgt 420

accggcaccg catcttcctg ttttttctat tccaatttca agttgcaggg caaaggcctg 480

cagttcaatt ttccggcaat ttatctccgt gagtcggaga taaggaaaat gattgcatct 540

gcaccgtatg acaccaatgc cgccgaagat cccatctata cttgcgttga aaagtcactt 600

gattttgttc tggttaaaag ctgtagaact attgaggata aatatattaa ttttttctcc 660

caattgttaa acaaaaagat ggtgaccgtg ggcccacttg ctcaatctgg tgaagaagaa 720

gaaaaggagt cagtgattat ggaatggctg agccagaagg gaaaatcctc aactgtgttt 780

gtttcttttg ggagtgagaa ttatttgtgc aataaaaaaa tggaagaact ggcttatggg 840

cttgagctta gcaatgtgaa tttcatatgg gtcattagat ttccatctgg gggtgaaaaa 900

ataaagattg gagatgtatt accagaaggg tatcttgaga gggtaaaaga gagaggattg 960

gtagttgagg ggtgggcccc acagaccaaa atattggggc attcaagtac aggtggattt 1020

gtgagtcact gcgggtggag ttctgtgaca gaaagttcga gctatggggt tccagttatt 1080

gcaattccta tgaattttga ccagccattg aatgcaaggc tgatggtgga gcttggtgct 1140

ggtttggagg ttttgaaaga tgaaaacttg gaattagaaa gaaaagaagt ggcaagagtt 1200

ataagagagg tggtaataga gaaaagtggg gaagaaataa ggaagaaagc aagagaaatg 1260

agtgagaaaa taagatcgaa aggagatgag gagattgatg atggagtaga ggagctgaga 1320

aaaatttgcc acaagaaaaa ccaaattctg gacctgaatt ga 1362

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Glu Glu Ala Ser Leu Arg Val Met Met Phe Pro Trp Leu

1 5 10 15

Gly Tyr Gly His Val Ser Pro Phe Leu Glu Leu Ala Lys Lys Leu Ser

20 25 30

Ala Lys Asn Phe His Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Asn

35 40 45

Ser Ile Lys Asn Arg Ile Asp Ser Leu Ser Ser Ser Ile Glu Leu Val

50 55 60

Glu Phe His Leu Pro Ser Ser Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr

65 70 75 80

Thr Asn Gly Leu Pro His His Leu His Lys Thr Leu Leu Gln Ala Phe

85 90 95

Asn Met Ser Lys Pro Asn Phe Ser Asp Ile Leu Asn Asn Leu Lys Pro

100 105 110

Asn Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Tyr Gln Pro Trp Val Pro Glu Ile Ala

115 120 125

Ser Ser His His Ile Pro Ala Val Asn Phe His Cys Thr Gly Thr Ala

130 135 140

Ser Ser Cys Phe Phe Tyr Ser Asn Phe Lys Leu Gln Gly Lys Gly Leu

145 150 155 160

Gln Phe Asn Phe Pro Ala Ile Tyr Leu Arg Glu Ser Glu Ile Arg Lys

165 170 175

Met Ile Ala Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Asn Ala Ala Glu Asp Pro Ile

180 185 190

Tyr Thr Cys Val Glu Lys Ser Leu Asp Phe Val Leu Val Lys Ser Cys

195 200 205

Arg Thr Ile Glu Asp Lys Tyr Ile Asn Phe Phe Ser Gln Leu Leu Asn

210 215 220

Lys Lys Met Val Thr Val Gly Pro Leu Ala Gln Ser Gly Glu Glu Glu

225 230 235 240

Glu Lys Glu Ser Val Ile Met Glu Trp Leu Ser Gln Lys Gly Lys Ser

245 250 255

Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly Ser Glu Asn Tyr Leu Cys Asn Lys

260 265 270

Lys Met Glu Glu Leu Ala Tyr Gly Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe

275 280 285

Ile Trp Val Ile Arg Phe Pro Ser Gly Gly Glu Lys Ile Lys Ile Gly

290 295 300

Asp Val Leu Pro Glu Gly Tyr Leu Glu Arg Val Lys Glu Arg Gly Leu

305 310 315 320

Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln Thr Lys Ile Leu Gly His Ser Ser

325 330 335

Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys Gly Trp Ser Ser Val Thr Glu Ser

340 345 350

Ser Ser Tyr Gly Val Pro Val Ile Ala Ile Pro Met Asn Phe Asp Gln

355 360 365

Pro Leu Asn Ala Arg Leu Met Val Glu Leu Gly Ala Gly Leu Glu Val

370 375 380

Leu Lys Asp Glu Asn Leu Glu Leu Glu Arg Lys Glu Val Ala Arg Val

385 390 395 400

Ile Arg Glu Val Val Ile Glu Lys Ser Gly Glu Glu Ile Arg Lys Lys

405 410 415

Ala Arg Glu Met Ser Glu Lys Ile Arg Ser Lys Gly Asp Glu Glu Ile

420 425 430

Asp Asp Gly Val Glu Glu Leu Arg Lys Ile Cys His Lys Lys Asn Gln

435 440 445

Ile Leu Asp Leu Asn

450

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatcccatg gataccgaaa agcttcat 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgagttaa attaattttt ttaacctcct 30

<210> 5

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Ala Pro Gln Ala Lys Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe

1 5 10 15

Val Ser His Cys Gly Trp Ser Ser Val Thr Glu Ser Ser Ser Tyr Gly

20 25 30

Val Pro Val Ile Ala Ile Pro Met Asn Phe Asp Gln

35 40

Claims

1. 一种分离的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在促进皂苷的糖基化过程中的应用，在所述糖基化过程中，糖供体为UDP-Glc，底物为人参皂苷Rd。