CN110760490B - 钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明首次从钝鳞紫背苔克隆得到1个可以催化黄酮醇、黄酮、二氢黄酮的7位羟基糖基化的糖基转移酶PaUGT1，体外酶活功能鉴定证明PaUGT1具有广谱的催化活性，能够催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类以及二羟基查尔酮类化合物糖苷化。其对黄酮醇(槲皮素、山奈酚)，黄酮(芹菜素，木犀草素)等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的7‑O糖基化产物。

Description

钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一种植物次级代谢产物，在植物体内大部分以苷的形式存在。现代研究表明黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗凝血、改善糖和脂类代谢、保护心脑血管系统等重要药用价值。糖基化可以改变植物黄酮类化合物的生理特性和化学活性，比如提高被修饰化合物的生物活性、稳定性、水溶性等。植物体内的黄酮类化合物的糖基化是由糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)催化的，它们将糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体，并形成糖苷键，一般具有较高的特异性。

黄酮糖苷类天然产物多是从植物中分离得到，从植物中提取工艺流程复杂，分离纯化困难使得大规模制备受到限制，且化学合成糖苷涉及区域选择性苷化和立体选择性苷化等原因合成产率较低。糖基转移酶在体外酶活反应时需要提供昂贵的糖供体，而相比之下，利用工程微生物(比如大肠杆菌、酵母)进行体内糖基化可以获得源源不断的UDP糖分子供体。近年来已经通过该方法合成各种类型的黄酮糖苷。目前黄酮醇7-O葡萄糖苷的生物合成研究鲜有报道且黄酮7-O葡萄糖苷(芹菜素-7-O-葡萄糖苷和木樨草素-7-O-葡萄糖苷)的产量相对较低。因此，筛选具有7-O糖基化功能的UGT，阐明它的催化活性，并将其用于黄酮糖苷的合成生物学研究具有重要的意义。

已研究的糖基转移酶多数来源于含有维管植物的高等植物，而苔藓植物中的糖基转移酶极少被鉴定。钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)是一种苔类植物，是从水生到陆生的过渡类型，为了适应干旱的陆地环境，其体内合成丰富的次级代谢产物(包括联苄、萜类和黄酮类化合物等)。目前，钝鳞紫背苔中不同类别的黄酮已经被分离鉴定，但是对苔类植物中催化黄酮糖苷生成的糖基转移酶(GTs)的研究尚未报道。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一种钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用。经研究发现，本发明得到的来自于苔类植物钝鳞紫背苔的糖基转移酶，该酶是能够高效催化黄酮7位羟基糖基化的糖基转移酶，可用于大肠杆菌生物合成黄酮类化合物7-O糖苷，因此具有较高的经济价值。

为实现上述技术目的，本发明采用技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种名为PaUGT1的蛋白质，所述名为PaUGT1的蛋白质来源于钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)。经试验验证，其具有具有催化黄酮7位羟基糖基化的功能。

本发明的又一具体实施方式中，所述PaUGT1是如下(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由469个氨基酸残基组成。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种编码所述PaUGT1的基因。

其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，SEQ ID No.2由1410个核苷酸组成，其中第1-1407为编码序列，第1408-1410位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。

本发明的第二个方面，含有所述基因的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体亦在本发明的保护范围之内。

本发明的又一具体实施方式中，所述重组表达载体为重组原核表达载体，所述重组原核表达载体包括在表达载体pET32a和pETDuet中插入上述编码基因后所得。

本发明的又一具体实施方式中，所述重组细胞为原核细胞，优选为细菌，进一步选自大肠杆菌、芽孢杆菌等；更进一步的，所述重组细胞为含有上述基因和/或重组表达载体的BL21(DE3)。

本发明的又一具体实施方式中，所述转化体包括原核生物。

本发明的第三个方面，所述蛋白质PaUGT1作为糖基转移酶的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明的第四个方面，所述编码基因、重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体在制备PaUGT1中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的第五个方面，提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明的第六个方面，提供所述蛋白质PaUGT1具有如下(d1)或(d2)中的应用：

(d1)催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类和二羟基查尔酮类化合物糖苷化；

(d2)制备黄酮醇糖苷类、黄酮糖苷类、二氢黄酮糖苷类和二羟基查尔酮糖苷类化合物。

本发明的又一具体实施方式中，所述黄酮醇糖苷类化合物包括但不限于槲皮素-7-O-葡萄糖苷和山柰酚-7-O-葡萄糖苷；所述黄酮糖苷类化合物包括但不限于芹菜素-7-O-葡萄糖苷和木樨草素-7-O-葡萄糖苷。

本发明的有益效果：

本发明提供的PaUGT1是首次发现的在钝鳞紫背苔中能够催化黄酮类化合物糖基化的一个7-O糖基转移酶，本发明利用PCR技术从cDNA获得了基因的全长序列。通过构建pET32a蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导、纯化得到目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明PaUGT1具有广谱的催化活性，能够催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类以及二羟基查尔酮类化合物糖苷化。其对黄酮醇(槲皮素、山奈酚)，黄酮(芹菜素，木犀草素)等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的7-O糖基化产物，因此具有较高的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：目的基因PaUGT1的ORF扩增产物的电泳图。

图2：PaUGT1蛋白SDS-PAGE电泳图；

其中：M:蛋白分子质量标准

泳道1：PaUGT1蛋白上清；

泳道2：PaUGT1蛋白纯化。

图3：PaUGT1酶活催化反应的HPLC图谱及产物的鉴定的质谱图谱。反应底物分别为(A)槲皮素、(B)山柰酚、(C)芹菜素、(D)木樨草素、(E)柚皮素、(F)根皮素。

其中：a：槲皮素-7-O-葡萄糖苷；b：槲皮素-3-O-葡萄糖苷；c：山柰酚-7-O-葡萄糖苷；d：山柰酚-3-O-葡萄糖苷；e：芹菜素-7-O-葡萄糖苷；f：木樨草素-7-O-葡萄糖苷；g：柚皮素-7-O-葡萄糖苷；h：根皮苷；i、j：根皮素-O-葡萄糖苷。

图4：VvGT1和PaUGT1与底物互作的的三维结构带状图。山柰酚分子和UDP用棍状模型显示。其中，图4A为VvGT1，图4B为PaUGT1。

图5A：PaUGT1与底物山柰酚互作的关键氨基酸。

图5B：PaUGT1与其突变体蛋白的催化活性。以UDP-葡萄糖为糖供体，5种黄酮类化合物为糖基受体：槲皮素、山柰酚、芹菜素、木樨草素和柚皮素。

图6：PaUGT1和突变体PaUGT1-Q19A的分子对接重叠分析模型。糖基供体：UDP；糖基受体：山柰酚(Kae)。

图7：在大肠杆菌U1饲喂过程中底物浓度对生物转化率的影响。分别以(A)槲皮素、(B)山柰酚、(C)芹菜素和(D)木樨草素为底物进行大肠杆菌U1的体内饲喂，底物浓度梯度设定为75μM、100μM、200μM、300μM、400μM。E：分别饲喂以上四种不同底物的最大转化率。

图8：在大肠杆菌BL21菌株U1和U2中合成7-O-葡萄糖苷。

A:分别以(a)槲皮素、(b)山柰酚、(c)芹菜素和(d)木樨草素为底物饲喂重组菌株U1的代谢产物HPLC图谱及产物的质谱鉴定。

B：饲喂重组菌株U1和U2生成的糖苷产物的定量分析。

图9：以二氢黄酮类化合物为底物生成黄酮7-O-葡萄糖苷的生物合成途径。

图10：底物柚皮素的浓度对重组菌株FU2生物转化率的影响。

图11：利用大肠杆菌FU1生物合成A7G和L7G。

A，C：分别以柚皮素和圣草酚饲喂大肠杆菌FU1生成糖苷化合物的HPLC图谱；

B，D：产物p1和p2的质谱鉴定；

E：大肠杆菌FU1合成A7G和L7G的定量分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1.表达基因PaUGT1的克隆

1.1CTAB-PVP法提取钝鳞紫背苔总RNA

(1)取新鲜的钝鳞紫背苔植物材料，清洗干净，用滤纸吸干多余水分，置于研钵中加液氮研磨至材料成粉末状。

(2)取适量粉末至提前预冷的2mL进口离心管中，加800μl 65℃预热的CTAB-PVP提取液，上下颠倒混匀。

上述CTAB-PVP提取缓冲液配制方法如下：

100mM Tris·HCl(pH 8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；溶液配置用DEPC处理过的ddH₂O，高压灭菌后备用。

(3)65℃水浴30min，每隔6-10min颠倒混匀一次。

(4)冷却后加入600μl氯仿，混匀；4℃13,000rpm离心10min。

(5)取上清水相转至新1.5mL的离心管，加入800μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。

(6)重复上步(即用氯仿抽提三次)。

(7)小心吸取上清转至新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，-20℃静置3h以上(或4℃静置过夜，若发现结冰现象，需要补加8M的LiCl)。

(8)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。

(9)加入700μl 75％乙醇洗涤沉淀2-3次。离心弃上清后挥干剩余乙醇。

(10)加入30μl Proteinase K处理后的灭菌水溶解RNA，制得总RNA。使用BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度及质量。

1.2PaUGT1基因全长扩增

1.2.1引物设计

利用软件Bioxm 2.6找出PaUGT1的ORF(Open Reading Frame)。在ORF两侧的非编码区设计全长引物PaUGT1-F/R，对基因进行扩增；

全长引物：

PaUGT1-F:GTATGTCCGTCAATCTGCTG；(SEQ ID No.3)

PaUGT1-R:TCTTCTCTACAGGGGATAAT；(SEQ ID No.4)

1.2.2 cDNA合成

以提取的钝鳞紫背苔的总RNA为模板，以PrimerScript RT Master Mix逆转录体系通过PCR技术获得cDNA模板链。

逆转录体系及逆转录程序如下：

(1)除基因组DNA

将上述各组分加入进口PCR管中，轻轻混匀后于42℃水浴5min。

(2)逆转录PCR

在PCR仪中的逆转录程序为：37℃,15min；85℃变性15s，4℃保温。

逆转录产物保存于-20℃，使用前稀释10倍。

1.2.3目的基因扩增

以稀释的逆转录的钝鳞紫背苔cDNA为模板，以PaUGT1-F/R为引物进行扩增。

扩增体系及扩增程序如下：

将以上组分加入200μL的PCR管中混合均匀，PCR按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃退火15s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸10min。

将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将目的大小条带切胶回收，方法如下。

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.4％，W/V，g/100ml)，并用TIANGEN胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：

(1)将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，经溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色5min，于紫外灯下快速切下含有目的大小条带的胶块，放入1.5mL离心管回收待用。

(2)加入200μL溶液PC，于55℃水浴溶解胶块。期间每隔2-3min颠倒震荡离心管使之充分溶解。

(3)将吸附柱CB2置于2mL的收集管中，将上述溶胶液转移至吸附柱CB2，12,000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液。

(4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW。12,000rpm离心1min，弃掉滤液。

(5)重复操作步骤(4)。

(6)弃掉滤液，将吸附柱CB2室温12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

(7)将吸附柱CB2置于新的1.5mL离心管中，开盖放置至乙醇挥干。在柱子膜中央加入30μL ddH₂O，室温静置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液立即使用或-20℃保存。

1.3目的片段平端载体连接

将上述胶回收产物片段按照以下反应体系连接到平端载体pTOPO：

将上述反应体系混匀放于PCR仪中25℃反应5分钟后，将最终产物进行大肠杆菌DH5α转化。

1.4转化

将上述5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。转化方法如下：-80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞(50μL)取出后置于冰上解冻，加入5μL连接产物，轻轻吹打混匀，冰上静置30min；42℃水浴中热击90s后迅速置于冰上2min，加入600μL无抗LB培养基后于37℃培养箱振荡培养1h迅速繁殖，取200μL转化液涂于LB固体培养基(含100μg/mL氨苄抗性)上，37℃静置培养12h。

LB培养基组分(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g，加水溶解后定容至1L。固体培养基加入琼脂(12g/L)后，高压蒸汽灭菌。

1.5重组子阳性克隆鉴定

随机挑选5个单克隆于200μL LB培养基，37℃振荡培养4h。以M13F/R为引物，菌液为模板进行菌落PCR。体系如下：

扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min；

菌落PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，能扩增出目的大小条带的为阳性单克隆，将条带大小合适的阳性克隆送测序。测序成功的阳性克隆存菌：930μL菌液加70μL DMSO，混合均匀后于-80℃保存。

实施例2.基因蛋白表达及酶活功能分析

2.1提取PaUGT1-pTOPO质粒

用质粒小量提取试剂盒(TIANGEN)提取质粒：

(1)将所存菌株PaUGT1-pTOPO-DH5α划LB板(含100μg/mL Amp)，37℃，12h后长出单克隆，挑取单克隆于4mL含Amp抗性的培养基中，37℃，110rpm培养10h。

(2)取菌液室温12,000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，尽可能倒掉上清。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1，涡旋振荡至菌体完全悬浮。

(4)向离心管中加入150μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(5)向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速的上下颠倒混匀，此时将出现絮状沉淀。静置2min后，12,000rpm离心5min。

(6)将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3(吸附柱放入收集管中)。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(7)向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

(8)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(9)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，挥干乙醇后，向吸附膜的中间部分悬空滴加30-50μL蒸馏水，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

2.2扩增PaUGT1 ORF

以构建的阳性单克隆质粒为模板，用带限制性内切酶酶切位点的引物对PaUGT1-pET32a-F/R和PrimerSTAR Max DNA聚合酶扩增目的基因PaUGT1的ORF。

PaUGT1-pET32a-F:CGGAATTCATGGCCCGAGAGTCCAGAGG；(SEQ ID No.5)

PaUGT1-pET32a-R:ATAAGAATGCGGCCGCCTAGGTCAAAGATTTTATTT；(SEQ ID No.6)

以PaUGT1-pTOPO质粒为模板，用上述引物扩增其ORF，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃退火15s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸10min。

PCR产物经凝胶电泳分离后，按胶回收试剂盒对片段进行胶回收。(结果见图1)

2.3酶切

载体pET32a及胶回收片段分别用EcoR I与Not I进行酶切，酶切体系如下：

酶切在37℃水浴进行，反应3h。酶切产物加10×Loading buffer终止反应后进行琼脂糖凝胶电泳并选择合适的条带进行胶回收，胶回收方法同上。

2.4连接、转化及阳性验证

酶切后的目的片段与酶切后的载体pET32a(购自Novagen公司)用T4 DNA Ligase(购自Takara公司)连接，体系如下：

将上述组分充分混匀后，16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。转化方法同上。挑取单克隆验证阳性并送测序，取测序正确的单克隆存菌并提取PaUGT1-pET32a质粒。将构建好的原核表达载体质粒热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化、筛选与鉴定方法同上。

2.5 PaUGT1重组蛋白原核表达

2.5.1重组蛋白诱导纯化

(1)挑取菌株PaUGT1-pET32a-BL21阳性克隆接种于4mL含Amp抗性的LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床震荡培养过夜。

(2)将培养好的菌液按1:100的比例接于200mL含Amp抗性的培养基中，相同条件下培养至OD₆₀₀为0.4-0.6。在菌液中加诱导剂IPTG使其终浓度为0.5mM，16℃，110rpm摇床里培养18h诱导目的蛋白表达。

(3)将菌液离心5000rpm,5min后弃上清，收集菌体。

(4)按照菌体质量向离心管中加入适量的Binding buffer洗涤液，涡旋菌体使之重悬，5,000rpm，离心5min，收集菌体，洗涤两次后加15～20mL Binding buffer重悬菌体。

(5)将菌液置于冰水混合物中，超声裂解菌体，4℃12,000rpm，离心20min后收集上清进行过柱纯化，留部分上清液和沉淀准备SDS-PAGE，以观察蛋白表达情况。

(6)将整合的上清加入Ni-NTA柱子中，待上清流完，加入一柱体积的洗脱液(含有20mM咪唑)洗掉杂蛋白，然后用5mL Elution buffer(含咪唑浓度为250mM)收集目的重组蛋白。将洗脱下的蛋白液置于蛋白分子为30,000Da规格的超滤管中，加入Binding buffer进行换液并浓缩目的蛋白。

(7)将浓缩液吸取至1.5mL收集管中，测定蛋白浓度，并留样电泳。

(8)蛋白加10％甘油后，保存至-80℃冰箱备用。

Binding buffer：分别称取2.42g Tris-HCl、29.22g NaCl、0.34g imidazole，加水溶解，调pH8.0，定容至1000mL，灭菌后加入70μLβ-巯基乙醇，4℃保存。

Elution buffer：分别称取2.42g Tris-HCl、29.22g NaCl、34g imidazole，加水溶解，调pH8.0，定容至1000mL，灭菌后加入70μLβ-巯基乙醇，4℃保存。

2.5.2蛋白的浓度测定

采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。

(1)完全溶解蛋白标准品BSA，取10μL用0.9％NaCl稀释至100μL，使其终浓度为0.5mg/mL作为标准品。

(2)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板中，加0.9％NaCl补足到20μL。各做三个平行。

(3)用0.9％NaCl适当稀释留取的蛋白样品，同样加20μL。各做3个平行。

(4)各孔加入200μL G250染色液，室温放置3-5min。

(5)用酶标仪测定595nm处的吸光值(A₅₉₅)，根据标准品蛋白浓度和对应的吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

2.5.3蛋白SDS-PAGE电泳

目的蛋白的表达及分离纯化情况用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium DodecylSulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)进行检测。

(1)组装电泳装置，将玻璃板固定于胶架上。

(2)配制12％分离胶，加入到电泳仪中，加水液封，静置直至分离胶凝固。

(3)配制5％浓缩胶，倒掉上层水。将配制好的5％的浓缩胶混匀后立即倒入，将孔梳插入到玻璃板间(避免气泡的产生)，待胶凝固后拔出梳子。

(4)在蛋白上清液和纯化的蛋白中分别加入适量loading buffer，在沸水中煮5min13,000rpm离心10min，取上清10μL点样，同时吸取蛋白Marker 3μL点样。

(5)向电泳槽中加适量电泳缓冲液，先90V恒压进行电泳，待样品电泳到分离胶时改为160V恒压电泳，直至溴酚蓝至胶的下沿，停止电泳。

(6)取下蛋白胶，放入考马斯亮蓝R-250染色液中浸泡染色，室温下轻摇染色4h。

(7)用蒸馏水冲洗掉蛋白胶表面的染色液，冲洗2～3次后置于脱色液中脱色2h，脱色过程中更换脱色液数次，直至蛋白胶背景洗干净。

(8)观察结果，蛋白电泳结果如图2。

SDS-PAGE分离胶和浓缩胶的配制溶液及比例如下：

2.6蛋白体外酶活功能鉴定

2.6.1体外酶活分析

PaUGT1进行体外酶活功能鉴定，以加入pET32a蛋白的反应体系为对照组。底物有芹菜素、木犀草素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、黄芩素、千层纸素A、柚皮素、圣草酚、金圣草素、香叶木素、染料木素和根皮素。酶活反应体系如下：

混匀上述组分，置于30℃反应30min后加等体积乙酸乙酯终止反应，等体积乙酸乙酯萃取两次后，合并有机相，挥干溶剂。用100μL的甲醇重溶，采用HPLC进行酶活反应分析。

2.6.2酶活产物分析

为了验证PaUGT1的体外酶活功能，HPLC被用于检测上述酶活反应的产物(图3)。分析采用ZORBAX SB-C18，5μm，4.6×150mm(Agilent)色谱柱，检测波长254nm,280nm,320nm和346nm，流速1.0mL/min，进样量为20μL。液相分析条件如下：

HPLC分析条件为：

LC-MS用于酶活产物鉴定。分析方法和分析柱同上。

酶活反应分析结果如表1。

表1 PaUGT1对部分底物的催化效率

^a酶活反应糖基供体为UDP-glucose；

^b酶活性为nmol·(mg·min)^-1±STDEV；

^cND：未能检测出产物或者产物量太低。

2.6.3酶学动力学参数测定

Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，30℃条件下，进行PaUGT1的酶学动力学分析，将底物浓度分别设为10、20、40、50、80、100、200、400μM。反应在酶加入时开始计时，反应5min，加等体积乙腈终止反应，平行实验3次。实验结果见表2。

表2：

实施例3.定点突变PaUGT1以筛选出更高催化活性的PaUGT1突变体。

以来自葡萄(Vitis vinifera)中的VvGT1(2c1z)的晶体结构作为模板，通过网站(http://swissmodel.expasy.org/interactive)对PaUGT1进行同源模拟，利用对接软件(Schrodinger Suites)对PaUGT1的蛋白分子结构和底物UDP及黄酮类化合物底物山柰酚进行分子对接，能量优化后得到最终的PaUGT1与底物的互作模型(图4)。

选择可能与受体分子具有相互作用的关键氨基酸进行定点突变：Q19A、Q19H、P84A、Q87G、F120A、L145A、L145F、F149A、I193S、R194S和P197L(图5A)。根据突变位点，在网站Primer X(http://www.bioinformatics.org/primerx/)上设计突变引物：

PaUGT1-Q19A-F：CCTCTCAGTGGCGCGGGTCACGTTG；(SEQ ID No.7)

PaUGT1-Q19A-R：CAACGTGACCCGCGCCACTGAGAGG；(SEQ ID No.8)

PaUGT1-Q19H-F：CTCTCAGTGGCCATGGTCACGTTGCC；(SEQ ID No.9)

PaUGT1-Q19H-R：GGCAACGTGACCATGGCCACTGAGAG；(SEQ ID No.10)

PaUGT1-Q87G-F：CCCCTCATGTCGGAGCAGCTACGGG；(SEQ ID No.11)

PaUGT1-Q87G-R：CCCGTAGCTGCTCCGACATGAGGGG；(SEQ ID No.12)

PaUGT1-F120A-F：CATTGCGGATTTCGCCATGTTCTGGTC；(SEQ ID No.13)

PaUGT1-F120A-R：GACCAGAACATGGCGAAATCCGCAATG；(SEQ ID No.14)

PaUGT1-L145A-F：GTGGCGTCATCGCAGCTAAGATGTTC；(SEQ ID No.15)

PaUGT1-L145A-A：GAACATCTTAGCTGCGATGACGCCAC；(SEQ ID No.16)

PaUGT1-F149A-F：CTCGCTAAGATGGCCCAAGAAGTGC；(SEQ ID No.17)

PaUGT1-F149A-R：GCACTTCTTGGGCCATCTTAGCGAG；(SEQ ID No.18)

PaUGT1-L145F-F：GTGGCGTCATCTTCGCTAAGATG；(SEQ ID No.19)

PaUGT1-L145F-R：CATCTTAGCGAAGATGACGCCAC；(SEQ ID No.20)

PaUGT1-P197L-F：CCGACATTTGCTTCTTCGGCTCG；(SEQ ID No.21)

PaUGT1-P197L-R：CGAGCCGAAGAAGCAAATGTCGG；(SEQ ID No.22)

PaUGT1-R194S-F：CCTTTTTCTATCTCACATTTGCCTC；(SEQ ID No.23)

PaUGT1-R194S-R：GAGGCAAATGTGAGATAGAAAAAGG；(SEQ ID No.24)

PaUGT1-P84A-F：CAAGGTGAAACCCGCTCATGTCCAGG；(SEQ ID No.25)

PaUGT1-P84A-R：CCTGGACATGAGCGGGTTTCACCTTG；(SEQ ID No.26)

PaUGT1-I193S-F：CTTCCTTTTTCTTCCCGACATTTGC；(SEQ ID No.27)

PaUGT1-I193S-R：GCAAATGTCGGGAAGAAAAAGGAAG；(SEQ ID No.28)

参考Stratagene QuikChange定点突变的方法，以PaUGT1-pET32a质粒为模板，扩增得到目的条带切胶后进行胶回收，通过DpnI消化酶将原质粒进行酶解，酶解产物转入大肠杆菌DH5α中，随机挑取单克隆进行阳性鉴定，选择阳性单克隆送测序成功后，按上述方法转化入大肠杆菌BL21中诱导并纯化出目的蛋白，以UDP-glucose为糖基供体，槲皮素、山柰酚、芹菜素、木樨草素以及柚皮素为底物进行酶活分析(结果如图5B)。

通过定点突变找到了一个关键氨基突变位点Q19A，突变体PaUGT1对黄酮醇、黄酮的催化活性显著提高(结果分析如表3)。通过野生型PaUGT1和突变体PaUGT1-Q19A的分子对接模型对比可以看出由于突变，糖供体和受体更加靠近，以一个更有利于催化的构型位于PaUGT1的结合口袋中(结果分析如图6)。

实施例3.PaUGT1生物合成黄酮7-O-葡萄糖苷

在体外酶活功能鉴定实验中，PaUGT1和PaUGT1-Q19A重组蛋白对黄酮醇类化合物(山柰酚和槲皮素)、黄酮类化合物(芹菜素和木犀草素)具有相对较好的催化活性，都可以在底物的7位进行糖基化。尝试用PaUGT1及其突变体酶法合成山柰酚-7-O-葡萄糖苷(K7G)、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(Q7G)，芹菜素-7-O-葡萄糖苷(A7G)和木樨草素7-O-葡萄糖苷(L7G)。

3.1利用大肠杆菌PaUGT1-pET32a-BL21(U1)和PaUGT1-pET32a-BL21(U2)生产化合物为了研究底物浓度以及体内饲喂培养时间对糖苷产物的影响，我们分别以底物槲皮素、山柰酚、芹菜素和木樨草素进行重组菌株U1的体内饲喂实验，具体实验操作如下：

(1)在37℃恒温培养箱中活化菌株，挑取单克隆接种至4mL LB液体培养基中(含Amp 100μg/mL)中，37℃培养箱继续培养7h；

(2)按照1:100的比例将目的菌株和对照菌株接种到50mL的抗性LB培养基中，37℃，200rpm摇床中培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加IPTG使其终浓度为0.5mM，20℃恒温培养5-7h；

(3)向菌液中加入DMSO溶解的底物(槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素)，设定底物浓度梯度为75-400μM。，放入20℃继续培养一段时间；

(4)每隔12h取出500μL菌液，加入等体积的乙酸乙酯萃取2-3次，合并有机相，吹干样品，加入150μL甲醇重溶，用HPLC分析产物。底物浓度及饲喂时间对糖苷产物的影响结果如图7；表4。

结果表明，从经济角度考虑，能够达到最大转化率糖苷产物的最佳底物浓度是100μM。我们以100μM的底物浓度按上述操作方法对重组菌株U1和U2进行饲喂实验，实验结果如图8。3.2构建大肠杆菌共表达载体生产化合物

重组菌株U2能够产生的黄酮糖苷产量高于菌株U1，它对黄酮醇山柰酚和槲皮素转化为相应的7-O葡萄糖苷(K7G和Q7G)的转化率达到70％以上，但是直接利用大肠杆菌U2生产黄酮7-O葡萄糖苷(A7G和L7G)产率较低，因此尝试将PaUGT1和来自于钝鳞紫背苔的上游基因黄酮合酶PaFNSI构建到pETDuet载体上，进行原核表达，合成路线如图9。

3.2.1构建大肠杆菌共表达载体

本发明提供的一种钝鳞紫背苔黄酮合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.29所示。上述钝鳞紫背苔黄酮合酶的编码基因已申请专利保护。

根据pETDuet载体和目的基因PaUGT1-Q19A、PaFNSI设计引物如下：

PaUGT1-Q19A-EcoRI-F:CGGAATTCATGGCCCGAGAGTCCAGAGG；(SEQ ID No.30)

PaUGT1-Q19A-NotI-R:ATAAGAATGCGGCCGCCTAGGTCAAAGATTTTATTT；(SEQ IDNo.31)

PaFNSI-pETDuet-F:GAAGATCTATGGCTCCCCCAGCGATCGC；(SEQ ID No.32)

PaFNSI-pETDuet-R:CGGATATCTCATATGACAAGAGCATCGT；(SEQ ID No.33)

以PaUGT1-pET32a为模板，PaUGT1-pETDuet-F/R为引物，PCR扩增目的片段：

将以上组分加入200μL的PCR管中混合均匀，PCR按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性10s，53℃退火15s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸10min。

PCR产物电泳并回收，载体pETDuet及回收的片段用EcoRI与NotI进行酶切，酶切体系如下：

用T4 DNA连接酶连接目的片段PaUGT1与载体pETDuet，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α，将单克隆验证阳性并送测序，取测序正确的单克隆存菌并提取质粒PaUGT1-Q19A-pETDuet。

以PaFNSI-pET32a为模板，PaFNSI-1-pETDuet-F/R为引物，按上述方法PCR扩增目的片段，用限制性内切酶BglII和EcoRV分别酶切片段和重组质粒PaUGT1-Q19A-pETDuet后，将酶切片段连接到载体另外一个酶切位点区域，16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α。验证单克隆阳性、测序成功后摇菌提取质粒PaUGT1-Q19A-PaFNSI-pETDuet，将质粒转化入BL21中，将最终的菌株命名为FU1。

3.2.2糖苷A7G和L7G的生产

为了研究底物浓度及饲喂反应时间对糖苷产量的影响，以柚皮素为底物对重组菌株FU1进行饲喂实验，底物浓度梯度设为75-400μM，具体操作参考3.1。HPLC分析黄酮糖苷的含量，液相分析方法同2.6.2，液相分析结果如图10。

通过饲喂条件的优化，发现最佳底物浓度为100μM。用该方法以100μM的柚皮素和圣草酚分别饲喂重组菌株FU1，HPLC/LC-MS分析产生的糖苷产物。(结果如图11)

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用

<130>

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> PaUGT1蛋白

<400> 1

Met Ala Arg Glu Ser Arg Gly Lys Pro His Ala Leu Leu Val Pro Leu

1 5 10 15

Ser Gly Gln Gly His Val Ala Pro Leu Leu Thr Leu Gly Met Arg Leu

20 25 30

Ala Asp Asn Gly Ile Thr Ile Thr Leu Ala Gly Phe Lys Lys Asp Val

35 40 45

Val Gly Ile Lys Glu Lys Tyr Gly Lys Gln Leu Gln Ser Leu Asp Phe

50 55 60

His Leu Leu Glu Leu Asp His Asp Pro Gly Val Ile Asp Asn Val Lys

65 70 75 80

Val Lys Pro Pro His Val Gln Ala Ala Thr Gly Arg Ala Met Glu Pro

85 90 95

Val Leu Glu Lys Leu Glu Ala Asp Arg Leu Ala Gly Arg Ala Ile Pro

100 105 110

Ser Cys Ile Ile Ala Asp Phe Phe Met Phe Trp Ser Glu Asp Ala Ala

115 120 125

Ala Arg Leu Gly Met Lys Arg Tyr Val Phe Tyr Pro Ser Gly Val Ile

130 135 140

Leu Ala Lys Met Phe Gln Glu Val Pro Phe Leu Leu Lys Thr Gly Lys

145 150 155 160

Leu Gln Leu Gly Asp Asp Asn Ser Val Ile Pro Phe Asp Gly Leu Val

165 170 175

Glu Leu Pro Gly Ile Ala Leu Val Lys Tyr Ser Asp Leu Pro Phe Ser

180 185 190

Ile Arg His Leu Pro Leu Arg Leu Gly Ser Thr Val Ser Ala Ser Ile

195 200 205

Val Val Asn Ser Phe Leu Asp Leu Glu Leu Glu Pro Ile Lys Tyr Tyr

210 215 220

Gln Ile Lys Ser Ser Ser Lys Gln Ser Gln Gly Lys Val Tyr Ala Val

225 230 235 240

Gly Pro Ile Val Thr Pro Ala Thr Phe Lys Asp His Ala Phe Leu Ser

245 250 255

Ala Thr Val Thr Thr Ala Thr Asp Pro Leu Ser Trp Leu Asp Thr Gln

260 265 270

Pro Gly Leu Ser Val Leu Tyr Ile Cys Leu Gly Ser Met Val Arg Leu

275 280 285

Ser Pro Pro Gln Ile Met Gln Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ser Leu Glu

290 295 300

Glu Lys Cys Ser Phe Leu Trp Val Leu Pro Arg Gly Asn Gly Asn Phe

305 310 315 320

Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Pro Ala Asp Phe Ala Arg Lys Ala Asn

325 330 335

Gly Arg Gly Leu Val Thr Thr Ser Trp Val Pro Gln Val Gln Val Leu

340 345 350

Ala His Pro Ala Ile Leu Gly Phe Leu Ser His Cys Gly Trp Cys Ser

355 360 365

Thr Ile Glu Ser Met Thr Ser Gly Val Pro Met Ile Ala Trp Pro His

370 375 380

Ala Ala Glu Gln Phe Leu Asn Cys Arg Tyr Ile Val Asp Gln Leu Lys

385 390 395 400

Val Ala Thr Glu Val Val Arg Gly Pro Asp Gly Val Val Glu Gln Lys

405 410 415

Glu Phe Glu Lys Ala Phe Thr Val Leu Leu Gly Asp Gln Gly Lys Gln

420 425 430

Ile Lys Asp Arg Cys Lys Glu Leu Lys Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ile

435 440 445

Ala Pro Gly Gly Ser Ser Glu Asn Ala Phe Gln Gln Leu Ile Glu Glu

450 455 460

Ile Lys Ser Leu Thr

465

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> PaUGT1核苷酸

<400> 2

atggcccgag agtccagagg gaaacctcat gcacttctgg tacctctcag tggccagggt 60

cacgttgccc ccttgctgac tctaggcatg aggctggccg acaacggcat caccatcact 120

ttggcgggct tcaagaaaga tgtcgtgggc atcaaggaga aatacggcaa gcagttgcaa 180

agtctcgatt tccatctact ggagctcgat cacgacccgg gggtcataga caacgtcaag 240

gtgaaacccc ctcatgtcca ggcagctacg ggtcgggcaa tggagccagt attggagaag 300

ctggaagcgg atcggctcgc tgggcgtgcc attcccagct gcatcattgc ggatttcttc 360

atgttctggt ccgaagatgc cgcagcgcgc ttgggtatga agcgatacgt tttttacccg 420

agtggcgtca tcctcgctaa gatgttccaa gaagtgcctt tcctgttgaa gacaggcaag 480

cttcagttag gagacgataa ctctgtcatc ccattcgatg gacttgtaga actcccgggt 540

attgcacttg tgaaatattc ggaccttcct ttttctatcc gacatttgcc tcttcggctc 600

ggatctaccg tttcggctag cattgtggta aattcgttcc tggacctcga gctcgaaccg 660

attaagtact atcaaattaa gtcttcatcc aagcaaagcc aaggcaaggt gtacgctgtt 720

ggacccatcg tgactcccgc cactttcaag gaccacgcat ttcttagtgc aacggtaact 780

acagccacgg atcccttaag ctggttggac actcaacctg gattgtcggt tctctacata 840

tgcctaggga gtatggttcg tctctctccc ccacagatta tgcaactagc tctcgctctt 900

gagtctctcg aggagaagtg cagcttcttg tgggttcttc ctcgagggaa tggaaatttt 960

gaagcgttgg aggatgtgct tcctgctgac ttcgcgagga aggcaaatgg gcgtggtctt 1020

gttacaacaa gttgggtacc tcaggtccaa gtcctggcac acccagccat cttgggcttt 1080

ctctcgcact gcggttggtg ttctacaata gagagcatga cgtctggtgt acccatgata 1140

gcttggcctc acgcagctga gcagtttctg aattgcagat atattgtgga tcaattgaag 1200

gtagctactg aagtggttag ggggccagat ggtgtggttg agcagaaaga atttgaaaaa 1260

gctttcactg tcctacttgg agatcagggc aagcaaataa aggacagatg taaagagttg 1320

aaggcgaaag ctgcagctgc catagctcca ggtggttcct ctgaaaatgc ctttcagcaa 1380

ctgattgagg aaataaaatc tttgacctag 1410

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtatgtccgt caatctgctg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttctctac aggggataat 20

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggaattcat ggcccgagag tccagagg 28

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ataagaatgc ggccgcctag gtcaaagatt ttattt 36

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctctcagtg gcgcgggtca cgttg 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caacgtgacc cgcgccactg agagg 25

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctctcagtgg ccatggtcac gttgcc 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcaacgtga ccatggccac tgagag 26

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccctcatgt cggagcagct acggg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccgtagctg ctccgacatg agggg 25

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cattgcggat ttcgccatgt tctggtc 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaccagaaca tggcgaaatc cgcaatg 27

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtggcgtcat cgcagctaag atgttc 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaacatctta gctgcgatga cgccac 26

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctcgctaaga tggcccaaga agtgc 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcacttcttg ggccatctta gcgag 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtggcgtcat cttcgctaag atg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

catcttagcg aagatgacgc cac 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccgacatttg cttcttcggc tcg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cgagccgaag aagcaaatgt cgg 23

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cctttttcta tctcacattt gcctc 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gaggcaaatg tgagatagaa aaagg 25

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

caaggtgaaa cccgctcatg tccagg 26

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cctggacatg agcgggtttc accttg 26

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cttccttttt cttcccgaca tttgc 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gcaaatgtcg ggaagaaaaa ggaag 25

<210> 29

<211> 361

<212> PRT

<213> PaFNSI蛋白

<400> 29

Met Ala Pro Pro Ala Ile Ala Glu Ala Gly Pro Asp Thr Arg Arg Val

1 5 10 15

Val Pro Met Ser Val Met Lys Leu Ser Asp Asp Ala Ala Asp Leu Pro

20 25 30

Glu Lys Phe Val Lys Ser Leu Gly Glu Arg Pro Thr Ile Ala His Asn

35 40 45

Asp Tyr Cys Lys Glu Ile Pro Val Ile Ser Leu Lys Gly Ile Glu Ser

50 55 60

Glu Ser Glu Arg Ala Arg Ile Val Ala Glu Val Gly Tyr Ala Cys Ala

65 70 75 80

Glu Trp Gly Ile Phe Gln Ile Val Asp His Gly Val Pro Ala Glu Leu

85 90 95

Met Lys Ser Met Met Glu Asn Thr Leu Gly Phe Phe Lys Leu Pro Leu

100 105 110

Asp Glu Lys Val Lys Tyr Ala Thr Met Pro Gly Gly Phe Pro Val Gly

115 120 125

Tyr Ala Ser Gly Ser His Arg Ala Asp Asp Asp Ile Leu Asp Trp Arg

130 135 140

Glu Leu Met Val His Arg Cys Leu Pro Lys Ala Val Arg Glu Asn Asp

145 150 155 160

Ile Ser Ile Trp Pro Glu Lys Pro Glu Thr Tyr Arg Lys Thr Leu Val

165 170 175

Glu Tyr Ser Asp Thr Met Gly Asp Leu Val Thr Ser Leu Leu Gly Leu

180 185 190

Ile Ser Glu Ser Leu Gly Leu Pro Thr Ser Tyr Ile Lys Asn Ala Val

195 200 205

Gly Gly Asp Asp Ala Glu Gln Lys Ile Leu Phe Asn Tyr Tyr Pro Gln

210 215 220

Cys Pro Gln Pro Asp Met Thr Leu Gly Leu Arg Ser His Thr Asp Tyr

225 230 235 240

Gly Thr Ile Thr Val Leu Gln Gln Asp Asp Val Gly Gly Leu Gln Ala

245 250 255

Tyr Lys Glu Asp Arg Asp Lys Trp Val Thr Val Glu Pro Ile Pro Gly

260 265 270

Ala Leu Val Ile Asn Leu Gly Asp Gln Ile Gln Ile Leu Ser Asn Ala

275 280 285

Lys Tyr Cys Ser Val Glu His Gln Ala Val Val Asn Ser Asn Gln Thr

290 295 300

Arg Leu Ser Leu Val Thr Phe Ala Asn Pro Ser Ser Thr Ser Gln Met

305 310 315 320

Gly Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ser Glu Glu Asn Pro Ala Lys Tyr Arg

325 330 335

Ser Tyr Thr Met Lys Glu Tyr Leu Pro Ile Cys Phe Ala Lys Lys Thr

340 345 350

Lys Lys His Tyr Asp Ala Leu Val Ile

355 360

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cggaattcat ggcccgagag tccagagg 28

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ataagaatgc ggccgcctag gtcaaagatt ttattt 36

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gaagatctat ggctccccca gcgatcgc 28

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cggatatctc atatgacaag agcatcgt 28

Claims (16)

1.一种蛋白质PaUGT1，其特征在于，所述蛋白质PaUGT1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述PaUGT1的基因。

3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如(b1)-(b2)所示：

(b1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体，其特征在于，所述重组表达载体为重组原核表达载体。

6.如权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体，其特征在于，所述重组原核表达载体包括在表达载体pET32a和pETDuet中插入编码基因后所得。

7.如权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体，其特征在于，所述重组细胞为原核细胞。

8.如权利要求7所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体，其特征在于，所述原核细胞为细菌。

9.如权利要求8所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体，其特征在于，所述细菌选自大肠杆菌、芽孢杆菌。

10.如权利要求7所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体，其特征在于，所述重组细胞为含有权利要求2或3所述基因或权利要求6所述重组表达载体的BL21(DE3)。

11.如权利要求4所述的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体，其特征在于，所述转化体包括原核生物。

12.权利要求1所述蛋白质PaUGT1作为糖基转移酶的应用。

13.权利要求2或3所述基因、权利要求4所述重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体在制备蛋白质PaUGT1中的应用。

14.权利要求1所述蛋白质PaUGT1在如下(d1)或(d2)中的应用：

(d1)催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类和二羟基查尔酮类化合物糖苷化；

(d2)制备黄酮醇糖苷类、黄酮糖苷类、二氢黄酮糖苷类和二羟基查尔酮糖苷类化合物。

15.如权利要求14所述应用，其特征在于，所述黄酮醇糖苷类化合物包括槲皮素-7-O-葡萄糖苷和山柰酚-7-O-葡萄糖苷。

16.如权利要求14所述应用，其特征在于，所述黄酮糖苷类化合物包括芹菜素-7-O-葡萄糖苷和木樨草素-7-O-葡萄糖苷。

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