CN109312375A - 一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种橙皮素的制备方法，包括：将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；采用底物流加法将所述底物配制液以0.1‑1mL/min的速度加入至含有α‑L‑鼠李糖苷酶和β‑葡萄糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液，流加完成后继续反应0.5‑1h，所述反应液的pH为6.0‑7.0，反应温度维持在45‑65℃，所述α‑L‑鼠李糖苷酶来源于链霉菌属，所述β‑葡萄糖苷酶来源于海栖热袍菌属；调节所述反应液的pH至3.0‑5.0使固体产物完全析出，收集所述固体产物，制得橙皮素。该方法高效简便，绿色环保，可以适用于工业化大规模生产。

Description

一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制 备橙皮素的生物酶

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶。

背景技术

橙皮素(Hesperetin)，分子式为C₁₆H₁₄O₆，熔点为227.5℃，其水溶性很差，几乎不溶于水，也不溶于氯仿和笨，易溶于乙醇等。在自然界中多以橙皮苷(Hesperidin)的形式存在。研究表明，橙皮素是一种中药提取物，主要存在于陈皮、青皮、枳壳等中药材中，是他们的主要起效成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、防止动脉粥样硬化等多种功效。

目前常用酸水解法将新橙皮苷(Neohesperidin)或橙皮苷水解得到橙皮素，此外还有很多文献报道的如水相-乙醇法、甲醇法、环己醇法等制备橙皮素方法，但这些方法工艺繁琐、污染严重，并且产物纯化困难等。近来发展的酶水解法有水解温度较低，水解反应较好控制等特点，但是经发酵产酶的产率并不高，价格昂贵，而且水解率较低，若酶系中含有多种酶，得到的反应产物仍然复杂，使得分离纯化困难。

因此，发展一种工艺简单、成本低、产率高且绿色环保的橙皮素制备方法具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶；本发明所述制备方法工艺简单、产量高和安全环保。

第一方面，本发明提供了一种橙皮素的制备方法，包括：

将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；

采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-100mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液，流加完成后继续反应0.5-1h，其中，所述反应液的pH为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃，所述α-L-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属，所述β-葡萄糖苷酶来源于海栖热袍菌属；

调节所述反应液的pH至3.0-5.0使固体产物完全析出，收集所述固体产物，所述固体产物即为橙皮素。

本发明中，所述橙皮素的制备方法的具体工艺路线如下所示：

其中，所述工艺采用生物酶法，所述橙皮苷如式(Ⅰ)所示，所述橙皮素如式(Ⅲ)所示。图中，式(Ⅱ)所示为橙皮素-7-O-葡萄糖苷(Hesperitin-7-O-glucoside)，也称橙皮素单葡萄糖苷，分子式C₂₂H₂₄O₁₁，相对分子质量464，是在生物酶水解橙皮苷生成橙皮素过程中的中间体，是由橙皮苷脱掉一个鼠李糖之后的产物，在本发明中统称为橙皮素中间体。所述橙皮素中间体的含量很低，相较于橙皮素的含量可以忽略不计。所述新橙皮苷的化学结构式如(Ⅵ)所示，将新橙皮苷按照上述生物酶法橙同样可以制得所述橙皮素，

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的来源广泛，目前在动物组织、植物和微生物中均有发现，然而关于动物组织和植物来源的报道相对较少。不同微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶的酶学性质存在差异，包括酶的比活性、酶作用的底物范围、最适pH、最适温度、作用时间和酶的稳定性等方面。例如，细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶最适pH呈中性或碱性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH一般在酸性范围内。并非所有的α-L-鼠李糖苷酶均对橙皮苷或新橙皮苷都有水解能力；本发明所述α-L-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属(Streptomyces)，通过水解底物(橙皮苷或新橙皮苷)的活力大小筛选获得活力较高的基因，经表达得到本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶，所述α-L-鼠李糖苷酶可以高效专一的水解橙皮苷或新橙皮苷并得到橙皮素-7-O-葡萄糖苷。本发明所述β-葡萄糖苷酶属于海栖热袍菌属(Thermotoga petrophila RKU-1)，采用同样方法获得，所述β-葡萄糖苷酶可以高效专一的水解橙皮素-7-O-葡萄糖苷得到橙皮素。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌共表达产生。可选地，本发明所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌Rosetta(DE3)共表达产生。其中所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶是两个独立的蛋白分子。所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶以粗酶液的形式参与反应。可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶的质量比为1：(0.1-10)。所述所述粗酶液是由大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶后，对所述大肠杆菌Rosetta(DE3)进行离心、清洗、破胞后收集得到。本发明通过采用共表达形式得到α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶粗酶液水解橙皮苷或新橙皮苷并制备橙皮素的方法，工艺精简，节约成本，产量高，而且绿色环保。可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶通过大肠杆菌表达产生；所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌表达产生。所述α-L-鼠李糖苷酶在所述粗酶液的质量浓度可以进行一定范围的调节。可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶在所述粗酶液的质量浓度范围为0.2-3％。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列的羧基端含有His标签。所述His标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。当所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌共表达产生时，所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶之间可以分别分离及提纯。

本发明中，所述底物配制液制备的具体过程包括，将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入5-10mol/L氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。可选地，所述氢氧化钠在底物配制液中的终浓度为0.25-0.5mol/L。所述浓度的氢氧化钠溶液可以有效提高橙皮苷的溶解性。相应地，所述浓度的氢氧化钠溶液可以有效提高新橙皮苷的溶解性。

本发明中，所述采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-100mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液的过程中，所述底物配制液的流加时间为4-6h。进一步地，可选地，所述底物配制液的流加时间为4.5-5.5h。所述流加时间是指所述底物配制液完全流加至所述反应液中的时间，所述底物配制液在所述底物流加法中的流加的速度根据所述流加时间进行调节。

可选地，所述橙皮苷或所述新橙皮苷在所述反应液的质量溶度为2.5-10％。进一步地，可选地，所述橙皮苷或所述新橙皮苷在所述反应液的质量溶度为5-10％。例如，所述橙皮苷或所述新橙皮苷在所述反应液的质量溶度为5％，或为8％，或为10％。可选地，所述反应液的pH为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃。进一步地，可选地，所述反应液的pH为6.5-7.0。可选地，所述反应温度维持在55-65℃。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶在所述反应液中的质量浓度为0.05-0.5％。进一步可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶在所述反应液中的质量浓度为0.1-0.5％。

可选地，所述缓冲液的缓冲剂包括磷酸盐、Tris缓冲剂或其他缓冲剂。优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。进一步地，优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。具体地，所述缓冲液包括磷酸钠缓冲液。所述磷酸钠缓冲液中和所述氢氧化钠溶液具有相同的阳离子，可以减少其他杂质阳离子的添加，防止其他杂质阳离子降低酶(包括α-L-鼠李糖苷酶或β-葡萄糖苷酶)的生物活性。所述缓冲液的pH为6.0-7.0。可选地，所述缓冲液的浓度为80-110mmol/L。进一步可选地，所述缓冲液的浓度为70-100mmol/L。优选地，所述缓冲液的浓度为90-110mmol/L。例如，所述缓冲液的浓度为70mmol/L，或为80mmol/L，或为100mmol/L。

可选地，所述调节所述反应液的pH至3.0-5.0使固体产物完全析出的过程包括向所述反应液加入酸溶液并调节所述反应液的pH至3.0-5.0，搅拌反应0.5-1h后使固体产物完全析出。可选地，所述酸溶液的浓度为2-6mol/L。进一步地，所述酸溶液的浓度为4-6mol/L。所述酸溶液包括盐酸。

可选地，所述收集的过程包括将对所述反应液进行过滤、洗涤、干燥和重结晶过程。其中，所述干燥过程包括采用真空干燥，温度为50-60℃。所述重结晶过程包括：将干燥后的所述固体完全溶解于甲醇中，温度在40-60℃，过滤得到滤液，对所述滤液进行浓缩至原体积的5-10％后加水至所述橙皮素结晶固体全部析出，重复操作得到橙皮素的精品。

本发明第一方面所提供的橙皮素的制备方法，所述制备方法工艺简单，成本低廉、绿色环保；由所述制备方法制得的橙皮素具有极高的产率。本发明利用底物流加法，将含有橙皮苷或新橙皮苷底物流加到反应体系中，底物终浓度可高到达10％，远远大于现有技术，相较与已报道现有制备工艺提高了5000倍左右，产能得到大幅度提高，适应大规模工业化生产。

第二方面，本发明提供了一种橙皮素中间体的制备方法，包括：

将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；

采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-100mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液，流加完成后继续反应0.5-1h，其中，所述反应液的pH为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃，所述α-L-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属；

收集所述反应液中析出的固体产物，所述固体产物即为橙皮素中间体。

可选地，所述收集的过程包括对所述反应液进行过滤、洗涤、干燥和重结晶过程。所述重结晶过程包括：将干燥后的所述固体完全溶解于丙酮溶液中，温度在30-40℃，过滤得到滤液，对所述滤液进行浓缩至原体积的5-10％后加水至所述橙皮素中间体结晶固体全部析出，重复操作得到橙皮素中间体的精品。所述丙酮溶液是指丙酮体积比为60-80％的水溶液。

可选地，所述橙皮素中间体的制备方法中，所述橙皮素中间体的固体产物在反应体系几乎不进行进一步的水解，即所述橙皮素在反应体系中的含量特别微小。将所述收集得到的橙皮素中间体再次采用底物流加法，并加入所述β-葡萄糖苷酶，可以制得所述橙皮素固体产物。

本发明第二方面提供的一种橙皮素中间体的制备方法，利用α-L-鼠李糖苷酶，并采用底物流加法实现对橙皮素中间体的制备，该方法工艺简单，产率高，绿色环保；并且α-L-鼠李糖苷酶的专一性好，可以有效较少橙皮素中间体的进一步水解。

第三方面，本发明提供了用于制备橙皮素的生物酶，所述生物酶包括α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

其中，所述如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的基因编码序列如SEQ ID NO：1所示；可选的，所述α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列的基因编码序列应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:1具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:3。同样的，对于所述β-葡萄糖苷酶，所述如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶可以高效专一的水解橙皮苷或新橙皮苷并得到橙皮素-7-O-葡萄糖苷。所述β-葡萄糖苷酶可以高效专一的水解橙皮素-7-O-葡萄糖苷得到橙皮素。所述橙皮苷或所述新橙皮苷经α-L-鼠李糖苷酶水解后得到橙皮素-7-O-葡萄糖苷(橙皮素中间体)过程中，并不会水解生成其他中间体产物，所述橙皮素-7-O-葡萄糖苷也不会被所述α-L-鼠李糖苷酶继续分解。本发明所述α-L-鼠李糖苷酶源于链霉菌属，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因序列经优化筛选实验获得。本发明所述β-葡萄糖苷酶源于海栖热袍菌属，所述β-葡萄糖苷酶的基因序列经优化筛选实验获得。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶通过大肠杆菌表达生成。所述β-葡萄糖苷酶通过通过大肠杆菌表达生成。所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶在所述大肠杆菌表达生成的体系中均属于异源表达。本发明优选地大肠杆菌表达系统，简单可行，培养周期短，发酵成本低，蛋白产量高。所述α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶具有很好的生物活性，纯度高，可广泛应用于生物制药、蛋白生产等领域。相比于传统其他发酵体系，本发明优选的α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶具有更高的产率，并且具有更强的生物活性。所述α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶都具有良好的专一性。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶通过构建重组质粒在大肠杆菌中异源表达；所述重组质粒包括所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列。进一步地，当所述重组质粒同时包括所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列时，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列的5’端前插入RBS序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的5’端前插入RBS序列。所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。本发明所述RBS序列为核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)序列，可以有效促进两组蛋白基因(α-L-鼠李糖苷酶基因和β-葡萄糖苷酶基因)进行独立的转录及翻译。

本发明中，所述重组质粒的载体质粒为pET22b(+)质粒。将所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列插入至所述pET22b(+)质粒中得到重组质粒，所述重组质粒可以高效、高产的在大肠杆菌中的表达得到α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列插入pET22b(+)质粒时，所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的5’端可加入起始密码子(如ATG)，所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的3’端可加入终止密码子(如TAA)。可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列的5’端在加入始密码子之后再插入RBS序列。

可选地，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因片段的上增设His标签(组氨酸标签)的核苷酸序列，能使表达后的蛋白带上His标签，His标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。所述His标签可以用于分离所述α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列和所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列中的一种或两种，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如SEQID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组质粒的制备方法，包括：

(1)提供上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQID NO:6-SEQ ID NO:11所示；

(2)提供或制备α-L-鼠李糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶基因模板，并以步骤(1)所得上游引物和下游引物为PCR引物，扩增所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶基因片段；

(3)取pET22b(+)质粒，将步骤(2)扩增得到的所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶基因片段和所述pET22b(+)质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组质粒。

可选地，所述步骤(3)中，在所述β-葡萄糖苷酶基因片段的5’端前插入RBS序列。可选地，所述步骤(3)中，在所述α-L-鼠李糖苷酶基因片段的5’端前插入RBS序列。可选地，所述步骤(3)中，所示双酶切反应的酶切位点可以为Nde I内切酶和Xho I内切酶。

本发明的有益效果包括以下几个方面：

1、本发明所述的制备方法，采用生物酶法(包括α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶)，并通过采用底物流加法进行反应，底物终浓度可高到达10％，相比于传统工艺提高了5000倍左右；

2、本发明所述的制备方法，制备过程中未使用有机试剂，采用生物酶法，高效简便，成本低，绿色环保，可以广泛适用于工业化规模生产；

3、由本发明所述的制备方法制备的橙皮素及其中间体，纯度高，可在制药领域或生物医学领域中有广泛的应用；

4、本发明利用大肠杆菌异源表达α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，酶的表达水平高，水解活力好，特异性强，水解产物单一。

附图说明

图1为本发明一实施例提供的pET22b-BGL04-Rha01重组质粒的质粒图谱；

图2为本发明一实施例提供的pET22b-Rha01重组质粒的质粒图谱；

图3为本发明一实施例提供的BGL04-Rha01粗酶液的凝胶电泳图；

图4为本发明一实施例提供的Rha01粗酶液的凝胶电泳图；

图5为本发明一实施例提供的橙皮素的高效液相色谱图；

图6为本发明一实施例提供的橙皮素-7-O-葡萄糖苷的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。

(1)构建pET22b-BGL04-Rha01、pET22b-Rha01重组质粒

a)提供上游引物和下游引物，采用PCR扩增实验得到α-L-鼠李糖苷酶(Rha01)和β-葡萄糖苷酶(BGL04)的基因编码序列。其中，α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。所述α-L-鼠李糖苷酶对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:7所示。所述β-葡萄糖苷酶对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:8所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:9所示。在所述Rha01和所述BGL04基因的5’端前插入RBS序列，所述RBS序列如SEQ ID NO:5所示，并通过上下游引物将其插入至质粒pET22b(+)中并构建pET22b-BGL04-Rha01重组质粒。

b)提供上游引物和下游引物，采用PCR扩增实验得到α-L-鼠李糖苷酶(Rha01)基因编码序列，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:11所示。通过上下游引物进行将α-L-鼠李糖苷酶的基因插入至质粒pET22b(+)中并构建pET22b-BGL04-Rha01重组质粒。

通过对应的上游引物和下游引物分别进行PCR扩增体系，配置扩增体系如下：

PCR扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸3min；30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，分别利用限制性内切酶Nde I和EcoR I、EcoR I和Xho I进行酶切，酶切后用T4连接酶连接已用Nde I和Xho I酶切处理的质粒pET22b(+)。连接产物转入大肠杆菌DH5α，经过氨苄抗性(Amp+)的筛选后挑取菌落送测序，测序成功后即得到α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的重组质粒pET22b-BGL04-Rha01和pET22b-Rha01。所述重组质粒pET22b-BGL04-Rha01的质粒图谱如图1所示；所述重组质粒pET22b-Rha01的质粒图谱如图2所示。

(2)表达α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶

将构建的重组质粒pET22b-Rha01、pET22b-BGL04和pET22b-BGL04-Rha01中的一种或多种转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，并以1％的接种量接种至含有10mL的LB培养基(100μg/mL氨苄青霉素(Amp))的50mL三角瓶中，维持恒定的37℃，200rpm的摇晃速率，过夜培养后，将菌液以1％的接种量转接到含有1L的LB培养基(100μg/mL Amp)的2L三角瓶中，继续37℃恒温培养至培养基中的OD600值达到0.6左右，加入终浓度为0.5mM左右的诱导剂IPTG，在37℃条件培养10小时后离心收集菌体。将菌体分别用4倍质量的100mM的PBS缓冲液(pH＝6.0)进行重悬并超声破碎20min，得到重组酶粗酶液，包括α-L-鼠李糖苷酶(Rha01)粗酶液、β-葡萄糖苷酶(BGL04)粗酶液以及BGL04-Rha01粗酶液。其中BGL04-Rha01粗酶液中含有α-L-鼠李糖苷酶(Rha01)和β-葡萄糖苷酶(BGL04)。

将表达获得的α-L-鼠李糖苷酶(Rha01)粗酶液、β-葡萄糖苷酶(BGL04)粗酶液和BGL04-Rha01粗酶液。分别进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。图3为所述BGL04-Rha01粗酶液的凝胶电泳图，其中泳道Marker为分子量标阶梯(Thermo ScientificPageRuler)，泳道BSA为质量浓度为1mg/mL的牛血清白蛋白，泳道A为菌体破胞后BGL04-Rha01粗酶液上清液，泳道B为菌体破胞后Rha01粗酶液上清液，泳道C为菌体破胞后BGL04粗酶液上清液，Rha01的分子量为87kDa，其中BGL04的分子量为72kDa。图4为所述Rha01粗酶液的凝胶电泳图，其中包括Marker(Thermo Scientific PageRuler)和BSA泳道，泳道1为菌体破胞后上清液，泳道2为菌体破胞后总蛋白，其中Rha01的分子量约为87kDa。所述α-L-鼠李糖苷酶(Rha01)和β-葡萄糖苷酶(BGL04)的分子大小均于相应蛋白的理论计算值相近。

实施例1

一种橙皮素的制备方法，包括：

将100g橙皮苷悬浮于300mL水中，并加入10mol/L氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。

采用底物流加法将所述底物配制液以1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400mL)的磷酸钠缓冲液(300mL,100mM)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应pH为6.0，温度维持在55℃；

在上述反应液中缓慢加入2mol/L HCl，加至pH到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000mL的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50mL去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。

本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果。液相检测使用月旭Xtimate C18，5μm×250×4.6mm为分析柱，取5mL乙酸加入到1000mL的水溶液：乙腈＝70：30，柱温为30℃，检测波长为UV208nm，流速为1.0mL/min。图5是实验过程中检测的橙皮素的高效液相色谱图，实验测得转化率为99.2％。

按照本实施例1的实验参数，在底物流加法中的反应温度在45-65℃区间内，选取在反应温度恒定在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时分别进行橙皮素的制备，并计算转化率，得到在不同反应温度下橙皮素的转化率，如表1所示。

按照本实施例1的实验参数，调节反应底物橙皮苷的质量浓度，选取在橙皮苷底物的质量浓度在3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％时分别进行橙皮素的制备，并计算转化率，得到在不同橙皮苷底物的质量浓度下橙皮素的转化率，如表2所示。

按照本实施例1的实验参数，调节底物流加法中的流加的速度，将所述底物配制液分别在4-9h内流加完成，选取流加时间分别为4h、5h、6h、7h、8h和9h下进行橙皮素的制备，并计算转化率，得到在不同流加时间下的橙皮素的转化率，如表3所示。

表1为在不同反应温度下橙皮素的转化率(％)：

反应温度(℃)	橙皮苷的质量(g)	橙皮素的质量(g)	转化率(％)
				45	100	44.1	89.1
50	100	47.2	95.3
				55	100	49.1	99.2
60	100	49.0	99.0
				65	100	48.8	98.5

从表1中可以看出，本实施方式中，所述橙皮素的制备方法中在反应温度为45-65℃时，可以高效的水解橙皮苷得到橙皮素，所述橙皮素的转化率≥89％；特别地，当反应温度为55-65℃时，所述橙皮素的转化率≥98％，远远大于传统工艺中的20-50％的转化率。

表2为在不同橙皮苷底物的质量浓度下橙皮素的转化率(％)：

橙皮苷底物质量浓度(％)	橙皮苷的质量(g)	橙皮素的质量(g)	转化率(％)
				3	30	14.8	99.8
4	40	19.7	99.5
				5	50	24.6	99.3
6	60	29.5	99.3
				7	70	33.9	98.0
8	80	38.3	96.7
				9	90	44.2	95.1
10	100	44.6	90.0

从表2中可以看出，本实施方式中，所述橙皮素的制备方法中在所述橙皮苷底物的质量浓度在3-10％时，所述橙皮素的转化率≥90％；特别地，当橙皮苷底物的质量浓度在3-7％时，所述橙皮素的转化率≥98％，远远大于传统工艺中的20-50％的转化率。

表3为在不同反应温度下橙皮素的转化率(％)：

流加时间(h)	流加的速度(mL/min)	橙皮苷的质量(g)	橙皮素的质量(g)	转化率(％)
					3	1.67	100	37.1	75.0
4	1.25	100	45.5	92.0
					5	1.00	100	49.0	99.1
6	0.83	100	49.1	99.2
					7	0.71	100	49.1	99.2
8	0.63	100	49.2	99.4
					9	0.56	100	49.2	99.3

从表3中可以看出，本实施方式中，所述橙皮素的制备方法中在底物配制液分别在3-9h内流加完成时，所述橙皮素的转化率≥75％；特别地，当橙皮素的制备方法中在底物配制液分别在4-9h内流加完成时，所述橙皮素的转化率≥92％，远远大于传统工艺中的20-50％的转化率。本发明所述橙皮素的制备方法中，优选地，底物配制液的流加时间为4-6h，这样既保证的时效，又具有较高的转化率。当所述底物配制液的流加时间小于3h，所述橙皮素的转化率将低于50％。

实施例2

一种橙皮素的制备方法，包括：

将100g橙皮苷悬浮于300mL水中，并加入10mol/L氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。

采用底物流加法将所述底物配制液以1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400mL)的磷酸钠缓冲液(300mL,100mM)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应pH为7.0，温度维持在55℃；

在上述反应液中缓慢加入2mol/L HCl，加至pH到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000mL的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50mL去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。

本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.1％。

实施例3

一种橙皮素的制备方法，包括：

将100g橙皮苷悬浮于300mL水中，并加入10mol/L氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。

采用底物流加法将所述底物配制液以1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400mL)的磷酸钠缓冲液(300mL,100mM)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应pH为6.5，温度维持在55℃；

在上述反应液中缓慢加入2mol/L HCl，加至pH到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000mL的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50mL去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。

本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.4％。

实施例4

一种橙皮素的制备方法，包括：

将100g新橙皮苷悬浮于300mL水中，并加入10mol/L氢氧化钠溶液至新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。

采用底物流加法将所述底物配制液以1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400mL)的磷酸钠缓冲液(300mL,)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应pH为6.5，温度维持在55℃；

在上述反应液中缓慢加入4mol/L HCl，加至pH到3.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000mL的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50mL去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，确保水分不大于1％。

本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.0％。

实施例5

一种橙皮素中间体的制备方法，包括：

将100g橙皮苷悬浮于300mL水中，并加入10mol/L氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；

采用底物流加法将所述底物配制液以1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶粗酶液(300mL)的磷酸钠缓冲液(300mL,100mM)中进行搅拌反应，流加完成后继续反应4h，控制反应pH为6.5，温度维持在55℃；

将上述反应液进行过滤，滤饼通过0.5倍体积的去离子水冲洗，取滤饼50℃烘干得到橙皮素中间体的粗品。将粗品溶解在100mL的80％的丙酮中，30℃搅拌至完全溶解后过滤得滤液，将滤液进行真空浓缩至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，有固体析出。过滤得滤饼，用少量去离子水冲洗滤饼后，将滤饼进行干燥得到橙皮素中间体精品。

本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得转化率为99.2％。

对比例1

一种橙皮素的制备方法，包括：

在磷酸钠缓冲液(600mL,100mM)中加入100g橙皮苷、并加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400mL)进行搅拌反应6h得到反应液；控制反应pH为6.0，温度维持在55℃；

在上述反应液中缓慢加入2mol/L HCl，加至pH到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000mL的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50mL去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，本实施例中，每隔一定时间取反应液用甲醇稀释50倍，微孔过滤后进样进行液相分析反应结果，实验测得反应的转化率为10％。

对比例2

一种橙皮素的制备方法，包括：

将100g橙皮苷悬浮于300mL水中，并加入10mol/L氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。

采用底物流加法将所述底物配制液以1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400mL)的磷酸钠缓冲液(300mL)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应pH为6.0，温度维持在30℃；

在上述反应液中缓慢加入2mol/L HCl，加至pH到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000mL的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50mL去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品；实验测得橙皮素的转化率为58％。

对比例3

一种橙皮素的制备方法，包括：

将100g橙皮苷悬浮于300mL水中，并加入10mol/L氢氧化钠溶液至所述橙皮苷完全溶解后得到底物配制液。

采用底物流加法将所述底物配制液以1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶共表达的粗酶液(400mL)的磷酸钠缓冲液(300mL)中进行搅拌反应得到反应液；流加约5h至底物配制液流加完成后继续反应1h，控制反应pH为9.0，温度维持在55℃；

在上述反应液中缓慢加入2mol/L HCl，加至pH到5.0搅拌0.5h，过滤得到橙皮素的固体，烘干得到橙皮素的粗品，确保水分不大于5％；将粗品溶解在1000mL的甲醇中，60℃至完全溶解后过滤除去滤饼得滤液，将滤液进行旋蒸至原体积的10％后加入4倍体积的去离子水，搅拌0.5h后，过滤得滤饼，用50mL去离子水冲洗滤饼后，将滤饼在60℃进行干燥得橙皮素的精品，实验测得橙皮素的转化率为30％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司

江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司

<120> 一种橙皮素的制备方法、橙皮素中间体的制备方法和用于制备橙皮素的生物酶

<150> PCT/CN2018/084377

<151> 2018-04-25

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgctgagca tcagccaagt tgcgtttgag caccaccgta ccgcgctggg tattggcgaa 60

acccagccgc gtgtgagctg gcgttttgac ggtaacgtta gcgattggga gcaacgtgcg 120

tacgagatcg aagtgaagcg tgcgggccac gacgcggatg ttttccgtag cgaaagcagc 180

gacagcgtgc tggtgccgtg gccgagcagc ccgctgcaga gcggcgagga agcgaccgtg 240

cgtgttcgta gctttggtag cgacggccaa cacgataccc cgtggagcga tgcggtgacc 300

gttgaaccgg gtctgctgac cccggatgat tggcacgatg cggtggttat tgcgagcgat 360

cgtccgaccg aggtggatgc gacccaccgt ccgattcagt tccgtaaaga atttagcgtg 420

gacgatagct acgttagcgc gcgtctgtat atcaccgcgc tgggtctgta cgaagcgcgt 480

attaacgacc aacgtgtggg tgatcacgtt atggcgccgg gctggcagag ctaccaatat 540

cgtcacgagt acaacaccta tgacgttacc gatctgctga agcagggtcc gaacgcgatc 600

ggcgtgaccg ttggtgaagg ctggtacagc ggtcgtatcg gctatgacgg tggcaaacgt 660

aacatttacg gtgataccct gggcctgctg agcctgctgg ttgtgaccaa gagcgacggt 720

agcaaactgt atatcccgag cgatagcagc tggaagagca gcaccggtcc gatcattagc 780

agcgagattt acgacggcga ggaatatgat agccgtctgg aacagaaggg ttggagccaa 840

gtgggcttca acagcaccgg ttggctgggc acccacgaac tgagctttcc gaaagagcgt 900

ctggcgagcc cggatggtcc gccggtgcgt cgtgttgcgg agcacaagct ggcgaacgtg 960

ttcagcagcg cgagcggcaa aaccgttctg gattttggtc agaacctggt gggctggctg 1020

cgtatccgtg ttaagggtcc gaaaggccaa accattcgtt tcgtgcacac cgaggttatg 1080

gaaaacggtg aggtggcgac ccgtccgctg cgtcaggcga aggcgaccga ccactttacc 1140

ctgagcggcg agggcgttca agagtgggaa ccgagcttca cctaccacgg ttttcgttat 1200

gttcaagttg atggttggcc ggcggacacc ccgctggatg aaaacagcgt taccgcgatc 1260

gtggttcaca gcgatatgga acgtaccggt tacttcgagt gcagcaaccc gctgatcagc 1320

aaactgcacg agaacattct gtggagcatg cgtggcaact tctttagcat tccgaccgac 1380

tgcccgcaac gtgatgaacg tctgggttgg accggcgaca tccacgcgtt cagccgtacc 1440

gcgaacttta tttatgacac cgcgggtttc ctgcgtgcgt ggctgaagga tgcgcgtagc 1500

gagcagctga accacagcta cagcctgccg tatgtgatcc cgaacattca cggtaacggc 1560

gagaccccga ccagcatctg gggtgacgcg attgtgggcg ttccgtggca gctgtacgaa 1620

agcttcggtg ataaagtgat gctggaggaa caatatggtg gcgcgaagga ctgggttgat 1680

aaaggtatcg tgcgtaacga cgttggcctg tgggatcgta gcacctttca gtgggcggac 1740

tggctggatc cgaaggcgcc ggcggatgat ccgggtcaag cgaccaccaa caaatacctg 1800

gttagcgacg cgtatctgct gcacagcacc gatatgctgg cgaacatcag caccagcctg 1860

agcaagggcg aggaagcgag caactacacc gaatggcacg cgaagctgac caaagagttc 1920

caaaaagcgt ggattaccag caacggtacc atggcgaacg agacccagac cggtctggcg 1980

ctgccgctgt actttgacct gtttccgagc gcggaacagg cgcaaagcgc ggcgaagcgt 2040

ctggtgaaca tcatcaagca gaacgattac aaggttggta ccggttttgc gggtacccac 2100

ctgctgggtc acaccctgag caaatacggc gagagcgacg cgttttatag catgctgcgt 2160

cagaccgaag tgccgagctg gctgtaccaa gtggttatga acggcaccac cacctgggag 2220

cgttgggata gcatgctgcc gaacggtagc atcaacccgg gccagatgac cagcttcaac 2280

cactatgcgg tgggtagcgt tggcagctgg ctgcacgaag tgattggtgg cctgagcccg 2340

gcggagccgg gttggcgtcg tatcaacatt gaagtggttc cgggtggcga cctgcagcaa 2400

gcgagcacca agtttctgac cccgtacggt atggcgagca ccaaatggtg gctggacggc 2460

caggatcaaa gctgcggtgg cttcgacttt cacctggtgg cggaagttcc gccgaacacc 2520

cgtgcgaccg tggttctgcc gggcaagggt ggcgagaaag tggatgttgg tagcggcgtt 2580

cacgaatatc acgtgcgttg cgttaaactg 2610

<210> 2

<211> 2163

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcaaga tcgacgagat tctgagccag ctgaccatcg aggaaaaggt gaaactggtg 60

gttggtgttg gtctgccggg tctgtttggt aacccgcaca gccgtgttgc gggtgcggcg 120

ggtgaaaccc atccggtgcc gcgtctgggt atcccgagct tcgttctggc ggatggtccg 180

gcgggtctgc gtattaaccc gacccgtgag aacgatgaaa acacctacta taccaccgcg 240

ttcccggtgg agatcatgct ggcgagcacc tggaacaagg acctgctgga ggaagtgggt 300

aaagcgatgg gcgaggaagt tcgtgaatac ggtgtggatg ttctgctggc gccggcgatg 360

aacattcacc gtaacccgct gtgcggccgt aactttgagt actatagcga agacccggtt 420

ctgagcggcg agatggcgag cgcgttcgtg aagggcgttc agagccaagg tgtgggcgcg 480

tgcatcaaac actttgttgc gaacaaccag gagaccaacc gtatggtggt tgataccatt 540

gtgagcgagc gtgcgctgcg tgaaatctac ctgaaaggtt tcgaaattgc ggtgaagaaa 600

gcgcgtccgt ggaccgttat gagcgcgtat aacaagctga acggcaaata ctgcagccaa 660

aacgagtggc tgctgaagaa agtgctgcgt gaggaatggg gtttcgacgg ctttgttatg 720

agcgactggt atgcgggtga taacccggtg gaacagctga aggcgggtaa cgacatgatc 780

atgccgggca aagcgtacca agttaacacc gagcgtcgtg atgaaatcga ggaaattatg 840

gaggcgctga aggaaggtcg tctgagcgag gaagtgctga acgagtgcgt tcgtaacatt 900

ctgaaagtgc tggttaacgc gccgagcttt aagggctacc gttatagcaa caaaccggat 960

ctggaaagcc atgcgaaggt ggcgtacgag gcgggtgttg aaggcgtggt tctgctggag 1020

aacaacggtg tgctgccgtt cgacgaaagc atccacgtgg cggtttttgg taccggccaa 1080

atcgagacca ttaaaggtgg caccggtagc ggtgataccc acccgcgtta taccatcagc 1140

attctggagg gtattaagga acgtaacatg aaattcgacg aggaactgac cagcatctac 1200

gaggattata ttaagaaaat gcgtgaaacc gaggaataca agccgcgtac cgacagctgg 1260

ggcaccgtta tcaagccgaa actgccggag aactttctga gcgagaaaga aattaagaaa 1320

gcggcgaaga aaaacgatgc ggcggtggtt gtgatcagcc gtattagcgg tgaaggctat 1380

gaccgtaagc cggttaaggg tgatttctac ctgagcgacg atgagctgga actgatcaag 1440

accgtgagcc gtgagtttca cgaacagggt aagaaagttg tggttctgct gaacatcggc 1500

agcccgattg aggttgcgag ctggcgtgac ctggtggatg gcatcctgct ggtttggcag 1560

gcgggtcaag aaatgggccg tattgtggcg gacgtgctgg ttggtcgtgt taacccgagc 1620

ggcaagctgc cgaccacctt cccgaaagac tatagcgatg tgccgagctg gacctttccg 1680

ggcgagccga aggataaccc gcaacgtgtg gtttacgagg aagacatcta cgtgggttat 1740

cgttactatg ataccttcgg cgttgagccg gcgtacgaat ttggttatgg cctgagctac 1800

accaaattcg aatataagga cctgaaaatc gcgattgacg gtgatatcct gcgtgttagc 1860

tacaccatta ccaacaccgg tgaccgtgcg ggcaaagagg tgtctcaggt gtatgttaaa 1920

gcgccgaagg gcaaaatcga taagccgttc caagaactga aagcgtttca caagaccaaa 1980

ctgctgaacc cgggcgagag cgaaaagatc ttcctggaga ttccgctgcg tgacctggcg 2040

agctttgatg gcaaagagtg ggtggttgaa agcggcgagt acgaagtgcg tgttggcgcg 2100

agcagccgtg acatccgtct gcgtgatatt ttcctggtgg agggtgaaaa gcgttttaaa 2160

ccg 2163

<210> 3

<211> 870

<212> PRT

<213> 链霉菌属(Streptomyces)

<400> 3

Ala Leu Ser Ile Ser Gln Val Ala Phe Glu His His Arg Thr Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ile Gly Glu Thr Gln Pro Arg Val Ser Trp Arg Phe Asp Gly Asn

20 25 30

Val Ser Asp Trp Glu Gln Arg Ala Tyr Glu Ile Glu Val Lys Arg Ala

35 40 45

Gly His Asp Ala Asp Val Phe Arg Ser Glu Ser Ser Asp Ser Val Leu

50 55 60

Val Pro Trp Pro Ser Ser Pro Leu Gln Ser Gly Glu Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Arg Val Arg Ser Phe Gly Ser Asp Gly Gln His Asp Thr Pro Trp Ser

85 90 95

Asp Ala Val Thr Val Glu Pro Gly Leu Leu Thr Pro Asp Asp Trp His

100 105 110

Asp Ala Val Val Ile Ala Ser Asp Arg Pro Thr Glu Val Asp Ala Thr

115 120 125

His Arg Pro Ile Gln Phe Arg Lys Glu Phe Ser Val Asp Asp Ser Tyr

130 135 140

Val Ser Ala Arg Leu Tyr Ile Thr Ala Leu Gly Leu Tyr Glu Ala Arg

145 150 155 160

Ile Asn Asp Gln Arg Val Gly Asp His Val Met Ala Pro Gly Trp Gln

165 170 175

Ser Tyr Gln Tyr Arg His Glu Tyr Asn Thr Tyr Asp Val Thr Asp Leu

180 185 190

Leu Lys Gln Gly Pro Asn Ala Ile Gly Val Thr Val Gly Glu Gly Trp

195 200 205

Tyr Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Asp Gly Gly Lys Arg Asn Ile Tyr Gly

210 215 220

Asp Thr Leu Gly Leu Leu Ser Leu Leu Val Val Thr Lys Ser Asp Gly

225 230 235 240

Ser Lys Leu Tyr Ile Pro Ser Asp Ser Ser Trp Lys Ser Ser Thr Gly

245 250 255

Pro Ile Ile Ser Ser Glu Ile Tyr Asp Gly Glu Glu Tyr Asp Ser Arg

260 265 270

Leu Glu Gln Lys Gly Trp Ser Gln Val Gly Phe Asn Ser Thr Gly Trp

275 280 285

Leu Gly Thr His Glu Leu Ser Phe Pro Lys Glu Arg Leu Ala Ser Pro

290 295 300

Asp Gly Pro Pro Val Arg Arg Val Ala Glu His Lys Leu Ala Asn Val

305 310 315 320

Phe Ser Ser Ala Ser Gly Lys Thr Val Leu Asp Phe Gly Gln Asn Leu

325 330 335

Val Gly Trp Leu Arg Ile Arg Val Lys Gly Pro Lys Gly Gln Thr Ile

340 345 350

Arg Phe Val His Thr Glu Val Met Glu Asn Gly Glu Val Ala Thr Arg

355 360 365

Pro Leu Arg Gln Ala Lys Ala Thr Asp His Phe Thr Leu Ser Gly Glu

370 375 380

Gly Val Gln Glu Trp Glu Pro Ser Phe Thr Tyr His Gly Phe Arg Tyr

385 390 395 400

Val Gln Val Asp Gly Trp Pro Ala Asp Thr Pro Leu Asp Glu Asn Ser

405 410 415

Val Thr Ala Ile Val Val His Ser Asp Met Glu Arg Thr Gly Tyr Phe

420 425 430

Glu Cys Ser Asn Pro Leu Ile Ser Lys Leu His Glu Asn Ile Leu Trp

435 440 445

Ser Met Arg Gly Asn Phe Phe Ser Ile Pro Thr Asp Cys Pro Gln Arg

450 455 460

Asp Glu Arg Leu Gly Trp Thr Gly Asp Ile His Ala Phe Ser Arg Thr

465 470 475 480

Ala Asn Phe Ile Tyr Asp Thr Ala Gly Phe Leu Arg Ala Trp Leu Lys

485 490 495

Asp Ala Arg Ser Glu Gln Leu Asn His Ser Tyr Ser Leu Pro Tyr Val

500 505 510

Ile Pro Asn Ile His Gly Asn Gly Glu Thr Pro Thr Ser Ile Trp Gly

515 520 525

Asp Ala Ile Val Gly Val Pro Trp Gln Leu Tyr Glu Ser Phe Gly Asp

530 535 540

Lys Val Met Leu Glu Glu Gln Tyr Gly Gly Ala Lys Asp Trp Val Asp

545 550 555 560

Lys Gly Ile Val Arg Asn Asp Val Gly Leu Trp Asp Arg Ser Thr Phe

565 570 575

Gln Trp Ala Asp Trp Leu Asp Pro Lys Ala Pro Ala Asp Asp Pro Gly

580 585 590

Gln Ala Thr Thr Asn Lys Tyr Leu Val Ser Asp Ala Tyr Leu Leu His

595 600 605

Ser Thr Asp Met Leu Ala Asn Ile Ser Thr Ser Leu Ser Lys Gly Glu

610 615 620

Glu Ala Ser Asn Tyr Thr Glu Trp His Ala Lys Leu Thr Lys Glu Phe

625 630 635 640

Gln Lys Ala Trp Ile Thr Ser Asn Gly Thr Met Ala Asn Glu Thr Gln

645 650 655

Thr Gly Leu Ala Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Leu Phe Pro Ser Ala Glu

660 665 670

Gln Ala Gln Ser Ala Ala Lys Arg Leu Val Asn Ile Ile Lys Gln Asn

675 680 685

Asp Tyr Lys Val Gly Thr Gly Phe Ala Gly Thr His Leu Leu Gly His

690 695 700

Thr Leu Ser Lys Tyr Gly Glu Ser Asp Ala Phe Tyr Ser Met Leu Arg

705 710 715 720

Gln Thr Glu Val Pro Ser Trp Leu Tyr Gln Val Val Met Asn Gly Thr

725 730 735

Thr Thr Trp Glu Arg Trp Asp Ser Met Leu Pro Asn Gly Ser Ile Asn

740 745 750

Pro Gly Gln Met Thr Ser Phe Asn His Tyr Ala Val Gly Ser Val Gly

755 760 765

Ser Trp Leu His Glu Val Ile Gly Gly Leu Ser Pro Ala Glu Pro Gly

770 775 780

Trp Arg Arg Ile Asn Ile Glu Val Val Pro Gly Gly Asp Leu Gln Gln

785 790 795 800

Ala Ser Thr Lys Phe Leu Thr Pro Tyr Gly Met Ala Ser Thr Lys Trp

805 810 815

Trp Leu Asp Gly Gln Asp Gln Ser Cys Gly Gly Phe Asp Phe His Leu

820 825 830

Val Ala Glu Val Pro Pro Asn Thr Arg Ala Thr Val Val Leu Pro Gly

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Lys Val Asp Val Gly Ser Gly Val His Glu Tyr His

850 855 860

Val Arg Cys Val Lys Leu

865 870

<210> 4

<211> 721

<212> PRT

<213> 海栖热袍菌属(Thermotoga petrophila RKU-1)

<400> 4

Met Gly Lys Ile Asp Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ile Glu Glu Lys

1 5 10 15

Val Lys Leu Val Val Gly Val Gly Leu Pro Gly Leu Phe Gly Asn Pro

20 25 30

His Ser Arg Val Ala Gly Ala Ala Gly Glu Thr His Pro Val Pro Arg

35 40 45

Leu Gly Ile Pro Ser Phe Val Leu Ala Asp Gly Pro Ala Gly Leu Arg

50 55 60

Ile Asn Pro Thr Arg Glu Asn Asp Glu Asn Thr Tyr Tyr Thr Thr Ala

65 70 75 80

Phe Pro Val Glu Ile Met Leu Ala Ser Thr Trp Asn Lys Asp Leu Leu

85 90 95

Glu Glu Val Gly Lys Ala Met Gly Glu Glu Val Arg Glu Tyr Gly Val

100 105 110

Asp Val Leu Leu Ala Pro Ala Met Asn Ile His Arg Asn Pro Leu Cys

115 120 125

Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro Val Leu Ser Gly Glu

130 135 140

Met Ala Ser Ala Phe Val Lys Gly Val Gln Ser Gln Gly Val Gly Ala

145 150 155 160

Cys Ile Lys His Phe Val Ala Asn Asn Gln Glu Thr Asn Arg Met Val

165 170 175

Val Asp Thr Ile Val Ser Glu Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Lys

180 185 190

Gly Phe Glu Ile Ala Val Lys Lys Ala Arg Pro Trp Thr Val Met Ser

195 200 205

Ala Tyr Asn Lys Leu Asn Gly Lys Tyr Cys Ser Gln Asn Glu Trp Leu

210 215 220

Leu Lys Lys Val Leu Arg Glu Glu Trp Gly Phe Asp Gly Phe Val Met

225 230 235 240

Ser Asp Trp Tyr Ala Gly Asp Asn Pro Val Glu Gln Leu Lys Ala Gly

245 250 255

Asn Asp Met Ile Met Pro Gly Lys Ala Tyr Gln Val Asn Thr Glu Arg

260 265 270

Arg Asp Glu Ile Glu Glu Ile Met Glu Ala Leu Lys Glu Gly Arg Leu

275 280 285

Ser Glu Glu Val Leu Asn Glu Cys Val Arg Asn Ile Leu Lys Val Leu

290 295 300

Val Asn Ala Pro Ser Phe Lys Gly Tyr Arg Tyr Ser Asn Lys Pro Asp

305 310 315 320

Leu Glu Ser His Ala Lys Val Ala Tyr Glu Ala Gly Val Glu Gly Val

325 330 335

Val Leu Leu Glu Asn Asn Gly Val Leu Pro Phe Asp Glu Ser Ile His

340 345 350

Val Ala Val Phe Gly Thr Gly Gln Ile Glu Thr Ile Lys Gly Gly Thr

355 360 365

Gly Ser Gly Asp Thr His Pro Arg Tyr Thr Ile Ser Ile Leu Glu Gly

370 375 380

Ile Lys Glu Arg Asn Met Lys Phe Asp Glu Glu Leu Thr Ser Ile Tyr

385 390 395 400

Glu Asp Tyr Ile Lys Lys Met Arg Glu Thr Glu Glu Tyr Lys Pro Arg

405 410 415

Thr Asp Ser Trp Gly Thr Val Ile Lys Pro Lys Leu Pro Glu Asn Phe

420 425 430

Leu Ser Glu Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ala Lys Lys Asn Asp Ala Ala

435 440 445

Val Val Val Ile Ser Arg Ile Ser Gly Glu Gly Tyr Asp Arg Lys Pro

450 455 460

Val Lys Gly Asp Phe Tyr Leu Ser Asp Asp Glu Leu Glu Leu Ile Lys

465 470 475 480

Thr Val Ser Arg Glu Phe His Glu Gln Gly Lys Lys Val Val Val Leu

485 490 495

Leu Asn Ile Gly Ser Pro Ile Glu Val Ala Ser Trp Arg Asp Leu Val

500 505 510

Asp Gly Ile Leu Leu Val Trp Gln Ala Gly Gln Glu Met Gly Arg Ile

515 520 525

Val Ala Asp Val Leu Val Gly Arg Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro

530 535 540

Thr Thr Phe Pro Lys Asp Tyr Ser Asp Val Pro Ser Trp Thr Phe Pro

545 550 555 560

Gly Glu Pro Lys Asp Asn Pro Gln Arg Val Val Tyr Glu Glu Asp Ile

565 570 575

Tyr Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr Asp Thr Phe Gly Val Glu Pro Ala Tyr

580 585 590

Glu Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Lys Phe Glu Tyr Lys Asp Leu

595 600 605

Lys Ile Ala Ile Asp Gly Asp Ile Leu Arg Val Ser Tyr Thr Ile Thr

610 615 620

Asn Thr Gly Asp Arg Ala Gly Lys Glu Val Ser Gln Val Tyr Val Lys

625 630 635 640

Ala Pro Lys Gly Lys Ile Asp Lys Pro Phe Gln Glu Leu Lys Ala Phe

645 650 655

His Lys Thr Lys Leu Leu Asn Pro Gly Glu Ser Glu Lys Ile Phe Leu

660 665 670

Glu Ile Pro Leu Arg Asp Leu Ala Ser Phe Asp Gly Lys Glu Trp Val

675 680 685

Val Glu Ser Gly Glu Tyr Glu Val Arg Val Gly Ala Ser Ser Arg Asp

690 695 700

Ile Arg Leu Arg Asp Ile Phe Leu Val Glu Gly Glu Lys Arg Phe Lys

705 710 715 720

Pro

<210> 5

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaggag 6

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggaattca aggagatata catatggcgc tgagcatcag ccaagt 46

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgctcgagt tacagtttaa cgcaacgcac gtg 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaattccat atgatgatgg gcaagatcga cga 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccggaattct tacggtttaa aacgcttttc acc 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgctcgagt tacagtttaa cgcaacgcac gtg 33

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccggaattct tacagtttaa cgcaacgcac gtga 34

Claims (10)

1.一种橙皮素的制备方法，其中，包括：

将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；

采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液，流加完成后继续反应0.5-1h，其中，所述反应液的pH为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃，所述α-L-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属，所述β-葡萄糖苷酶来源于海栖热袍菌属；

调节所述反应液的pH至3.0-5.0使固体产物完全析出，收集所述固体产物，所述固体产物即为橙皮素。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过大肠杆菌共表达产生。

4.如权利要求1的制备方法，其中，所述α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列的羧基端含有His标签。

5.如权利要求1的制备方法，其中，所述采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液的工程中，所述底物配制液的流加时间为4-6h。

6.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述氢氧化钠在底物配制液中的终浓度为0.25-0.5mol/L。

7.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述收集的过程包括对所述反应液进行过滤、洗涤、干燥和重结晶操作。

8.一种橙皮素中间体的制备方法，其中，包括：

将橙皮苷或新橙皮苷悬浮于水中，并加入氢氧化钠溶液至所述橙皮苷或所述新橙皮苷完全溶解后得到底物配制液；

采用底物流加法将所述底物配制液以0.1-1mL/min的速度加入至含有α-L-鼠李糖苷酶的缓冲液中进行搅拌反应并得到反应液，流加完成后继续反应0.5-1h，其中，所述反应液的pH为6.0-7.0，反应温度维持在45-65℃，所述α-L-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属；

收集所述反应液中析出的固体产物，所述固体产物即为橙皮素中间体。

9.用于制备橙皮素的生物酶，其中，所述生物酶包括α-L-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，所述α-L-鼠李糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述α-L-鼠李糖苷酶来源于链霉菌属，所述β-葡萄糖苷酶来源于海栖热袍菌属。

10.如权利要求9所述的生物酶，其中，所述α-L-鼠李糖苷酶和所述β-葡萄糖苷酶通过构建重组质粒在大肠杆菌中异源表达；所述重组质粒包括所述α-L-鼠李糖苷酶和/或所述β-葡萄糖苷酶的基因编码序列。