CN113025594B

CN113025594B - 多肽、核酸及其在合成香叶醇上的应用

Info

Publication number: CN113025594B
Application number: CN202110237987.9A
Authority: CN
Inventors: 姜浩; 余凤; 秦丽; 宛晓春; 宋传奎
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-03-04
Also published as: CN113025594A

Abstract

本发明公开了多肽、核酸及其在合成香叶醇上的应用，属于基因工程领域。所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用基因工程手段，构建了重组表达香叶合成酶的重组大肠杆菌，并表达得到了香叶醇合成酶蛋白，该蛋白能特异地催化GPP合成香叶醇，并且，本发明提供的香叶醇合成酶催化底物合成香叶醇时的转化率可以达到90％，显著高于其他香叶醇合成酶。

Description

多肽、核酸及其在合成香叶醇上的应用

技术领域

本发明涉及多肽、核酸及其在合成香叶醇上的应用，尤其是催化GPP合成香叶醇上的应用，属于基因工程领域。

背景技术

香叶醇(Geraniol)，又称牻牛儿醇，是药用植物、香料植物中一种重要的非环式单萜醇化合物，广泛应用于香精香料工业，是制取柠檬醛、香草醇、紫罗兰酮和羟基香草醛等香料的原料。香叶醇的多种活性表明，香叶醇可以作为一种治疗多种疾病的候选药物。香叶醇具有驱虫、抗菌(Chavez et al.,2018)、抑制肿瘤生长(Cho et al.,2016；Lee et al.,2016)、降血糖(Babukumar et al.,2017)等功效。临床上用于肝炎(Chen etal.,2016b)、结肠炎的治疗(Soubh et al.,2015)，同时对神经炎症具有缓解作用。另外，香叶醇是茶叶中主要的香气物质，其含量的多少对茶叶的品质有着重要的影响。

目前，香叶醇主要通过植提取和化学合成方法进行生产，但是天然植物中香叶醇含量较低，从植物分离得到的香叶醇来源有限，不能满足香料和香料工业的巨大需求，而化学合成所使用的原料具有不可再生性且易污染环境，这需要通过生物技术过程最大限度地生产香叶醇。因而利用现代生物技术手段生产香叶醇是一条较为理想的途径。

香叶醇合成酶基因是香叶醇生物合成途径的关键基因之一，催化香叶基焦磷酸(GPP)生成香叶醇，是单萜生物合成途径中的限速酶。虽然其他植物中有香叶醇合成酶，但，这些来源的香叶醇合成酶不一定具有合成茶叶关键香气物质的功能，而茶树来源的香叶醇合成酶一直难以获得。

发明内容

[技术问题]

现有技术中没有茶叶来源的用于合成茶叶香气物质的香叶醇合成酶。

[技术方案]

本发明提供了一种来源于茶叶的香叶醇酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码该香叶合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了携带编码香叶合成酶的基因的重组载体，例如：pGEX4T1-CsGS5。

本发明提供了表达所述香叶合成酶的重组菌株，例如：E.coli BL21 pGEX4T1-CsGS5。

本发明提供了所述香叶合成酶在合成香叶醇上的应用，是以GPP为底物催化合成香叶醇。所述催化反应可以在PBS缓冲液中进行。进一步地，催化的温度为20℃-40℃、缓冲液pH为6.5-8。进一步地，催化反应体系中还添加了金属离子Mg²⁺、K+、Mn²⁺。

[有益效果]

目前在茶叶中香叶醇合成酶基因未见报道，本发明是首次在茶叶中发现了合成茶叶香气物质香叶醇的香叶醇合成酶基因。本发明利用基因工程手段，构建了重组表达香叶合成酶的重组大肠杆菌，并表达得到了香叶醇合成酶蛋白，该蛋白能特异地催化GPP合成香叶醇，并且，本发明提供的香叶醇合成酶催化底物合成香叶醇时的转化率可以达到90％，显著高于其他香叶醇合成酶。

本发明提供的香叶醇合成酶可用于制备驱虫、抗菌用品中，以及抑制肿瘤生长、降血糖、缓解或治疗肝炎、结肠炎、神经炎症的药物。

附图说明

图1为GC-MS检测香叶醇的色谱图，Standard of geraniol：香叶醇标品，CsGS5：本发明香叶醇合成酶与底物GPP反应所得产物，vector：携带空载体的菌体破碎液上清与底物GPP反应液。

具体实施方式

实施例1CsGS5的克隆

1、cDNA模板的获取：将茶叶的鲜叶液氮处理磨碎后，用商业化提取植物RNA的试剂盒提取RNA，之后用商业化反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。以cDNA为模板，利用CsGS5F/CsGS5 R引物对扩增编码香叶醇合成酶的基因CsGS5。

①PCR引物序列：

CsGS5 F:GGTTCCGCGTGGATCC ATG GCC CTT CGA GCT CTA TTT(SEQ ID No.3)CsGS5 R:CGCTCGAGTCGACCCGGGTTA CTT GAG AGG AAT GGG TTG GA(SEQ ID No.4)

②反应体系：

③PCR反应程序：

2、重组质粒pGEX4T1-CsGS5的构建

将完整的pGEX4T1载体根据需要进行双酶切，从而获得线性载体，之后通过商业化的试剂盒胶回收载体，获得纯化后的线性载体。用连接酶将单一的目的基因CsGS5与线性载体进行连接，构建重组质粒pGEX4T1-CsGS5，之后转化到Trans1-T1感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中，经过菌落PCR验证后，将菌液送给通用生物有限公司完成测序工作。测得CsGS5的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3、CsGS5基因的原核表达与纯化

将构建成功的表达载体pGEX4T1-CsGS5转化到BL21感受态细胞进行过夜培养，选取阳性菌斑转入LB培养基中37℃过夜培养，在37℃条件下进行扩大培养，直至OD600＝0.6-0.8为止。冷却至16-18℃后，加入1M的IPTG在16℃培养室内诱导过夜。第二天离心收集菌体，超声破碎，收集破碎液的上清，即为粗酶液，将粗酶液进行纯化(Song C,Hong X,ZhaoS,et al.Glucosylation of 4-Hydroxy-2,5-Dimethyl-3(2H)-Furanone,the KeyStrawberry Flavor Compound in Strawberry Fruit[J].Plant Physiol.2016,171(1):139-151；Song C,Ring L,Hoffmann T,et al.Acylphloroglucinol Biosynthesis inStrawberry Fruit[J].Plant Physiol.2015,169(3):1656-1670；Song C,Gu L,Liu J,etal.Functional Characterization and Substrate Promiscuity ofUGT71Glycosyltransferases from Strawberry(Fragaria×ananassa)[J].PlantandCell Physiology.2015,56(12))，并进行SDS-PAGE检测。

4、产物鉴定

反应体系

以上酶活反应体系在20ml气质进样瓶里进行，按以上反应体系混匀后放到30℃1h，45℃15min水浴条件下，整个过程用SPME吸附。吸附完成后SPME进GC-MS进行分析。

GC-MS条件为：Thermo Fisher trace 1300gas chromatography system,equipped with ISQ7000MS(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)。化合物的分离采用DB-5MS色谱柱(60m 0.25mm，膜厚0.25m,J&amp；W Scientific,Folsom,CA,USA)。载气采用氦气(99.99％)，流速为1mL/min。进样口温度250℃使用离注入模式采样时间为1.00分钟。柱子程序升温设置如下：40℃保持3min，5℃/min升至80℃，3℃/min升至160℃，10℃/min升至240℃并保持3min。电子碰撞质谱在70ev下生成，扫描范围为30～600m/z，离子源温度为230℃,MS界面温度为250℃。图1为GC-MS检测酶活产物色谱图，其中，Standard ofgeraniol：香叶醇标品，CsGS5：本发明香叶醇合成酶与底物GPP反应所得产物，vector：携带空载体的菌体破碎液上清与底物GPP反应液。可以看出，空载对照组完全没有产生香叶醇，本发明制备的香叶醇合成酶可以GPP合成香叶醇。经过计算，GPP的转化率达到90％。

SEQ ID No.1：

MALRALFSPFLVSPILLASLQSPKTPTTVCPSKSIRCASNTITIDDHTVTRRSANYPPSFWDYNFVQSLSSDYTEEKYMREAYNMKDEVKGLINGVMDPLAKLELIDAVQRLGLKYHFEGEIKQSLDDLIHLHNDAWCSDDLHATALRFR

LLRQHGCDVPKDVFESFKDETGNFKISLFEDVKGLLSLYEASFFGLDGETIIDEAKIFTIANLKNIKGDMSPSMVRKVGHALDMPLHWRLTRVEARWFIETYEQEQNMSPILLEFAKLDYNMVQSVHQKEVGNLARWWVDMGLDKMSFAR

DRLVEHYLWCSGMVFEPKFGAFRDMGTKIISLITTIDDIYDVYGALHEIELFTDFVDRWDVNGIDKLPHNIRTCLLALFNTVNEIGYWTLKNRGFNIIPYLSKADELARGDNLKAVQCYMNETGASEEVARDYINNLVHETWKTMNKGMF

ESYPFSEPFLSANPNLGRTAQCFYQYGDGHGIPHNWTKDHLISLLVQPIPLK*

SEQ ID No.2：

ATGGCCCTTCGAGCTCTATTTTCACCATTTCTTGTCTCTCC

AATTCTCCTAGCCTCTCTTCAATCACCCAAAACCCCTACCACCGTTTGTCCTTCTAAATCCATTCGATGTGCGAGCAATA

CCATAACGATTGATGATCATACAGTTACTCGACGATCAGCAAATTATCCACCAAGTTTTTGGGACTACAATTTTGTGCAG

TCACTTAGCAGCGATTACACCGAGGAGAAATATATGAGGGAGGCTTATAATATGAAGGATGAAGTGAAAGGTCTCATAAA

TGGAGTGATGGACCCATTGGCAAAGCTGGAGTTGATCGATGCCGTTCAAAGGCTAGGATTAAAGTATCATTTTGAGGGTG

AGATTAAGCAATCGCTTGATGATTTGATACACTTACACAACGACGCATGGTGTTCTGATGATCTGCATGCAACAGCCCTC

CGATTTAGGCTTCTTAGACAGCACGGATGTGATGTACCCAAAGATGTGTTCGAAAGCTTCAAGGATGAGACCGGTAATTT

CAAGATATCCCTCTTTGAGGATGTGAAAGGGCTGCTGAGTTTGTATGAAGCTTCTTTCTTCGGGTTGGACGGTGAAACTA

TCATTGATGAAGCCAAGATCTTCACAATTGCAAATTTGAAGAATATCAAAGGAGACATGTCACCGAGTATGGTTAGAAAA

GTTGGCCATGCTTTGGATATGCCCTTGCATTGGAGGCTAACAAGGGTTGAGGCTAGATGGTTCATAGAGACATATGAGCA

AGAACAAAATATGAGCCCTATTTTGCTTGAATTTGCTAAATTGGACTACAACATGGTGCAGTCTGTTCATCAAAAGGAGG

TTGGCAATTTGGCAAGGTGGTGGGTGGACATGGGCTTAGACAAAATGAGCTTTGCGAGAGACAGGTTGGTGGAACACTAC

CTTTGGTGCTCTGGAATGGTGTTTGAGCCAAAATTTGGAGCTTTTAGAGACATGGGGACTAAGATTATTAGTTTAATAAC

AACAATCGATGACATTTATGATGTCTATGGTGCACTGCATGAAATAGAGCTCTTCACGGACTTTGTTGACAGATGGGATG

TGAATGGAATTGATAAGCTTCCACACAATATAAGGACATGCCTGCTTGCTCTATTCAATACCGTCAATGAAATAGGGTAT

TGGACACTGAAAAACCGAGGCTTCAACATCATTCCTTATTTGAGCAAAGCGGATGAATTGGCAAGAGGAGATAATCTCAA

GGCAGTCCAGTGCTACATGAATGAAACTGGAGCTTCTGAAGAAGTTGCTCGAGATTACATAAACAATTTGGTTCATGAGA

CATGGAAGACTATGAACAAAGGCATGTTTGAAAGCTATCCCTTCTCTGAACCATTTTTGAGTGCTAATCCAAATCTTGGC

CGAACAGCTCAATGCTTTTACCAGTATGGAGATGGGCATGGCATTCCACACAACTGGACCAAGGACCATCTCATTTCATT

ATTGGTCCAACCCATTCCTCTCAAGTAA

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学

<120> 多肽、核酸及其在合成香叶醇上的应用

<130> BAA210019A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 502

<212> PRT

<213> 茶叶

<400> 1

Met Ala Leu Arg Ala Leu Phe Ser Pro Phe Leu Val Ser Pro Ile Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ser Leu Gln Ser Pro Lys Thr Pro Thr Thr Val Cys Pro Ser

20 25 30

Lys Ser Ile Arg Cys Ala Ser Asn Thr Ile Thr Ile Asp Asp His Thr

35 40 45

Val Thr Arg Arg Ser Ala Asn Tyr Pro Pro Ser Phe Trp Asp Tyr Asn

50 55 60

Phe Val Gln Ser Leu Ser Ser Asp Tyr Thr Glu Glu Lys Tyr Met Arg

65 70 75 80

Glu Ala Tyr Asn Met Lys Asp Glu Val Lys Gly Leu Ile Asn Gly Val

85 90 95

Met Asp Pro Leu Ala Lys Leu Glu Leu Ile Asp Ala Val Gln Arg Leu

100 105 110

Gly Leu Lys Tyr His Phe Glu Gly Glu Ile Lys Gln Ser Leu Asp Asp

115 120 125

Leu Ile His Leu His Asn Asp Ala Trp Cys Ser Asp Asp Leu His Ala

130 135 140

Thr Ala Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Cys Asp Val Pro

145 150 155 160

Lys Asp Val Phe Glu Ser Phe Lys Asp Glu Thr Gly Asn Phe Lys Ile

165 170 175

Ser Leu Phe Glu Asp Val Lys Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser

180 185 190

Phe Phe Gly Leu Asp Gly Glu Thr Ile Ile Asp Glu Ala Lys Ile Phe

195 200 205

Thr Ile Ala Asn Leu Lys Asn Ile Lys Gly Asp Met Ser Pro Ser Met

210 215 220

Val Arg Lys Val Gly His Ala Leu Asp Met Pro Leu His Trp Arg Leu

225 230 235 240

Thr Arg Val Glu Ala Arg Trp Phe Ile Glu Thr Tyr Glu Gln Glu Gln

245 250 255

Asn Met Ser Pro Ile Leu Leu Glu Phe Ala Lys Leu Asp Tyr Asn Met

260 265 270

Val Gln Ser Val His Gln Lys Glu Val Gly Asn Leu Ala Arg Trp Trp

275 280 285

Val Asp Met Gly Leu Asp Lys Met Ser Phe Ala Arg Asp Arg Leu Val

290 295 300

Glu His Tyr Leu Trp Cys Ser Gly Met Val Phe Glu Pro Lys Phe Gly

305 310 315 320

Ala Phe Arg Asp Met Gly Thr Lys Ile Ile Ser Leu Ile Thr Thr Ile

325 330 335

Asp Asp Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Ala Leu His Glu Ile Glu Leu Phe

340 345 350

Thr Asp Phe Val Asp Arg Trp Asp Val Asn Gly Ile Asp Lys Leu Pro

355 360 365

His Asn Ile Arg Thr Cys Leu Leu Ala Leu Phe Asn Thr Val Asn Glu

370 375 380

Ile Gly Tyr Trp Thr Leu Lys Asn Arg Gly Phe Asn Ile Ile Pro Tyr

385 390 395 400

Leu Ser Lys Ala Asp Glu Leu Ala Arg Gly Asp Asn Leu Lys Ala Val

405 410 415

Gln Cys Tyr Met Asn Glu Thr Gly Ala Ser Glu Glu Val Ala Arg Asp

420 425 430

Tyr Ile Asn Asn Leu Val His Glu Thr Trp Lys Thr Met Asn Lys Gly

435 440 445

Met Phe Glu Ser Tyr Pro Phe Ser Glu Pro Phe Leu Ser Ala Asn Pro

450 455 460

Asn Leu Gly Arg Thr Ala Gln Cys Phe Tyr Gln Tyr Gly Asp Gly His

465 470 475 480

Gly Ile Pro His Asn Trp Thr Lys Asp His Leu Ile Ser Leu Leu Val

485 490 495

Gln Pro Ile Pro Leu Lys

500

<210> 2

<211> 1509

<212> DNA

<213> 茶叶

<400> 2

atggcccttc gagctctatt ttcaccattt cttgtctctc caattctcct agcctctctt 60

caatcaccca aaacccctac caccgtttgt ccttctaaat ccattcgatg tgcgagcaat 120

accataacga ttgatgatca tacagttact cgacgatcag caaattatcc accaagtttt 180

tgggactaca attttgtgca gtcacttagc agcgattaca ccgaggagaa atatatgagg 240

gaggcttata atatgaagga tgaagtgaaa ggtctcataa atggagtgat ggacccattg 300

gcaaagctgg agttgatcga tgccgttcaa aggctaggat taaagtatca ttttgagggt 360

gagattaagc aatcgcttga tgatttgata cacttacaca acgacgcatg gtgttctgat 420

gatctgcatg caacagccct ccgatttagg cttcttagac agcacggatg tgatgtaccc 480

aaagatgtgt tcgaaagctt caaggatgag accggtaatt tcaagatatc cctctttgag 540

gatgtgaaag ggctgctgag tttgtatgaa gcttctttct tcgggttgga cggtgaaact 600

atcattgatg aagccaagat cttcacaatt gcaaatttga agaatatcaa aggagacatg 660

tcaccgagta tggttagaaa agttggccat gctttggata tgcccttgca ttggaggcta 720

acaagggttg aggctagatg gttcatagag acatatgagc aagaacaaaa tatgagccct 780

attttgcttg aatttgctaa attggactac aacatggtgc agtctgttca tcaaaaggag 840

gttggcaatt tggcaaggtg gtgggtggac atgggcttag acaaaatgag ctttgcgaga 900

gacaggttgg tggaacacta cctttggtgc tctggaatgg tgtttgagcc aaaatttgga 960

gcttttagag acatggggac taagattatt agtttaataa caacaatcga tgacatttat 1020

gatgtctatg gtgcactgca tgaaatagag ctcttcacgg actttgttga cagatgggat 1080

gtgaatggaa ttgataagct tccacacaat ataaggacat gcctgcttgc tctattcaat 1140

accgtcaatg aaatagggta ttggacactg aaaaaccgag gcttcaacat cattccttat 1200

ttgagcaaag cggatgaatt ggcaagagga gataatctca aggcagtcca gtgctacatg 1260

aatgaaactg gagcttctga agaagttgct cgagattaca taaacaattt ggttcatgag 1320

acatggaaga ctatgaacaa aggcatgttt gaaagctatc ccttctctga accatttttg 1380

agtgctaatc caaatcttgg ccgaacagct caatgctttt accagtatgg agatgggcat 1440

ggcattccac acaactggac caaggaccat ctcatttcat tattggtcca acccattcct 1500

ctcaagtaa 1509

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttccgcgt ggatccatgg cccttcgagc tctattt 37

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctcgagtc gacccgggtt acttgagagg aatgggttgg a 41

Claims

1.一种来源于茶叶的香叶醇合成酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述香叶醇合成酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.表达权利要求1所述香叶醇合成酶的重组菌株。

5.权利要求1所述香叶醇合成酶在合成香叶醇中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是以GPP为底物催化合成香叶醇。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化反应在PBS缓冲液中进行，反应温度为20℃-40℃、缓冲液pH为6.5-8。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，催化反应体系中还添加了金属离子Mg²⁺、K⁺和Mn²⁺。