CN108070576A - 一种茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用方法。茶树糖基转移酶CsUGT85A53的突变基因CsUGT85A53(E59D)在体外催化合成(Z)‑3‑己烯醇糖苷的能力较野生型提高了1‑2倍外源喷施(Z)‑3‑己烯醇可显著提高茶树叶片(Z)‑3‑己烯醇糖苷的能力；通过基因工程方法将CsUGT85A53(E59D)突变体在植物中过表达，可显著提高植物(Z)‑3‑己烯醇糖苷糖苷的积累；结合体外喷施(Z)‑3‑己烯醇，效果更佳，显著提高了植物释放(Z)‑3‑己烯醇的能力，为植物病虫害的防治提供新策略。

Description

一种茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：植物挥发性化合物在植物与环境相互交流的过程中具有重要作用，其中C6-绿叶挥发物(Z)-3-己烯醇最近被证实在植物-植物信号交流中具有十分重要的作用。(Z)-3-己烯醇及其糖苷分子在茶树直接与间接防御中均具有十分重要的作用，未感染植株通过相应及合成(Z)-3-己烯醇糖苷来防御潜在害虫，但目前为止，植物中(Z)-3-己烯醇糖苷化的的分子机制仍然不清楚。近年来，由于绿叶挥发物有别于其他挥发性有机化合物的一些特征，如普遍存在于植物中、损伤后快速释放该类挥发物在植物防御应答中的作用引起了越来越多研究者的关注。挥发物糖苷作为香气物质的前体是植物在生长发育过程中形成的次级代谢产物，具有重要的生理功能和活性。番茄在草食动物的攻击下释放到空气中的(Z)-3-己烯醇被邻近的同种植物“闻”到后，便将这种香气物质转化为糖苷，这种糖苷抑制了草食动物的生长和存活率，而与此同时，(Z)-3-己烯醇又可以吸引天敌。拟南芥具有感受外界多种挥发性物质，并在体内将其转化成相应糖苷的能力，而暴露于(Z)-3-己烯醇中的拟南芥自身可提高灰霉病的防御能力。在茶树中顺-3-己烯醇在植物体内是以糖苷的形式存在一定条件下水解后释放出游离态的香气挥发物用来吸引天敌防御害虫。番茄或猕猴桃中挥发性前体糖苷的功能意味着植物叶片中的糖苷不仅可以作为直接的防御化合物，而且还可以作为挥发性物质的前体吸引草食动物的天敌。综上可知，(Z)-3-己烯醇及其糖苷分子在茶树直接与间接防御中均具有十分重要的作用，未感染植株通过相应及合成(Z)-3-己烯醇糖苷来防御潜在害虫，但目前为止，茶树乃至整个植物中(Z)-3-己烯醇糖基化的机制仍然不清楚。在实际生产生活中，对于很多植物往往采取的是化学防治、生物防治或者两者结合的方法来提高植物的抗病虫能力。化学防治，通常就是指现阶段病虫害防治的最重要手段，通过施用化学药剂达到快速高效的杀菌杀虫的目的，其优点是适用范围广，收效快而显著，方法简便，经济实用，但缺点是过多施用化学药剂往往容易造成环境污染，甚至危及人和动物生命安全。而生物防治，是指利用生物之间的拮抗作用和双重寄生习性来防治病害。其优点是对动物和植物一般无害，对环境多无污染，但缺点是收效甚微，见效慢。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)茶毛虫农药的广泛使用使得茶叶农残问题严重，严重影响了茶树的品质以及人类的身心健康。

(2)化学药剂往往容易造成环境污染，甚至危及人和动物生命安全。

(3)生物防治收效甚微，见效慢。

(4)(Z)-3-己烯醇糖基化的分子机制不清楚，在业内属于技术空白，限制了其在植物病虫害防治中的应用。

解决上述技术问题的难度和意义：(Z)-3-己烯醇及其糖苷分子在茶树直接与间接防御中均具有十分重要的作用，未感染植株通过响应及合成(Z)-3-己烯醇糖苷来防御潜在害虫。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用方法。

本发明是这样实现的，一种茶树糖基转移酶突变体在植物害虫防御中的应用方法，所述茶树糖基转移酶突变体在植物害虫防御中的应用方法通过转基因技术，提高植物富集(Z)-3-己烯醇糖苷的能力，进而提高植物抵御害虫的能力。

进一步，所述茶树糖基转移酶突变体在植物害虫防御中的应用方法通过转基因技术，将基因突变体CsUGT85A53(E59D)在烟草和拟南芥中过量表达，转基因植物具有合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力。

本发明的另一目的在于提供一种合成所述(Z)-3-己烯醇糖苷的茶树糖基转移酶突变体，并研究了其在植物害虫防御中的应用方法。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述(Z)-3-己烯醇糖苷的植物病虫害防治方法。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：在茶树糖基转移酶CsUGT85A53的基础上，通过氨基酸定点突变技术，得到了在体外具有非常强的催化合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力CsUGT85A53(E59D)突变体；利用转基因烟草或拟南芥，揭示了该突变体基因在植物体内合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力提高了十多倍；利用外源(Z)-3-己烯醇暴露及病虫害侵害茶树幼苗过程中，得到(Z)-3-己烯醇糖苷的积累及CsUGT85A53基因调控的关系；转基因技术与体外喷施(Z)-3-己烯醇相结合，转基因植物合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力和效果更好。基于此研究结果的基础上，本发明发现了CsUGT85A53具有较强合成(Z)-3-己烯醇糖苷能力的CsUGT85A53(E59D)突变体，将该基因在植物中过量表达，可显著提高植物合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力，增强转基因释放(Z)-3-己烯醇的潜力，这为植物病虫害的防治提供更多新的策略。

附图说明

图1是本发明实施例提供的通过茶树转录组数据与代谢产物关联分析已初步筛选出几条可能与(Z)-3-己烯醇糖苷合成相关的糖基转移酶基因示意图。

图2是本发明实施例提供的用顺-3-己烯醇处理茶苗诱导糖苷的增加后取样，进行RNA提取并反转录为CDNA，通过定量PCR技术检验已筛选基因的表达量是否有差异进一步确定目的基因示意图。

图3是本发明实施例提供的CsUGT85A53的突变基因CsUGT85A53(E59D)编码的蛋白在体外酶活实验中具有催化合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力示意图。

图4是本发明实施例提供的通过LC-MS对体外酶活反应产物的检测结果示意图。

图5是本发明实施例提供的(Z)-3-己烯醇葡萄糖苷的对比示意图。

图6是本发明实施后的效果，从统计结果上可以看出通过处理过的烟草植株产生(Z)-3-己烯醇糖苷的量与对照组相比提高11.1倍。

图7是本发明实施例提供的转换模式示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

(Z)-3-己烯醇对害虫具有趋避作用，而对天敌具有吸引作用，而z-己烯醇糖苷具有释放(Z)-3-己烯醇的能力(相当于储备库)；本发明筛选到的基因所编码的蛋白具有合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力，而突变体合成能力更强大；本发明通过转基因技术，我们已将这个基因在烟草和拟南芥中过量表达，转基因植物具有合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力，特别是在空气中暴露有(Z)-3-己烯醇的前体下，比不转基因的富集能力提高了十多倍。因此，可以明显看出来，我们通过转基因技术，能够提高植物富集(Z)-3-己烯醇糖苷的能力，进而提高植物抵御害虫的能力。

本发明从基因工程层面着手通过增加植物体内(Z)-3-己烯醇糖苷的富集来增加(Z)-3-己烯醇的释放的潜力，从而提高植物对病虫害的抵御能力。

本发明实施例提供的茶树糖基转移酶突变体在植物害虫防御中的应用目的是提高(Z)-3-己烯醇糖苷的合成能力。

下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。

1、通过茶树转录组数据与代谢产物关联分析已初步筛选出几条可能与(Z)-3-己烯醇糖苷合成相关的糖基转移酶基因，如图1。

2、用顺-3-己烯醇处理茶苗诱导糖苷的增加后取样，进行RNA提取并转录为CDNA，通过定量PCR技术检验已筛选基因的表达量是否有差异进一步确定目的基因，如图2。

3、CsUGT85A53的突变体CsUGT85A53(E59D)在体外酶活实验中均显示出能够催化(Z)-3-己烯醇糖基化形成(Z)-3-己烯醇糖苷，如图3。

4、下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。

1)具体实验设计为：以茶树为例，将两株茶苗分别置于两个体积为500立方厘米的玻璃瓶容器内，各自用棉签蘸取50-100Mm10-100μL的(Z)-3-己烯醇及溶剂DMSO，使其在密闭的容器中挥发，以此来模拟未损伤的茶树叶片暴露在损伤叶片释放的挥发性的(Z)-3-己烯醇中的效果，在密封2、4、6、8、12个小时，取相同叶位的叶片用液氮处理，保存在-80度冰箱，用来准备随后的RNA，及糖苷的提取。

2)另一方法，还可以通过向茶树叶片喷洒适量的(Z)-3-己烯醇来提高植株本身的防御，实验结果表明，喷洒了(Z)-3-己烯醇的植株叶片中(Z)-3-己烯醇糖苷的含量明显升高，这种结果的出现时外界环境的改变诱导相关基因的表达促使植物体合成更多的(Z)-3-己烯醇糖苷，这种通过外源挥发物的刺激就可以直接刺激植物自身启动防御的机制更为直接，高效。

3)在之前实验的基础上，通过定点突变技术，又得到了CsUGT85A53突变的序列CsUGT85A53(E59D)通过体外酶活实验证明该突变体所编码的蛋白催化(Z)-3-己烯醇糖基化而形成对应糖苷的功能较野生型蛋白提高了1-2倍。通过LC-MS对体外酶活反应产物的检测结果，如图4。

4)暴露在(Z)-3-己烯醇中的植株会通过积累体内(Z)-3-己烯醇糖苷的量来抵御即将到来的昆虫的侵袭，由图5可知将暴露在(Z)-3-己烯醇中4个及6个小时的茶苗叶片中CsUGT85A53(E59D)的表达量与对照相比均有明显的升高，因此取处理6小时的茶树叶片进行(Z)-3-己烯醇糖苷的提取并检测，结果发现与对照组相比(Z)-3-己烯醇葡萄糖苷有明显的增加约11倍，如图5。

5)以烟草为例，本发明实施例提供的第3个实例方是在烟草植株中提高(Z)-3-己烯醇糖苷前体的方法具体包括以下步骤：

(1)过量表达载体的构建(CsUGT85A53的突变体与过量表达载体PBI121的连接)与转化以CsUGT85A53(E59D)为例子进行说明：

把上述基因连接到PBI121载体上，转入GV3101菌中28℃培养挑克隆通过菌落PCR验证，将阳性菌株扩大培养30毫升左右至OD600＝0.6-0.8，(如图4)。

(2)烟草的瞬时表达

悬浮液的配置(1)：50ml的IM重悬液包括：0.1mol/L的MgCl2,500mmol/LMES,1mol/L AS(乙酰丁香酮)，pH调到5-6之间，悬浮液的配置(2)：10ml的IM重悬液包括：10mmol/L的MgCl2和0.5μmol/L AS(乙酰丁香酮)将摇好的菌液取8-10毫升至离心管中，1000-4000×g离心10-20分钟，弃上清，用重悬液重悬至OD600＝0.2-0.4，黑暗纺织2-3个小时选取6周左右长势良好的本氏烟草，挑选健康植株的嫩叶用注射器轻轻摩擦叶背除去角质层，从叶背注射300-500微升的重悬液待烟草自然生长3-6天后将100μmol/L顺-3-己烯醇的混合物注射到之前已经注射过菌液的叶片中。4-6个小时以后取样用液氮处理过之后保存在-80度冰箱将样品在液氮中磨碎后称取0.1克样品用500微升的甲醇进行低温超声萃取；

(3)选择转基因烟草通过LC-MS对从烟草叶片中萃取的糖苷进行检测，结果如图6分别为从五个转基因株系以及空载体PBI121对照株系的烟草叶片中提取的糖苷的含量。(以之前确定的体外酶活反应生成的顺-3-己烯醇葡萄糖苷为参照。)

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用，其特征在于，所述茶树糖基转移酶突变体体外合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力提高了1-2倍；在植物害虫防御中的应用方法通过转基因技术，显著提高植物富集(Z)-3-己烯醇糖苷的能力，进而增强植物抵御害虫的能力。

2.如权利要求1所述的茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用方法，其特征在于，所述茶树糖基转移酶突变体在植物害虫防御中的应用方法通过转基因技术，将基因CsUGT85A53(E59D)在烟草等植物中过量表达，实验结果证明该基因过表达的植株合成(Z)-3-己烯醇糖苷的能力得到显著提高。

3.一种利用权利要求1所述(Z)-3-己烯醇糖苷的茶树糖基转移酶突变体及其在植物害虫防御中的应用方法。

4.一种利用权利要求1所述(Z)-3-己烯醇糖苷的植物病虫害防治方法。