CN102391969B - 梭菌auh-jlc140及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种梭菌及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用。梭菌（Clostridiumsp.）AUH-JLC140，保藏号为CGMCC No.5305。梭菌AUH-JLC140应用于生物合成去氧甲基安哥拉紫檀素，包括下述步骤：将菌株AUH-JLC140的种子液按10-15%接种量转接到BHI液体培养基中培养，加入黄豆苷原母液，在厌氧工作站内培养3-4天；用乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备代谢产物。本发明解决了O-Dma的生物合成及其资源匮乏问题，对O-Dma药理活性及新药研发具有极大的推动作用。

Description

梭菌AUH-JLC140及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用

技术领域

本发明涉及一种菌株及其应用，尤其是一种梭菌AUH-JLC140及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用。

背景技术

大豆异黄酮（soy isoflavones）是大豆等少数豆科植物在其生长过程中形成的一类次生代谢产物，迄今已从大豆中分离了12种异黄酮成分，包括游离型苷元（aglycone）和结合型糖苷（glucosides）两大类，天然大豆中95%以上的异黄酮为结合型糖苷，共9种；另外3种为大豆异黄酮苷元，包括黄豆苷原（daidzein）、染料木素（genistein）和黄豆黄素（glycitein），其中黄豆苷原和染料木素占大豆异黄酮总苷元的95%以上，为大豆异黄酮苷元的主要成分。1986年美国科学家首先发现大豆中的异黄酮具有抑制癌细胞生长的功效。大量流行病学研究证实，大豆异黄酮具有植物雌激素作用，能明显降低与性激素相关癌症，如乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等的发病率、预防骨质疏松、有效缓解妇女更年期综合症。此外，大豆异黄酮还能降低心脑血管发病率及抗氧化、抗溶血、抗真菌等生物学功能。

动物实验表明，大部分以结合型糖苷存在的异黄酮在胃肠道微生物菌群作用下被水解，脱去糖基转变为游离型苷元才被胃肠粘膜直接吸收，被吸收的染料木素和黄豆苷原再进一步被细菌代谢为各种不同产物。与染料木素相比，黄豆苷原在人体内的代谢研究较为详尽，迄今已从人体尿液和血液中检测到的黄豆苷原的代谢产物包括：二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD）、四氢黄豆苷原（tetrahydrodaidzein，简称THD）、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin 简称O-Dma）和雌马酚（equol）等，有关黄豆苷原在人体内的代谢途径如下所示。

大豆异黄酮对人体的有益调节作用很大程度上取决于吸收到机体内的异黄酮将面临怎样的代谢，尤其取决于代谢产物中有无雌马酚生成及含量高低。目前，在已分离的所有大豆异黄酮代谢产物中雌马酚被认为是生理活性最高的成分。研究表明，雌马酚除与人体雌激素受体ER具有较高的亲和力外，还具有极强的抗氧化、抗肿瘤、缓解更年期综合症、预防骨质疏松和降低心脑血管发病率等功效。然而，大量流行病学研究表明，人群中只有大约30-50%的个体，其肠道微生物菌群能将摄入体内的黄豆苷原转化为雌马酚,而80-90%的个体则是将摄入体内的黄豆苷原转化为O-Dma。因此，O-Dma对人体的有益调节作用更是不容忽视。然而，由于O-Dma目前在国内外市场尚无销售，因而，与雌马酚相比有关O-Dma生理活性方面研究报道仍十分有限，但已有研究结果表明，O-Dma具有比其亲本化合物黄豆苷原更高更广的生理活性，使O-Dma显示出诱人的药物研发价值。

2005年美国著名营养学家JW Lampe 等曾指出，相同浓度下黄豆苷原代谢产物O-Dma所具有的生理活性在某些方面可能与雌马酚相当，甚至可能会超过雌马酚，雌马酚和O-Dma这两种代谢产物很可能在不同方面各自发挥着重要生理功能。体外研究结果已证实，O-Dma不仅与人体雌激素受体ER_a和ER_b的亲和力明显高于其前体黄豆苷原，而且与ER_a结合后在诱导基因转录上O-Dma也强于黄豆苷原。此外，当浓度高于10mM时，O-Dma能明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长（Kinjo J etal,Biol Pharm Bull 2004）。2008年日本学者比较了O-Dma与雌马酚在体内外对切除子宫小鼠的骨密度及脂类代谢的影响，发现O-Dma与雌马酚一样，均能促进脂类物质的正常代谢，但在体外破骨细胞生长方面，O-Dma则只表现轻微抑制作用（Ohtomo T etal, Eur J Nutr 2008）。我们通过对比黄豆苷原和O-Dma对二苯代苦味酰基自由基（DPPH）的体外清除作用时发现，较低浓度（0.33-1.33毫摩尔/升）下，O-Dma和黄豆苷原对DPPH自由基的清除作用无显著差异；但当浓度升高到3.33毫摩尔/升时，O-Dma对DPPH自由基的体外清除作用极显著高于其亲本化合物黄豆苷原（XL Liang etal, J Agric Food Chem 2010）。

早在1998年就曾对O-Dma进行过化学合成报道（Wähälä etal, Proc Soc Exp Biol Med 1998），但由于反应过程中副产物多，且反应所需化学催化剂价格昂贵，目前国内外尚无公司销售化学合成或生物合成的O-Dma。通过微生物发酵合成O-Dma可解决目前O-Dma资源匮乏问题。另外，O-Dma本身为手性化合物，有R-和S-两种对映异构体。此前，曾经分别从人和褐马鸡粪便中分离得到能将黄豆苷原开环转化为O-Dma的细菌菌株各一株，其中从人肠道分离的真细菌属菌株Eubacteriumramulus Julong601将黄豆苷原转化生成的O-Dma在手性高效液相色谱条件下有两个峰出现，其中后面峰（O-Dma2）的峰面积远大于前面峰（O-Dma1）。通过计算，由菌株Julong601代谢黄豆苷原产生的O-Dma 的对映体过量率（e.e.%）为90%，即生成的O-Dma中有5%左右为O-Dma1，有95%左右为O-Dma2（Wang XL etal J.Microbol.Biotechnol.2004）。然而，菌株Julong601在转化速度上比较迟缓（约一周），在实际应用中有一定缺陷性。除了菌株Julong601，还从褐马鸡肠道中分离了一株海氏肠球菌Enterococcus hirae AUH-HM195，该菌株也同样能将黄豆苷原转化为O-Dma,且同样需要较长的转化时间（约一周）。此外，与人肠道分离菌株Julong601相比，褐马鸡肠道分离菌株AUH-HM195产生的相关转化酶对底物的立体选择性更差些，由菌株AUH-HM195代谢黄豆苷原产生的O-Dma 的对映体过量率（e.e.%）为67%，即生成的O-Dma中有大约16.5%为O-Dma1，有83.5%为O-Dma2（于飞等，微生物学报，2010）。

发明内容

本发明提供一种梭菌AUH-JLC140及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用，梭菌AUH-JLC140在厌氧条件下能将底物黄豆苷原高效转化为去氧甲基安哥拉紫檀素（O-Dma），O-Dma比现有技术底物黄豆苷原具有更高更广的生理活性，解决了去氧甲基安哥拉紫檀素（O-Dma）的微生物生物合成问题及其资源匮乏问题，对新药研发具有极大的推动作用。

本发明所采取的技术方案是：

一种梭菌（Clostridium sp.）AUH-JLC140，保藏号为CGMCC No.5305。

梭菌Clostridium sp.AUH-JLC140（JN874874）是从公鸡新鲜粪样中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将大豆异黄酮黄豆苷原高效转化为O-Dma。为书写方便，这里将菌株Clostridium sp.AUH-JLC140简称JLC140，以下均使用该转化菌株的简称形式，菌株JLC140与菌株Clostridium sp.AUH-JLC140为同一菌株。

本发明中的梭菌Clostridium sp.AUH-JLC140菌株（简称JLC140）已于2011年9月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.5305。该保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述梭菌AUH-JLC140的分类学特征为：

菌落直径2.5~4.5 毫米，菌落中央稍黄白有凸起，外围透明，菌落边缘整齐，在BHI培养基中菌体为短杆或中短杆状，该菌株革兰氏染色呈阳性。

与上述O-Dma产生菌株Julong601和 AUH-HM195相比，从鸡肠道分离的梭菌属菌株AUH-JLC140转化黄豆苷原为O-Dma的速度有所加快，如果按10%接种量接种大约需4天。此外，菌株AUH-JLC140产生的转化酶具有极高的立体选择性，由菌株AUH-JLC140代谢黄豆苷原产生的O-Dma 的对映体过量率（e.e.%）为91.9%，即生成的O-Dma中只有4.05%为O-Dma1，其余95.95%则全部为O-Dma2（附图3）。由于O-Dma化合物匮乏，目前国内外尚无有关O-Dma绝对立体构型或R-型O-Dma 及S-型O-Dma的旋光方向的报道，因而，通过手性高效液相色谱条件分出的O-Dma1和 O-Dma2目前尚无法断定究竟哪一个是R-型，哪一个是S-型。

本发明还提供了梭菌AUH-JLC140在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用，其特征在于用于合成去氧甲基安哥拉紫檀素O-Dma。

所述的应用，是在厌氧条件下将底物黄豆苷原转化合成去氧甲基安哥拉紫檀素（O-Dma），包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLC140的培养

将低温冷冻保存的梭菌AUH-JLC140融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37ºC下培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLC140重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；

（2）底物黄豆苷原与菌株AUH-JLC140共培养及代谢产物的分离纯化

①底物黄豆苷原与菌株AUH-JLC140共培养

将菌株AUH-JLC140的种子液按10-15%接种量转接到BHI液体培养基中培养，根据黄豆苷原母液浓度（40-60毫摩尔/升）及三角瓶中培养基体积，确定母液加入量，使得黄豆苷原在培养基中的浓度为0.6毫摩尔/升, 在厌氧工作站内培养3-4天；

②代谢产物的分离纯化

用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上分离制备去氧甲基安哥拉紫檀素。

其中，所述菌株AUH-JLC140的分离培养包括下述步骤：

（1）公鸡粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取新鲜粪样，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，并放置在37℃厌氧工作站内，以此作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；

（2）转化菌株的分离培养

①单一菌落式分离培养

将新鲜BHI液体培养基内的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10^{– 1}，10^{– 2}、10^{– 3}、10^{– 4}、10^{– 5}、10^{– 6}、10^{– 7}、10^{– 8}，再分别将100微升浓度分别为10^{– 5}、10^{– 6}、10^{– 7}、10^{– 8}的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养24-48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；

②单菌落的混合培养及转化活性测定

将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升黄豆苷原母液10微升，在厌氧工作站内培养3天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；

③特定功能微生物菌落的分离筛选

一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物黄豆苷原母液10微升，共同培养3天后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中能够开环转化底物黄豆苷原的单菌落。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

1. 本发明提供的鸡肠道梭菌JLC140能在厌氧条件下将底物黄豆苷原高效转化为O-Dma，O-Dma比底物黄豆苷原具有更高更广的生理活性。

2. 本发明的梭菌JLC140解决了O-Dma的生物合成及其资源匮乏问题，对O-Dma药理活性及新药研发具有极大的推动作用。

3. 本发明的梭菌JLC140转化底物黄豆苷原合成的O-Dma为手性化合物，其对映体过量率（e.e.%）高达91.9%,在目前已报道的具有相同功能的转化菌株中，对映体过量率为最高。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为实施例1中菌株JLC140转化底物黄豆苷原的高效液相色谱图；

图2为实施例1中菌株JLC140转化底物黄豆苷原的代谢产物的紫外吸收图谱；

图3 为实施例1中菌株JLC140转化底物黄豆苷原生成的O-Dma纯品在手性柱上的高效液相色谱图；

图4 为实施例1中菌株JLC140对底物黄豆苷原的转化动态曲线；

图5 为实施例1中菌株JLC140对不同浓度底物黄豆苷原转化能力比较。

具体实施方式

实施例1

1.菌株JLC140的分离培养

（1）公鸡粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取公鸡新鲜粪样，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，并放置在37℃厌氧工作站内，以此作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群。

（2）转化菌株的分离培养

①单一菌落式分离培养

用新鲜BHI液体培养基内的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10^{– 1}，10^{– 2}、10^{– 3}、10^{– 4}、10^{– 5}、10^{– 6}、10^{– 7}、10^{– 8}，再分别将100微升浓度分别为10^{– 5}、10^{– 6}、10^{– 7}、10^{– 8}的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号。

②单菌落的混合培养及转化活性测定

将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升黄豆苷原母液10微升，在厌氧工作站内培养3天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成。

③特定功能微生物菌落的分离筛选

一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物黄豆苷原母液10微升，共同培养3天后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中能够开环转化底物黄豆苷原的单菌落。

2.菌株JLC140的纯化培养、菌种鉴定

（1）单菌落的纯化培养

将筛选出的具有转化功能的菌落或菌苔在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液150微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的50％甘油水溶液的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-70ºC的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。

（2）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定

以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F:

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，菌株JLC140与菌株Clostridiumorbiscindens （包括strain LNB 203，strain LNB 208，strain NML 070830，strain AIP 028.07等）亲缘关系最近，其16S rDNA序列相似性均为96%。因而，将该功能菌株初步鉴定为梭菌属菌株，并将该功能菌株命名为AUH-JLC140。菌株AUH-JLC140的16S rDNA序列已上交美国NCBI核苷酸库，获得菌株JLC140的注册号（Accession Number）为 JN874874。

3.菌株JLC140在黄豆苷原转化中的应用

（1）菌株JLC140的培养

将–70ºC低温保存的鸡肠道分离菌株JLC140冻融后，按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37ºC下培养24小时后试管中菌液呈混浊。再以10%接种量将试管中已长混浊的菌株JLC140重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；

（2）底物黄豆苷原与菌株JLC140共培养

在超净台内将上述事先培养好的菌株JLC140的种子液按10-15%接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入40-60毫摩尔/升的黄豆苷原母液, 使得培养基中黄豆苷原浓度为0.6毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养3-4天，菌株JLC140可将底物黄豆苷原高效转化为O-Dma。

（3）用HPLC检测底物黄豆苷原被菌株JLC140的转化情况

取上述三角瓶中培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液。

（4）代谢产物的分离纯化与结构鉴定

经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集产物峰。将收集的产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其纯度，再分别测定代谢产物的紫外吸收图谱、核磁共振氢谱和碳谱。结果表明，经HPLC检测，在保留时间17.679分检测到一个产物峰，该产物峰保留时间与标准品O-Dma的完全一致（见附图1）；另外，经全波长扫描，该产物峰分别在278纳米和317纳米处有最大紫外吸收（见附图2），这与文献中报道的O-Dma的紫外吸收图谱相吻合。根据产物峰的HPLC保留时间和最大紫外吸收图谱即可将该产物鉴定为O-Dma。为确保产物结构的准确性，我们还对纯化后的产物的核磁共振氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）分别进行了测定。通过谱图解析并与文献报道中的O-Dma的核磁共振谱进行对比分析，发现该产物的¹H-NMR和¹³C-NMR与文献中报道的O-Dma 完全一致。因此，最终将该产物准确鉴定为O-Dma。代谢产物的¹H-NMR和¹³C-NMR结果如下：

¹H-NMR((CD₃)₂CO),400MHZ): 7.86(1H,d, J=9.0Hz, H-6′), 7.18(2H, d, J=8.5Hz, H-2′′,6′′), 6.76(2H,d, J=8.5Hz, H-3′′,5′′),6.32(1H,dd, J=9.0Hz,2.5Hz,H-5′),6.25(1H,d, J=2.5Hz,H-3′),4.73(1H,q, J=7.0Hz, H-2),1.38(3H,d, J=7.0Hz, 3-CH₃)。

¹³C-NMR((CD₃)₂CO),100MHZ): 165.8(C-4′), 165.1(C-2′), 156.9(C-4′′), 133.7(C-1′′), 133.4(C-6′), 128.9(C-2′′,6′′), 116.2(C-3′′,5′′), 112.7(C-1′), 108.3(C-5′), 103.2 (C-3′), 46.1 (C-2),19.5(C-3)。

（5）菌株代谢产物对映体过量率（e.e.%）检测

将3（4）中获得的O-Dma纯品重新溶解在100%甲醇中，在手性柱上检测出峰情况，并根据峰面积计算对映体过量率。本发明中产物O-Dma经手性柱后分别在26.0分和30.3分出现两个物质峰（见附图3），经计算本发明中合成的O-Dma的对映体过量率(e.e%)为91.9%。

（6）菌株JLC140对底物黄豆苷原的转化动态

为了解菌株JLC140转化底物黄豆苷原的速度，以便确定最佳转化时间，对菌株JLC140转化底物黄豆苷原的转化动态进行了测定，具体方法如下：

将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的黄豆苷原母液0.5 毫升，在厌氧工作站内分别培养12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时和144小时后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见附图4），由附图4可以看出，底物与菌株JLC140共同培养24小时后已经明显有底物生成，此时有大约10%底物被转化为O-Dma；共同培养48小时至72小时底物O-Dma 生成量急剧增加，培养72小时产物生成量有大约85%左右底物黄豆苷原被转化为O-Dma；共同培养96小时后产物O-Dma稍有上升，有93%左右底物被转化为O-Dma，但此后产物量基本稳定，以后随培养时间延长，产物量反而稍有下降。

4.菌株JLC140对不同浓度底物黄豆苷原最大转化能力测定

将菌株JLC140分别与不同浓度的黄豆苷原在厌氧工作站内共同培养4天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物黄豆苷原被转化情况。结果表明，菌株JLC140对浓度分别为0.2毫摩尔/升和0.4毫摩尔/升的黄豆苷原的转化能力相似，平均转化率分别为93.5%和94.8%；当浓度为0.6毫摩尔/升时，转化率稍有降低，平均转化率为91.2%；当所加入的底物浓度为0.8毫摩尔/升时，菌株JLC140对底物黄豆苷原转化能力急剧下降，平均转化率为70.9%（见附图5）。平均转化率的计算方法为：转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）。

实施例2

菌株JLC140的分离、培养方法同实施例1。

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株JLC140的种子液按10%接种量转接到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40毫摩尔/升的黄豆苷原母液1.5 毫升, 在厌氧工作站内培养3天。用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，得到O-Dma的转化率为91.8%。

实施例3

菌株JLC140的分离、培养方法同实施例1。

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株JLC140的种子液按15%接种量转接到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入60毫摩尔/升的黄豆苷原母液1.0 毫升, 在厌氧工作站内培养4天。用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，得到O-Dma的转化率为93.1%。

Claims (3)

1.一种梭菌（Clostridium sp.）AUH-JLC140，保藏号为CGMCC No.5305。

2.如权利要求1所述的梭菌AUH-JLC140在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用，其特征在于用于生物合成去氧甲基安哥拉紫檀素。

3.根据权利要求2所述的梭菌AUH-JLC140在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用，其特征在于在厌氧条件下能将底物黄豆苷原转化合成去氧甲基安哥拉紫檀素，其应用方法包括下述步骤：

（1）菌株AUH-JLC140的培养

将低温冷冻保存的梭菌AUH-JLC140融化并按15-20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37ºC下培养24小时；再以10%接种量将试管中的菌株AUH-JLC140重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；

（2）底物黄豆苷原与菌株AUH-JLC140共培养及代谢产物的分离纯化

①底物黄豆苷原与菌株AUH-JLC140共培养

将菌株AUH-JLC140的种子液按10-15%接种量转接到BHI液体培养基中培养，根据黄豆苷原母液浓度为40-60毫摩尔/升及三角瓶中培养基体积，确定母液加入量，使得黄豆苷原在培养基中的浓度为0.6毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养3-4天，即可将底物黄豆苷原高效转化为去氧甲基安哥拉紫檀素；

②代谢产物的分离纯化

用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上分离制备去氧甲基安哥拉紫檀素。

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