CN106008301B - 26‑甲基‑25‑羟基维生素d3化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为1.26‑甲基‑25‑羟基维生素D3化合物，提供一种对乳腺癌细胞（MDA‑MB‑435）、肝癌细胞(HepG2)均表现出较好的抗癌活性，可应用于制备抗癌药物的新化合物，其结构式如式（I）所示：
Description
技术领域：
本发明涉及一种假诺卡氏菌来源的26-甲基-25-羟基维生素D3化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症是严重威胁人类生命的常见病和多发病。研发高效和特异性强的新型抗癌药物是抗肿瘤药物研究的热点。近年来，研究发现活性维生素D3类药物及其类似物还具有调控靶细胞、诱导细胞分化及抑制细胞增殖等作用机制而发挥药效活性，使其在重大疾病如恶性肿瘤、免疫疾病、银屑病等疾病的治疗上表现出巨大潜力，已成国内外研究的热点药物。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种微生物来源的26-甲基-25-羟基维生素D3化合物。所述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物是从假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophicaSIIA243或者假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243的发酵液中分离得到的，该化合物对乳腺癌细胞（MDA-MB-435）、肝癌细胞(HepG2)均表现出较好的抗癌活性，可应用于制备抗癌药物。
本发明的另一个目的是提供上述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种26-甲基-25-羟基维生素D3化合物，其结构式如式（I）所示：
（I）
本发明所述假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏日期是2013年7月17日，保藏号是CGMCCNo.7935。该菌株是由从广州白云山的土壤样品中分离筛选得到的能够将维生素D3转化为骨化二醇的原始菌株假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243诱变处理后得到的，参见专利CN103898004A。使用假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophicaSIIA2243菌株和假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243都能够制备得到26-甲基-25-羟基维生素D3化合物。
上述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243或者假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
（2）将种子培养液接入发酵培养基中，摇床培养，向发酵液中补入维生素D3，继续发酵得发酵液；
（3）将步骤(2)的发酵液，用有机溶剂进行萃取，浓缩，制备柱分离后得到式（I）化合物。
步骤（1）所述种子培养基的组分为：蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0。步骤（1）所述摇床培养是摇瓶转速100～300r/min，温度20～35℃，培养2～5天，得摇瓶种子液。
步骤（2）所述发酵培养基的组分为：蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0。步骤（2）所述种子液培养的时间为1～4天，培养的温度为 20～35℃，摇瓶转速100～300r/min，补入维生素D3，继续发酵1～10天。
步骤（3）所述有机溶剂为乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩后获得的浓缩液利用柱直径为20mm～100mm高压制备液相层析系统进行分离，获得26-甲基-25-羟基维生素D3组分，即得式（I）化合物。
本发明分离得到的26-甲基-25-羟基维生素D3化合物具有抑制癌细胞增殖的作用，因此可用于制备抗癌药物。
所述抗癌包括抗乳腺癌、抗肝癌。
本发明具有如下有益效果：
本发明的26-甲基-25-羟基维生素D3化合物是从通过假诺卡氏菌发酵方式制备得到，原材料价格低廉且易得，分离过程简单，所以26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备成本低；所述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物具有抑制癌细胞增殖的作用，该化合物对乳腺癌细胞（MDA-MB-435）、肝癌细胞(HepG2)均表现出较好的抗癌活性，可应用于制备抗癌药物，应用前景广阔。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243发酵制备26-甲基-25-羟基维生素D3化合物为了便于理解本发明，下面将结合实施例来进一步详细描述本发明。除非另有特指，本实施例中的灭菌条件为121℃，30分钟。%为质量百分比。
1，培养基：
种子培养基：蛋白胨1.5%，玉米浆1.5%，葡萄糖1.5%，黄豆粉0.4%，氯化钠0. 5%，磷酸二氢钾0.2%，其余为水，pH7.5。
发酵培养基：蛋白胨1.5%，玉米浆1.5%，葡萄糖1.5%，黄豆粉0.4%，氯化钠0. 5%，磷酸二氢钾0.2%，其余为水，pH7.5,
2，发酵制备26-甲基-25-羟基维生素D3
制种：SIIA2243斜面菌株挖块到装有100ml种子培养基的500ml三角烧瓶中，摇瓶转速280r/min，温度29℃，培养3天，总共制得500ml种子液。
发酵：取20ml种子液在无菌条件下移入装有200ml发酵培养基的750 ml三角烧瓶中，共接种25瓶，摇瓶转速280r/min，温度29℃，培养3天，向每瓶发酵液中补入溶解有200mg维生素D3的溶液10ml，继续发酵5天后终止发酵。
提取精制：终止发酵后，往约5000ml发酵液中加入5000ml乙酸乙酯，搅拌2hr，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液，将乙酸乙酯萃取液移入浓缩瓶中进行减压浓缩，所回收的有机溶剂乙酸乙酯又进行二次萃取，而减压浓缩后获得的浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，色谱条件：色谱柱 DAC C18柱（50 mm×250 mm，10 µm）；流动相乙腈∶水（85∶15）；流速 40 ml/min；检测波长 265 nm；进样量 10 ml。收集目标组分，减压浓缩至干后，获得26-甲基-25-羟基维生素D3化合物组分，即得式（I）化合物30mg。
对其进行质谱及核磁共振分析检测。
化合物结构分析测试的数据如下：
ESI-MS m/z 415.29[M]+;1HNMR(500MHz,CDCl3) δ 2.38(ddd, J=5.1、10.5、14.2Hz,
1H),2.15(dq, J=4.8、13.9 Hz, 1H), 1.31~1.33(m, 1H), 1.90~1.94(m,1H),3.90(ddq,J=4.0、9.4、13.5 Hz, 1H),2.56(dd, J=4.2、12.9 Hz, 1H),2.27(dd, J=9.5、12.6 Hz, 1H),6.21(d, J=11.7 Hz, 1H),5.95(d, J=10.9 Hz, 1H),2.79~2.83(m, 1H),1.64 ~1.68(m,1H),1.35~1.37(m, 1H), 1.26~1.30(m,1H),1.25~1.29(m, 1H),1.96~1.98(m,1H),
1.22~1.26(m, 1H),1.63~1.65(m, 1H), 1.50~1.52(m,1H),1.26~1.30(m, 1H),1.83~1.85
(m,1H),1.94~1.98(m, 1H),0.52(s, 3H),4.78(s, 1H), 5.01(s, 1H),1.36~1.40(m, 1H),
0.90(d, J=7.0 Hz, 3H),1.23~1.27(m, 1H), 1.22~1.26(m,1H),1.17~1.21(m,1H), 1.46~1.50(m,1H),1.01~1.05(m, 2H),1.65(q, J=5.0 Hz,2H),1.12(t, J=6.5、6.0Hz,3H),1.42(s, 3H); 13CNMR(125MHz,CDCl3)δ32.0(CH2),35.1 (CH2),69.2 (CH),
45.9 (CH2),135.0( C),122.3( CH),117.5(CH),142.1( C),29.0(CH2),145.0(C),23.6 (CH2), 40.5(CH2), 45.8(C),56.4 (CH),22.2 (CH2),27.7 (CH2),56.3 (CH),12.0 (CH3),112.4( CH2)36.0( CH),19.0 (CH3),29.6 (CH2),23.5(CH2),35.6 (CH2)77.3(C),34.6 (CH2) ,17.3 (CH3),30.3 (CH3)。
C-3位立体构型的确定: (1)根据C-3位氢的耦合常数进行的判断，参考的是甾体类三萜苷元C-3位羟基构型确定的方法。(2) 目标物1的旋光度（α）为：+ 0.401o,测定条件：20℃，浓度C 0.5g/100ml ; 测定方法：参照中国药典维生素D3 旋光度的测定方法。同样条件下测定25-羟基维生素D3的旋光度（α）为+ 0.422o ，说明目标物1同25-羟基维生素D3的立体构型一致，均为右旋体。
基于以上数据分析，最终确证该目标物为(5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-(26-甲基)-3β,25-二醇，即26-甲基-25-羟基维生素D3，结构式如式（I）所示：
（I）
实施例2：
假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243发酵制备26-甲基-25-羟基维生素D3化合物。
详细操作参见实施例1，最终获得26-甲基-25-羟基维生素D3化合物组分，即得式（I）化合物26mg。
实施例3：
采用MTT法测试26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的抗癌活性。
MTT：3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种染料。
取对数生长期的乳腺癌细胞（MDA-MB-435）、肝癌细胞(HepG2)分别接种于96孔板，用DMEM培养基将细胞稀释至1×104个/ml，每孔加入200μL已经稀释的细胞，每组设定五个平行孔，另设空白孔（未接种细胞的孔）和对照孔（接种细胞但不含药物的DMEM培养基孔），37 ℃，5%CO2条件下培养24小时。
将26-甲基-25-羟基维生素D3配制为终浓度为0, 0.1, 0.5, 1. 0, 5. 0, 10,20, 30, 40, 50μmol/L的溶液，将已经培养了24小时的96孔板取出，小心吸去培养基，往每孔加入不同浓度的26-甲基-25-羟基维生素D3溶液200μL，继续培养48小时，
取MTT 50 mg溶解在25ml 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，每孔加入2mg/ml的MTT 20μL，孵育4小时，尽量吸出孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150μL，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪于570nm波长下测定各孔OD值；以吸光度值对药物浓度对数作图，求出IC50值，结果用平均值±标准偏差表示。
结果显示26-甲基-25-羟基维生素D3对乳腺癌细胞（MDA-MB-435）、肝癌细胞(HepG2)肿瘤细胞的IC50 (μg/mL)分别为14.34±1.89和16.29±1.96，这表明26-甲基-25-羟基维生素D3具有明显的抗乳腺癌和抗肝癌作用。
Claims (6)
1.26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法，其特征在于，该化合物的结构式（Ⅰ）如下所示：
其制备方法包括如下步骤：
（1）将假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
（2）将种子培养液接入发酵培养基中，摇床培养，向发酵液中补入维生素D3，继续发酵得发酵液；
（3）将步骤(2)的发酵液，用有机溶剂进行萃取，浓缩，制备柱分离后得到式（I）化合物；
所述假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏日期是2013年7月17日，保藏号是CGMCCNo.7935。
2.根据权利要求1所述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述种子培养基的组分为：蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0。
3.根据权利要求1所述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述摇床培养是摇瓶转速100～300r/min，温度20～35℃，培养2～5天，得摇瓶种子液。
4.根据权利要求1所述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述发酵培养基的组分为：蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0。
5.根据权利要求1所述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述种子液培养的时间为1～4天，培养的温度为 20～35℃，摇瓶转速100～300r/min，补入维生素D3，继续发酵1～10天。
6.根据权利要求1所述26-甲基-25-羟基维生素D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述有机溶剂为乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩后获得的浓缩液利用柱直径为20mm～100mm高压制备液相层析系统进行分离，获得26-甲基-25-羟基维生素D3组分，即得结构式（I）的化合物。
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