CN105087612A - 黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因，该基因从茶叶鲜叶中分离获得，具有如SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列，该基因的编码蛋白具有如SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列；本发明首次克隆并验证了CsUGT73A20基因具有形成多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷的功能，本发明还提供了含有CsUGT73A20基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，通过生物工程方法大量合成多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷，为进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。

Description

黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及分子生物工程技术领域，尤其涉及的是一种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

植物中的黄酮类物质,属于苯并吡喃环结构的一类天然化合物。它们多在苯并吡喃环母核的3-O,5-O，7-O，3’-O，4’-O等多羟基位点上与糖基团结合形成黄酮苷类物质。茶树中的黄酮类主要为柚皮素(N)、山奈素(KC)，山奈酚(K)和芹菜素(A)，如图1所示。

黄酮及黄酮苷类物质是茶叶多酚的重要组成成分,不仅是茶汤中涩味等品质成分物质,也是构成汤色色泽的重要因子。茶树黄酮及其苷类具有多种生理功能如抗氧化等，是当今药物和保健品热门开发的对象。

黄酮醇糖基化在很多植物中主要发生在3或7-OH上，但是，在2004年Lim关于拟南芥糖基转移酶的研究中发现，一些糖基转移酶没有严格区域选择性，可以在槲皮素的3、7、3’,或4’位点糖苷化，在某些情况下,甚至形成少量的3,7二槲皮素糖苷和7,3’二槲皮素糖苷。而对山奈酚非特异性糖基化的研究只在2008年Markus的报道中发现：FaGT6和FaGT7糖基转移酶基因主要形成3-O-山奈酚葡萄糖糖苷，少量的7-O-山奈酚葡萄糖糖苷和4’-O-山奈酚葡萄糖糖苷。并且FaGT6糖基转移酶基因还能形成少量的一种二葡萄糖糖苷。而对茶树中CsUGT73A20糖基转移酶基因研究发现它不仅可以形成多位点山奈酚单葡萄糖糖苷，还可以非特异性形成多种多位点山奈酚二葡萄糖糖苷(山奈酚3，7-O-二葡萄糖糖苷，山奈酚3，4’-O-二葡萄糖糖苷和山奈酚7，3’-O-二葡萄糖糖苷)，如图1所示。随着反应时间延长，其中3,7-O-二葡萄糖糖苷产量增加显著。迄今为止，茶树中编码依赖尿苷二磷酸葡萄糖的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶基因的功能还没有得到验证。本发明研究一种能编码尿苷二磷酸葡萄糖依赖的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶基因，构建重组工程菌，提供一种生产多种黄酮醇葡萄糖苷的方法。

柚皮素苷、山奈素苷、山奈酚苷和芹菜素苷都是黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶基因的产物。有一些黄酮苷类物质如柚皮素苷、山奈素苷、部分山奈酚单糖苷可以商品化购买。但是还有一些黄酮苷类物质，如山奈酚双氧葡萄糖苷，由于天然含量低纯化难度大，至今没有市场商品产物。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用，以提供一种新的能够编码茶树黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶基因及其编码蛋白。利用本发明的重组工程菌，可以大量合成山奈酚双氧葡萄糖苷，为山奈酚双氧葡萄糖苷等多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷生物合成的工程化奠定基础。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因，该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

优选的，所述的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因应用于多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷生物合成。

一种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因的编码蛋白，所述编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

优选的，所述的编码蛋白应用于多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷生物合成。

一种重组质粒，所述重组质粒含有所述黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

优选的，所述重组质粒为将黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT73A20。

一种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有所述的重组质粒，或其基因组中整合有外源的所述的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因序列，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

优选的，所述转基因工程菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株，或其基因组中整合有所述黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因序列的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株。

(三)有益效果

本发明提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了形成多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷相关的黄酮醇葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因功能，本发明还提供了含有CsUGT73A20基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷，进一步开展多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷的生物合成调控研究奠定基础。

附图说明

图1是类黄酮物质(柚皮素、山奈素，山奈酚和芹菜素)及其部分葡糖糖糖苷物质的化学结构式。

图2是CsUGT73A20重组蛋白(rCsUGT73A20)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图；其中，M为蛋白Marker；1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4为诱导后破碎后沉淀；5为纯化后蛋白。

图3是HPLC分析rCsUGT73A20催化的酶活产物结果图，其中，图3-A～3-F以UDP-葡萄糖为糖供体，以黄酮醇化合物(山奈酚，山奈酚3-O-葡萄糖苷，山奈酚7-O-葡萄糖苷，山奈素，芹菜素，柚皮素)作为糖受体的HPLC图谱；

图4是重组CsUGT73A20蛋白催化合成黄酮醇葡萄糖苷产物的一级质谱和二级质谱分析图谱；其中，图4-A～4-F为山奈酚双氧葡萄糖苷，山奈酚葡萄糖苷，山奈素双氧葡萄糖苷，山奈素葡萄糖苷，芹菜素葡萄糖苷，柚皮素葡萄糖苷的一级和二级质谱图；

图5为pMal-c2X质粒图谱

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例以及实施例附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、材料

1、茶树品种：舒茶早(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensiscultivarShuchazao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于-80℃冰箱中备用；

2、pMal-c2X载体；

3、大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌：购于上海北诺生物科技有限公司；

4、LB培养基：称取10g的NaCl，5g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，加入950mL去超纯水搅拌溶解，用1mol/L的NaOH调pH至7.0，加水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌15min，即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可；

5、质量比为40％的葡萄糖溶液：称取40g葡萄糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定容至100mL，110℃灭菌10min；

6、氨苄青霉素母液(Amp+，100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素Amp，溶于10mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存；

7、1mol/L的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)：称取2.383gIPTG，溶于灭菌超纯水，定容至10mL，过滤除菌，分装并于-20℃保存；

8、蛋白纯化缓冲液：上柱缓冲液：称取0.37gEDTA，11.67gNaCl，2.42gTris，0.15gDTT于足量纯水中，搅拌使其充分混匀。用稀盐酸调其PH至7.4，定容至1L,即得上柱缓冲液。洗脱缓冲液：1L上柱缓冲液中加入3.60g麦芽糖，溶解搅拌均匀。

9、100mM的pH7.5的Tris-HCL缓冲溶液：称取1.1214gTris加水至90mL搅拌溶解均匀，加稀HCL调pH至7.5，补水定容至100mL；

10、体积比为1％的乙酸：用移液管量取10mL色谱级乙酸溶液于1L容量瓶中，用超纯水定容至1L。

二、CsUGT73A20基因的克隆：

1、设计带有表达载体pMal-c2X载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示：

SEQIDNO：3：正向引物：5’-

CGCGGATCCATGGGTAAGCTTAAATTCTTCTTC-3’

SEQIDNO：4：反向引物：5’-

ACGCGTCGACTTATGAACTCAATTCTTGTATTAG-3’；

2、按照TaKaRaRNAiso试剂盒和RNAisoPlus试剂盒说明书，提取茶树品种舒茶早鲜叶RNA，并反转录为cDNA；

3、以反转录产物cDNA为模板，用SEQIDNO：3和SEQIDNO：4引物进行扩增，扩增程序为94℃预变性30s，94℃变性10s，62℃退火20s，72℃延伸50s，30个循环，72℃继续延伸10min，获得的PCR产物置于16℃保存。

4、将PCR产物利用PCR纯化试剂盒纯化，并连接到pMD19-TSimpleVector后进行菌落PCR验证，获得阳性菌落，提取菌落质粒，获得含有CsUGT73A20基因的T载体，同时将菌液送至深圳华大公司进行测序。

三、CsUGT73A20基因的原核表达及功能验证

本实施例中所用到的原核表达和及其功能验证技术手段为本领域的普通技术人员常用或完全可以理解技术手段。

1、将含有CsUGT73A20基因的T载体用BamHⅠ和SalI进行双酶切，酶切产物连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中，获得pMal-c2X-CsUGT73A20重组质粒；

2、将pMal-c2X-CsUGT73A20重组质粒转化到大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌中，接种到100μL的LB液体培养基，37℃，180r/min下培养45～60min；取100μL的菌液涂布于含100μg/mLAmp+的LB平板上，37℃倒置培养；

3、经过菌落PCR验证，挑取阳性菌落，接种至含2g/L的100mL的灭菌的LB液体培养基中，28℃，200r/min下震荡培养，直至OD600≈0.6，获得转基因的工程菌；

4、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃过夜培养，收集菌体，加入10mL上柱缓冲溶液，充分悬浮菌体，置于-20℃过夜，将菌体置于冰上解冻，待解冻后置于超声破碎仪中以15％功率超声破碎10min，12000rpm离心收集上清液；利用直链淀粉树脂亲和柱纯化重组蛋白(affinitychromatographyonanamylaseresin，NewEnglandBiolabs，MA，USA)，利用本领域常用的SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图2所示。

从图2中可看出，pMal-c2X-CsUGT73A20重组质粒转化表达宿主菌Novablue(DE3)，诱导表达后，与诱导前(泳道1)相比，该基因在诱导后(泳道2)有重组蛋白的表达，且重组蛋白条带的大小与预测的一致，加上42.5kDa麦芽糖结合蛋白(MBP)重组标签后，在70kd到100kd之间有明显的重组蛋白条带；诱导后菌体经超声破碎离心后，上清中有可溶性重组蛋白(泳道3)，可用于进一步纯化分析；上清蛋白经直链淀粉树脂柱纯化后，得到较纯的重组蛋白(泳道4)，纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。

四、CsUGT73A20重组蛋白的酶学活性检测分析：

对于类黄酮底物的酶活检测，是在50μL反应体系，100mMpH7.5的Tris-HCL缓冲溶液包含5mMUDP-葡萄糖作为糖基供体，200μM潜在的类黄酮化合物(山奈酚、山奈素、柚皮素、芹菜素，杨梅素、圣草酚、儿茶素和矢车菊色素)作为糖基受体、5-10μg的纯化后的重组蛋白和0.1％的β-巯基乙醇。

所有酶反应体系，在30℃水浴30min后加入等体积的甲醇终止反应，矢车菊为底物的反应体系例外，需加入20μL的5％盐酸终止反应，反应均以空载蛋白作为对照，获得酶反应产物。

酶反应产物经产物标准品结合HPLC-MS进行鉴定，HPLC-MS检测条件如下：维特斯HSST3色谱柱(WatersACQUITYUPLCHSST3，150mm×2.1mm，1.7tzm)；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样体积为5μL；流动相A为含1％(v/v)乙酸溶液；流动相B为100％乙腈溶液；对于类黄酮化合物的检测，HPLC梯度程序设置为：0～5min，10～15％B；5～15min，15～40％B；15～20min，40～60％B；20～25min，60～80％B；25～30min，80～10％B；光谱检测波长扫描范围为200～550nm。在化合物的MS定性识别中，采用ESI电喷雾离子源，负离子模式；毛细管电压为3.5kV，离子源温度为350℃，雾化气(氮气)流速为6L/min，化合物检测扫描质荷比范围设置为m/z100～1000，碰撞电压为45V。

利用HPLC-MS及黄酮醇糖苷标准品对酶促反应产物进行检测，结果表明当以UDP-葡萄糖作为糖供体时，CsUGT73A20可特异性的催化类黄酮底物(芹菜素和柚皮素)7-OH上的糖苷化，而对山奈素和山奈酚7-OH催化位点具有非特异性，对其它类黄酮及酚酸化合物均未检测到任何活性；另外，UDP-半乳糖作为糖供体时，CsUGT73A20对于类黄酮底物或酚酸类底物均未检测到任何酶活性。

在UDP-葡萄糖充足的情况下，分别以山奈酚和山奈素作为底物，加入纯化后的融合蛋白，在pH7.5条件下分别检测它们的产物。结果表明CsUGT73A20酶对山奈酚的反应有6个产物生成，如表1(1～6)所示，对山奈素的反应有2个产物生成，如表1(7～8)所示。

表1：CsUGT73A20反应产物的HPLC，MS和MS/MS数据

综上，本发明实施例具有如下有益效果：本发明提供了一种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因，该基因从茶叶鲜叶中分离获得，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，该基因的编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；本发明首次克隆并验证了CsUGT73A20基因具有形成多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷的功能，本发明还提供了含有CsUGT73A20基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷，进一步开展黄酮醇糖苷生物合成调控研究奠定基础。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

ATGGGTAAGCTTAAATTCTTCTTCTTTCCGATGATGGCTCAAGGCCACATGATCCCAACTCTGGACATGGCTAAGCTCTTCTCTTCCCATGGCGTTGATGCCACCATAATCACCACCCCTCTCAACGCCCCTCACTTCACCAGATCAATCCAAAGAACCCATCACTCCTCAATCTCTGTCCTCACCATCAAATTCCCTGCTGTCGAGGCCGGCTTGCCCGAAGGTTGCGAGAGCATCGATCAAATCTCTTCCCCCGACATGGTTCCCATCTTCTTCAGGGCCACCGACATGCTCCAAGACCCGCTCGAGCGACTCCTCCAAGACTCCCGCCCCGATTGCCTCGTCGCAGACATGTTCTTCCCCTGGGCCAGTCATGTCGCAGCCAAGTTCAATATTCCAAGACTGGTTTTCCATGGGACTAGCTTCTTCGCCATGTGCGCTTTGCAGACTCTGAGGCTTTACAAGCCTCAGAGAACTGTGTCGTCCGACGATGAACCCTTTGTTTTGCCTAATCTTCCTCACAAAATAATGTTAACTAGATTGCAGCTGCCCGAGAATGATCGACACGGTACAGAGACGGATTGGACGAGGTTTCTGAGGAAAGCGGAAGAGGCAGAGCTATCAAGCTATGGAATTGTAGTCAACAGTTTCTACGAGCTCGAACCGGACTATGCCGATCATTACAGGAACGTCTTGGGAAGAAAAGCCTGGCATATTGGCCCTGTTTCGCTATTCAATCGGGAGGTAGAAGACAAAGCACATAGAGGTAAAGAATCAGCGATTGAGGAACTCGAGTGCTTGAAATGGCTCGATTCCAAGAAACCCAATTCTGTGATTTATGTATGTTTTGGTAGTATGACCGATTTTACTGTTTCTCAGTTGTATGAGATTGCGATGGGGGTCGAAGCTTCCGGGCAACAATTCATCTGGGTTGTGAGGAAAGGCAAGAACGAAGATGAAGAAAACGATGAGAAGTGGTTGCCAGAGGGGTTTGAGGAGAGAATTAAGGACAAGGGACTAATCATAAGGGGTTGGGCACCACAAGTTTTGATTCTTGATCATGAATCGATTGGGGGTTTTGTGACTCACTGCGGGTGGAATTCGATCCTGGAAGGTGTTTGTGCCGGTGTCCCAATGGTAACTTGGCCGGTTTTTGCCGAGCAATTCTATAATGAGAAGTTGGTGACTGAGATTTTGAGAATTGGGATTGGTGTTGGTGCTCGGCAATGGCAGATGAGAGTAGGAAGTGACTGTATCAAGAGAGAAGCGATAGCAGAGGCGGTGAAGCGGGTTATGGAAGCAGGGGAAGAGGCAGAGGGAATAAGAAGCCGAGCCAGGGCACTTAAAGATATGGCGAAGAAGGCTGTTGAGGAAGGTGGATCGTCTTACGCTGATCTGAAAACTCTAATACAAGAATTGAGTTCATAA

SEQIDNO：1

MGKLKFFFFPMMAQGHMIPTLDMAKLFSSHGVDATIITTPLNAPHFTRSIQRTHHSSISVLTIKFPAVEAGLPEGCESIDQISSPDMVPIFFRATDMLQDPLERLLQDSRPDCLVADMFFPWASHVAAKFNIPRLVFHGTSFFAMCALQTLRLYKPQRTVSSDDEPFVLPNLPHKIMLTRLQLPENDRHGTETDWTRFLRKAEEAELSSYGIVVNSFYELEPDYADHYRNVLGRKAWHIGPVSLFNREVEDKAHRGKESAIEELECLKWLDSKKPNSVIYVCFGSMTDFTVSQLYEIAMGVEASGQQFIWVVRKGKNEDEENDEKWLPEGFEERIKDKGLIIRGWAPQVLILDHESIGGFVTHCGWNSILEGVCAGVPMVTWPVFAEQFYNEKLVTEILRIGIGVGARQWQMRVGSDCIKREAIAEAVKRVMEAGEEAEGIRSRARALKDMAKKAVEEGGSSYADLKTLIQELSS

SEQIDNO：2

CGCGGATCCATGGGTAAGCTTAAATTCTTCTTC

SEQIDNO：3

ACGCGTCGACTTATGAACTCAATTCTTGTATTAG

SEQIDNO：4。

Claims (8)

1.一种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因，其特征在于，该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因应用于多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷生物合成。

3.一种如权利要求1所述的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的编码蛋白，其特征在于，编码蛋白应用于多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷生物合成。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有如权利要求1所述黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT73A20。

7.一种转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌含有如权利要求5所述的重组质粒，或其基因组中整合有外源的如权利要求1所述的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因序列。

8.根据权利要求7所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株，或其基因组中整合有所述黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因序列的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株。