CN116790545A - 用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶PpUGT2 - Google Patents

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Abstract

本发明属于天然产物生物合成技术领域，具体涉及用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明的PpUGT2能够催化薯蓣皂苷元/偏诺皂苷元分别合成地索苷和偏诺皂苷元‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷。本发明的糖基转移酶为重楼皂苷提供了高效的生物合成方法。

Description

用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶PpUGT2
技术领域
本发明属于天然产物生物合成技术领域，具体涉及用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用。
背景技术
重楼是黑药花科(Melanthiaceae)重楼属(Paris)植物的统称，全世界共有27种，我国分布有21种，其中18种为我国特有种，并以云贵高原至四川一带分布最为集中。重楼具有重要的药用价值，在我国有着悠久的利用历史。其中滇重楼(云南重楼，P.polyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)和七叶一枝花(P.polyphylla Smithvar.chinensis(Franch.)Hara)的干燥根茎收载于《中华人民共和国药典》，具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功能，主治疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐。现代药理学研究表明重楼具有止血、抗肿瘤、抑菌、镇痛、抗早孕等活性。
重楼皂苷是重楼的主要活性成分，其中重楼皂苷I、II和VII的总含量是《中国药典》规定用于重楼质量评价的标准。重楼皂苷具有广泛的药理活性，包括止血、缩宫、抗肿瘤、抑菌、抗心机缺血和免疫调节作用等。重楼皂苷结构复杂，化学合成难以实现，从重楼中直接分离纯化难度较大、且受重楼资源短缺限制，严重制约了该类天然产物的开发和应用。
糖基化修饰是重楼皂苷生物合成的关键步骤，其依赖于糖基转移酶催化完成，对重楼皂苷的生物活性、生物利用度、水溶性等具有重要影响。中国专利申请202110109409.7公开了薯蓣皂苷元/偏诺皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用，该酶属于UGT73家族，对底物薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元的Km值分别为53.69±9.37和73.43±8.16μM，表明其对底物的亲和力不高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因和应用，本发明的用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶对底物的亲和力高。
本发明提供了用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，包括1)～6)中的糖基转移酶中的一种或几种：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpUGT1；
2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PpUGT2；
3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的PpUGT3；
4)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的PpUGT4；
5)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的PpUGT5；
6)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
本发明还提供了上述方案所述糖基转移酶的编码基因，包括1)～6)中的编码基因中的一种或几种：
1)核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的PpUGT1的编码基因；
2)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的PpUGT2的编码基因；
3)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的PpUGT3的编码基因；
4)核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的PpUGT4的编码基因；
5)核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的PpUGT5的编码基因；
6)SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供了包含上述方案所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。
本发明还提供了上述方案所述的糖基转移酶或者所述的编码基因或者所述的重组载体、表达盒或重组菌在制备含有糖基转移酶的转基因植物中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的糖基转移酶或者所述的编码基因或者所述的重组载体、表达盒或重组菌在合成重楼皂苷中的应用。
优选的，所述重楼皂苷包括化学结构式分别如式I～式VI所示的地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B中的一种或几种；
优选的，当所述糖基转移酶为PpUGT1和/或PpUGT2时，所述重楼皂苷为地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
优选的，当所述糖基转移酶为PpUGT3时，所述重楼皂苷为重楼皂苷V和/或重楼皂苷VI。
优选的，当所述糖基转移酶为PpUGT4和/或PpUGT5时，所述重楼皂苷为薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和/或trikamsteroside B。
优选的，所述PpUGT1和PpUGT2分别以薯蓣皂苷元为底物合成地索苷；所述PpUGT1和PpUGT2分别以偏诺皂苷元为底物合成偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；
所述PpUGT3以地索苷为底物合成重楼皂苷V；所述PpUGT3以偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物合成重楼皂苷VI；
所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷V为底物合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷VI为底物合成trikamsteroside B。
本发明提供了用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，包括1)～6)中的糖基转移酶中的一种或几种：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpUGT1；2)氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的PpUGT2；3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的PpUGT3；4)氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示的PpUGT4；5)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的PpUGT5；6)SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。本发明的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2分别以薯蓣皂苷元为底物合成地索苷；所述PpUGT1和PpUGT2分别以偏诺皂苷元为底物合成偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT3以地索苷为底物合成重楼皂苷V；所述PpUGT3以偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物合成重楼皂苷VI；所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷V为底物合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷VI为底物合成trikamsteroside B。本发明的糖基转移酶对底物的亲和力好，PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元为底物时的Km值分别为20.1和16.1μM；PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷VI为底物时的Km值分别为32.5和22.1μM。本发明的糖基转移酶为重楼皂苷提供了高效的生物合成方法，并为重楼皂苷的人工合成以及构建新的重楼皂苷衍生物奠定了基础。
附图说明
图1为合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2、合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3、合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5编码基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中M泳道为DL2000DNAMarker，泳道1、2、3、4和5为目的条带(1668，1773，1455，1398，1404bp)；
图2为实施例2中表达合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1的大肠杆菌表达质粒结构示意图；
图3为实施例2中表达合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT2的大肠杆菌表达质粒结构示意图；
图4为实施例2中表达合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3的大肠杆菌表达质粒结构示意图；
图5为实施例2中表达合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4的大肠杆菌表达质粒结构示意图；
图6为实施例2中表达合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT5的大肠杆菌表达质粒结构示意图；
图7为实施例4中酶促反应产物的HPLC分析图谱；其中A为PpUGT1和PpUGT2分别以薯蓣皂苷元(1)和偏诺皂苷元(2)为底物，UDP-葡萄糖为糖供体的酶活产物的HPLC分析图谱；B为PpUGT1和PpUGT2的催化反应；C为PpUGT3分别以地索苷(3)和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)为底物，UDP-鼠李糖为糖供体的酶活产物的HPLC分析图谱；D为PpUGT3的催化反应；E为PpUGT4和PpUGT5分别以重楼皂苷V(5)和重楼皂苷VI(6)为底物，UDP-葡萄糖为糖供体的酶活产物的HPLC分析图谱；F为PpUGT4和PpUGT5的催化反应；
图8为实施例5中Lineweaver–Burk plot得到的用于计算Km值的函数；A和B分别为PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元为底物时Lineweaver–Burk plot得到的函数；C和D分别为PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷VI为底物时Lineweaver–Burk plot得到的函数。
具体实施方式
本发明提供了本发明提供了用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，包括1)～6)中的糖基转移酶中的一种或几种：
1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的PpUGT1；
2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PpUGT2；
3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的PpUGT3；
4)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的PpUGT4；
5)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的PpUGT5；
6)SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
在本发明中，PpUGT1～PpUGT5分别由555、590、484、465和467个个氨基酸组成，分子量分别预测为61.5、64.8、52.1、52.7和52.5kDa，将PpUGT1～PpUGT5分别放在NCBI中进行BLASTX分析比对，结果显示PpUGT1在氨基酸水平上与海枣(Phoenix dactylifera)的甾醇3-β-葡萄糖转移酶UGT80A2-like isoform X1(XP_038974355.1)同源性为84.44％，PpUGT2氨基酸序列与XP_038974355.1同源性为82.9％，PpUGT3氨基酸序列与海枣(Phoenixdactylifera)莨菪亭葡萄糖转移酶(XM_039127341.1)的同源性为73.05％，PpUGT4和PpUGT5在氨基酸水平上与Musa acuminata subsp.malaccensis的UDP-葡萄糖转移酶91C1-like isoform X3(XP_009408288.1)同源性分别为53.8％和54.11％，此外，通过Target P软件预测PpUGT1、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5是不含转运肽的蛋白，PpUGT2是一个含有38个氨基酸转运肽的蛋白。
本发明提供的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2均能高效催化薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元分别生成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；PpUGT3高效催化地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷分别合成重楼皂苷V和VI；糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5高效催化重楼皂苷V和VI分别合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷是重楼皂苷生物合成途径的关键中间化合物；重楼皂苷V和重楼皂苷VI为重要的重楼皂苷，也是重楼皂苷I、II、III或VII和H生物合成的关键中间化合物；薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B为重楼属植物的微量成分。本发明为地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B提供了高效的生物合成方法，并为重楼皂苷的人工合成以及构建新重楼皂苷衍生物奠定了基础。
本发明还提供了上述方案所述糖基转移酶的编码基因，包括1)～6)中的编码基因中的一种或几种：
1)核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的PpUGT1的编码基因；
2)核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的PpUGT2的编码基因；
3)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的PpUGT3的编码基因；
4)核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的PpUGT4的编码基因；
5)核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的PpUGT5的编码基因；
6)SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
本发明中，所述SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示编码基因的开放阅读框分别为1668、1773、1455、1398和1404bp。PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5的编码基因的发现丰富了糖基转移酶编码基因的多样性。
本发明对PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5的编码基因的cDNA序列的获取方法并没有特殊限定，采用本领域常规的cDNA获取方式即可。
本发明从黑药花科植物滇重楼(Pairs polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)出发，克隆并功能鉴定了重楼皂苷生物合成途径中5个糖基转移酶PpUGT1～PpUGT5的编码基因。
本发明还提供了包含上述方案所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。
本发明对所述重组载体的基础载体并没有特殊限定，本发明实施例中所述重组载体的基础载体优选为pCold TF。
在本发明中，所述重组菌的原始菌优选为大肠杆菌、酿酒酵母或农杆菌。本发明对所述大肠杆菌、酿酒酵母或农杆菌的种类并没有特殊限定；在本发明中，所述大肠杆菌优选为菌株Rosetta(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)菌株。本发明对所述构建重组载体以及转化的方法并没有特殊限定，采用本领域常规的方法即可。在本发明具体实施过程中，将所述编码基因与原核表达载体连接，构建成为能够在大肠杆菌中表达的重组质粒，再将重组质粒转化至大肠杆菌中构建成为重组菌。
在本发明中，当所述重组菌为重组大肠杆菌或者重组酿酒酵母时，将重组大肠杆菌或重组酿酒酵母进行发酵培养，得到含有糖基转移酶的重组菌的发酵液。
本发明还提供了上述方案所述的糖基转移酶或者所述的编码基因或者所述的重组载体、表达盒或重组菌在制备含有糖基转移酶的转基因植物中的应用。
在本发明中，所述转基因植物优选的包括转基因烟草。
在本发明中，当所述重组菌为重组农杆菌时，本发明将重组农杆菌转染本氏烟草瞬时表达，得到含有糖基转移酶的新鲜烟叶。
本发明还提供了上述方案所述的糖基转移酶或者所述的编码基因或者所述的重组载体、表达盒或重组菌在合成重楼皂苷中的应用。
在本发明中，所述重楼皂苷包括化学结构式分别如式I～式VI所示的地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B中的一种或几种；
在本发明中，当所述糖基转移酶为PpUGT1和/或PpUGT2时，所述重楼皂苷为地索苷和/或偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
在本发明中，当所述糖基转移酶为PpUGT3时，所述重楼皂苷为重楼皂苷V和/或重楼皂苷VI。
在本发明中，当所述糖基转移酶为PpUGT4和/或PpUGT5时，所述重楼皂苷为薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和/或trikamsteroside B。
在本发明中，所述PpUGT1和PpUGT2独立的以薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元为底物分别合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；所述PpUGT3以地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物分别合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI；所述PpUGT4和PpUGT5独立的以重楼皂苷V和重楼皂苷VI为底物分别合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。
本发明中，所述合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2及其编码基因是通过催化薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，所述合成重录皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3及其编码基因是通过催化地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷分别合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI，所述合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5及其编码基因是通过催化重楼皂苷V和重楼皂苷VI分别合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2，合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3，合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5编码基因cDNA序列的获取及生物信息学分析：
根据分子克隆手册从滇重楼中获取RNA，利用SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒中引物5’-CDS primer和SMART IITM A oligonucleotide进行反转录合成cDNA，并以基因特异性引物进行PCR扩增，得到PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因全长cDNA序列。
经分析，PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因的开放阅读框(ORF)分别为1668bp(SEQ ID NO.6)、1773bp(SEQ ID NO.7)、1455bp(SEQ ID NO.8)、1398bp(SEQ IDNO.9)和1404bp(SEQ ID NO.10)，分别编码555个氨基酸(SEQ ID NO.1)、590个氨基酸(SEQID NO.2)、484个氨基酸(SEQ ID NO.3)、465个氨基酸(SEQ ID NO.4)和467个氨基酸(SEQID NO.5)，分子量分别预测为61.5、64.8、52.1、52.7和52.5kDa。PpUGT 3、PpUGT 4和PpUGT5包含具有44个氨基酸的plant secondary product glycosyltransferases(PSPG)盒，PpUGT1和PpUGT2的PSPG盒中插入了16个氨基酸，将PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因放在NCBI中运用BLASTX进行同源性搜索，PpUGT1和PpUGT2氨基酸序列与海枣(Phoenix dactylifera)的甾醇3-β-葡萄糖基转移酶UGT80A2-like isoform X1(XP_038974355.1)同源性分别为84.44％和82.9％，PpUGT3氨基酸序列与海枣莨菪亭葡萄糖转移酶/XM_039127341.1的同源性为73.05％，PpUGT4和PpUGT5安激素序列与Musa acuminatasubsp.malaccensis的UDP-葡萄糖基转移酶91C1-like isoform X3(XP_009408288.1)同源性分别为53.8％和54.11％，此外，通过Target P软件预测PpUGT1、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5是不含转运肽的蛋白，PpUGT2是一个含有38个氨基酸转运肽的蛋白。
实施例2
合成地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖基转移酶PpUGT1和PpUGT2，合成重楼皂苷V和重楼皂苷VI的糖基转移酶PpUGT3，合成薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B的糖基转移酶PpUGT4和PpUGT5编码基因表达载体构建：
以实施例1合成的PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5基因cDNA为模板，PpUGT1F:5’-aaggtaggcatatggagctcatgcctgaagaggtgaataattct-3’(SEQ ID NO.21)和PpUGT1R:5’-tatctagactgcaggtcgactcacgaacaaccaaagcatctccgt-3’(SEQ ID NO.22)，PpUGT2F:5’-aaggtaggcatatggagctcatggcggagagcggcagtggagcag-3’(SEQ ID NO.23)和PpUGT2R:5’-tatctagactgcaggtcgactcaggagcagcccatgtacttc-3’(SEQ ID NO.24)，PpUGT3F:5’-aaggtaggcatatggagctcatgggctccgacgatcgtcaacctc-3’(SEQ ID NO.25)和PpUGT3R:5’-tatctagactgcaggtcgactcagtctttcgattcctttctggat-3’(SEQ ID NO.26)，PpUGT4F:5’-aaggtaggcatatggagctcatgggagaagacaatggaagccttc-3’(SEQ ID NO.27)和PpUGT4R:5’-tatctagactgcaggtcgacttacattttcaaaggctgaggtttc-3’(SEQ ID NO.28)，PpUGT5F:5’-aaggtaggcatatggagctcatggaagaaggcaatgaaagccttc-3’(SEQ ID NO.29)和PpUGT5R:5’-tatctagactgcaggtcgacttacagcttcagaggttgtggcgtc-3’(SEQ ID NO.30)为引物对，利用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR体系为50μL。
PCR扩增反应体系为：
5×PrimeSTAR HS Buffer 10μL
dNTP Mixture(2.5mM each) 4μL
Primer F 1μL
Primer R 1μL
Template cDNA 0.5μL
PrimeSTAR HSDNA Polymerase 0.5μL
去离子水 33μL
PCR扩增的反应程序为：98℃10sec，60℃15sec，72℃2min，35个循环。程序结束后进行产物回收纯化。
pCold TF载体经限制性核酸内切酶KpnI和SalI双酶切，37℃反应3h，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，并进行产物回收纯化。纯化的PCR产物与载体pCold TF连接，即将PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5编码基因cDNA克隆到N末端含有HIS标签的pColdTF表达载体上，构建重组载体pCold TF/PpUGT1、pCold TF/PpUGT2、pCold TF/PpUGT3、pCold TF/PpUGT4和pCold TF/PpUGT5，其结构示意图如图2～图6所示。将重组载体pColdTF/PpUGT1、pCold TF/PpUGT2、pCold TF/PpUGT3、pCold TF/PpUGT4和pCold TF/PpUGT5转化大肠杆菌DH5α，涂布在添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)的LB固体平板进行筛选，37℃恒温培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取单克隆进行PCR及酶切验证，选出阳性克隆进行DNA测序验证。
实施例3
糖基转移酶PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5重组蛋白的诱导表达及可溶性分析：
挑取测序正确的重组菌株提取质粒pCold TF/PpUGT1、pCold TF/PpUGT2、pColdTF/PpUGT3、pCold TF/PpUGT4和pCold TF/PpUGT5，将质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，利用添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)的LB固体平板进行筛选，随机挑取单克隆进行菌落PCR验证，经验证正确的单克隆接种于6ml含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。活化后的菌按照1:100比例接种至50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600值约为0.5。取5mL菌液作为对照，剩余加入45μL 0.3mM IPTG，16℃诱导过夜。配制相关蛋白纯化缓冲液，低温诱导的菌液经4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入7mL缓冲液1(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，5mM DTT，10mM咪唑)，重悬菌体；冰上超声破碎菌体20min；留取100μL作为对照，其余样品经4℃,12000rpm离心10min，转移上清，并加入500μLNi-NTAAgarose(购自Qiagen公司)，4℃孵育1h；将含有Ni-NTA Agarose的蛋白液加入Polypropylene柱(购自Qiagen公司)，分别以6mL缓冲液1、6mL缓冲液2(20mM Tris-HClpH8.0，500mM NaCl，5mM DTT，20mM咪唑)及3mL缓冲液3(20mM Tris-HCl pH8.0，500mMNaCl，5mM DTT，250mM咪唑)进行顺序洗脱，并同时收集洗脱液，缓冲液3洗脱液即为纯化后的蛋白，加入等体积甘油，混匀，-80℃保存，以10％SDS-PAGE按照相关操作步骤进行蛋白可溶性和大小分析，结果表明PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5重组蛋白的可溶性较好，蛋白大小在95KDa～140KDa之间。
实施例4
糖基转移酶PpUGT1、PpUGT2、PpUGT3、PpUGT4和PpUGT5的体外酶活测试及产物分析：
反应液：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100μΜ糖供体，底物100μΜ，300μL粗酶，去离子水补足至400μL。将反应液混匀，30℃静置反应6h，加入等体积甲醇终止反应，真空减压干燥，加入100μL甲醇溶解，12000rpm离心20min，反应液经HPLC分析检测得图7。
PpUGT1和PpUGT2的底物是薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元，糖供体是UDP-葡萄糖；PpUGT3的底物是地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，糖供体是UDP-鼠李糖；PpUGT4和PpUGT5的底物是重楼皂苷V和重楼皂苷VI，糖供体是UDP-葡萄糖。UDP-葡萄糖和UDP-鼠李糖购自广州昂飞生物科技有限公司；薯蓣皂苷元(CAS 512-04-9)购自上海源叶生物科技有限公司；地索苷(CAS14144-06-0)和重楼皂苷V(CAS19057-67-1)购自成都曼思特生物科技有限公司；重楼皂苷VI(CAS 55916-51-3)购自成都植标化纯生物技术有限公司；偏诺皂苷元(CAS 507-89-1)和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(CAS 37341-36-9)来自本实验室。
HPLC色谱条件1：Aglient 1260系统，Aglient SDB-C18色谱柱(4μm，4.6×250mm)，CH3CN-H2O流动相(0-18min：44％-86％，18-22min:86％-100％，22-32min:100％，v/v)，37℃柱温，20μL进样体积，1mL/min流速，195nm检测波长。
由图7中的A和B可以看出，与对照组相比，PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元为底物时，均合成了1个特异产物，将其分别与标准品地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷进行对比，特异产物峰与标准品的保留时间一致，表明该产物分别是地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；由图7中的C和D可以看出，与对照组相比，PpUGT3以地索苷和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物时，均合成了1个特异产物，将其分别与标准品重楼皂苷V和重楼皂苷VI进行对比，特异产物峰与标准品的保留时间一致，表明该产物分别是重楼皂苷V和重楼皂苷VI；由图7中的E和F可以看出，与对照组相比，PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷V和重楼皂苷VI为底物时，均合成了1个特异产物，将其分别与标准品薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B进行对比，特异产物峰与标准品的保留时间一致，表明该产物分别是薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1-2)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1-6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和trikamsteroside B。
实施例5
糖基转移酶PpUGT1、PpUGT2、PpUGT4和PpUGT5的酶动力学参数分析：
pCold TF/PpUGT1、pCold TF/PpUGT2、pCold TF/PpUGT4和pCold TF/PpUGT5的大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)在6mL添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。活化后的菌按照1:100比例接种至50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600值约为0.5。加入50μL 0.3M IPTG，16℃诱导过夜。配制相关蛋白纯化缓冲液，低温诱导的菌液经4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入7mL缓冲液1(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，5mM DTT，10mM咪唑)，重悬菌体；冰上超声破碎菌体10min；留取100μL作为对照，其余样品经4℃,12000rpm离心10min，转移上清，并加入500μL Ni-NTA Agarose(购自Qiagen公司)，4℃孵育1h；将含有Ni-NTA Agarose的蛋白液加入Polypropylene柱(购自Qiagen公司)，分别以6mL buffer 1、6L buffer 2(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑)及3mL buffer3(320mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，250mM咪唑)进行顺序洗脱，并同时收集洗脱液，buffer3洗脱液即为纯化后的蛋白，加入等体积甘油，混匀，-20℃保存。
PpUGT1和PpUGT2的酶动力学参数测定：
反应液：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100μΜUDP-葡萄糖，纯化后的蛋白100μg，薯蓣皂苷元浓度梯度0，20，40，60，80，100μM，去离子水补足至300μL。将反应液混匀，37℃静置反应45min，加入等体积甲醇终止反应，真空减压干燥，加入100μL甲醇溶解，12000rpm离心20min，所的样品用于HPLC检测。
HPLC色谱条件2：Aglient 1260系统，Aglient SDB-C18色谱柱(4μm，4.6×250mm)，CH3CN-H2O流动相(0-15min：55％-100％，15-27min:100％，22-32min:100％，v/v)，37℃柱温，20μL进样体积，1mL/min流速，195nm检测波长。
PpUGT4和PpUGT5的酶动力学参数测定：
反应液：50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100μΜUDP-葡萄糖，纯化后的蛋白100μg，重楼皂苷VI浓度梯度0，20，40，60，80，100μM，去离子水补足至300μL。将反应液混匀，37℃静置反应25min，加入等体积甲醇终止反应，真空减压干燥，加入100μL甲醇溶解，12000rpm离心20min，所的样品用于HPLC分析。
HPLC色谱条件3：Aglient 1260系统，Aglient SDB-C18色谱柱(4μm，4.6×250mm)，CH3CN-H2O流动相(0-15min：30％-75％，15-16min:75％-95％，16-21min:95％，v/v)，37℃柱温，20μL进样体积，1mL/min流速，195nm检测波长。
以重楼皂苷VI按照HPLC色谱条件3制备标准曲线，重楼皂苷VI的浓度梯度为0，5，10，15，20，25nmol，得到峰面积与浓度的函数y＝538.12x+38.989(R2＝0.9999)，根据函数计算反应产物的含量。根据Lineweaver–Burk plot得到图8，根据图8中函数在x和y轴的截距进而计算出Km值。
由图8中的A和B计算出PpUGT1和PpUGT2以薯蓣皂苷元为底物时的Km值分别为20.1和16.1μM；由C和D计算出PpUGT4和PpUGT5以重楼皂苷VI为底物时的Km值分别为32.5和22.1μM。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (7)

1.用于重楼皂苷生物合成的糖基转移酶，为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PpUGT2的糖基转移酶。
2.权利要求1所述糖基转移酶的编码基因，为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的PpUGT2的编码基因。
3.包含权利要求2所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌。
4.权利要求1所述的糖基转移酶或者权利要求2所述的编码基因或者权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在制备含有糖基转移酶的转基因植物中的应用。
5.权利要求1所述的糖基转移酶或者权利要求2所述的编码基因或者权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在合成重楼皂苷中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重楼皂苷为化学结构式如式I、式II所示的地索苷、偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PpUGT2以薯蓣皂苷元为底物合成地索苷；所述PpUGT2以偏诺皂苷元为底物合成偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
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