CN106148446A - 一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，该粗酶液能够一步水解新橙皮苷或橙皮苷β-D-葡萄糖苷键，制得相应的苷元橙皮素。其步骤包括：发酵制备Penicillium decumbens的粗酶液，通过调整该粗酶液含量及反应时间，可以将新橙皮苷或橙皮苷直接转化为橙皮素，转化液通过有机溶剂溶解或萃取，色谱分离纯化得到橙皮素。本方法能够克服传统化学方法制备橙皮素反应条件苛刻、污染严重、转化率低等缺点，以及直接采用微生物发酵造成的操作繁琐、产物不单一、产物纯化困难等不足之处。

Description

一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法。

背景技术

传统药用资源橘皮，又称为陈皮，具有祛痰、平喘，降血压，抗菌，抗炎，抗氧化等药理作用。橘皮中除了含有精油以外，还含有大量的黄酮类化合物，研究表明，橘皮中的黄酮类化合物是其发挥抗炎、抗氧化等药理活性的主要相关因素。橘皮中黄酮类化合物成分复杂，目前已经从橘皮中分离到了60多种黄酮类化合物，其中比较常见的有橘皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川皮素、柚皮苷、柚皮芸香甘等。

新橙皮苷和橙皮苷因其含量高，药理活性突出等优点，来源广泛，在当前的研究中得到了更普遍的关注。其药理活性包括抗肝癌细胞扩增、抑制小鼠因感染引起的内毒素休克、抗过敏、抗雌激素、保护神经系统、抗氧化、自由基清除以及潜在的胃肠道保护作用等等。但有研究证实新橙皮苷或橙皮苷会被肠道菌的水解代谢，释放出其苷元橙皮素，而橙皮素具有更广泛的药理活性，其抗炎活性要高于糖苷本身，因此两者口服后发挥药效的基础可能是橙皮素。如何通过含量较高糖苷水解制备含量较低的苷元，以阐明其发挥活性作用的物质基础，或将低价值的成分转为高价值的成分，在食品和药学领域都成为橘皮资源研究的热门。

目前水解转化糖苷类化合物常用的方法有化学法和生物法。在新橙皮苷或橙皮苷的研究中，多采用酸水解法，如美国专利US4150038中利用浓硫酸等在低碳醇的作用下水解橙皮苷产生橙皮素。此外还有很多文献报道生成橙皮素的方法，如水相法、水相-乙醇法、甲醇法、环己醇法等，但这些方法都会涉及到工艺繁琐、污染严重、产物纯化困难等其中部分缺点。

利用微生物发酵法进行生物转化也是一种常见的方法。Zhang Wei等利用Clostridium sp.8,Bacteroides sp.15,Bacillus sp.46,Enterobacter sp.41-1和sp.73等五株肠道菌的发酵液催化新橙皮苷转化，得到水解产物、脱羟基、脱甲基以及乙酰化产物。尽管微生物发酵法反应条件温和、反应效率高、环境污染小，但反应产物种类多样、成分复杂，不仅影响收率，对于纯化分离也造成了更大的困难。

酶促水解反应也是一种生物转化的常用手段，糖苷酶可以选择性的识别不同种类或不同构型的糖苷键，以定向地水解相应的糖苷键。其主要特点为转化效率高、反应专一性强、条件温和易实现，排除了后期繁琐的分离过程。因此通过寻找经济高效、专一稳定的工具酶来定向地进行生物转化，获得所需要的目标化合物也逐渐成为现代研究的重要突破点。尽管一步水解制备橙皮素的实例较为缺乏，但通过筛选合适的工具酶和反应条件，获得更高含量、高活性的苷元仍是值得去探索的领域。

发明内容

本发明提供了一种通过酶法水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法。

一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，按照以下步骤进行：

1)采用Penicillium decumbens(斜卧青霉)发酵产生的高α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的粗酶液，在缓冲液中选择性的水解新橙皮苷或橙皮苷，使其转化为橙皮素，具体方法为，取20-50mg的新橙皮苷或橙皮苷置于反应釜中，按照10：1：0.1的体积比依次加入缓冲液、粗酶液和激活剂后共同孵育；

2)橙皮素的制备：待反应结束后，将上述转化液与等倍体积的甲醇混合，离心后取上清，于40-50℃减压浓缩后溶于0.5倍体积的甲醇，过制备型色谱柱即得到橙皮素。

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、或柠檬酸缓冲液；

所述的激活剂为：CaCl₂溶液。

所述步骤1)中:反应体系中激活剂浓度为5-20mM，缓冲液的pH值为5.5-7.0，水解反应温度为20-40℃，反应时间为0.5-4h，离心条件为4℃下20000g离心20min。

所述步骤2)中处理沉淀的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。

上述粗酶液处理新橙皮苷或橙皮苷后，使得二糖苷一步转化为苷元，转化率达到98％以上。

本发明提供了一种利用工具酶高效高选择性转化新橙皮苷或橙皮苷，制备更高应用价值的代谢产物的方法，转化率可达到98％以上，最终收率可达95％。与其他方法相比，该方法转化效率高、反应专一性强、条件温和易实现，产物纯度高，缩减了后期繁琐的分离过程。

附图说明

图1为酶解新橙皮苷制备橙皮素的液相转化图，反应时间为4h，新橙皮苷完全转化。

图2为酶解橙皮苷制备橙皮素的液相转化图，反应时间为4h，橙皮苷完全转化。

具体实施方式

本发明通过下列实施例对本发明技术内容予以进一步阐明，其目的仅仅为了更好理解本发明，而不是限制本发明权利要求的保护范围。实施例需要体现权利要求中范围的上限、下限和中间值，至少还需要添加一个实施例。将权利要求中的激活剂等具体物质代入实施例中。

实施例1

粗酶液的制备

使用含有3％的麦麸提取物，0.2％酵母提取物，1％葡萄糖，0.5％的KH2PO4，0.2％的(NH4)2SO4作为种子培养基，将上述种子培养基50ml分配到100ml锥形瓶中，在120℃灭菌15min，将Penicillium decumbens的琼脂平板培养物接种到其中，并在30℃培养2天作为种子液。

500ml Erlenmeyer培养瓶中放入100ml含5％玉米浆，0.2％酵母提取物，0.2％的KH2PO4，1％柚皮苷的培养基，PH4.5，高压灭菌121度30min。将1ml种子液接种于此培养基，150rpm，25℃摇床培养5天。离心收集上清液，即为粗酶液。

实施例2

取100ml三角瓶依次加入20ml磷酸缓冲液(pH6.0)，3.5ml粗酶液，250ul浓度为20mM的激活剂，600ul浓度为80mM的新橙皮苷溶液，封闭瓶口后，于37℃下200rpm旋转式摇床反应4h，每隔1h取样进行HPLC分析(检测波长283nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，梯度为，0-10min，25％-50％B；10.0-12.0min，50％-90％B；12.0-16.0min，90％-90％B，流速1ml/min)，新橙皮苷0.5h转化率大于98％，反应4h后完全转化。制备出的产品为橙皮素.如图1所示，由图1可以看出该粗酶液对新橙皮苷具有极高的转化率。

实施例3

取100ml三角瓶依次加入20ml磷酸缓冲液(pH6.0)，3.5ml浓度为100mg/ml的酶溶液，250ul浓度为20mM的激活剂，600ul浓度为80mM的橙皮苷溶液，封闭瓶口后，于37℃下200rpm旋转式摇床反应4h，每隔1h取样进行HPLC分析(检测波长283nm，流动相为：乙腈(B)/纯水(A)，梯度为，0-10min，25％-50％B；10.0-12.0min，50％-90％B；12.0-16.0min，90％-90％B，流速1ml/min)，橙皮苷0.5h转化率大于98％，反应4h后完全转化。制备出的产品为橙皮素.如图2所示，由图2可以看出该粗酶液在转化橙皮苷制备橙皮素方面具有很显著的优势。

Claims (5)

1.一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，其特征在于按照以下步骤进行：

1)采用Penicillium decumbens即斜卧青霉发酵产生的高α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的粗酶液，在缓冲液中选择性的水解新橙皮苷或橙皮苷，使其转化为橙皮素，具体方法为:取20-50mg的新橙皮苷或橙皮苷置于反应釜中，按照10：1：0.1的体积比依次加入缓冲液、粗酶液和激活剂后共同孵育；

2)橙皮素的制备：待反应结束后，将上述转化液与等倍体积的甲醇混合，离心后取上清，于50℃减压浓缩后溶于0.5倍体积的甲醇，过制备型色谱柱即得到橙皮素。

2.如权利要求1所述的一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、或柠檬酸缓冲液；所述的激活剂为CaCl2溶液。

3.如权利要求1所述的一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，其特征在于步骤1)中:反应体系中激活剂浓度为5-20mM，缓冲液的pH值为5.5-7.0，水解反应温度为20-40℃，反应时间为0.5-4h，离心条件为4℃下20000g离心20min。

4.如权利要求1所述的一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，其特征在于：所述步骤2)中处理沉淀的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。

5.如权利要求1所述的一种通过酶促水解新橙皮苷或橙皮苷制备橙皮素的方法，其特征在于：上述混粗酶液处理新橙皮苷或橙皮苷后，使得二糖苷一步转化为苷元，转化率达到98％以上。