CN109735523B

CN109735523B - 雪松醇合酶Lc-CedS编码基因及其应用

Info

Publication number: CN109735523B
Application number: CN201910108138.6A
Authority: CN
Inventors: 黎胜红; 刘燕; 罗菲; 凌伊; 刘艳春
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2019-02-02
Filing date: 2019-02-02
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2039-02-02
Also published as: CN109735523A

Abstract

本发明公开了一种用于生产雪松醇的雪松醇合酶Lc‑CedS及其编码基因与其应用。本发明从唇形科植物米团花(Leucosceptrum canum)出发，克隆并功能鉴定了一种合成雪松醇的萜类合酶Lc‑CedS编码基因，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示，与不同表达载体连接，构建成为能够在大肠杆菌、烟草中表达的重组质粒，再将重组质粒转化至大肠杆菌以及本氏烟草中构建成为工程细胞，实现了大肠杆菌和本氏烟草异源合成雪松醇。雪松醇具有重要的应用价值，本发明构建的该基因工程细胞安全稳定，生产周期短，显示出其在应用开发中的重大价值。

Description

雪松醇合酶Lc-CedS编码基因及其应用

技术领域：

本发明技术属于合成生物学领域，具体涉及一种生产倍半萜化合物—雪松醇(cedrol)的萜类合酶Lc-CedS及其编码基因与其应用。

背景技术：

萜类化合物结构多样、用途广泛，具有广泛的生物功能和药理作用。倍半萜是萜类化合物的重要组成部分，其种类繁多，广泛存在于高等植物和微生物中，具有重要的生物活性，例如抗肿瘤、抗炎、免疫抑制、神经系统、抗菌和昆虫拒食等活性。此外倍半萜的芳香性和可燃性等特征，使其在生物燃料、香料以及食品和化妆品添加剂等方面也具有应用潜力。

雪松醇(cedrol)，又叫柏木脑，广泛存在于柏科、杉科和松科等多种植物的挥发油中，是一种带着微香的倍半萜醇化合物。雪松醇被美国食品药品管理局(FDA)批准作为芳香剂或佐剂(21CFR 172.515)，广泛用于化妆品、香精、香料、食品添加剂和药品佐剂等领域。同时，雪松醇还具有广泛的药理活性，如血小板活化因子(platelet ctivating factor，PAF)受体拮抗、自主神经系统镇静、解痉、促进真皮成纤维细胞外基质((ECM)产生、抑制细胞色素P450酶、促进毛发生长等作用。此外，雪松醇还表现出抗菌、趋避蚂蚁和毒杀黑腿蜱虫等生物功能。雪松醇重要的生物活性以及复杂的三环骨架，引起了化学合成、生物转化和给药系统方面的关注，但是负责雪松醇生物合成关键步骤的雪松醇合酶编码基因及其应用尚未有文献报道。

发明内容：

本发明的目的是提供雪松醇合酶Lc-CedS编码基因cDNA序列及其应用。

为实现本发明目的，本发明提供雪松醇合酶Lc-CedS，具体内容为：

(1)Seq ID No.1所示氨基酸序列构成的蛋白；

(2)Seq ID No.1所示的氨基酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。

本发明还提供雪松醇合酶Lc-CedS的编码基因，其为：

(1)Seq ID No.2所示的核苷酸序列；

(2)Seq ID No.2所示的核苷酸序列经取代和/或缺失和/或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列；

含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或转基因烟草也属于本发明的保护范围。

上述蛋白在细菌、真菌、植物等合成雪松醇的应用也属于本发明的保护范围。

上述蛋白能够催化法尼烯焦磷酸脂合成雪松醇的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供含所述雪松醇合酶Lc-CedS编码基因或所述雪松醇合酶Lc-CedS编码基因cDNA序列的载体。

本发明还提供所述雪松醇合酶Lc-CedS编码基因或所述雪松醇合酶Lc-CedS编码基因cDNA序列的宿主细胞、工程菌株及转基因细胞系。

所述的雪松醇合酶Lc-CedS或其编码基因在制备含有雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、转基因烟草中的应用。

所述的雪松醇合酶Lc-CedS或其编码基因在制备含有雪松醇的发酵液或新鲜烟叶中的应用，所述的应用是采用：构建含有编码所述基因的表达载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌BL 21以及农杆菌LBA 4404中，将获得的基因工程细菌进行发酵培养或将农杆菌转染本氏烟草瞬时表达，得到含有雪松醇的发酵液或新鲜烟叶。

本发明还提供了所述的雪松醇合酶Lc-CedS或其编码基因在制备下述结构式所示的雪松醇中的应用，

本发明还提供获取雪松醇合酶Lc-CedS编码基因cDNA序列的特异性引物对，包括：

正向引物(Lc-CedSF)：5’-GGTACCATGATTACTGCTAGCGTTGTAG-3’

反向引物(Lc-CedSR)：5’-AAGCTTTTAAATGACTAAGGGATTCACA-3’

上述引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

本发明提供的雪松醇合酶Lc-CedS的开放阅读框(ORF)为1650bp(Seq ID No.2)，编码549个氨基酸(Seq ID No.1)，将其放在NCBI中进行BLASTN分析比对，结果显示与唇形科植物广藿香(Pogostemon cablin)的gamma-cadinene synthase/Q49SP7的同源性达到了67％。

本发明提供的雪松醇合酶Lc-CedS编码基因是从米团花中克隆获得的萜类合酶基因，其能够特异性催化倍半萜的直接前体法尼基焦磷酸脂(FDP)合成雪松醇，该基因是首次从植物中克隆得到，该酶的发现丰富了萜类合酶的多样性，此外能够在一定程度上解决该化合物的来源及资源问题。

本发明从唇形科大型木本植物米团花(Leucosceptrum canum)中克隆并功能鉴定了雪松醇合酶Lc-CedS，并利用大肠杆菌(Escherichia coli)以及本氏烟草(Nicotianabenthamiana)生成雪松醇的应用。

附图说明

图1为雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中M泳道为DL2000DNA Marker，泳道1为目的条带(1650bp)。

图2为实施例4中酶促反应产物的GC-MS分析的总离子流图及酶促反应产物的质谱图。

图3为实施例5中表达雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的工程大肠杆菌提取物的GC-MS分析总离子流图及产物质谱图。

图4为实施例6中瞬时表达雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的转基因烟草提取物的GC-MS分析总离子流图。

图5、图6为实施例6中表达雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的烟草表达质粒结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图，用本发明的实施例来说明本发明的实质性内容，但不用来限制本发明的范围。除特殊标明外，实验例均按照常规实验条件进行。如参照分子克隆手册，相关参考文献或厂家制造商说明书相关建议条件。

实施例1

雪松醇合酶Lc-CedS编码基因cDNA序列的获取及生物信息学分析：

米团花RNA提取，操作步骤参见分子克隆手册，获取RNA，利用SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒中引物5’-CDS primer和SMART IITM Aoligonucleotide，以及3’-CDS primer分别进行反转录合成cDNA，并以3’RACE-in(CCACGATTTGTTCGCCACTTCACTT)和3’RACE-out(AGCGTTTGGGACTGGCGTATCATTTTG)，以及5’RACE-in(AATGATACGCCAGTCCCAAACGCT)和5’RACE-out(GTTGCGTAAATGGGAATAAAAATGAGTGC)为引物，分别进行PCR扩增，得到Lc-CedS基因全长cDNA序列(如Seq ID No.2)。

雪松醇合酶Lc-CedS的开放阅读框(ORF)为1650bp(Seq ID No.2)，编码549个氨基酸(Seq ID No.1)，分子量大小为63kDa，该雪松醇合酶Lc-CedS基因编码的氨基酸序列包含典型的DDXXD和“NSE/DTE”保守基序。将雪松醇合酶Lc-CedS编码基因放在NCBI中运用BLASTN进行同源性搜索，该基因在核苷酸水平上进行分析比对，与其他物种的同源性比较高，结果显示与唇形科植物广藿香(Pogostemon cablin)的gamma-cadinene synthase/Q49SP7的同源性达到了67％，此外，通过Target P软件预测该候选的雪松醇合酶是一个不含转运肽的线粒体靶向蛋白。

实施例2

雪松醇合酶Lc-CedS编码基因cDNA序列表达载体构建：

米团花RNA提取，操作步骤参见分子克隆手册，获取RNA，以SMART^TMRACE cDNAAmplification Kit试剂盒中引物5’-CDS primer进行反转录合成cDNA为模板，上述Lc-CedSF和Lc-CedSR为引物，利用高保真酶PrimeSTAR HSDNA Polymerase进行PCR扩增，PCR体系为50μL，反应程序为：5×PrimeSTARHS Buffer 10μL，dNTP Mixture(2.5mM each)4μL，Primer F 1μL，Primer R 1μL，Template 0.5μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，ddH₂O补足至50μL。PCR程序为：98℃10sec，60℃15sec，72℃2min,35个循环，程序结束后以1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，并进行产物回收纯化。同时pCold TF载体经限制性核酸内切酶KpnI和HindIII双酶切，37℃反应3h，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，并进行产物回收纯化。酶切后的载体pCold TF与PCR产物连接，即将雪松醇合酶Lc-CedS编码基因cDNA克隆到N末端含有HIS标签的pCold TF表达载体上，转化大肠杆菌DH5α，涂布在添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)的LB固体平板进行筛选，37℃恒温培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取单克隆进行PCR及酶切验证，选出阳性克隆进行DNA测序验证。

实施例3

雪松醇合酶Lc-CedS的蛋白诱导表达及可溶性分析：

挑取测序正确的重组pCold TF/Lc-CedS菌株提取质粒，将质粒转化至表达菌株Rosetta(DE3)，利用添加氨苄青霉素(Amp:100μg/mL)和氯霉素(CM:34μg/mL)的LB固体平板进行筛选，随机挑取单克隆进行菌落PCR验证，经验证正确的单克隆接种于6ml含氨苄青霉素和氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。活化后的菌按照1:100比例接种至100mL LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀值约为0.5。取5mL菌液作为对照，剩余加入95μL 0.3mM IPTG，16℃诱导过夜。配制相关蛋白纯化buffer，将低温诱导的菌液4℃,12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入7mL buffer1(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，10mM咪唑)重悬菌体；冰上超声破碎菌体10min；留取100μl作为对照，其余样品4℃,12000rpm离心10min，转移上清，加500μl Ni-NTA Agarose(购自Qiagen公司)，4℃孵育1h；待1h后，将含有Ni-NTA Agarose的蛋白液加入Polypropylene柱(购自Qiagen公司)，分别以6ml buffer1、6ml buffer2(20mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑)及3ml buffer(320mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，250mM咪唑)进行顺序洗脱，并同时收集洗脱液，buffer3洗脱液即为纯化后的蛋白，加入等体积甘油，混匀，-20℃保存，以10％SDS-PAGE按照相关操作步骤进行蛋白可溶性分析。

实施例4

雪松醇合酶Lc-CedS的体外酶活测试及产物分析：

配制10×Reaction buffer：1mM Tris–HCl pH 7.4，50mM MgCl₂，1M KC，20mMDTT，-20℃保存。取纯化后的蛋白40μL，Reaction buffer 20μL，GDP/FDP/GGDP 10μL，去离子水补足至200μL，将各组分混匀，30℃静置反应3h，加入等体积正己烷萃取3次，12000rpm离心10min，取有机相氮气浓缩至50μL，GC-MS检测。

GC-MS色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)；柱温程序设置为：60℃(2min)，5℃/min升温至240℃，240℃保持2min，10℃/min升温至280℃，280℃保持2min，以不分流模式进样，进样量为5μl，载气为氦气，氦气流量为3ml/min，柱前压为40KPa。

GC-MS质谱条件：离子源EI源，离子源温度250℃，电子能量70ev，质量范围为35-550amu。

实施例5

雪松醇合酶Lc-CedS在大肠杆菌中的异源表达：

将重组pCold TF/Lc-CedS质粒与pBbA5c-MevT-MBIS质粒共同转化大肠杆菌BL 21(DE 3)菌株，利用含Amp和CM的LB固体平板筛选转化菌落，挑取单克隆进行验证，将验证正确的单克隆接种到6ml含Amp和CM的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养，按照1:100再次接种到含相同抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀值约为0.5，加入0.3mM IPTG，16℃诱导过夜，温度调节至25℃，继续培养3天，石油醚萃取，取有机层，减压蒸发浓缩，得到体内酶活反应样品，利用GC-MS对样品进行分析检测。检测条件参见实施例4。

实施例5

雪松醇合酶Lc-CedS在本氏烟草中的异源表达：

利用同源重组和gateway重组技术将雪松醇合酶Lc-CedS编码基因克隆至二元载体pEAQ-HT和pEAQ-HT-DEST1中，形成表达载体pEAQ-HT/Lc-CedS(表达载体1)和pEAQ-HT-DEST1/Lc-CedS(表达载体2)。利用Primer5设计合适的引物，设计构建pEAQ-HT/Lc-CedS表达载体的引物对1，Lc-CedS-Agel-F(5’-TTCTGCCCAAATTCGCGACCGGTATGATTACTGCTAGCGTTG-3’)和引物Lc-CedS-Xhol-R(5’-TGAAACCAGAGTTAAAGGCCTCGAGTTAAATGACTAAGGGA-3’)；构建pEAQ-HT-DEST1/Lc-CedS表达载体的引物对2，Lc-CedS-attB1(5’-GGGGACAAGTTT GTACAAAAAAGCAGGCTTCATGATTACTGCTAGCGTTGT-3’)和Lc-CedS-attB2(5’-GGGGACCACTTTGT ACAAGAAAGCTGGGTCTTAAATGACTAAGGGATTCACA-3’)。利用高保真酶PrimeSTAR HS DNAPolymerase进行扩增，PCR体系为(50μL)：10μL5×PrimeSTAR HS Buffer，4μL dNTPMixture(2.5mM each)，1μL Primer F，1μLPrimer R，0.5μL Template，0.5μL PrimeSTARHS DNA Polymerase，ddH₂O补足至50μL。PCR程序为：98℃10sec，64℃15sec，72℃2min,35个循环，程序结束后以1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，并进行产物回收纯化。将两个目的片段纯化后，引物对1扩增的片段通过Takara的infusion酶与经过Agel和Xhol双酶切的二元载体pEAQ-HT重组，构建表达载体pEAQ-HT/Lc-CedS；引物对2扩增的片段与入门载体pDONR207发生BP反应得到载体pDONR207/Lc-CedS，pDONR207/Lc-CedS与pEAQ-HT-DEST1发生LR反应最终构建表达载体pEAQ-HT-DEST1/Lc-CedS。将DNA测序验证成功的两个载体分别转化农杆菌LBA4404，挑取单克隆进行PCR验证，验证成功后加入到合适体积LB液体培养基中(利福平：50μg/mL,链霉素：50μg/mL，卡那霉素：50μg/mL)培养，至OD₆₀₀值约为2，5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，以MMA buffer(10mM MES pH 5.6，10mM MgCl₂，100μM乙酰丁香酮)重悬菌体至OD₆₀₀值约为0.4，室温静置1-3h。以无菌注射器吸取菌液注射本氏烟草幼叶，注射前一天本氏烟草浇足水，注射过后的烟草继续放在温室(16h/light；8h/dark,22℃)培养，培养第六天时取样，丙酮提取，石油醚萃取，减压蒸发浓缩后利用GC-MS对样品进行分析检测。检测条件参见实施例4。

本发明不受上述具体文字描述的限制，应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，在此发明基础上本领域技术人员做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110>中国科学院昆明植物研究所

<120> 雪松醇合酶Lc-CedS编码基因及其应用

<170>中国国家知识产权局

<210>1

<211>549

<212> PRT

<213>米团花（Leucosceptrum canum）Lc-CedS

<400>1

Met Ile Thr Ala Ser Val Val Asp Gly Thr Leu Ser Cys Leu Arg Asp Val Arg

1 5 10 15

Pro Pro Val Thr Ile His Pro Pro Cys Ile Trp Gly Asp Lys Leu Ser Thr Phe

20 25 30 35

Ser Met Asp Asp Gln Val Gln Asn Lys Tyr Ala Glu Gly Ile Glu Ala Leu Lys

40 45 50

Asp Glu Ala Arg Ser Lys Leu Met Gly Ala Thr Ser Thr Lys Leu Met Ile Leu

55 60 65 70

Val Asp Ser Leu Glu Arg Leu Gly Leu Ala Tyr His Phe Glu Thr Gln Ile Glu

75 80 85 90

Glu Lys Leu Gln Glu Met Tyr Lys Glu Asp Asp Gly Gly Asp His Asp Leu Leu

95 100 105

Ala Thr Ser Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Arg Tyr His Val Ser Cys

110 115 120 125

Ser Val Phe Asp Lys Phe Lys Asp Ser Asp Asp Lys Phe Lys Glu Ala Leu Ile

130 135 140

Ser Asp Val Glu Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ala Tyr Val Gln Ile Ser

145 150 155 160

Gly Glu Gly Ile Leu Gln Glu Ala Leu Glu Phe Thr Thr His His Leu Thr Arg

165 170 175 180

Val Ala Pro Gln Leu Glu Cys Pro Leu Lys Asp Lys Val Asn Arg Ala Leu Glu

185 190 195

His Pro Leu His Arg Asp Val Pro Ile Phe His Ala Leu Ile Phe Ile Pro Ile

200 205 210 215

Tyr Ala Thr Asp Glu Ser Arg Asp Glu Leu Leu Gln Arg Leu Ala Thr Leu Asn

220 225 230

Phe Asn Phe Leu Gln Asn Leu Tyr Lys Lys Glu Leu Cys Glu Leu Ser Arg Trp

235 240 245 250

Trp Asn Lys Phe Asp Leu Lys Ser Lys Leu Pro Tyr Ile Arg Asp Ser Leu Val

255 260 265 270

Gly Ser Tyr Leu Trp Ala Ala Ala Phe His Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Gly Val

275 280 285

Arg Met Ala Val Thr Lys Cys Leu Gln Ile Ala Val Val Met Asp Asp Thr Tyr

290 295 300 305

Asp Asn Tyr Ala Thr Leu Gly Glu Ala Gln Leu Phe Thr Glu Thr Leu Glu Arg

310 315 320

Trp Ser Met Asp Glu Ile Asp Gly Leu Pro Asp Tyr Met Lys Thr Val Tyr His

325 330 335 340

Phe Ile Met Ser Thr Tyr Glu Asp Tyr Glu Arg Asp Thr Thr Lys Glu Gln Met

345 350 355 360

Phe Ala Ile Pro Tyr Phe Lys Glu Ala Val Lys Gln Leu Gly Arg Ala Tyr Asn

365 370 375

Gln Glu Leu Lys Trp Val Met Glu Arg Gln Met Pro Ser Phe Glu Glu Tyr Val

380 385 390 395

Lys Asn Ser Glu Ile Thr Ser Cys Val Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Phe Pro

400 405 410

Phe Leu Lys Ser Ala Thr Lys Glu Thr Ile Asp Trp Leu Leu Ser Glu Pro Gln

415 420 425 430

Leu Ala Ile Ser Thr Ala Met Ile Gly Arg Phe Cys Asp Asp Leu Gly Ser His

435 440 445 450

Glu Arg Glu Ser Lys Gly Gly Glu Met Leu Thr Val Leu Asp Cys Tyr Met Lys

455 460 465

Gln His Gly Val Ser Lys Gln Glu Thr Val Ser Lys Phe Ala Glu Ile Ile Glu

470 475 480 485

Asp Ala Trp Lys Asp Leu Asn Ala Ala Trp Ala Thr Thr Thr Ser Ser Pro Lys

490 495 500

Glu Met Val Glu Gln Phe Leu Asn Tyr Ala Arg Met Ala Gly Ala Thr Tyr Lys

505 510 515 520

Asn Asn Gly Asp Ala Tyr Thr Asn Pro Lys Tyr Val Phe Gly Pro Tyr Ile Asp

525 530 535 540

Ala Leu Phe Val Asn Pro Leu Val Ile

545

<160>2

<210>1

<211>1650

<212> DNA

<213>米团花（Leucosceptrumcanum）Lc-CedS编码基因cDNA序列

<400> 1

atgattactgctagcgttgtagatggtactttaagttgcctgagagatgtgaggccacct 60

gtgaccattcatcccccttgcatttggggtgataaattatctacgttttctatggacgat 120

caggtacagaacaaatacgcagaaggcattgaagcattgaaggatgaagcaagaagcaag 180

ctaatgggtgcaacatctaccaaactgatgatattagtcgattcgcttgaacgtttggga 240

ctggcgtatcattttgagacacagatcgaagagaaactccaagaaatgtataaagaggac 300

gatggaggcgaccacgatttgttggccacttcacttcgatttcgtttgctcaggcaacat 360

cgctatcatgtttcttgcagcgtgtttgataaatttaaggacagtgacgataaattcaaa 420

gaagctctcatcagtgatgttgagggattactaagtttgtatgaagcagcctacgtccag 480

attagtggcgaagggatcttacaagaagctctcgaatttacaacccatcacttgacacgt 540

gtggcgccacaattagagtgtccccttaaagacaaagtgaatcgagctttggaacatcca 600

cttcatagggatgttccaatctttcatgcactcatttttattcccatttacgcaacagat 660

gaatctagggatgaactacttcagagactagcaacattgaacttcaatttcctgcagaat 720

ttgtacaagaaagagctttgtgaactctccaggtggtggaacaaatttgatctcaagtca 780

aaactaccgtacataagagacagcttggtggggtcctatctttgggccgcagcattccat 840

tttgaacctcagtattctggtgttcgaatggcagttaccaaatgcctacaaattgcagta 900

gtaatggatgatacatatgataattatgctacacttggagaagctcaactttttacagaa 960

actttggaaaggtggagtatggatgaaattgatggactccctgattatatgaaaactgtt 1020

tatcattttattatgagtacgtatgaagattatgaacgtgatacaacaaaagaacaaatg 1080

tttgcaattccttacttcaaagaagcggtgaaacaacttggaagggcttacaaccaagag 1140

ctgaagtgggttatggaaagacaaatgccttcatttgaagaatatgttaaaaattcagag 1200

attaccagttgtgtctacgttttgttcactgccctatttccattcctgaaatctgctact 1260

aaagaaaccattgattggttgctgagtgagcctcaactggcaatatcgacggccatgatt 1320

ggtcgattctgcgatgacttgggcagccacgaacgcgagagtaagggaggggaaatgctc 1380

actgtcttggattgctacatgaaacaacatggtgtatcaaagcaagagactgtatccaaa 1440

tttgcagaaataattgaggatgcgtggaaggatttgaacgcggcatgggccacgaccaca 1500

tcttcgcctaaggaaatggtcgagcaatttttaaactacgcgcgaatggcaggtgctact 1560

tacaaaaacaatggagatgcttatacaaatcccaaatacgtttttggaccatatattgat 1620

gctctatttgtgaatcccttagtcatttaa 1650

Claims

1.雪松醇合酶Lc-CedS，其特征在于其为：Seq ID No.1所示氨基酸序列构成的蛋白。

2.权利要求1所述雪松醇合酶Lc-CedS的编码基因，其特征在于其为：Seq ID No.2所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述的雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的重组载体。

4.含有权利要求2所述的雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的表达盒。

5.含有权利要求2所述的雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的重组菌。

6.权利要求2所述的雪松醇合酶Lc-CedS编码基因在制备含有雪松醇合酶Lc-CedS编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌、转基因烟草中的应用。

7.权利要求1所述的雪松醇合酶Lc-CedS或权利要求2所述的编码基因在制备含有雪松醇合酶的发酵液或新鲜烟叶中的应用，其特征在于所述的应用是采用：构建含有编码所述酶的基因的重组表达载体，将所述重组表达载体转化至大肠杆菌BL 21以及农杆菌LBA4404中，将获得的基因工程细菌进行发酵培养或将农杆菌转染本氏烟草瞬时表达，得到含有雪松醇合酶的发酵液或新鲜烟叶。

8.权利要求1所述的雪松醇合酶Lc-CedS或权利要求2所述的编码基因在制备下述结构式所示的雪松醇中的应用，