CN104357419B - 一种灯盏花糖基转移酶、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灯盏花糖基转移酶，包括选自以下(a)～(c)所述的多肽:(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的由(a)衍生的多肽；(c)与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽。

Description

一种灯盏花糖基转移酶、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来自于灯盏花，具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽及其制备和应用。

背景技术

灯盏花[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.]是云南重点开发的“五大天然系列”药物之一。灯盏花最早记载于明代的《滇南本草》，是云南苗族的传统药用植物，其药性味辛、微苦，温，归心、肝经，具有祛风散寒，活血通络止痛等功效，用于风寒湿痹痛，中风瘫痪，胸痹心痛，牙痛，感冒等疾病。灯盏花为菊科飞蓬属多年生植物，以其总黄酮及其灯盏乙素(黄酮)、咖啡酰奎宁酸类化合物为活性成分开发有4个注射液品种，成为云南省最具发展潜力的药用植物之一。其中灯盏乙素具有抗凝血、抗血栓形成，改善血液流变性及微循环，增加脑血流量，抗心肌缺血，提高机体耐缺氧能力等作用，临床上用于治疗脑供血不足、脑出血所致后遗症、高粘脂血症、脑血栓、冠心病、心绞痛等疾病。灯盏乙素的合成途径目前尚不清晰，但是其C7位的糖基化对其生物合成具有重要意义。

虽然目前已经克隆得到一些植物黄酮类的糖基化基因，虽然能够对黄酮类化合物进行糖基化，但其糖基化位置往往没有专一性。如来源于蜡状芽孢杆菌的糖基转移酶，以UDP-葡萄糖为糖基供体，以木犀草素或芹菜素为糖基受体，在7位或4’位的羟基上进行随机的糖基化；又如来源于拟南芥的尿苷二磷酸葡萄糖糖基转移酶(UGT)可对槲皮素进行糖基化，但是糖基化可发生在槲皮素3位、7位、3’位和4’位，得到6种不同的糖基化产物(存在两种双位糖基化产物)。这些糖基化位置不可控的反应往往实际用途不大，能够催化底物在专一位点进行糖基化的糖基转移酶更具应用价值。

来源于不同物种的糖基化酶在蛋白质一级结构上差别很大，未知糖基化酶分离鉴定困难。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽，选自以下(a)～(c)所述的多肽:

(a)、由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的由(a)衍生的多肽；

(c)、与(a)中的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽。

将本发明中，具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽，命名为F7GAT多肽，包括由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽，还包括如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽基础上的保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、类似物。

所述“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明F7GAT多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

它们可以是以下(1)～(4)中任一种多肽：

(1)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代；优选的是保守氨基酸残基；

(2)其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；

(3)其中SEQ ID NO：2所示的多肽与另一种化合物融合，进一步，所述化合物为延长多肽半衰期的化合物，更进一步，如聚乙二醇；

(4)其中附加的氨基酸序列融合进SEQ ID NO：2所示的多肽而形成的多肽序列，进一步所述附加的氨基酸序列为前导序列或分泌序列或用来纯化次多肽的序列或蛋白原序列。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选为重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主，如细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞中产生。根据重组生产方案所使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明的另一目的在于提供一种多核苷酸，选自如下(e)～(h)：

(e)、编码F7GAT多肽的多核苷酸；优选地，为编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成多肽的多核苷酸；更优选地，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1中所示序列或如SEQ IDNO.1中4-1419位所示序列。

(f)、编码F7GAT多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；

(g)、在严格条件下与(e)或(f)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽的多核苷酸；所述两个杂交的多核苷酸序列具有至少50％，优选具有70％的同一性。

其中，与上述条件(f)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。

上述条件(g)中的严格条件是指：(1)在较低的离子强度和较高的温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，优选为97％以上时才发生杂交；并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽具有相同的生物学活性和功能。

(h)、与(e)或(f)或(g)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽的多核苷酸。

本发明所述的多核苷酸还包括上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明F7GAT多肽有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。这些多核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一种多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

进一步，上述多核苷酸为DNA或RNA。

DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码链中编码SEQ ID NO：2所示多肽的编码区序列可以是与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”是指编码具有SEQ ID NO：2多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

本发明还提供一种带有上述多核苷酸序列的cDNA序列，为含有SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于扩增上述多核苷酸全部或部分序列的引物，所述引物包含如下(a)～(d)任一所述序列：

(a)含有如SEQ ID NO.4所述序列中后24bp，或后21bp核苷酸序列；

(b)含有如SEQ ID NO.6所述序列中后24bp，或后21bp核苷酸序列；

(c)含有如SEQ ID NO.5所述序列中后23bp，或后20bp核苷酸序列；

(d)含有如SEQ ID NO.7所述序列中后23bp，或后20bp核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种含有编码F7GAT多肽多核苷酸的重组载体。

上述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的破MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种转入了含有编码F7GAT多肽多核苷酸的重组载体的重组宿主细胞。上述宿主细胞指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、酵母等。

本发明的另一目的在于提供一种具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽的制备方法,包括以下工序:

(1)培养转入了含有编码F7GAT多肽多核苷酸的重组载体的重组宿主细胞；(2)从该重组宿主细胞中提取具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽的粗提物或从该重组宿主细胞中提取具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽。

本发明利用基因重组方法，使重组宿主细胞带有包含本发明多核苷酸全部或部分的表达单元，使重组宿主细胞能够自发地或诱导地表达本发明多肽的全部或部分，该多肽可以通过常规方法被分离纯化而得到，也可以不进行分离纯化。如本发明所用，“表达单元”是指一段DNA或RNA，在宿主细胞中可使其中部分核苷酸启动表达(转录、和/或翻译)并产生特定的多肽。重组宿主细胞表达的本发明多肽，可通过简单的细胞破碎制成包含本发明多肽的细胞粗提物，也可使用本领域常规技术进行分离和纯化，最终得到纯度较高的多肽。多肽纯化、制备方法与表达载体和宿主细胞的选择有关。另外，应当理解，使用胞外体系(如Cell free)合成本发明多肽，其原理与胞内合成多肽差别不大，也在本发明多肽生产方法范围内。

本发明的另一目的在于提供一种产生糖基化产物的方法，该方法在宿主细胞内或细胞外，以黄酮化合物或类黄酮为底物，生产对应糖苷化合物的方法，所述方法选自以下(a)～(b)工序的任一种：

(a)利用所述具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的F7GAT多肽，以黄酮化合物或类黄酮为底物，葡萄糖或葡萄糖醛酸为供体，体外反应生产相应糖基化产物；

(b)利用转入了含有编码F7GAT多肽多核苷酸的重组载体的重组宿主细胞，以黄酮化合物或类黄酮为底物，葡萄糖或葡萄糖醛酸为供体，体外反应生产相应糖基化产物。

优选地，所述葡萄糖或葡萄糖醛酸为UDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖醛酸

优选地，所述黄酮化合物或类黄酮为7位羟基的黄酮类化合物，或含7位羟基的二氢黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类等，或具有类似酚羟基结构的化合物；更优选地，为芹菜素、野黄芩素。

附图说明：

图1为F7GAT编码基因PCR电泳图

图2为带有F7GAT编码基因的重组载体酶切电泳图

图3为重组质粒28a-F7GAT的质粒图谱示意图

图4为重组质粒181-PC-F7GAT的质粒图谱示意图

图5为F7GAT纯化SDS-PAGE电泳图(1,50mM咪唑蛋白缓冲液洗脱蛋白；2,100mM咪唑蛋白缓冲液洗脱蛋白；3，200mM咪唑蛋白缓冲液洗脱蛋白)

图6为F7GAT催化底物与UDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖酸反应产物HPLC-MS分析图

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。

将本发明中，具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽，命名为F7GAT多肽，包括由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽，还包括如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽基础上的保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、类似物。

实施例1 F7GAT的编码核苷酸的获得

根据本发明公布的核苷酸序列信息，可使用下列两种方法中的一种获得F7GAT的编码核苷酸。

方法一，根据序列SEQ ID NO：1的信息对F7GAT的编码核苷酸进行人工合成，或根据氨基酸序列SEQ ID NO：2，针对目标宿主细胞(如大肠杆菌等)对核苷酸序列进行密码子优化后进行人工合成。

方法二，通过灯盏花的基因组或转录组扩增或分离得到。具体来说，可使用常规方法或试剂盒从植物灯盏花中提取DNA或RNA，从而建立灯盏花DNA序列文库或者cDNA文库(SEQ ID NO.3)，以之为模板，使用引物F7GAT-F1(SEQ ID NO.4)和F7GAT-R1(SEQ IDNO.5)，利用常规PCR方法，特异性扩增F7GAT的编码核苷酸。PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示。

实施例2 F7GAT编码基因CDS区的克隆

针对表达F7GAT宿主细胞的不同，选取不同载体进行克隆。

1)克隆至大肠杆菌表达载体pET28-a(+)：

使用引物F7GAT-F1(SEQ ID NO.4)和F7GAT-R1(SEQ ID NO.5)为引物，以包含F7GAT编码核苷酸序列的DNA或RNA为模板进行常规PCR，得到F7GAT的编码核苷酸。

引物F7GAT-F1和F7GAT-R1的5’端带有NdeI和XhoI酶切位点序列，以此PCR所得到产物两端也分别带有NdeI和XhoI酶切位点。

PCR产物纯化。

使用限制性内切酶NdeI和XhoI对载体pET-28a(+)和PCR纯化产物进行酶切。

按照内切酶使用说明对内切酶进行失活。

将酶切后的载体和PCR片段混合，使用T4DNA连接酶使二者发生连接。

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布与LB+卡那霉素的固体平板上进行筛选(37℃过夜培养)。感受态细胞通过氯化钙法进行制备。

转化子接种于5毫升液体LB+卡那霉素培养基中进行震荡培养(37℃、220转/分钟培养8-10小时)。使用质粒提取试剂盒提取质粒。

提取后的质粒用限制性内切酶NdeI和XhoI进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析找出正确克隆的质粒(如图2所示)，进行DNA测序，测序引物为通用引物T7和T7-ter。

测序正确质粒即为目标质粒，命名为28a-F7GAT，其图谱如图3所示

b)克隆至酿酒酵母表达载体YEplac181

酿酒酵母表达首先需要选取合适的启动子与终止子，本实施例中选取酿酒酵母诱导型启动子GAL1与终止子CYC1。首先使用常规方法将诱导型启动子GAL1与终止子CYC1克隆至酿酒酵母表达载体YEplac181，得到重组载体181-PC。

使用引物F7GAT-F2(SEQ ID NO.6)和F7GAT-R2(SEQ ID NO.7)为引物，以包含F7GAT编码核苷酸序列的DNA或RNA为模板进行常规PCR，得到F7GAT的编码核苷酸。

引物F7GAT-F2和F7GAT-R2的5’端带有SalI和XbaI酶切位点序列，以此PCR所得到产物两端也分别带有SalI和XbaI酶切位点。

PCR产物纯化。

使用限制性内切酶SalI和XbaI对载体181-PC和PCR纯化产物进行酶切。

后续连接、转化及转化子验证步骤与本例(a)中类似。

最终将F7GAT编码基因克隆至重组载体181-PC上，所得重组质粒命名为181-PC-F7GAT，其质粒图谱如图4所示。

实施例3 利用重组大肠杆菌表达F7GAT，以及F7GAT的分离和纯化

1.基因的表达

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒28a-F7GAT(构建方法如实施例2a))转入E.coliBL21(DE3)菌株中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan+，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆PET-28a-31047至5mL LB液体培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8时。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan+，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD600为0.6-0.8时，降温至16℃，加终浓度为0.5mMIPTG，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500rpm离心15min；

(4)弃上清，用30mL 0.05M Hepes蛋白缓冲液(50mM Hepes，1M NaCl，5mM MgCl2，pH7.0)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

2.蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH2O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按一定流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用0.05M Hepes蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用30mL 50mM咪唑蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：分别用30mL 100mM，200mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样.

e:SDS-PAGE检测:组氨酸六聚体标签构建在重组蛋白的N末端，将上述制得的样品进行10％SDS-PAGE检测，结果如图5所示，结果显示纯化的重组蛋白在52.5KDa处形成一个单一的条带，即使用100mM咪唑蛋白缓冲液洗脱可得到纯化的F7GAT蛋白。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加10mL 0.05M蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为4mg/mL。即得到纯化浓缩的F7GAT蛋白。

实施例4 利用F7GAT体外合成灯盏乙素和芹菜素7--O--葡萄糖苷

F7GAT可催化黄酮化合物或类黄酮7位羟基与UDP-葡萄糖的葡萄糖基发生转化，形成对应的底物7位葡萄糖苷化合物。催化条件较为简单，只需加入黄酮化合物或类黄酮底物、UDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖醛酸)并缓冲至pH7.5，37℃即可发生反应。本实施例中选用黄酮化合物芹菜素和野黄芩素为底物，分别与UDP-葡萄糖及UDP-葡萄糖醛酸进行反应，具体体系如下：

标准体外酶活检测体系：	200ul
		50mM Tris-HCl，pH7.5：	138ul
野黄芩素/芹菜素(1000mg/L)：	10ul
		0.5mM UDP-sugar/0.5mM UDP-sugar acid：	2ul
F7GAT蛋白(制备、纯化如实施例3)：	50ul

1)反应条件：

反应体系混匀后于37℃反应10min。

反应结束后，12000rpm离心2min,所得上清液用0.22μm过滤后，进行HPLC-MS检测。

2)HPLC-MS检测条件：

a)HPLC：

色谱柱：Angle ABS C18(4.6×250mm)，紫外检测器，检测波长210nm。

流动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液

梯度洗脱程序：(浓度为乙腈百分比)

0min 20％

30min 27％

35min 45％

40min 95％

41min 20％

b)MS检测条件：

正离子模式

核质比(m/z)：100-1200

氮气流速：6.0升/分钟

温度：180℃

雾化器压力：1bar

探头电压：14.5KV。

通过LC-MS分析可知，野黄芩素与芹菜素可分别与UDP-葡萄糖或UDP-葡萄糖醛酸发生反应，生成灯盏乙素等糖基化化合物，结果如图6所示。

Claims (8)

1.一种灯盏花糖基转移酶，其特征在于，具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能，为由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.一种多核苷酸，其特征在于，为编码权利要求1所述多肽的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA或RNA。

4.一种权利要求2所述的多核苷酸的cDNA，其特征在于，为SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。

5.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2、3任一项所述的多核苷酸。

6.一种重组宿主细胞，其特征在于，转入了权利要求5所述的重组载体。

7.一种具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽的制备方法,其特征在于,包括以下工序:

(1)培养权利要求6所述的重组宿主细胞；(2)从该重组宿主细胞中提取具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽的粗提物或从该重组宿主细胞中提取具有在黄酮化合物或类黄酮7位羟基上转移糖功能的多肽。

8.一种产生糖基化产物的方法，其特征在于，选自以下(a)～(b)工序的任一种：

(a)利用权利要求1所述的多肽，以黄酮化合物或类黄酮为底物，葡萄糖或葡萄糖醛酸为供体，体外反应生产相应糖基化产物；

(b)利用权利要求6所述的重组宿主细胞，以黄酮化合物或类黄酮为底物，葡萄糖或葡萄糖醛酸为供体，体外反应生产相应糖基化产物。