CN106459949A - 补身醇合酶及生产补身醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过使至少一种多肽接触法尼基二磷酸酯来生产补身醇和/或补身醇衍生物的方法。该方法可以在体外或体内进行。本发明还提供在本发明的方法中有用的多肽的氨基酸序列以及编码本发明多肽的核酸。该方法进一步提供经基因改造以表达本发明多肽并且有用于生产补身醇和/或补身醇衍生物的宿主细胞或生物体。
Description
技术领域
本领域涉及一种生产补身醇(drimenol)的方法,所述方法包含使多肽与焦磷酸法尼酯(FPP)接触。具体地,所述方法可以在体外或体内进行以生产补身醇,其在香料领域是一种非常有用的化合物。本文还提供一种在本文提供的方法中有用的多肽的氨基酸序列。本文提供一种编码本文实施方式的多肽的核酸以及含有所述核酸的表达载体。本文还提供经转化以在所述生产补身醇的方法中使用的非人宿主生物体或细胞。
背景技术
在大多数生物体(微生物、动物和植物)中发现了萜烯。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元构成并且通过存在于它们结构中的这些单元的数目进行分类。因此,单萜、倍半萜和二萜是分别含有10、15和20个碳原子的萜烯。例如,在植物界中广泛地发现有倍半萜。许多倍半萜分子因为它们的风味和芳香特性以及它们的美容、医疗和抗菌效果而众所周知。已经鉴别出许多倍半萜烃和倍半萜类化合物。
萜烯的生物合成生产涉及称为萜合酶的酶。实际上,在植物界中存在大量的倍半萜合酶,均使用相同的底物((焦磷酸法尼酯,FPP),但是具有不同的产品构造。已经克隆了编码倍半萜合酶的基因和cDNA并且表征了相应的重组酶。
当前,补身醇的主要来源是天然含有补身醇的植物,并且这些天然源中的补身醇含量很低。已经开发了化学合成途径,但是仍然较复杂且不具成本效益。
发明内容
本文提供了一种生产补身醇的方法,包含:
i)使无环法尼基二磷酸酯(FPP)前体与具有补身醇合酶活性且包含SEQ ID NO:6的多肽接触,以生产补身醇;和
ii)任选地分离所述补身醇。
本文还提供一种分离的多肽,其具有补身醇合酶活性且包含SEQ ID NO:6。
本文进一步提供一种分离的核酸分子,其编码权利要求4中所述的多肽。
附图说明
图1:(-)-补身醇的结构
图2:真实的(-)-补身醇的质谱
图3:真实的(-)-补身醇的13C NMR谱
图4:真实的(-)-补身醇的X-射线(Cu K辐射)结构
图5:分离的补身醇合酶(VaTPS3)在烟草叶中的瞬时表达实验的GC/MS色谱。标出了GC/MS色谱中的补身醇峰,并且还提供了相应的质谱。
图6:重组VaTPS3在工程细菌细胞中生产的产物的GC/MS分析。A:细胞培养物的溶剂提取物的总离子色谱。B:12.544min处的峰的GC/MS(对于真实的(-)-补身醇标准的质谱,参见图2)。在11.902min处的洗脱峰为法尼醇,其来源于工程化大肠杆菌细胞生产的焦磷酸法尼酯的水解。
图7:真实的(-)-补身醇(上)、外消旋补身醇(中)和由重组VaTPS3在工程化细菌细胞中生成的补身醇(下)的手性GC/FID色谱。
图8:由重组VaTPS3合酶在体外生产的倍半萜的GC/MS分析。A:在使用外源FPP培育时由重组VaTPS3合酶生产的倍半萜的总离子色谱。B:使用由空质粒转化的大肠杆菌细胞在相同实验条件下进行的阴性对照。C:在12.99min处的峰的质谱。D:真实的(-)-补身醇标准的质谱。
具体实施方式
对于本文的说明书以及所附的权利要求书,除非另有说明,使用的“或”是指“和/或”。类似地,“包含(comprise、comprises、comprising)”、“包括(include、includes、including)”可以互换使用并且不旨在限制。
还需要理解的是,其中各个实施方式的说明使用的术语“包含”,本领域技术人员将能够理解,在一些具体的实例中,一个实施方式可以被替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述。在一个方面,本文提供一种生产补身醇的方法,包含:
i)使无环萜烯焦磷酸酯(特别地为法尼基二磷酸酯(FPP))与具有补身醇合酶活性且包含SEQ ID NO:6的多肽接触,以生产补身醇;和
ii)任选地分离所述补身醇。
在一方面,分离所述补身醇。
在本文提供的另一方面,以大于或等于60%、80%或90%或甚至95%的选择性生产补身醇。
本文进一步提供一种分离的多肽,其具有补身醇活性且包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
本文进一步提供一种分离的核酸分子,其编码包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽。
本文进一步提供一种包含序列SEQ ID NO:5的核酸分子。
本文进一步提供一种权利要求1所述的方法,其包含步骤:使用编码包含SEQ IDNO:6的多肽的核酸转化宿主细胞或非人生物体,和在允许所述多肽的生产的条件下培养该宿主细胞或生物体。
进一步提供的是至少一种载体,其包含所述的核酸分子。
本文进一步提供一种从原核载体、病毒载体和真核载体的组中选择的载体。
本文进一步提供一种载体,其为表达载体。
作为“补身醇合酶”或作为“具有补身醇合酶活性的多肽”,在此我们指的是一种能够催化从无环萜烯焦磷酸酯(特别是FPP)开始合成补身醇的多肽,该补身醇为任一立体异构体的形式或所述立体异构体的混合物的形式。补身醇可以是唯一产物或者可以是倍半萜混合物的一部分。
多肽催化特定倍半萜(例如补身醇)的合成的能力可以简单地通过进行实施例2至4中详细描述的酶测定来确认。
根据本发明,多肽还指包括截短的多肽,前提是它们保持了它们的补身醇合酶活性。
如下文所预期的,“通过改造SEQ ID NO:5或其互补序列获得的核苷酸序列”涵盖使用现有技术已知的任何方法(例如通过引入任何类型的突变,诸如缺失、插入或取代突变)改变SEQ ID NO:5或其互补序列的序列获得的任何序列。此种方法的例子在关于变体多肽及制备它们的方法的说明书部分进行了列举。
使用的缩写
bp 碱基对
kb 千碱基
BSA 牛血清白蛋白
DNA 脱氧核糖核酸
cDNA 互补DNA
DTT 二硫苏糖醇
FID 火焰电离检测器
FPP 焦磷酸法尼酯
GC 气相色谱
IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷
LB 溶源性肉汤
MS 质谱/质谱法
MVA 甲羟戊酸
PCR 聚合酶链反应
RMCE 重组酶介导的盒式交换
3’-/5’-RACE 3’和5’快速扩增cDNA末端
RNA 核糖核酸
mRNA 信使核糖核酸
miRNA 微RNA
siRNA 小干扰RNA
rRNA 核糖体RNA
tRNA 转移RNA
术语“多肽”是指连续聚合的氨基酸残基的氨基酸序列,例如,至少15个残基,至少30个残基,至少50个残基。在本文实施方式的一些实施方式中,多肽包含作为酶、其片段或其变体的氨基酸序列。
术语“分离的”多肽是指通过任何方法或本领域已知的方法(包括重组、生物化学和合成法)的组合从天然环境中取出的氨基酸序列。
术语“蛋白”是指任何长度的氨基酸序列,其中氨基酸被共价肽键所连接,并且包括寡肽、肽、多肽和全长蛋白,不管天然生成的还是合成的。
术语“补身醇合酶”或“补身醇合酶蛋白”是指能够将法尼基二磷酸酯(FPP)转化为补身醇的酶。
术语“生物学功能”、“功能”、“生物学活性”或“活性”是指本文提供的补身醇合酶催化FPP形成补身醇的能力。
可互换使用的术语“核酸序列”、“核酸”和“多核苷酸”是指核苷酸的序列。核酸序列可以是任何长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,并且包括基因、外显子、内含子、有义和反义互补序列、基因组DNA、cDNA、miRNA、siRNA、mRNA、rRNA、tRNA、重组核酸序列、分离的和纯化的天然产生的DNA和/或RNA序列、合成DNA和RNA序列、片段、引物和核酸探针的编码和非编码序列。本领域技术人员了解,RNA的核酸序列相同于DNA序列,差异在于胸腺嘧啶(T)被替代为尿嘧啶(U)。
“分离的核酸”或“分离的核酸序列”被定义为一种核酸或核酸序列,其所处的环境与天然产生的核酸或核酸序列所处的环境不同。如本文使用的如应用于核酸的术语“天然产生的”是指在自然的细胞中发现的核酸。例如,存在于能够从自然源中分离出的生物体(例如生物体的细胞)中的核酸序列,并且该核酸序列未经人类在实验室进行特意的改造,那么该核酸序列是天然产生的。
“重组核酸序列”是使用实验室方法(分子克隆)将来自多于一个源的遗传物质组合在一起所生成的核酸序列,由此创造出不是天然产生并且不能以其它方式在生物有机体中发现的核酸序列。
“重组DNA技术”是指一种用于制备重组核酸序列的分子生物学程序,例如描述于由Weigel和Glazebrook编制的实验室手册,2002Cold Spring Harbor Lab Press;和Sambrook et al.,1989Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press中。
术语“基因”是指一种DNA序列,其包含可操作地连接到适当调控区域(例如启动子)的被转录为RNA分子(例如细胞中的mRNA)的区域。因此,基因可以包含多个可操作地连接的序列,诸如启动子、5’前导序列(包含例如参与翻译初始化的序列)、cDNA或基因组DNA的编码区、内含子、外显子和/或3’非翻译序列(包含例如转录终止位点)。
“嵌合基因”是指通常不能在自然物种中找到的任何基因,特别是其中核酸序列存在一个或多个部分在性质上彼此不相关联的基因。例如,启动子在性质上与转录区的部分或全部或与另一调控区不相关联。术语“嵌合基因”应当被理解为包括表达构建体,其中启动子或转录调控序列被可操作地连接到一个或多个编码序列或反义(即有义链的反向互补链)或反向重复序列(有义和反义,由此RNA转录物在转录后形成双链RNA)。
“3’URT”或“3’非翻译序列”(也称为“3’未翻译区”或“3’末端”)是指在基因编码序列的下游发现的核酸序列,其包含例如转录终止位点和(在大多数天但非全部的真核mRNA中)多聚腺苷酸化信号诸如AAUAAA或其变体。在转录终止后,mRNA转录物可以被切去多聚腺苷酸化信号并且可以添加poly(A)尾,其参与了mRNA向翻译位点例如胞浆的运输。
“基因的表达”包括基因的转录和mRNA向蛋白质的翻译。过表达是指在转基因细胞或生物体中,以mRNA水平、多肽和/或酶活性测量的基因产物的生产超过了相似遗传背景的非转化细胞或生物体中的生产水平。
如本文中使用的“表达载体”是指使用分子生物学方法和重组DNA技术工程化以将外来或外源DNA递送到宿主细胞中的核酸分子。表达载体典型地包括适合转录核苷酸序列所需的序列。编码区通常编码目的蛋白,但是也可以编码RNA,例如反义RNA、siRNA等。
如本文所使用的“表达载体”包括任何线性的或环状的重组载体,包括但不限于病毒载体、噬菌体和质粒。本领域技术人员根据表达系统能够选择适合的载体。在一个实施方式中,表达载体包括可操作地连接到至少一个调控序列(其控制转录、翻译、起始和终止,诸如转录启动子、操纵子和增强子)或mRNA核糖体结合位点和任选地包括至少一个选择标记的核酸。当调控序列功能性地涉及本文实施方式的核酸时,核苷酸序列是“可操作地连接的”。
“调控序列”是指确定本文实施方式的核酸序列的表达水平、并且能够调控可操作地连接到该调控序列的核酸序列的转录速率的核酸序列。调控序列包含启动子、增强子、转录因子、启动子元素等。
“启动子”是指控制编码序列的表达的核酸序列,其提供RNA聚合酶用的结合位点以及适合转录所需的其它因子,包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和活化子蛋白结合位点。术语启动子的含义包括术语“启动子调控序列”。启动子调控序列可以包括可能影响转录、RNA加工或相关编码核酸序列的稳定性的上游和下游元素。启动子包括天然来源的和合成的序列。编码核酸序列通常位于启动子相对于以转录起始位点为起始的转录方向的下游。
术语“组成型启动子”是指不受调控的启动子,其允许其可操作地连接的核酸序列持续转录。
如本文使用的,术语“可操作地连接”是指处于功能性关系的多核苷酸元素的连接。当核酸与另一核酸序列处于功能性关系时,那么该核酸是“可操作地连接的”。例如,如果启动子或者转录调控序列能够影响编码序列的转录,那么该启动子或者转录调控序列是可操作地连接到该编码序列的。可操作地连接意味着被连接的DNA序列通常是邻接的。与启动子序列有关的核苷酸序列相对于要被转化的植物可以是同源或异源来源的。所述序列还可以是完全或部分合成的。不管来源如何,与启动子序列相关的核酸序列将根据在结合到本文实施方式的多肽后所连接的启动子性质而表达或沉默。相关核酸在所有时间或替代地在特定时间在整个生物体中或在特定组织、细胞或细胞室中可以编码需要表达或抑制的蛋白。此种核苷酸序列特别地编码将所需表型性状赋予给由其改变或转化的宿主细胞或生物体的蛋白质。更特别地,相关核苷酸序列引起在生物体中生产补身醇。特别地,所述核苷酸序列编码补身醇合酶。
“靶肽”是指一种氨基酸序列,其将蛋白质或多肽靶向细胞内细胞器(即,线粒体或质体)或细胞外空间(分泌信号肽)。编码靶肽的核酸序列可以被融合到编码蛋白或多肽的氨基末端(例如N-末端)的核酸序列或者可以被用来替换原有的靶多肽。
术语“引物”是指短的核酸序列,其被杂交到模板核酸序列并且被用于与该模板互补的核酸序列的聚合。
如本文所使用的,术语“宿主细胞”或“转化细胞”是指被改变以包藏至少一种核酸分子(例如,编码所需蛋白或核酸序列的重组基团,该核酸序列在转录后产生有用于生产补身醇的补身醇合酶蛋白)的细胞(或生物体)。宿主细胞特别地是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞。宿主细胞可以含有根据本发明所述的重组基因,其已经被整合到该宿主细胞的核或细胞器的基因组中。替代地,宿主可以含有染色体外的重组基因。同源序列包括直系或旁系同源序列。鉴别直系或旁系的方法包括现有技术中已知且在本文中描述的进化方法、序列相似性和杂交方法。
旁系同源物来源于基因复制,其产生具有相似序列和相似功能的两种或更多种基因。旁系同源物典型地聚簇在一起并且通过基因在相关植物物种内的复制而形成。使用成对Blast分析或在基因家族的进化分析过程中使用程序诸如CLUSTAL在类似基因的组中发现旁系同源物。在旁系同源物中,共有序列可以是相关基因中序列的识别特性并且具有基因的类似功能。
直系或直系同源序列是彼此相似的序列,因为它们被发现在由共同的祖先传下的物种中。例如,具有共同祖先的植物物种已经含有相同类似序列和功能的许多酶。本领域技术人员能够识别直系同源序列并预测直系同源的功能,例如通过使用CLUSTAL或BLAST程序构建一个物种的基因族的进化树。一种用于识别或确认同源序列间的相似功能的方法是通过比较过表达或缺乏(在基因敲除/敲除中)相关多肽的植物中的转录物概况。本领域技术人员能够理解,具有相似转录物概况的基因具有大于50%调控的共同转录物或具有大于70%调控的共同转录物或大于90%调控的共同转录物,所述转录物会具有相似的功能。本文所述序列的同源物、旁系同源物、直系同源物以及任何其它变体预期以类似的方式发挥作用,使得植物生产补身醇合酶蛋白。
本文提供的一个实施方式提供补身醇合酶(包括直系同源物和旁系同源物)的氨基酸序列以及用于在其它生物体中识别和分离补身醇合酶的直系同源物和旁系同源物。特别地,如此识别的补身醇合酶的直系同源物和旁系同源物保留了补身醇合酶活性并且能够从FPP前体为起始而生产补身醇。
术语“选择性标记物”是指在表达后能够被用来选择包括该选择性标记物的细胞的任何基因。以下描述了选择性标记物的例子。本领域技术人员了解不同的抗生素、杀真菌剂、营养缺陷型或除草剂选择标记物可适用于不同的目标物种。
本申请目的的“补身醇”是指(-)-补身醇(CAS:468-68-8)。
术语“生物体”是指任何非人多细胞或单细胞生物体。诸如植物或微生物。特别地,微生物是细菌、酵母、藻类或真菌。术语“植物”被互换地用来包括植物细胞,包括植物原生质体、植物组织、产生再生植株的植物细胞组织、或植物的部分、或植物机件诸如根、茎、叶、花、花粉、胚珠、胚、果实等。任何植物均可以用来实施本文实施方式的方法。
在体外要与无环焦磷酸酯(例如FPP)接触的多肽可以使用标准蛋白或酶提取技术从表达它的任何有机体中提取得到。如果宿主生物体是将本文实施方式的多肽释放到培养基中的单细胞生物体或细胞,那么可以简单地从所述培养基收集所述多肽,例如,通过离心,任选地随后进行洗涤步骤和再悬浮于适合的缓冲液中。如果所述生物体或细胞将多肽累积于其细胞中,那么可以通过破裂或裂解所述细胞并且进一步从细胞裂解液中提取多肽来获得所述多肽。
然后,可以将具有补身醇合酶活性的多肽(为分离的形式或与其它蛋白在一起的形式,例如处于从培养的细胞或微生物中获得的粗制蛋白提取物中)悬浮于处在最佳pH的缓冲液中。如果适合,可以加入盐、DTT、无机阳离子及其它种类的酶促辅因子以便使酶活性最佳化。向多肽悬浮液中加入前体FPP,然后在最佳的温度(例如15至40℃,特别地25至35℃,更特别地30℃)下进行培育。在培育之后,可以通过标准分离工序诸如溶剂提取,从培育的溶液中分离出所产生的补身醇,并且(任选地在从所述溶液中取出多肽之后)进行蒸馏。
根据另一特定的实施方式,任一上述实施方式的方法是在体内进行的。在这种情况下,步骤a)包含在有助于生产补身醇的条件下,培养能够生产FPP并且经转化以表达至少一种多肽的非人宿主生物体,所述至少一种多肽包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列并且具有补身醇合酶活性。
根据更特别的实施方式,所述方法进一步包含,在步骤a)之前,使用至少一种编码多肽的核酸转化能够生产FPP的非人生物体或细胞,所述多肽包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的并且具有补身醇合酶活性,以便所述生物体表达所述多肽。
本文实施方式的这些实施方式是特别有利的,因为其能够在体内进行所述方法而无需预先分离出所述多肽。反应在经转化以表达所述多肽的生物体或细胞内直接发生。
根据更特别的实施方式,在任一上述实施方式中使用的至少一种核酸包含已经通过改造SEQ ID NO:5或其互补序列获得的核苷酸序列。根据另一实施方式,所述至少一种核酸分离自败酱科族,特别是黑水缬草。所述生物体或细胞旨在“表达”多肽,前提是所述生物体或细胞经转化以包藏编码所述多肽的核酸,这种核酸被转录至mRNA并且在所述宿主生物体或细胞中发现所述多肽。术语“表达”涵盖“异源表达”和“过表达”,后者是指mRNA、多肽和/或酶活性的水平高于在非转化的生物体或细胞中所测量的水平。随后,在致力于描述作为本文具体目的的此种转化的非人宿主生物体或细胞的说明书部分中以及在实施例中,将描述用于转化非人宿主生物体或细胞的适合方法的更详细说明。
特定的生物体或细胞是指当其天然地产生FPP或当其不天然地产生FPP但是在使用本文所述的核酸转化之前或与使用所述核酸一起被转化以生产FPP时“能够产生FPP”。经转化以比天然存在的有机体或细胞产生更高量的FPP的生物体或细胞也被“能够生产FPP的生物体或细胞”所涵盖。用于转化生物体(例如微生物)以便它们生产FPP的方法在本领域中是已知的。
为了在体内进行本文的实施方式,在有助于补身醇的生产的条件下培养宿主有机体或细胞。因此,如果宿主是转基因植物,那么例如提供最佳的生长条件,诸如最佳光、水和营养条件。如果宿主是单细胞有机体,那么有助于补身醇的生产的条件可以包含向宿主的培养基中添加适合的辅因子。此外,可以选择培养基以便最大化补身醇合成。在下列实施例中以更详细的方式描述了最佳的培养条件。
适合于在体内进行本文实施方式的方法的非人宿主生物体可以是任何非人多细胞或单细胞生物体。在一个特定的实施方式中,用来在体内进行本文实施方式的非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。可以使用任何植物、原核生物或真菌。特别有用的植物是天然产生高量萜烯的那些。在一个更特定的实施方式中,用来在体内进行本文实施方式的方法的非人宿主生物体是微生物。可以使用任何微生物,但根据甚至更特定的实施方式,所述微生物是细菌或酵母。更特别地,所述细菌是大肠杆菌且所述酵母是酿酒酵母。
这些有机体的一些天然不产生FPP。为了适合于进行本文实施方式的方法,这些有机体必须经转化以产生所述前体。它们可以在使用根据任一上述实施方式所述的核酸改造之前或同时地被如此转化,如上所说明的。
还可以使用分离的更高等真核细胞以替代完整的生物体作为宿主以在体内进行本文实施方式的方法。适合的真核细胞可以是任何非人细胞,但特别地是植物或真菌细胞。
在另一特定的实施方式中,所述多肽包含SEQ ID NO:6。
根据另一特定实施方式,在任一上述实施方式中使用的或由任一上述实施方式中使用的核酸编码的具有补身醇合酶活性的至少一种多肽包含作为SEQ ID NO:6的变体的氨基酸序列,其是通过基因工程获得的,前提是所述变体保持了如上定义的补身醇合酶活性并且与SEQ ID NO:6具有所需百分比的同一性。换言之,所述多肽特定地包含由已经通过改造SEQ ID NO:5或其互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。根据一个更特定的实施方式,在任一上述实施方式中使用的或由任一上述实施方式中使用的核酸编码的具有补身醇合酶活性的至少一种多肽,由作为SEQ ID NO:6的变体(通过基因工程获得)的氨基酸序列组成,即由已经通过改造SEQ ID NO:5或其互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
根据另一特定的实施方式,在任一上述实施方式中使用的或由在任一上述实施方式中使用的核酸编码的至少一种具有补身醇合酶活性的多肽是SEQ ID NO:6的变体,其可以在其它有机体中自然地发现,诸如其它植物物种,前提是其保持了补身醇合酶活性。
如本文中使用的,所述多肽旨在是包含本文确定的氨基酸序列的多肽或肽片段以及截短的或变体多肽,前提是它们保持了如上所定义的补身醇合酶活性,并且它们与SEQID NO:6的相应片段共享有至少确定百分比的同一性。
变体多肽的例子是由交替mRNA剪接事件或本文所述多肽的蛋白水解切割产生的天然存在的蛋白。归因于蛋白水解的变种包括例如在不同类型的宿主细胞中表达后N-或C-末端的差异,这是由于从本文实施方式的多肽蛋白水解去除一个或多个末端氨基酸引起的。本文实施方式还涵盖了如下文所描述的,通过天然或人工突变本文实施方式的核酸获得的核酸所编码的多肽。
由在氨基和羧基末端融合额外的肽序列产生的多肽变体也可以用在本文实施方式的方法中。特别地,此种融合能够增强多肽的表达,有用于蛋白的纯化或改善多肽在期望环境或表达系统中的酶活性。此种额外的肽序列例如可以是信号肽。因此,本发明包括使用变体多肽(诸如通过与其它寡肽或多肽融合所获得的那些和/或连接到信号肽的那些)的方法。由与另一种功能肽(诸如来自萜生物合成路径的另一种蛋白)融合产生的多肽也可以有利地用于本文实施方式的方法中。
根据另一实施方式,在任一上述实施方式中使用的或由在任一上述实施方式中使用的核酸编码的所述至少一种具有补身醇合酶活性的多肽分离自败酱科族(Valerianaceae)的植物,特别地分离自黑水缬草(Valeriana amurensis)。实施本文实施方式的方法的一种重要工具是所述多肽本身。因此,本文提供具有补身醇合酶活性并且包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽。
根据一个特定的实施方式,所述多肽能够生产倍半萜的混合物,其中补身醇占所产生的倍半萜的至少20%、特别地至少30%、特别地至少35%、特别地至少90%、特别地至少95%、更特别地至少98%。在本文提供的另一方面,以大于或等于95%、更特别地98%的选择性生产补身醇。
根据一个特定的实施方式,所述多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
根据另一个特定的实施方式,所述多肽由SEQ ID NO:6组成。
所述至少一种多肽包含作为SEQ ID NO:6的变体的氨基酸序列,其是通过基因工程获得的或者在缬草植物或在其他植物物种中发现的。换言之,当通过基因工程获得所述变体多肽时,所述多肽包含由已经通过改造NO:5或其互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。根据一个更特定的实施方式,具有补身醇合酶活性的所述至少一种多肽由作为SEQ ID NO:6的变体的氨基酸序列组成,其是通过基因工程获得的,即由已经通过改造NO:6获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
根据另一个实施方式,所述多肽分离自败酱科族的植物,特别地分离自黑水缬草。如本文所使用的,所述多肽旨在作为包含本文确定的氨基酸序列以及截短的或变体多肽的多肽或肽片段,前提是它们保持了如上定义的活性并且它们与SEQ ID NO:6的相应片段共享至少确定百分比的同一性。
如上所述,当在体内进行所述方法时,编码本文实施方式的多肽的核酸是一种用来改造将要使用的非人宿主生物体或细胞的有用工具。
因此,本文还提供编码根据任一上述实施方式所述的多肽的核酸。
根据一个更特定的实施方式,所述核酸包含SEQ ID NO:5或其互补序列。
根据另一个更特定的实施方式,所述核酸由核苷酸序列SEQ ID NO:5或其互补序列组成。
本文实施方式的核酸可以被定义为包括单链形式或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物(DNA和/或RNA)。术语“核苷酸序列”应当被理解为包含多核苷酸分子或独立片段形式的寡核苷酸分子或理解为较大核酸的组件。本文实施方式的核酸还涵盖某些分离的核苷酸序列,包括基本上不含内源性污染物质的那些分离的核苷酸序列。本文实施方式的核酸可以是截短的,前提是其编码如上所述的本发明涵盖的多肽。
在一个实施方式中,本文实施方式的核酸可以是缬草物种或其它物种的植物中天然存在的,或可以是通过改造SEQ ID NO:5或其互补序列获得的。
包含由SEQ ID NO:5或其变体的突变获得的序列的核酸被涵盖在本文实施方式中,前提是它们包含的所述序列共享SEQ ID NO:5或其互补序列的至少定义的序列,并且前提是它们编码如任一上述实施方式中定义的具有补身醇合酶活性的多肽。突变可以是这些核酸的任何种类突变,诸如点突变、缺失突变、插入突变和/或移码突变。可以制备变体核酸以便使其核苷酸序列适应特定的表达系统。例如,如果氨基酸由特定的密码子编码,已知细菌表达系统能更有效地表达多肽。
由于遗传密码的简并,多于一个密码子可以编码相同的氨基酸序列,多个核酸序列能够编码相同的蛋白或多肽,所有这些DNA序列均被涵盖在本文实施方式中。在适当的情况下,编码补身醇合酶的核酸序列可以被优化以增加在宿主细胞中的表达。例如,可以使用特定的密码子通过宿主合成本文实施方式的核苷酸以提高表达。
用于转化适于在体内进行本文实施方式的方法的宿主生物体或细胞的另一重要工具是表达载体,其包含根据本文实施方式的任一实施方式所述的核酸。因此,本文还提供此种载体。
如下文进一步披露的,本文提供的表达载体可以被用在用于制备遗传转化的宿主生物体和/或细胞的方法中,用在包藏本文实施方式的核酸的宿主生物体和/或细胞中,以及用在用于制备具有补身醇合酶活性的多肽的方法中。
经转化以包藏本文实施方式的至少一种核酸以便异源表达或过表达本文实施方式的至少一种多肽的重组非人宿主生物体和细胞,也是实施本文实施方式的方法的非常有用的工具。因此,本文提供此种非人宿主生物体和细胞。
根据任一上述实施方式所述的核酸可以被用来转化非人宿主生物体和细胞,并且所表达的多肽可以是任何上述的多肽。
本文实施方式的非人宿主生物体可以是任何非人多细胞或单细胞生物体。在特定的实施方式中,所述非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。任何植物、原核生物或真菌均适于根据本文所述的方法进行转化。特别有用的植物是天然生产高量萜烯的那些植物。
在更特别的实施方式中,所述非人宿主生物体是微生物。任何微生物均适合作为非人宿主,但根据甚至更特别的实施方式,所述微生物是细菌或酵母。更特别地,所述细菌是大肠杆菌和所述酵母是酿酒酵母。
除了完整的生物体之外,分离的更高等的真核细胞也可被转化。作为更高等的真核细胞,我们在此指的是除酵母细胞之外的任何非人真核细胞。特别的更高等的真核细胞是植物细胞或真菌细胞。
通过附接共价或非共价连接到多肽主链的改造基团,变体也可以不同于本文实施方式的多肽。通过引入N-连接的或O-连接的糖基化位点、和/或添加半胱氨酸残基,所述变体还包括与本文提供的多肽不同的多肽。本领域技术人员能够了解如何改造氨基酸序列和保留生物活性。
可以使用各种方法确定任何补身醇合酶蛋白、变体或片段的功能性或活性。例如,在植物、细菌或酵母细胞中瞬时或稳定的过表达可以被用来测试蛋白是否具有活性,即从FPP前体生产补身醇。可以在指示功能性的微生物表达系统(诸如本文实施例2或3中描述的对补身醇生产的检定)来评估补身醇合酶活性。本文实施方式的补身醇合酶多肽的变体或衍生物保留了从FPP前体生产补身醇的能力。本文提供的补身醇合酶的氨基酸序列变体可以具有附加的期望生物学功能,包括例如改变的底物利用、反应动力学、产品分布或其它改变。
本文的实施方式提供本文实施方式的多肽,其被用于生产补身醇的方法中,该方法在体外或体内使FPP前体与本文实施方式的多肽接触。
本文还提供一种分离的重组或合成多核苷酸,其编码本文提供的多肽或变体多肽。本文实施方式的一个实施方式提供一种分离的重组或合成核酸序列SEQ ID NO:5,其编码具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其片段的补身醇合酶,该补身醇合酶在细胞中催化从FPP前体产生补身醇。本文还提供cDNA、基因组DNA和RNA序列。在本文中,将编码补身醇合酶或其变体的任何核酸序列称为补身醇合酶编码序列。
根据一个特定的实施方式,SEQ ID NO:5的核酸是编码如实实施中所述获得的补身醇合酶的补身醇合酶基因的编码序列。
SEQ ID NO:5的多核苷酸的片段是指特别地为本文实施方式的多苷酸的至少15bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp和/或至少60bp长度的连续核苷酸。特别地,多核苷酸的片段包含本文实施方式的多核苷酸的至少25、更特别地至少50、更特别地至少75、更特别地至少100、更特别地至少150、更特别地至少200、更特别地至少300、更特别地至少400、更特别地至少500、更特别地至少600、更特别地至少700、更特别地至少800、更特别地至少900、更特别地至少1000个连续核苷酸。不受限制的,本文的多核苷酸的片段可以被用作PCR引物和/或用作探针、或用于反义基因沉默或RNAi。
本领域技术人员清楚的是,基因(包括本文实施方式的多核苷酸)可以通过本领域已知的方法基于可获得的核苷酸序列信号(诸如在所附的序列表中发现的)进行克隆。这些包括例如设计表示此种基因的侧翼序列的DNA引物,所述基因的一种是在有义取向上产生的并且初始化有义链的合成,而另一种以反向互补的方式创造并且产生反义链。诸如在聚合酶链反应中使用的那些热稳定的DNA聚合酶通常被用来进行此种实验。替代地,表示基因的DNA序列可以被化学合成并且随后导入到DNA载体分子中,所述DNA载体分子可以通过例如相容性细胞(诸如大肠杆菌)来繁殖。
在一个本文提供的相关实施方式中,提供了PCR引物和/或用于检测编码补身醇合酶的核酸序列的探针。本领域技术人员将能够了解,基于SEQ ID NO:5合成简并的或特定的PCR引物对的方法,所述PCR引物对用以扩增编码补身醇合酶或其互补序列的核酸序列。用于编码补身醇合酶的核酸序列的检测试剂盒可以包括特异于编码补身醇合酶的核酸序列的引物和/或探针,以及使用所述引物和/或探针检测编码样品中编码补身醇合酶的核酸序列的相关协议。此种检测试剂合可以被用来检测植物是否已被改造,即使用编码补身醇合酶的序列转化。
由SEQ ID NO:5的突变获得的核酸序列可以被常规地制得并且也处于本文提供的实施方式中。对于本领域技术人员言清楚的是,可以向SEQ IDNO:5的DNA序列中导入一个或多个核苷酸的突变、缺失、插入和/或替换。通常,突变是基因的DNA序列的改变,其能够改变所产生的多肽的氨基酸序列。
为了测试根据本文实施方式所述的变体DNA序列的功能,目标序列被可操作地连接到选择性或筛选性标记基因,并且在原生质体的瞬时表达分析中或在稳定转化植物中测试报告基因的表达。本领域技术人员能够理解,能够推动表达的DNA序列被构建为模块。因此,来自较短DNA片段的表达水平可能不同于来自最长片段的表达水平,并且能够彼此不同。本文还提供了编码本文提供的补身醇合酶的核酸序列的功能性等同物,即在严格条件下杂交到SEQ ID NO:5的核酸序列的核苷酸序列。
本领域技术人员能够想到用于识别其它有机体中同源序列的方法以及用于检测同源序列之间的序列同一性百分比的方法(在本文的定义部分确定)。然后可以对此种新识别的DNA分子进行测序并且可以将所述序列与SEQ ID NO:5的核酸序列进行比较。
本文提供的相关实施方式提供与根据SEQ ID NO:5所述的核酸序列互补的核酸序列(诸如抑制性RNA),或者在严格条件下杂交到根据SEQ ID NO:5所述的核苷酸序列的至少一部分的核酸序列。本文实施方式的替代实施方式提供一种改变宿主细胞中基因表达的方法。例如,在某些背景下(例如,在昆虫叮咬或蛰伤之后或在暴露于一定的温度下),在宿主细胞或宿主有机体中可以增强或过表达或诱导本文实施方式的多核苷酸。
本文提供的多核苷酸的表达的改变还会产生“异位表达”,其在改变的以及在对照或野生型有机体中是一种不同的表达模式。表达的改变是由本文实施方式的多肽与外源性或内源性调节剂的接触而发生的或者是由于多肽的化学改造导致的。所述术语还指本文实施方式的多核苷酸的改变的表达模式,其被改变至低于检测水平或者完全被抑制活性。
在一个实施方式中,在单一宿主中共同表达多种补身醇合酶编码核酸序列,特别地在不同启动子的控制下进行。替代地,在单个转化载体上可以存在多种补身醇合酶蛋白编码核酸序列,或者可以同时使用单独的载体进行共转化并且选择包含两个嵌合基因的转化体。类似地,在单一植物中可以与其它嵌合基因(例如编码增强虫害抗性等的其它蛋白的嵌合基因)一起表达一种或多种补身醇合酶编码基因。
本文实施方式的编码补身醇合酶的核酸序列可以被插入到表达载体中和/或被包含在插入到表达载体中的嵌合基因中,以便在宿主细胞或宿主有机体中生产补身醇合酶蛋白。用于将转基因插入到宿主细胞的基因组中的载体在本领域中是众所周知的,并且包括质粒、病毒、粘粒和人工染色体。其中插入了嵌合基因的二元或共整合载体也被用来转化突主细胞。
本文提供的实施方式提供重组表达载体,其包含补身醇合酶基因的核酸序列、或可操作地连接到缔合核酸序列(诸如例如启动子序列)的包含补身醇合酶基因的核酸序列的嵌合基因。例如,包含SEQ ID NO:5的核酸序列的嵌合基因或可以可操作地连接到适合于在植物细胞、细菌细胞或真菌细胞中表达的启动子序列、可操作地连接到3’非翻译的核酸序列。
替代地,启动子序列可以已经存在于载体中,以便待转录的核酸序列插入到该启动子序列的载体下游。载体通常被工程化以具有复制起点、多克隆位点和选择性标记物。
下列实施例仅是说明性的并且不旨在限制本文所述的实施方式、权利要求的范围。
实施例
实施例1:真实的(-)-补身醇的制备及结构鉴定
通过蒸馏、随后急骤层析并且结晶,从(阿米香树属Amyris balsamifera)分离(-)-补身醇。通过GC/MS(图2,LRI 1744在DB1柱上)、NMR(图3)、X-射线衍射(图4)和旋光度(-6.52°,c=0.092;MeOH)鉴定(-)-补身醇的结构(图1)。
实施例2:从黑水缬草分离补身醇合酶基因(VaTPS3)及其功能确认
收集存活黑水缬草植物的根组织,并且立即在液氮中冷冻。使用研钵和研杵将冷冻的组织磨成粉以备RNA分离。使用CTAB方法提取总RNA,并且使用DNase(Ambion TurboDNA-游离DNase处理和清除剂)处理以在cDNA合成之前除去DNA污染物。遵循制造商推荐的标准协议,使用RT-PCR用的Superscript IIITM第一链合成系统(18080-051)从总RAN合成cDNA。
对于TPS基因克隆,将以下简并引物GATTTCAANMTKCTRCAAAWGCTTCA和GCATTCRASGCCNGWNGCAACATGT用于PCR,使用以上合成的cDNA作为模板。在20ul含有lx反应缓冲液、dNTPs(各0.2mM)、引物(各l uM)、cDNA(1ul)和DNA聚合酶(0.2ul Q5高保真度DNA聚合酶,NEB)的反应体积中进行PCR。PCR参数如下:98℃45秒进行初始变性,随后进行35个循环的98℃15秒、55℃30秒和72℃30秒。最后,添加72℃5分钟以进行最后一次扩展。将预期大小的PCR产物克隆到pMD-19-T载体中以进行测序。基于序列分析,预期所述PCR产物为倍半萜合酶基因的片段。
使用Clontech's SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒,通过3’和5’RACE PCR克隆这种DNA序列的全长。使用了以下基因特异性引物:外引物ATCTTCCTCCTCGTGGCTCATTACATCG和内引物CGGCCAAACGATTACCGATTGACACTAC用于5’RACE;外引物TACCACGAACCAAAGTACTCTCCGGCTC和内引物GGAAGAGTTAAAAGCTATCGCCAAGTGC用于3’RACE。通过TA克隆将来自两个内引物对的PCR产物克隆到pMD-19载体中,并且进行测序。然后产生全长序列并且命名为VaTPS3。
将这种全长TPS基因克隆到pCAMBIA2300-基植物表达载体中,并且通过农杆菌渗入介导的瞬时表达在烟草叶中检查其功能。经处理的叶的GC/MS分析检测到补身醇作为占主导地位的挥发性代谢物存在(高达5μg/g鲜重叶)。在配备有DBl-ms柱(30m x 0.25mm idx 0.25m DB-1ms(J&W 122-0132))和耦合有5975系列质谱仪的Agilent 6890系列GC系统进行GC/MS。载气是1ml/min恒流的氦。注入为分流模式(25:1),注射器温度设定在250℃,且柱箱温度程序控温为以5℃/min从50℃(5min保持)升温至300℃,然后以50℃/min升温至340℃(3min保持)。基于真实标准的保留指数和质谱的一致性来确认产品的身份(图5)。
GC/MS色谱分析分离的补身醇合酶在烟草叶上的瞬时表达实验。在GC/MS色谱上标出补身醇峰,并且还展示出相应的质谱。
实施例3:VaTPS3在工程化大肠杆菌细胞中的异源表达和功能表征
对于VaTPS3在大肠杆菌中的异源表达,通过DNA2.0(Menlo Park,CA)设计合成了编码VaTPS3的cDNA的密码子优化版本,并且亚克隆到pJ404细菌表达载体(DNA2.0)中,以产生pJ404/VaTPS3。将大肠杆菌BL21StarTM(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)用作类异戊二烯生产菌株。为了提高亲本细菌菌株的体内生产力,采取通过异源甲羟戊酸途径的过表达的代谢工程方法。通过DNA2.0化学合成由大肠杆菌乙酰乙酰基-CoA硫解酶(atoB)、金黄色葡萄球菌HMG-CoA合酶(mvaS)、金黄色葡萄球菌HMGCoA还原酶(mvaA)和酿酒酵母焦磷酸法尼酯(FPP)合酶(ERG20)基因组成的合成操纵子,并连接入NcoI-BamHl消化的pACYCDuet-1载体(Invitrogen)中,产生pACYC/29258。作为低级的甲羟戊酸途径,使用下列引物,从基因组DNA(肺炎链球菌ATCC BAA-334),PCR扩增来自肺炎链球菌编码甲羟戊酸激酶(MvaKl)、磷酸甲羟戊酸激酶(MvaK2)、甲羟戊酸二磷酸酯脱羧酶(MvaD)和焦磷酸异戊烯酯异构酶(Fni)的天然操纵子:5’-AAGGAGATATACATATGACAAAAAAAAGTTGGTGTCGGTCAGG-3’(正向)和5’-CTTTACCAGACTCGAGTTACGCCTTTTTCATCTGATCCTTTGC-3’(反向)。使用In-Fusion 2.0Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech),将所得到的扩增子克隆到Ndel-Xhol消化的pACYC/29258载体中,提供pACYC/29258_4506载体(J.Am.Chem.Soc.2013,134:18900-18903)。然后,使用上述的pJ404/VaTPS3构建体共转化FPP-高产菌株。将转化细胞的单菌落用来接种5mL补充有适当抗生素的LB培养基。然后,在37℃和250rpm下将培养物培育过夜。次日,使用200μL过夜培养物接种2mL矿物‘AM’培养基并且在37℃和250rpm下培育(J.Am.Chem.Soc.2013,134:18900-18903)。培养4至6小时之后(或当培养物在600nm下的光密度达到值~2时),将培养物冷却到25℃并且使用0.1mM异丙基-D-l-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。此时,向生长培养基中添加10%(v/v)的十二烷。在使用轨道振荡(250rpm)培育72小时之后,使用一体积的甲基叔丁基醚(MTBE)将细胞培养物提取两次,并且通过GC/MS分析溶剂提取物。在配备有DB1柱(30m x 0.25mm x 0.25mm膜厚;Agilent)并且耦合有5975系列质谱仪的Agilent 6890系列GC系统上进行GC/MS。载气是恒流1ml/min的氦。注身为分流模式,注射器温度设定在250℃并且柱箱温度以10℃/min从50℃程序升温至225℃,并且以20℃/min升温至320℃。基于真实标准的保留指数和质谱的一致性来确认产品的身份。
如图6所示,重组VaTPS3产生(-)-补身醇作为主要产物(选择性98%)并取得了约200mg/L的峰值滴度。通过匹配从(阿米香树属)分离的真实的(-)-补身醇标准的保留时间和质谱确认了(-)-补身醇的身份。通过手性GC分析确定了对映纯度(图7)。
实施例4:VaTPS3的体外功能表征
将实施例3中描述的密码子优化版本的VaTPS3cDNA亚克隆到pJ414细菌表达载体(DNA2.0)中以产生pJ414/VaTPS3。
在BL21StarTM(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen)中进行VaTPS3的异源表达。将使用pJ414/VaTPS3质粒转化的细胞的单菌落用来接种5ml含有50μg/ml羧苄青霉素的LB培养基。在37℃轨道振荡下培育5至6小时之后,将细菌培养物转移到20℃培育箱中。然后,通过添加0.1mM IPTG诱导重组VaTPS3的表达,并且在20℃将培养物培育过夜。次日,通过离心收集细胞,再悬浮于0.1体积50mM MOPSO pH 7的10%丙三醇中,并且通过超声裂解。通过离心(在20,000g下30min)澄清提取物,并且将含有可溶性胞质蛋白的上清液用于进一步实验。
在80μΜ法呢基二磷酸酯(FPP,Sigma)和0.1至0.5mg蛋白提取物的存在下,在1mL的50mM MOPSO pH 7的10%丙三醇、1mM DTT、15mM MgCl2中进行体外检测。在20℃将管培育12至24小时,并且使用一体积的戊烷提取两次。在氮气流量下浓缩后,如实施例3中所述,通过GC-MS分析庚烷提取物。使用空pJ414质粒转化的大肠杆菌细胞的提取物,在相同的实验条件下进行阴性对照。如图8所示,VaTPS3重组酶以大于98%的选择性产生作为主产物的(-)-补身醇。通过匹配从(阿米香树属)分离的真实的(-)-补身醇标准的质谱和保留时间确认了(-)-补身醇的身份。
序列表
SEQ ID NO:1
ATCTTCCTCCTCGTGGCTCATTACATCG
SEQ ID NO:2
CGGCCAAACGATTACCGATTGACACTAC
SEQ ID NO:3
TACCACGAACCAAAGTACTCTCCGGCTC
SEQ ID NO:4
GGAAGAGTTAAAAGCTATCGCCAAGTGC
SEQIDNO:5
ATGTCTACTGCATTAAACAGTGAGCATGAAACTGTTCGTCCATTAGCAAGTTTTAAACCGAGTACATGGGGCGATCTTTTCATCTCTTATTCTGAAGATAGCCAGCTTAAGGAAGTATATGGTAAAGAGCACGAATGTCTGAAACAACAAGTGAAAACAATGTTGTTGGATCTGACAAATTATAGAATTTCGGAGAAAATCGCTTTCATAAATACGTTGGAGAGATTAGGGGTATCTCATGAGTTTGAGAATGAGATTGAAGGGCTGCTTCATCAAATGTTTGATGCTCATTCTAAATTCCAAGATGGCATTCAACACTTTGATTTGTTCACATTGGGGATTTACTTTAGGATTCTCAGGCAACATGGCTATAGAATCTCTTGTGATGTTTTCAACAAGTTGAAAGATAGCAACAATGAATTCAAGAAGGAACTTAAAGAGGACGCTATTGGTTTGCTAAGTTTGTACGAAGCGACACAAGTAAGAGCACACGCTGAAGAAATTTTAGACGAAGCCCTCATTTTCACAAAGGCTCAACTTGAATCCATAGCCGCAACCTCGAGCTTAAGCCCATTTGTCGAGAAGCAAATTACTCATGCTTTGGTCCAAGCTCTCCACAAAGGAATCCCAAGAGTCGAATCGCGCCATTTCATCTCTGTTTATGAAGAAGATCCTGACAAAAATGATTTGTTGTTGAGGTTCTCAAAGATTGATTACAATCTTGTACAAATGCTTCACAAGCAAGAATTGTGCCATATCTCAAAGTGGTGGAGAGATTCGGAGCTCGAAACAAAACTAACTTATGTGAGGAATAGAGTGGCGGAATGCTTTTTATGGACTCTTTGTGTGTACCACGAACCAAAGTACTCTCCGGCTCGGCTTCTGTTAGGCAAACTCATAAATATCATATCTTGCACTGATGACACATATGATGCGTATGGTACATTAGAGGAAGTTCAGATCTTTACAGATGTCATACAAAGGTTGGATAGGAGTTCTATGGAGCAGCTGCCGGATTACATGAAAATCCTCTACAAAGCTGTCCTTGATCTTTTTGACGAAGTAGAAGTTCAGCTATCGAACCATGAAACTAATAATACTTATCGTATGGCTTATGCGAAGGAAGAGTTAAAAGCTATCGCCAAGTGCTACGAAAAGGAGCACATATGGTTCAGAAAATGTCACGTGCCCCCATTCGAAGAATATCTAGAGAATGCGGTAGTGTCAATCGGTAATCGTTTGGCCGTACCTTTTTCTTTTCTGGGAATGGATCAAGTAGCAGGTGTTGAAGCGTTCGAGTGGGCCAAAACTGATCCCAAAATGGTAAAATCGTGCGGTAAAGTCTTACGACTTGTTGACGATGTAATGAGCCACGAGGAGGAAGATGTAAGAGGACACGTGGCAACGGGAGTCGAATGCTACATGAAAGAACACGGAGTGAGTAGGGAAGAGGCCATCGTGGAGTTCTACAAGAGGGTCGAGTACGCGTGGAAGGATGTGAACGAGGAATTTATAACGCCGAACCATCTGCATATCGACCTCCTCAACCGCGTTCTTAACCTTACAAGAATTGCAGACGTTGTTTACAAGTTTGAAGACGGCTACACGCATCCCGAGAAGACTCTGAAACATCATATCATGGCGTTGTTCGTCGACCCCGTCCCCATATAG
SEQ ID NO:6
MSTALNSEHETVRPLASFKPSTWGDLFISYSEDSQLKEVYGKEHECLKQQVKTMLLDLTNYRISEKIAFINTLERLGVSHEFENEIEGLLHQMFDAHSKFQDGIQHFDLFTLGIYFRILRQHGYRISCDVFNKLKDSNNEFKKELKEDAIGLLSLYEATQVRAHAEEILDEALIFTKAQLESIAATSSLSPFVEKQITHALVQALHKGIPRVESRHFISVYEEDPDKNDLLLRFSKIDYNLVQMLHKQELCHISKWWRDSELETKLTYVRNRVAECFLWTLCVYHEPKYSPARLLLGKLINIISCTDDTYDAYGTLEEVQIFTDVIQRLDRSSMEQLPDYMKILYKAVLDLFDEVEVQLSNHETNNTYRMAYAKEELKAIAKCYEKEHIWFRKCHVPPFEEYLENAVVSIGNRLAVPFSFLGMDQVAGVEAFEWAKTDPKMVKSCGKVLRLVDDVMSHEEEDVRGHVATGVECYMKEHGVSREEAIVEFYKRVEYAWKDVNEEFITPNHLHIDLLNRVLNLTRIADVVYKFEDGYTHPEKTLKHHIMALFVDPVPI
SEQ ID NO:7
AAGGAGATATACATATGACAAAAAAAAGTTGGTGTCGGTCAGG
SEQ ID NO:8
CTTTACCAGACTCGAGTTACGCCTTTTTCATCTGATCCTTTGC
SEQ ID NO:9
GATTTCAANMTKCTRCAAAWGCTTCA
SEQ ID NO:10
GCATTCRASGCCNGWNGCAACATGT
SEQ ID NO:11
密码子优化的VaTPS3nt序列(来自实施例3)
ATGAGCACCGCGTTGAACTCCGAGCATGAAACCGTCCGTCCGCTGGCTAGCTTTAAACCGAGCACGTGGGGTGACCTGTTCATCAGCTACAGCGAGGACAGCCAGCTGAAAGAAGTGTATGGTAAAGAGCATGAATGTCTTAAGCAACAAGTTAAGACCATGCTGCTGGACCTGACGAATTACCGTATCAGCGAGAAGATTGCCTTCATCAATACGCTGGAGCGCCTGGGTGTTTCTCACGAGTTCGAGAATGAAATCGAAGGCCTCCTGCATCAGATGTTCGACGCGCACTCCAAGTTTCAAGATGGCATTCAGCACTTTGACCTGTTTACCCTGGGCATTTACTTCCGTATTTTGCGCCAGCACGGTTATCGTATCTCGTGCGATGTGTTTAACAAGCTGAAGGACTCTAATAACGAATTCAAGAAAGAACTGAAAGAAGATGCAATTGGTCTGCTGTCTCTGTATGAAGCGACCCAAGTGCGTGCCCATGCAGAAGAGATTTTGGACGAAGCGCTGATCTTCACCAAGGCTCAGCTGGAGAGCATCGCGGCGACGAGCAGCCTGAGCCCGTTTGTCGAGAAACAGATTACCCACGCCTTGGTGCAAGCGTTGCATAAAGGCATCCCACGCGTGGAGAGCCGCCACTTCATTAGCGTGTACGAAGAGGACCCGGACAAGAACGATTTGCTGCTGCGTTTTTCCAAGATTGACTACAATTTAGTTCAAATGCTGCACAAACAAGAGTTGTGTCATATTAGCAAATGGTGGCGTGACTCCGAGCTGGAGACTAAACTGACCTACGTCCGTAATCGCGTGGCAGAGTGTTTTCTGTGGACCCTGTGTGTTTACCACGAGCCGAAGTATAGCCCGGCACGTCTGCTGCTGGGTAAACTGATCAACATCATTTCTTGCACGGACGACACCTATGATGCATACGGTACGCTGGAAGAAGTCCAAATCTTTACCGACGTGATCCAGCGTTTGGACCGTAGCTCGATGGAGCAGCTGCCGGATTACATGAAGATTCTGTATAAAGCTGTTCTGGATCTGTTCGATGAAGTTGAGGTTCAGCTGAGCAACCATGAGACTAACAATACCTACCGCATGGCGTACGCAAAAGAAGAACTGAAGGCTATTGCGAAATGCTACGAGAAAGAGCACATCTGGTTTCGCAAGTGTCATGTTCCACCGTTCGAAGAGTATCTGGAGAACGCCGTGGTGAGCATCGGTAATCGTCTGGCGGTCCCGTTCAGCTTCTTGGGTATGGACCAGGTTGCGGGCGTCGAGGCCTTTGAGTGGGCAAAGACCGATCCTAAAATGGTTAAAAGCTGCGGTAAGGTTCTGCGCCTGGTCGATGATGTCATGAGCCATGAAGAAGAAGATGTGCGTGGTCACGTGGCGACGGGCGTTGAGTGCTACATGAAAGAGCACGGTGTCAGCCGTGAAGAGGCGATCGTTGAATTCTATAAGCGTGTCGAGTATGCATGGAAAGACGTCAACGAAGAGTTCATTACTCCGAATCACTTGCACATTGATCTGCTGAACCGTGTTCTGAACTTAACCCGCATTGCCGATGTCGTATACAAGTTTGAAGATGGCTATACCCACCCGGAAAAGACGCTGAAACACCATATCATGGCGCTGTTCGTGGACCCGGTGCCGATCTAA
Claims (14)
1.一种生产补身醇的方法,包含:
i)使无环法尼基二磷酸酯(FPP)前体与具有补身醇合酶活性且包含SEQ ID NO:6的多肽接触,以生产补身醇;和
ii)任选地分离所述补身醇。
2.如权利要求1所述的方法,其包含使所述补身醇与至少一种酶接触以生产补身醇衍生物。
3.如权利要求1所述的方法,其包含使用化学合成将所述补身醇转换为补身醇衍生物。
4.一种分离的多肽,其具有补身醇活性且包含SEQ ID NO:6。
5.一种分离的核酸分子,其编码权利要求4所述的多肽。
6.权利要求5所述的核酸分子,其中所编码的多肽具有包含SEQ ID NO:5的序列。
7.如权利要求1所述的方法,其包含步骤:使用编码包含SEQ ID NO:6的多肽的核酸转化宿主细胞或非人生物体,并且在允许所述多肽的生产的条件下培养所述宿主细胞或生物体。
8.一种载体,其包含权利要求6的核酸分子。
9.权利要求8所述的载体,其中所述载体是原核载体、病毒载体或真核载体。
10.权利要求8或9所述的载体,其为表达载体。
11.如权利要求7所述的方法,其中所述细胞是原核细胞。
12.如权利要求7所述的方法,其中所述细胞是细菌细胞。
13.如权利要求7所述的方法,其中所述细胞是真核细胞。
14.如权利要求7所述的方法,其中所述真核细胞是酵母细胞或植物细胞。
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