CN104370916B - 源于米曲霉的吲哚萜speradine B及应用 - Google Patents

源于米曲霉的吲哚萜speradine B及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种源于米曲霉的吲哚萜speradine B及应用。该化合物具有抑制肿瘤细胞增殖作用，具有抗肿瘤活性。其结构式为：。通过发酵培养米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT‑1，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。经实验证实，该化合物对人宫颈癌细胞系hela具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于抗肿瘤的研究。

Description

源于米曲霉的吲哚萜speradine B及应用
技术领域
本发明涉及一种源于米曲霉的吲哚萜speradine B及应用。
背景技术
吲哚萜是从真菌和细菌的次生代谢产物中分离得到的一类具有独特生物活性的化合物，具有抑制钾离子通道的活性，抗肿瘤活性，选择性强效孕酮受体竞争活性和抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的活性。Cyclopiazonic酸（CPA）类生物碱是吲哚萜化合物的一个重要分支，它们通常包含三个结构单元：一个吲哚环，一个半萜和两个乙酸支链。迄今为止，只有6个类似天然产品被发现。
本发明人研究得知，米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1，(已于2011年12月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M2011437) 的发酵产物的粗提取物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示生物碱类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物对hela细胞的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种源于米曲霉的吲哚萜speradine B及应用。该化合物具有抑制肿瘤细胞增殖作用，具有抗肿瘤活性。其结构式为：
。
该化合物的制备方法，是通过发酵培养米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。具体步骤如下：
按培养微生物的常规方法，取米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1接种到PDA固体斜面培养基上，在28℃培养箱中培养4天，然后接种到培养液中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液；所述培养液组成：每升海水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0 g、麦芽糖20.0g、味精10.0 g、葡萄糖10.0 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.3 g。
（2）浸膏的获得
将米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1的发酵培养液，经纱布过滤分为发酵液和菌丝体。发酵液部分按体积比1:2加入乙酸乙酯，经两次萃取后，得发酵液乙酸乙酯提取液。菌丝体则以丙酮溶液超声破壁3次，滤去残渣后将清液合并，减压浓缩去除丙酮后，按体积比为1:2加入乙酸乙酯萃取两次，得菌体乙酸乙酯提取液。将发酵液乙酸乙酯提取液和菌体乙酸乙酯提取液合并，减压蒸馏至干，得到提取物总浸膏。
（3）化合物的分离精制
提取物总浸膏通过100～200目硅胶拌样后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度组分为洗脱液，通过300-400目硅胶进行减压硅胶色谱柱层析，分离成Fr. A, Fr. B, Fr. C, Fr.D, Fr.E共5个组分，其中Fr. A, Fr. C是两个主要组分。Fr. C组分（二氯甲烷：甲醇 50:1洗出物）以三氯甲烷、甲醇（1：2）为洗脱剂，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到Fr.C-1和Fr.C-2 二个组分。Fr. C-1组分（先洗脱出来的组分）再次通过300-400目硅胶柱进行加压柱层析，以二氯甲烷：甲醇为洗脱液梯度洗脱，分离得到四个组分：Fr. C-1-1、Fr. C-1-2、Fr. C-1-3和Fr. C-1-4，其中，Fr. C-1-1（二氯甲烷洗出物）通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250 mm，5μm)：分离流速为5 mL/min，流动相为45%MeOH，分离得到化合物2.9 mg (19.7 min)。
所述米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1，已于2011年12月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M 2011437。
本发明还保护了所述的化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制药物中的用途，及该化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。所述肿瘤细胞为hela细胞。
本发明的显著优点：研究所示该吲哚萜化合物较为罕见，所述生物碱类化合物具有显著的抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物对hela细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
附图说明
图1为speradine B主要的COSY，HMBC和NOESY信号。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：
。
实施例1该化合物的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1(已于2011年12月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号是：CCTCC NO：M 2011437)。适量，接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1适量，接种到装有400mL培养液 [ 培养液组成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麦芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.3，海水定容 ] 的1000mL锥形瓶中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液。
2 浸膏的获得
将米曲霉（Aspergillus oryzae）IBPT-1的发酵培养液，经纱布过滤分为发酵液和菌丝体。发酵液部分按体积比1:2加入乙酸乙酯，经两次萃取后，得发酵液乙酸乙酯提取液。菌丝体则以丙酮溶液超声破壁3次，滤去残渣后将清液合并，减压浓缩去除丙酮后，按体积比为1:2加入乙酸乙酯萃取两次，得菌体乙酸乙酯提取液。将发酵液乙酸乙酯提取液和菌体乙酸乙酯提取液合并，减压蒸馏至干，得到提取物总浸膏。
3 化合物的分离精制
提取物总浸膏通过100～200目硅胶拌样后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度组分为洗脱液，通过300-400目硅胶进行减压硅胶色谱柱层析，分离成Fr. A, Fr. B, Fr. C, Fr.D, Fr.E共5个组分，其中Fr. A, Fr. C是两个主要组分。Fr. C组分（二氯甲烷：甲醇 50:1洗出物）以三氯甲烷、甲醇（1：2）为洗脱剂，采用Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，得到Fr.C-1和Fr.C-2 二个组分。Fr. C-1组分（先洗脱出来的组分）再次通过300-400目硅胶柱进行加压柱层析，以二氯甲烷：甲醇为洗脱液梯度洗脱，分离得到四个组分：Fr. C-1-1、Fr. C-1-2、Fr. C-1-3和Fr. C-1-4，其中，Fr. C-1-1（二氯甲烷洗出物）通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250 mm，5μm)：分离流速为5 mL/min，流动相为45%MeOH，分离得到化合物2.9 mg (19.7 min)。
化合物 淡黄色油状物，高分辨质谱HR-ESI-MS在m/z: 287. 1396处给出分子离子峰[M + H]+， (Calcd for C16H19N2O3, 287.1390)，提示分子量为286，结合波谱信息推测分子式为C16H18N2O3。 1H和13C-NMR数据见表1，主要的COSY，HMBC和NOESY信号见图1。
表1 NMR化合物的1H和13C-NMR数据(500MHz 1H and 125MHz 13C ，in CDCl3)a)
实施例2 体外抗肿瘤活性的测试
1 实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制 测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用肿瘤细胞系，肿瘤细胞用含10% FBS的DMEM培养基，在37℃于通入5% 二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法
丽丝胺罗丹明B（SRB）法 取对数生长期的hela细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，于37℃下培养24小时。取在药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞坏死的形态学特征，继而在4℃、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清液。每孔细胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4% SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1%醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris换成（100mmol/L，pH 10.5）溶解蛋白结合染料并利用酶标仪测定每孔在520nm处的光密度（OD）值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零）。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR (%) = (OD空白对照-OD样品)/OD空白对照 × 100%式计算每个浓度下的样品对细胞增殖抑制率 (IR%)。根据不同浓度的抑制率计算，得出IC50值。
2. 实验结果
细胞增殖抑制活性测试结果
在SRB法测试中，根据不同浓度的该化合物的肿瘤细胞增殖抑制率，应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算半数抑制浓度IC50值。结果见表2。
表2 化合物对人肿瘤细胞增殖的抑制活性
3. 结论
化合物对肿瘤细胞hela具有较强的增殖抑制作用，可作为制备hela细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。

Claims (4)

1.化合物。
2.权利要求 1 所述的化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制药物中的用途。
3.权利要求 1 所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
4.根据权利要求 2 所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤细胞为hela细胞。
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