CN104312996B

CN104312996B - α‑L‑鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用

Info

Publication number: CN104312996B
Application number: CN201410504753.6A
Authority: CN
Inventors: 赵林果; 裴建军; 冯翊阳; 汤锋; 岳永德; 操海群; 余晓丹
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2034-09-26
Also published as: CN104312996A

Abstract

α‑L‑鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示；编码所述 α‑L‑鼠李糖苷酶Rha1的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。该α‑L‑鼠李糖苷酶在酶用量13U/mL，pH 6.5，35℃的条件下水解1.5 g/L的芦丁20 min,水解效率高达98%以上；该酶能在低温下生物催化和转化芦丁、柚皮苷等黄酮类化合物，大大降低了能耗。

Description

α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程技术领域，具体涉及对黑曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC3.2.1.40)广泛存在于动物、植物和微生物中，能够特异性地水解许多糖苷类物质，如柚皮苷、芦丁、橙皮苷等糖苷类物质末端α-L-鼠李糖基，可用于食品、医药等领域。主要的功能和作用包括：

(1)脱苦作用：黄烷酮糖苷类物质是柑桔中的主要苦味物质，α-L-鼠李糖苷酶可以作用于黄烷酮糖苷类物质，脱去一个鼠李糖分子之后，转化为单糖苷，其苦味为原来的三分之一。

(2)增香作用：葡萄糖中存在大量键合态芳香物质，键合态芳香物质本身并没有呈香功能，但可以在糖苷酶的作用下裂解糖苷键释放糖苷配基，产生游离态芳香物质。许多品种葡萄键合态芳香物质含量多于游离态芳香物质，因为键合态芳香物质构成了葡萄中重要的、潜在的芳香成分，6-O-α-L-鼠李吡喃-β-D-葡萄吡喃糖苷是葡萄中主要的键合态芳香物质。利用α-L-鼠李糖苷酶可以有效释放这些香气物质。

(3)生物转化：α-L-鼠李糖苷酶还可用于黄酮类物质的生物转化。不同的糖链决定了黄酮类物质的不同生理功能，α-L-鼠李糖苷酶可以专一性的水解黄酮类物质糖链中的鼠李糖苷，如α-L-鼠李糖苷酶可以转化芦丁生产药用价值更高的异斛皮素。

黑曲霉具有产生α-L-鼠李糖苷酶的能力，但其产量不高，而且直接通过菌株发酵获得α-L-鼠李糖苷酶一般和β-葡萄糖苷酶紧密结合在一起形成柚苷酶，分离得到纯的α-L-鼠李糖苷酶用于生物转化具有一定的难度。另一方面，黑曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶还没有被克隆和表达，本实验室在前期的研究中发现了黑曲霉NL-1发酵生产的α-L-鼠李糖苷酶能有效应用于芦丁的生物转化，因此对黑曲霉NL-1来源的α-L-鼠李糖苷酶展开了研究。

[1]Soares NF,Hotchkiss JH.Naringinase immobilization in packagingfilms for reducing naringin concentration in grapefruit juice[J].J Food Sci1998,63:61-65；

[2]Spagna G,Barbagallo RN,Martino A,et al.A simple method forpurifying glycosidases:α-L-rhamnopyranosidase from Aspergillus niger toincrease the aroma of Moscato wine[J].Enzyme Microb Techno1,2000,27:522-530；

[3]González BR,Trindade LM,Manzanares P,et al.Production ofbioavailable flavonoid glucosides in fruit juices and green tea by use offungalα-L-rhamnosidases.Agric.Food Chem,2004,52(20):6136-6142.

发明内容

解决的技术问题：直接通过黑曲霉菌株发酵获得的α-L-鼠李糖苷酶，不仅酶活力低，而且粗酶液富含β-葡萄糖苷酶。针对目前还没有黑曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶基因被克隆表达，且难以低成本大规模获得用于黄酮类物质生物转化的黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶纯酶的缺点，本发明提供一种来源于黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用。

技术方案：α-L-鼠李糖苷酶Rha1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述α-L-鼠李糖苷酶Rha1的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种插入了SEQ ID NO.1所示α-L-鼠李糖苷酶Rha1基因的重组质粒。

所述重组质粒的制备方法，其特征在于：

(1)按照真菌鼠李糖苷酶的同源性设计简并引物P1和P2，以黑曲霉菌株(Aspergillus niger)NL-1的mRNA反转录的cDNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到鼠李糖苷酶Rha1基因的PCR扩增产物，所述引物为：

P1：5’-ATGGCS(G/C)D(A/G/T)GCCAAATCTY(C/T)TM(A/C)TTGAA-3’；

P2：5’-GGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3’；

(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物与pMD-19T克隆载体在16℃下过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有α-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pMD-19T-Rha1；

(3)通过对鼠李糖苷酶Rha1全序列分析，设计引物P3和P4：

P3：5’-GGAATTCCATATGGCCAGCCAAATCTTCATTGAAA-3’,下划线表示Nde I位点；

P4：5’-CCCAAGCTTGGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3’,下划线表示Hind Ⅲ位点；

以P3和P4为引物，以pMD-19T-Rha1为模板进行PCR；将所得的PCR扩增产物和pET20b分别用Nde I和Hind Ⅲ双酶切，并分别割胶回收，16℃连接4h；将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有α-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pET20b-Rha1。

包含所述的重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。

所述α-L-鼠李糖苷酶Rha1在柚皮苷、芦丁生物催化转化中的应用。

有益效果：本发明首次克隆并重组表达了黑曲霉菌株(Aspergillus niger)α-L-鼠李糖苷酶Rha1的基因，重组酶Rha1可以水解柚皮苷和芦丁。该α-L-鼠李糖苷酶在酶用量13U/mL，pH6.5，35℃的条件下水解1.5g/L的芦丁20min,水解效率高达98％以上；该酶能在低温下生物催化和转化芦丁、柚皮苷等黄酮类化合物，大大降低了能耗。

附图说明

图1为重组α-L-鼠李糖苷酶电泳图；图1中M：Mark；1：粗酶液；2：纯化后酶液。

图2为重组α-L-鼠李糖苷酶Rha1水解柚皮苷的HPLC图谱。其中，(1)图谱为使用灭活的α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷的HPLC图谱，(2)图谱为加α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷的HPLC图谱。

图3为重组α-L-鼠李糖苷酶Rha1水解芦丁的HPLC图谱；第一个峰为芦丁(保留时间为3.630)，第二峰为异槲皮苷(保留时间为3.788)。

图4为重组α-L-鼠李糖苷酶水解芦丁条件的优化结果。其中，图a为温度对芦丁水解率的影响，图b为pH对芦丁水解率的影响，图c为时间对芦丁水解率的影响，图d为酶用量对芦丁水解率的影响。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内，如无特殊说明，均为常规方法。本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)Top10F’；pMD-19T克隆载体试剂盒，限制性内切酶、修饰酶、连接酶等(购自Takara公司)；pET20b vector(购自Invitrogen公司)、p-NPR购自Sigma公司。

实施例1

1.黑曲霉菌株(Aspergillus niger)总RNA的获得

1.1黑曲霉菌株(Aspergillus niger)的培养

黑曲霉菌株(Aspergillus niger)NL-1由本实验室筛选获得(黑曲霉cbh1基因和耐高糖bgl1基因克隆表达及定向改造，李国庆，南京林业大学，硕士论文，2012年)，保藏在南京林业大学微生物菌种保藏库，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放生物材料。黑曲霉菌株(Aspergillus niger)的培养基配方为：葡萄糖30g/L，K₂HPO₄·3H₂O1g/L，KCl0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，FeSO₄0.01g/L，NaNO₃0.2g/L，pH调至4.8，接种新鲜的黑曲霉孢子悬液，30℃下180rpm培养3-4天过滤收集菌丝体。

1.2黑曲霉菌株(Aspergillus niger)总RNA的提取

取收集的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗一次后，用在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中，加入1mL Trizol后剧烈震荡，4℃下12000g离心10min后转移上清液至2mL离心管，加入200μL氯仿震荡15s混匀后30℃下孵育2-3min，4℃下12000g离心10min取上层清夜，加入0.8倍体积异丙醇混匀后4℃下12000g离心10min，去净上清后用75wt.％乙醇水溶液(DEPC处理过的，去除了mRNA酶)清洗2次后4℃下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，-20℃下保存。

2.α-L-鼠李糖苷酶Rha1编码基因的克隆

2.1黑曲霉(Aspergillus niger)cDNA的获得

以黑曲霉(Aspergillus niger)菌株总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下各逆转录所用试剂均来自于试剂盒“PrimeScriptTM1stStrand cDNA SynthesisKit”，购自Takara公司)。

在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液：

混匀后65℃下保温5min后冰上放置1min

在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：

上述反应液混匀后在50℃下保温1h，70℃下保温15min后冰上冷却，得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成。

2.2α-L-鼠李糖苷酶Rha1基因的引物设计及克隆

按照NCBI数据库中公布的真菌α-L-鼠李糖苷酶基因，再根据黑曲霉密码子的偏好性设计简并引物。

对黑曲霉(Aspergillus niger)进行发酵培养(发酵培养基为：鼠李糖10g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，KH₂PO₄1.5g/L，(NH₄)₂SO₄4g/L，ZnSO₄·7H₂O0.09g/L，CaCl₂0.1g/L，酵母提取物1g/L，豆粕2.0g/L，蛋白胨2.0g/L)，30℃下180rpm培养3-4天。根据NCBI上真菌鼠李糖苷酶的氨基酸序列来设计简并引物P1,P2,为上下游引物扩增Rha1基因片段，使用Ex Taq聚合酶(购自Takara公司)以推荐比例配制50μL反应液进行片段扩增，PCR反应条件是95℃，5min；35次循环(95℃，30s；52℃，30s；72℃，2min50s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到黑曲霉(Aspergillus niger)α-L-鼠李糖苷酶Rha1基因，回收的片段与pMD-19T simple载体连接，产物转化到大肠杆菌E.coliTop10F’中，转化产物涂布于蓝白斑筛选平板，37℃过夜培养，接种单菌落到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10h后，提取质粒进行序列测定，如SEQ IDNO.1所示，得到重组质粒pMD-19T-Rha1。

3.α-L-鼠李糖苷酶Rha1表达载体的构建及表达

3.1α-L-鼠李糖苷酶Rha1表达载体的构建

P3：5’-GGAATTCCATATGGCCAGCCAAATCTTCATTGAAA-3’，下划线表示Nde I位点；

P4：5’-CCCAAGCTTGGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3’，下划线表示Hind Ⅲ位点；

以P3与P4为引物以pMD-19T-Rha1为模板扩增去Rha1基因片段，PCR反应条件是95℃，5min；35次循环(95℃，30s；52℃，30s；72℃，2min50s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。，将pET20b质粒和Rha1基因片段分被使用Nde I和Hind Ⅲ酶切，割胶回收，再用T4连接酶16℃连接4小时，连接产物转化到大肠杆菌E.coli Top10F’中，转化产物涂布到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pET20b-Rha1。

3.2α-L-鼠李糖苷酶Rha1表达载体的转化及筛选

取重组质粒将重组质粒pET20b-Rha11μL加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中混匀冰上放置20min，通过42℃的水浴锅孵育2min后放置在冰上5min，向其中加入1mL SOC培养基，在37℃培养1h后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板(氨苄青霉素的终浓度为100mg/L)上来筛选出转化子，挑取几个单菌落到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10小时后，取1mL菌液测序，确定含有pET20b-Rha1重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

3.3α-L-鼠李糖苷酶重组基因工程菌pET20b-Rha1/BL21(DE3)的表达

将重组大肠杆菌BL21(DE3)划线于LB平板上(氨苄青霉素的终浓度为100mg/L)进行活化，37℃培养12h，至长出单菌落后接种于20mL LB液体培养基中，于37℃，180rpm摇床培养3-4h，至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达3-4个小时。同时将含有空质粒pET20b的大肠杆菌BL21(DE3)作为阴性对照(Control)。吸出1mL的菌液5000r/min离心3min收集菌体，弃上清，用1mL PBS缓冲液洗涤菌体两次后用500μL的PBS重新悬浮菌体后进行超声裂解，工作条件为：超声3s，间隔5s，共50次。12000r/min离心10min，吸出15μL上清备用，上清中加入15μL5×SDS上样缓冲液混匀，煮沸5min后，各取10μL进行SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白，如图1。

4.重组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

4.1酶活测定方法

反应体系200μL，20μL10mmol/L对硝基苯α-L-鼠李糖苷酶(pNPR)中加入100μL100mmol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液(pH6.5)，去离子水70μL，先在35℃孵育5min，再加入10μL酶液反应10min，显色后再加入1mol/L的碳酸钠溶液600μL终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmol p-硝基苯酚所用的酶量为1个酶活力单位。

4.2最适反应温度的测定

在20-50℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为100mmol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液(pH6.5)，发现重组α-L-鼠李糖苷酶的最适反应温度为35℃。

4.3最适反应pH

在不同的pH(6.0-8.0，100mmol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液)条件下，35℃分别测定酶活，发现重组α-L-鼠李糖苷酶的最适反应pH为6.5。

5.重组α-L-鼠李糖苷酶对柚皮苷和芦丁的水解

5.1重组α-L-鼠李糖苷酶对柚皮苷的水解

取纯化后的α-L-鼠李糖苷酶0.5U，加入100μL100mmol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液，10μL50mmoL/L的柚皮苷(Naringin，甲醇溶解)，添加去离子水至200μL，在35℃条件下孵育30min，取出12000rpm离心2min，加入200μL甲醇(分析纯)混匀，经0.22μm的有机滤膜过滤到色谱瓶中，使用HPLC分析，分析条件为：柱温，30℃；流速，1.2mL/min；进样量，5μL；检测波长，280nm；流动相，甲醇:超纯水＝68:32(V:V)。结果如图2。

5.2重组α-L-鼠李糖苷酶对芦丁的水解

取纯化后的α-L-鼠李糖苷酶0.5U，加入100μL100mmol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液，10μL50mmoL/L的芦丁(甲醇溶解)，添加去离子水至200μL，在35℃条件下孵育30min，取出12000rpm离心2min，加入200μL甲醇(分析纯)混匀，经0.22μm的有机滤膜过滤到色谱瓶中，使用HPLC分析，分析条件为：柱温，30℃；流速，1.0mL/min；进样量，5μL；检测波长，368nm；流动相，甲醇:超纯水＝55:45(V:V)。结果如图3。

5.3重组α-L-鼠李糖苷酶水解芦丁条件的优化

为了获得α-L-鼠李糖苷酶对芦丁水解的最适温度、最适pH、最适反应时间及最适用酶量，以灭活的α-L-鼠李糖苷酶处理的芦丁的含量为100％，结果如图4。图4(a)可以看出水解的最适温度为40℃，在35℃、40℃、45℃条件下重组α-L-鼠李糖苷酶对芦丁的水解效果影响较小；图4(b)可以看出水解的最适pH为6.5；图4(c)可以看出水解20min、30min、40min的水解效果相差不大，适宜水解时间为30min左右；图4(d)结果表明，α-L-鼠李糖苷酶在酶用量13U/mL，pH6.5，40℃的条件下水解1.5g/L的芦丁30min，水解效率高达98％以上。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2769

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 1

atggccagcc aaatcttcat tgaaacccct acagttgagc aacactcaac cgggtttggc 60

attggaactg cgactccgcg tctgtcatgg cgattcctca ccaccgacag tagtcctcgc 120

gactgggagc agacggccta cgaagtggaa gttgttcgtt ccggatctcg agaggaaacc 180

taccatgtga acagcagtgc atcggtgctg gtcccttggc ccagtggccc actacaatcc 240

cgggaaatcg cacaggtccg tgttcgagca tacgggtgca gcgctggcaa ggagcagcag 300

agtgactgtg ccaccgcttg gtctccctgg cggactattg agtgtggact actcgaccgc 360

gctgactggg tagcccgacc tattgccagt cctgaggaac cacagccgga tcatccatta 420

cgaccggtgc gattccgtaa agagttccaa ctccctgcgg caggtaccat agaaaaagct 480

cgcctttata tcacgagctt tggagtatac cgcgccttca tcaacgggca tcgagtaggg 540

gatcagtgtc tcgcgcccgg atggaccagc taccgccatc gcttgaacta tcaagtgttc 600

gacatcgcgt ccctcctgaa tgctgaaggt cctaatgtcc ttgcggtaga ggttgcagag 660

ggctggtacg ccactcgcct cggcttcctt ggcgggcgaa gacagctgta tggggatcga 720

ctggccgtgt tggcccagct ggagatccaa cttggatcta atggagaccg attctatatg 780

tctaccgata gcacctggac gtgtactccc agtgccatca tccggagtga gctctatgac 840

ggcgaggttt acgatacccg tgaagaagat tcgacctgga actgcttgcg tcttgaccaa 900

acctcccgct gggtggccgt tcaggaactc gagttcccaa ccgcagcctt ggtggcaccg 960

aacgctcccc cagtccgtat caccgaggag atatctccag tctccgtcca gaagacccca 1020

tccggtgcca ccgtcatcga cttcggccag aacctggtcg gtcgactttg cgtgcgctcg 1080

ttgaacaagc cctcgggctc tcgcgtttcc ttcattcacg ccgaagtgct tgagaatggc 1140

gagctcgggg ttcgacccct gcgacacgcc aagtgcaccg acgaagtcat tctaagtgat 1200

acagagctgg tagattggtc gcctcagtat acattccacg ggtttcggtt cgtccaggtc 1260

aatggttggg atgaagaaag cgatggatca ctgctcctca acatcaacgc gcttgtgatg 1320

cacactgata tgactcgcag cggatggttt tcctgctcgc accctatggt caatcaactc 1380

cacaccaatg cctggtggag tatgcgtggg aatttccttt ccatccctac cgattgcccc 1440

cagagggatg aacgcctcgg ctggaccggg gatattcaga tattctgccc atcggccaac 1500

ttcctctaca atactgctgg catgctgagt gactggttgc aagatgtcgc ggccgagcag 1560

ctgagggaga aagatggttg cgtgcctcca tttacagtcc ccaatatcat tagtgagacc 1620

ctgtggccgc atacgccgca ggctgtatgg gatgatgtgg tgatcctaac gccctgggcc 1680

ctctaccggt cgtatgggga cagtgaaatt ctccgccgtc aatatgaaag catgctcgcc 1740

tggatcgatc gcggcatccg tcgcggctca gatggactct gggaccctga gctttggcaa 1800

ctgggagact ggttagaccc aacagcgccg cccgaggaac ctggggatgc acgcaccagc 1860

ggaaccctcg ttgctgatgc ctatctcgtg cacatcactt cggtgatgtc cgaaatcagc 1920

caggtcctcg gccagagcca ggatgccgca cggtttaaga cggactataa tcgactcaag 1980

gcgaggttcc aggccaagta tataacggcg actgggttac tagtcggcga tacccaaacg 2040

gcgcttagcc ttgccatcgt gtacgacctt cactccaccc ctgaagcagc gcaagcagca 2100

gcatcacgtc tcgtccacct cgtccggctc gccaagtttc gcgtcgccac cgggttcgcg 2160

ggcactccaa tcatcacgca tgctctcacc aagagcggaa atccccagat cgcctaccgg 2220

atgttgctag agaaatctcg tccgtcgtgg atgtatccca tcaccatggg ggcgacgacc 2280

atgtgggaga ggtgggacag catgctcccc gacgggtcca tcaaccctgg cgaaatgacc 2340

agcttcaacc actacgccct gggttcgatc atcaactggc tgcactccgt tgtagccggc 2400

gtcagccctc tggccccagg ctggaaacac atacaggtcg ccccgacacc tgggcctaca 2460

attcactctg ctgaagccat gtatgacact ccttatgggc gactggaatg ccggtggtcg 2520

atcgagactg atgcagaccg cttccacatg gacctgttga taccccctaa ctctcgcgcg 2580

cgtgtaatct tgccaactcg agagaagcta tcacagcccg ttggttctcg tgaagacgga 2640

ggcttttggg tgggttcggg gcgtcacaag ttctcagcga ccttcgagtg gaaggactat 2700

tctagggact ggccaccaaa gcctctgaat ccgattatgc gtgaacctga accggaggat 2760

attgcctga 2769

<210> 2

<211> 922

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 2

Met Ala Ser Gln Ile Phe Ile Glu Thr Pro Thr Val Glu Gln His Ser

1 5 10 15

Thr Gly Phe Gly Ile Gly Thr Ala Thr Pro Arg Leu Ser Trp Arg Phe

20 25 30

Leu Thr Thr Asp Ser Ser Pro Arg Asp Trp Glu Gln Thr Ala Tyr Glu

35 40 45

Val Glu Val Val Arg Ser Gly Ser Arg Glu Glu Thr Tyr His Val Asn

50 55 60

Ser Ser Ala Ser Val Leu Val Pro Trp Pro Ser Gly Pro Leu Gln Ser

65 70 75 80

Arg Glu Ile Ala Gln Val Arg Val Arg Ala Tyr Gly Cys Ser Ala Gly

85 90 95

Lys Glu Gln Gln Ser Asp Cys Ala Thr Ala Trp Ser Pro Trp Arg Thr

100 105 110

Ile Glu Cys Gly Leu Leu Asp Arg Ala Asp Trp Val Ala Arg Pro Ile

115 120 125

Ala Ser Pro Glu Glu Pro Gln Pro Asp His Pro Leu Arg Pro Val Arg

130 135 140

Phe Arg Lys Glu Phe Gln Leu Pro Ala Ala Gly Thr Ile Glu Lys Ala

145 150 155 160

Arg Leu Tyr Ile Thr Ser Phe Gly Val Tyr Arg Ala Phe Ile Asn Gly

165 170 175

His Arg Val Gly Asp Gln Cys Leu Ala Pro Gly Trp Thr Ser Tyr Arg

180 185 190

His Arg Leu Asn Tyr Gln Val Phe Asp Ile Ala Ser Leu Leu Asn Ala

195 200 205

Glu Gly Pro Asn Val Leu Ala Val Glu Val Ala Glu Gly Trp Tyr Ala

210 215 220

Thr Arg Leu Gly Phe Leu Gly Gly Arg Arg Gln Leu Tyr Gly Asp Arg

225 230 235 240

Leu Ala Val Leu Ala Gln Leu Glu Ile Gln Leu Gly Ser Asn Gly Asp

245 250 255

Arg Phe Tyr Met Ser Thr Asp Ser Thr Trp Thr Cys Thr Pro Ser Ala

260 265 270

Ile Ile Arg Ser Glu Leu Tyr Asp Gly Glu Val Tyr Asp Thr Arg Glu

275 280 285

Glu Asp Ser Thr Trp Asn Cys Leu Arg Leu Asp Gln Thr Ser Arg Trp

290 295 300

Val Ala Val Gln Glu Leu Glu Phe Pro Thr Ala Ala Leu Val Ala Pro

305 310 315 320

Asn Ala Pro Pro Val Arg Ile Thr Glu Glu Ile Ser Pro Val Ser Val

325 330 335

Gln Lys Thr Pro Ser Gly Ala Thr Val Ile Asp Phe Gly Gln Asn Leu

340 345 350

Val Gly Arg Leu Cys Val Arg Ser Leu Asn Lys Pro Ser Gly Ser Arg

355 360 365

Val Ser Phe Ile His Ala Glu Val Leu Glu Asn Gly Glu Leu Gly Val

370 375 380

Arg Pro Leu Arg His Ala Lys Cys Thr Asp Glu Val Ile Leu Ser Asp

385 390 395 400

Thr Glu Leu Val Asp Trp Ser Pro Gln Tyr Thr Phe His Gly Phe Arg

405 410 415

Phe Val Gln Val Asn Gly Trp Asp Glu Glu Ser Asp Gly Ser Leu Leu

420 425 430

Leu Asn Ile Asn Ala Leu Val Met His Thr Asp Met Thr Arg Ser Gly

435 440 445

Trp Phe Ser Cys Ser His Pro Met Val Asn Gln Leu His Thr Asn Ala

450 455 460

Trp Trp Ser Met Arg Gly Asn Phe Leu Ser Ile Pro Thr Asp Cys Pro

465 470 475 480

Gln Arg Asp Glu Arg Leu Gly Trp Thr Gly Asp Ile Gln Ile Phe Cys

485 490 495

Pro Ser Ala Asn Phe Leu Tyr Asn Thr Ala Gly Met Leu Ser Asp Trp

500 505 510

Leu Gln Asp Val Ala Ala Glu Gln Leu Arg Glu Lys Asp Gly Cys Val

515 520 525

Pro Pro Phe Thr Val Pro Asn Ile Ile Ser Glu Thr Leu Trp Pro His

530 535 540

Thr Pro Gln Ala Val Trp Asp Asp Val Val Ile Leu Thr Pro Trp Ala

545 550 555 560

Leu Tyr Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Glu Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Glu

565 570 575

Ser Met Leu Ala Trp Ile Asp Arg Gly Ile Arg Arg Gly Ser Asp Gly

580 585 590

Leu Trp Asp Pro Glu Leu Trp Gln Leu Gly Asp Trp Leu Asp Pro Thr

595 600 605

Ala Pro Pro Glu Glu Pro Gly Asp Ala Arg Thr Ser Gly Thr Leu Val

610 615 620

Ala Asp Ala Tyr Leu Val His Ile Thr Ser Val Met Ser Glu Ile Ser

625 630 635 640

Gln Val Leu Gly Gln Ser Gln Asp Ala Ala Arg Phe Lys Thr Asp Tyr

645 650 655

Asn Arg Leu Lys Ala Arg Phe Gln Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Thr Gly

660 665 670

Leu Leu Val Gly Asp Thr Gln Thr Ala Leu Ser Leu Ala Ile Val Tyr

675 680 685

Asp Leu His Ser Thr Pro Glu Ala Ala Gln Ala Ala Ala Ser Arg Leu

690 695 700

Val His Leu Val Arg Leu Ala Lys Phe Arg Val Ala Thr Gly Phe Ala

705 710 715 720

Gly Thr Pro Ile Ile Thr His Ala Leu Thr Lys Ser Gly Asn Pro Gln

725 730 735

Ile Ala Tyr Arg Met Leu Leu Glu Lys Ser Arg Pro Ser Trp Met Tyr

740 745 750

Pro Ile Thr Met Gly Ala Thr Thr Met Trp Glu Arg Trp Asp Ser Met

755 760 765

Leu Pro Asp Gly Ser Ile Asn Pro Gly Glu Met Thr Ser Phe Asn His

770 775 780

Tyr Ala Leu Gly Ser Ile Ile Asn Trp Leu His Ser Val Val Ala Gly

785 790 795 800

Val Ser Pro Leu Ala Pro Gly Trp Lys His Ile Gln Val Ala Pro Thr

805 810 815

Pro Gly Pro Thr Ile His Ser Ala Glu Ala Met Tyr Asp Thr Pro Tyr

820 825 830

Gly Arg Leu Glu Cys Arg Trp Ser Ile Glu Thr Asp Ala Asp Arg Phe

835 840 845

His Met Asp Leu Leu Ile Pro Pro Asn Ser Arg Ala Arg Val Ile Leu

850 855 860

Pro Thr Arg Glu Lys Leu Ser Gln Pro Val Gly Ser Arg Glu Asp Gly

865 870 875 880

Gly Phe Trp Val Gly Ser Gly Arg His Lys Phe Ser Ala Thr Phe Glu

885 890 895

Trp Lys Asp Tyr Ser Arg Asp Trp Pro Pro Lys Pro Leu Asn Pro Ile

900 905 910

Met Arg Glu Pro Glu Pro Glu Asp Ile Ala

915 920

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcsdgcc aaatctytmt tgaa 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcaatatcc tccggttcag gttca 25

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaattccat atggccagcc aaatcttcat tgaaa 35

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccaagcttg gcaatatcct ccggttcagg ttca 34

Claims

1.α-L-鼠李糖苷酶Rha1，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述α-L-鼠李糖苷酶Rha1的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一种插入了SEQ ID NO.1所示α-L-鼠李糖苷酶Rha1基因的重组质粒。

4.权利要求3所述重组质粒的制备方法，其特征在于：

(1)按照真菌鼠李糖苷酶的同源性设计简并引物P1和P2，以黑曲霉菌株(Aspergillusniger)NL-1的mRNA反转录的cDNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到鼠李糖苷酶Rha1基因的PCR扩增产物，所述引物为：

P1：5’-ATGGCS(G/C)D(A/G/T)GCCAAATCTY(C/T)TM(A/C)TTGAA-3’；

P2：5’-GGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3’；

(3)通过对鼠李糖苷酶Rha1全序列分析，设计引物P3和P4：

P4：5’-CCCAAGCTTGGCAATATCCTCCGGTTCAGGTTCA-3’,下划线表示Hind Ⅲ位点；以P3和P4为引物，以pMD-19T-Rha1为模板进行PCR；将所得的PCR扩增产物和pET20b分别用Nde I和Hind Ⅲ双酶切，并分别割胶回收，16℃连接4h；将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有α-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒pET20b-Rha1。

5.包含权利要求3所述的重组质粒的大肠杆菌宿主细胞。

6.权利要求1所述α-L-鼠李糖苷酶Rha1在柚皮苷、芦丁生物催化转化中的应用。