CN104673722B - 耐氧夏普氏菌及其在二氢大豆异黄酮有氧合成中的应用 - Google Patents

耐氧夏普氏菌及其在二氢大豆异黄酮有氧合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21，保藏号为CGMCC No.9976及其在二氢黄豆苷原和二氢染料木素有氧合成中的应用。属于微生物技术领域。应用包括以下步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21的培养；（2）底物黄豆苷原或染料木素与耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21共培养；（3）代谢产物的分离纯化。本发明耐氧夏普氏菌Aeroto‑AUH‑JLD21能够在有空气氧的条件下将黄豆苷原高效转化为二氢黄豆苷原，也能将染料木素高效转化为二氢染料木素，转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，能够实现二氢黄豆苷原和二氢染料木素在有空气氧条件下的高效生产。

Description

耐氧夏普氏菌及其在二氢大豆异黄酮有氧合成中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域。
背景技术
大豆异黄酮（soybean isoflavones）是大豆等豆科植物在其生长过程中形成的一类次生代谢产物，主要存在于大豆种子的子叶和胚轴中。目前从大豆中分离并得到结构鉴定的异黄酮共有12种，包括9种异黄酮葡萄糖苷和3种相应的糖苷配基（Wang et al 1994，JAgric Food Chem，42:1666-1673）,即黄豆苷原（daidzein）、染料木素（genistein）和黄豆黄素（glycitein），其中黄豆苷原和染料木素占大豆异黄酮总苷元的95% 以上，为大豆异黄酮苷元主要成分。大量流行病学研究证实，大豆异黄酮具有抗氧化、抗癌、降低心脑血管发病率、减少骨质流失以及缓解妇女更年期综合症等多种生理或药理功能。
被哺乳动物摄入体内的大豆异黄酮极少能直接被胃肠黏膜吸收，大部分在糖苷酶作用下从结合型糖苷变为游离型苷元，然后在肠道微生物菌群作用下被转化为各种不同代谢产物。其中大豆异黄酮黄豆苷原可被转化为二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD）、四氢黄豆苷原（tetrahydrodaidzein）、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin）和雌马酚（equol）等代谢产物（Joannou et al 1995，J Steroid Biochem Mol Biol，54:167-184）；染料木素被代谢为二氢染料木素（dihydrogenistein，简称DHG）、4-乙基苯酚(4′-propionicacid)和5-羟基-雌马酚（5-hydroxy-equol）等代谢产物（Coldham et al1999，J Steroid Biochem Mol Biol，70:168-184）。目前已知，由微生物代谢黄豆苷原产生的DHD是高活性植物雌激素雌马酚的生物合成前体。在以往研究中从人肠道菌群中分离了一株能将DHD转化为雌马酚的严格厌氧爱格氏菌属菌株Eggerthella sp. Julong732 ，该菌株不能将DHD前体黄豆苷原转化为雌马酚，但能将黄豆苷原代谢产物DHD转化为雌马酚(Wang et al 2005，Appl Environ Microbiol，71:214-219 )，这为DHD是合成雌马酚的前体提供了直接证据。同样地，DHG也是5-羟基-雌马酚合成的前体。专利文献CN103275884B公开了一株从鸡粪中分离的能将底物染料木素转化为5-羟基-雌马酚的厌氧史雷克氏菌Slackia sp. AUH-JLC159（又称斯奈克氏菌AUH-JLC159），该菌株也能将染料木素代谢产物DHG转化为5-羟基-雌马酚，表明DHG是5-羟基-雌马酚生物合成的前体。
DHD和DHG是大豆异黄酮被微生物代谢时必经的首步代谢产物，有关DHD和DHG生物学功能也有研究报道。如DHD被报道是保持血管活性的成分之一，由于它与17-β雌二醇的结构相似，从而能有效的抑制血管收缩，防止内皮组织受伤害（Beck et al 2005，J SteroidBiochem，94:499-518）。此外，Chin-Dusting 等2001年（Brit J Pharm，133:595-605）以及Jiang等2003年（J Vasc Res， 40:276-284）分别分析比较了黄豆苷原及包括黄豆苷原加氢产物DHD等不同代谢产物对心脑血管的保护作用，研究结果均表明DHD对心脑血管的保护作用远高于其亲本化合物黄豆苷原。此外，试验结果还表明，DHD和DHG与其亲本化合物黄豆苷原和染料木素相比，水溶性明显增加，一定浓度下（浓度不低于3.33毫摩尔/升）的DHD和DHG体外清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH）能力均显著高于其亲本化合物黄豆苷原和染料木素(Liang et al，2010,J Agric Food Chem，58:11548-11552)。大豆异黄酮代谢产物DHD和DHG目前可进行人工化学合成，但由于所用催化剂价格昂贵，致使目前市场售价较高。
目前，已从不同动物肠道微生物菌群中分离得到多株能将底物黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG的细菌菌株，然而这些菌株均为严格厌氧细菌菌株。由于从黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG的反应为加氢还原反应，因此，厌氧菌在转化时必须保证严格的厌氧环境，而长期维持严格厌氧环境造价极高。文献“大豆异黄酮还原菌株耐氧突变株的耐氧机制与有氧转化调控”中，尝试对已分离的能将黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG的严格厌氧菌株进行耐氧驯化，并将从牛瘤胃分离的具有上述转化功能的细菌菌株Niu-O16成功驯化为耐氧突变株Aeroto-Niu-O16，该耐氧突变株在有空气氧条件下既能生长，又能将底物黄豆苷原和染料木素分别转化为DHD和DHG。但是，由于该耐氧突变株耐氧机制之一就是在氧气刺激下在其菌体外壁形成一层以多糖为主要成分的抗氧化“保护膜”结构，这层抗氧化“保护膜”结构有力的阻挡了氧气进入菌体细胞内，进而大大降低了氧气对菌体造成的伤害。然而，由于菌体转化时产生的酶为胞内酶，底物黄豆苷原和染料木素需进入菌体内部，在菌体内部被转化为产物后再运出菌体。以往研究表明，这层抗氧化“保护膜”结构严重阻碍了底物（与染料木素比，底物黄豆苷原尤为突出）从菌体外转运到菌体内，加之底物黄豆苷原和染料木素水溶性较差，大量底物（尤其是底物黄豆苷原）被阻滞在这层抗氧化“保护膜”中了，而被阻滞在抗氧化“保护膜”中的底物不能被有机溶剂（如乙酸乙酯）有效萃取出来，这使得产物DHD和DHG的量大大降低，尤其是DHD降低更明显。加入底物浓度越大，形成的抗氧化“保护膜”结构导致的产物量损失越大（Zhao et al 2011，ApplMicrobiol Biotechnol，92:803-813），因此，耐氧突变株Aeroto-Niu-O16在实际生产中不具有可应用性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐氧突变菌Aeroto-AUH-JLD21及其在二氢黄豆苷原和二氢染料木素有氧合成中的应用。该菌株能在自然条件（有空气氧条件）下，将底物黄豆苷原高效转化为二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD），也能将底物染料木素高效转化为二氢染料木素（dihydrogenistein，简称DHG），转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，能够实现二氢黄豆苷原和二氢染料木素在有空气氧条件下的高效生产。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种耐氧夏普氏菌（sharpea sp.）Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCC No.9976。
耐氧夏普氏菌sharpea sp. Aeroto-AUH-JLD21是由保藏号为CGMCC No.5306的严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp. AUH-Julong21（EU919864）经过长期耐氧驯化后得到的耐氧突变株。该耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在有空气氧条件下既能快速生长又能将底物黄豆苷原和染料木素分别高效转化为DHD和DHG。有关底物黄豆苷原和染料木素以及它们的转化产物DHD和DHG的结构如下：
本发明中的耐氧夏普氏菌sharpea sp. Aeroto-AUH-JLD21菌株（简称耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21）已于2014年11月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC No.9976。中国科学院微生物研究所菌种保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
耐氧夏普氏菌sharpea sp. Aeroto-AUH-JLD21的分类学特征为：
菌落发黄，菌落外围无透明圈；菌体在BHI液体培养基中呈长丝状，交织在一起，生长12小时后大部分菌体沉落在试管底部。
该菌株淀粉水解酶活性阳性，吲哚反应阴性，脲酶阴性，可发酵葡萄糖产酸产气，能利用乳糖、甘露糖、蔗糖、水杨苷、纤维二糖和棉籽糖等，不能利用鼠李糖、甘露醇、山梨醇、松叁糖等。
经刚果红染色及电镜观察，耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21菌体外壁几乎看不到抗氧化“保护膜”结构。
本发明还提供了耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用。
应用包括下述步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养18～24小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15% 接种量接种到添加0.10%L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物黄豆苷原，使底物黄豆苷原的终浓度为1.2～2.4毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养1～2天，即可将底物黄豆苷原高效转化为二氢黄豆苷原；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢黄豆苷原。
本发明还提供了耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢染料木素有氧合成中的应用。
应用包括下述步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养18～24小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；
（2）底物染料木素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15% 接种量接种到添加0.10%L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物染料木素，使底物染料木素的终浓度为1.2～2.4毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养1～2天，即可将底物染料木素高效转化为二氢染料木素；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢染料木素。
其中，所述耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得包括下述步骤：
（1）严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp. AUH-Julong21的活化培养
在厌氧工作站中，将低温冷冻保存的严格厌氧红椿菌Coriobacterium sp. AUH-Julong21（保藏号为CGMCC No.5306，以下简称红椿菌AUH-Julong21）融化并按10%～15% 接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10% 接种量将试管中的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21重新转接到新鲜BHI液体培养基中，培养24小时作为种子液。
（2）红椿菌AUH-Julong21的耐氧驯化
将在厌氧工作站内培养18～24 小时生长至对数期的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21以10% 接种量接种到事先准备好的驯化培养基中。初始的驯化培养基组成为：BHI培养基中添加0.15% L-半胱氨酸和0.15% 抗坏血酸（Vc）。菌株在初始驯化培养基中生长稳定后（转接5～10次），降低培养基中的L-半胱氨酸和Vc的添加量（每次均降低0.01～0.02%），待菌株生长稳定后（转接5～10次），再转接到下一个梯度继续驯化，还原剂L-半胱氨酸和Vc的降低幅度仍为每次0.01～0.02%，依次类推，最终将培养基中L-半胱氨酸和Vc含量降低为零。在转接过程中，分别加入底物黄豆苷原或底物染料木素与驯化菌共培养，用高效液相（HPLC）跟踪测定，分别检测底物黄豆苷原和染料木素被转化情况。最终获得在有空气氧条件下既能生长又能将底物黄豆苷原或染料木素分别高效还原为DHD和DHG的耐氧突变株，将该耐氧突变株命名为耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21，以下简称耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21或耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21为同一菌株。
（3）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的纯化培养与菌种保藏
将耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在BHI琼脂培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，至少重复两次。对划出的形态一致的单菌落进行转化活性测定，将有转化活性的单一菌落进行液体培养并保藏。具体方法为：将在液体培养基中生长至对数期的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21取400微升，加入到盛有400微升事先已灭菌的10% 脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在−80ºC的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
（4）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R
（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物，对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21与菌株Sharpea azabuensis strain HM250, Sharpea azabuensis strain ST18和Sharpeaazabuensis strain HM244的16S rDNA序列相似性均高达99%。
在进行耐氧驯化时使用的原出发菌株为严格厌氧红椿菌Coriobacteriumsp.AUH-Julong21，该菌株的16S rDNA序列与红椿菌Coriobacterium sp. strain CCUG33918相似性高达99%。然而，原出发菌株严格厌氧红椿菌AUH-Julong21经长期的耐氧驯化后得到的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21发生了跨属突变。耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的16S rDNA序列变得与红椿菌属菌株相似性低于90%，而与夏普氏菌属菌株的相似性高达99%。因而，将该耐氧突变株初步鉴定为夏普氏菌属菌株。
夏普氏菌属（Sharpea）是日本学者Morita等于2008年在国际系统进化微生物杂志上命名的一个新细菌属（Morita et al 2008，Int J Syst Microbiol, 58:2682-2686）。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21能够在有空气氧的条件下将黄豆苷原高效转化为二氢黄豆苷原，也能将染料木素转化为二氢染料木素，转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，能够实现二氢黄豆苷原和二氢染料木素在有空气氧条件下的高效生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21分别转化底物黄豆苷原和染料木素的高效液相色谱图；
图2为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21分别转化底物黄豆苷原和染料木素生成产物的紫外吸收图谱；
图3为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物黄豆苷原的转化动态曲线；
图4为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物黄豆苷原的转化能力比较；
图5为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物染料木素的转化动态曲线；
图6为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物染料木素的转化能力比较；
图7 为不同还原剂对耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21转化黄豆苷原的影响；
图8为组合还原剂对耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21转化黄豆苷原的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
1、耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得
（1）严格厌氧红椿菌AUH-Julong21的活化培养
在厌氧工作站中，将低温冷冻保存的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21（保藏号为CGMCC No.5306）融化并按10%～15% 接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10% 接种量将试管中的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21重新转接到新鲜BHI液体培养基中，培养24小时作为种子液。
（2）红椿菌AUH-Julong21的耐氧驯化
将在厌氧工作站内培养18～24 小时生长至对数期的严格厌氧红椿菌AUH-Julong21以10% 接种量接种到事先准备好的驯化培养基中。初始的驯化培养基组成为：BHI培养基中添加0.15% L-半胱氨酸和0.15% 抗坏血酸（Vc）。菌株在初始驯化培养基中生长稳定后（转接5～10次），降低培养基中的L-半胱氨酸和Vc的添加量（每次均降低0.01～0.02%），待菌株生长稳定后（转接5～10次），再转接到下一个梯度继续驯化，还原剂L-半胱氨酸和Vc的降低幅度仍为每次0.01～0.02%，依次类推，最终将培养基中L-半胱氨酸和Vc含量降低为零。在转接过程中，分别加入底物黄豆苷原或底物染料木素与驯化菌共培养，用高效液相（HPLC）跟踪测定，分别检测底物黄豆苷原和染料木素被转化情况。最终获得在有空气氧条件下既能生长又能将底物黄豆苷原或染料木素分别高效转化为DHD和DHG的耐氧突变株，将该耐氧突变株命名为耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21。
（3）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的纯化培养与菌种保藏
将耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在BHI琼脂培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，至少重复两次。对划出的形态一致的单菌落进行转化活性测定，将有转化活性的单一菌落进行液体培养并保藏。具体方法为：将在液体培养基中生长至对数期的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21取400微升，加入到盛有400微升事先已灭菌的10% 脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在−80ºC的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
（4）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R
（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物，对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21与菌株Sharpea azabuensis strain HM250, Sharpea azabuensis strain ST18和Sharpeaazabuensis strain HM244的16S rDNA序列相似性均高达99%。
在进行耐氧驯化时使用的原出发菌株为严格厌氧红椿菌Coriobacteriumsp.AUH-Julong21，该菌株的16S rDNA序列与红椿菌Coriobacterium sp. strain CCUG33918相似性高达99%。然而，原出发菌株严格厌氧红椿菌AUH-Julong21经长期的耐氧驯化后得到的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21发生了跨属突变。耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21的16S rDNA序列变得与红椿菌属菌株相似性低于90%，而与夏普氏菌属菌株的相似性高达99%。因而，将该耐氧突变株初步鉴定为夏普氏菌属菌株。
2、耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养24小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养6小时作为种子液。
（2）底物黄豆苷原与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为40毫摩尔/升的底物黄豆苷原，使底物黄豆苷原的终浓度为1.6毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天，即可将底物黄豆苷原转化为二氢黄豆苷原。
（3）用HPLC检测底物黄豆苷原被耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21的转化情况
从上述培养液中取100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入80微升100% 甲醇溶液，用100% 甲醇溶液稀释10倍后再用HPLC检测底物被转化情况。
结果发现，加入到培养基中的底物黄豆苷原明显减少，而在底物黄豆苷原的后面出现另一物质峰，且该新物质峰随着底物黄豆苷原的减少而成比例增加，表明该新出现的物质峰为黄豆苷原被耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化后生成的代谢产物。经与标准品对比发现，黄豆苷原代谢产物与二氢黄豆苷原DHD的高效液相保留时间完全一致（见图1-A）。
（4）黄豆苷原代谢产物的分离纯化和结构鉴定
经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100% 甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集底物黄豆苷原的代谢产物峰，并在旋转蒸发仪上蒸干。
在分析型高效液相色谱仪上测定上述黄豆苷原代谢产物的纯度，再测定其紫外吸收谱。结果表明，黄豆苷原的代谢产物分别在275和325纳米处有最大紫外吸收（见图2-A），这恰与DHD的最大紫外吸收相吻合（Wang et al，2005, J Biotechnol, 115:261-269）。
将上述黄豆苷原代谢产物进行核磁共振氢谱（1HNMR）和碳谱（13C NMR）测定(Bruker AVANCE 400型超导核磁共振波谱仪)，溶剂采用丙酮-d6。黄豆苷原代谢产物的1H-NMR和13C-NMR为：1H NMR (Acetone-d6, 400 MHz,): δ 7.75 (1H, d,J = 8.8 Hz, H-5 ),7.15 (2H, d,J = 8.5 Hz, H-2′,6′), 6.80 (2H, d,J = 8.5 Hz, H-3′,5′), 6.59 (1H,dd,J = 8.7, 2.1 Hz, H-6), 6.41 (1H,d,J = 2.0 Hz, H-8), 4.91(2H, m, H-2), 3.88(1H, m,H-3); 13C NMR (Acetone-d6, 100MHz): δ 191.2 (C-4), 165.3(C-8α), 164.5(C-7), 157.6 (C-4′), 130.7 (C-2′,6′), 130.2 (C-5), 128.2 (C-1′), 116.3 (C-3′,5′), 115.5 (C-4α), 111.5 (C-6), 103.5 (C-8), 75.1 (C-2), 55.6 (C-3)。
因此，通过与标准品对比高效液相保留时间和紫外吸收图谱，结合核磁共振氢谱和碳谱分析结果，将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21代谢底物黄豆苷原的代谢产物准确鉴定为二氢黄豆苷原（DHD）。
（5）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物黄豆苷原的转化动态
为了解耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物黄豆苷原的速度，以便确定最佳转化时间，对耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物黄豆苷原的转化动态进行了测定，具体方法如下：
将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升液体BHI培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的黄豆苷原500微升，分别在普通生化培养箱内培养0小时、6小时、12小时、18 小时、24小时、30小时、36小时、42小时和48小时后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入80微升100% 甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态。
结果表明：底物加入6小时后即有38.09% 产物DHD被生成，培养至24小时后有81.14%的底物黄豆苷原被转化为DHD；继续培养至48小时，产物DHD稍有上升（见图3）。
（6）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物黄豆苷原转化能力测定
将事先准备好的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21的种子液（培养方法同上所述）以10%接种量转接到添加组合还原剂（0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸）的新鲜BHI液体培养基中，培养6小时后加入不同浓度的底物黄豆苷原，并继续在普通生化培养箱内共同培养2天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100% 甲醇溶液，并用HPLC检测底物黄豆苷原被转化情况，并根据标准曲线和出峰峰面积计算转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）。
结果表明，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对浓度为1.2毫摩尔/升、1.6毫摩尔/升和2.0毫摩尔/升的黄豆苷原的平均转化率分别为84.11%、83.92%和81.15%；当底物浓度增至2.4毫摩尔/升时，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物黄豆苷原的转化效率有所降低，平均转化率为75.62%（见图4）。
3、耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢染料木素有氧合成中的应用
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养24小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养6小时作为种子液。
（2）底物染料木素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为40毫摩尔/升的底物染料木素，使底物染料木素的终浓度为1.6毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天，即可将底物染料木素转化为二氢染料木素。
（3）用HPLC检测底物染料木素被耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21的转化情况
从上述培养液中取100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入80微升100% 甲醇溶液，用100% 甲醇溶液稀释10倍后再用HPLC检测底物被转化情况。
结果发现，加入到培养基中的底物染料木素明显减少，而在底物染料木素的前面出现另一物质峰，且该新物质峰随着底物染料木素的减少而成比例增加，表明新出现的物质峰为染料木素被耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化后生成的代谢产物。经与标准品对比发现，染料木素代谢产物与二氢染料木素DHG的高效液相保留时间完全一致（见图1-B）。
（4）染料木素代谢产物的分离纯化和结构鉴定
经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100% 甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集底物染料木素的代谢产物峰，并在旋转蒸发仪上蒸干。
在分析型高效液相色谱仪上测定上述染料木素代谢产物的纯度，再测定其紫外吸收谱。结果表明，染料木素的代谢产物在290纳米处有一最大紫外吸收（见图2-B），这恰与DHG的最大紫外吸收相吻合（Wang et al, 2005, J Biotechnol, 115:261-269）。
将上述染料木素代谢产物进行核磁共振氢谱（1HNMR）和碳谱（13C NMR）测定(Bruker AVANCE 400型超导核磁共振波谱仪)，溶剂采用丙酮-d6。
染料木素代谢产物的1H-NMR和13C-NMR为：1H NMR (Acetone-d6, 400 MHz,): δ12.26 (1H, S, H-5 ), 7.29 (2H, d,J = 8.0 Hz, H-2′,6′), 6.83 (2H, d,J = 8.5Hz, H-3′,5′), 5.97 (1H,S, H-6), 5.97 (1H,S, H-8), 4.61(2H, m, H-2), 3.97 (1H,m,H-3); 13C NMR (Acetone-d6, 100MHz): δ 198.0 (C-4), 164.4(C-8α), 167.5 (C-7),157.9 (C-4′), 130.8 (C-2′,6′), 130.2 (C-5), 127.7 (C-1′), 116.5 (C-3′,5′),103.4 (C-4α), 97.2 (C-6),95.7 (C-8), 72.5 (C-2), 53.6 (C-3)。
因此，通过与标准品对比高效液相保留时间和紫外吸收图谱，结合核磁共振氢谱和碳谱分析结果，将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21代谢底物染料木素的代谢产物准确鉴定为二氢染料木素（DHG）。
（5）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物染料木素的转化动态
为了解耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物染料木素的速度，以便确定最佳转化时间，对耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21转化底物染料木素的转化动态进行了测定，具体方法如下：
将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升液体BHI培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的染料木素500微升，分别在普通生化培养箱内培养0小时、6小时、12小时、24小时、36小时和48小时后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入80微升100% 甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况。
结果表明：底物加入6小时后即有27.63% 产物DHG被生成，培养至24小时后，所加入的底物染料木素84.15% 被转化为DHG；继续培养至48小时产物DHG的量无显著上升（见图5）。
（6）耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21对不同浓度底物染料木素转化能力测定
将事先准备好的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21的种子液（培养方法同上所述）以10%接种量转接到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的新鲜BHI液体培养基中，培养6小时后加入不同浓度的底物染料木素，并继续在普通生化培养箱内共同培养2天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100% 甲醇溶液，并用HPLC检测底物染料木素被转化情况，并根据标准曲线和出峰峰面积计算转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）。
结果表明，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对浓度为1.2毫摩尔/升和1.6毫摩尔/升的染料木素的平均转化率分别为85.30%和83.25%；当底物浓度增至2.0毫摩尔/升时，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物染料木素的转化效率有所降低，平均转化率为78.92%；当底物浓度增至2.4毫摩尔/升时，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物染料木素的转化效率明显降低，平均转化率仅为20.67%。因此，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLD21在有空气氧条件下能高效转化底物染料木素的浓度为1.6毫摩尔/升（见图6）。
实施例2
耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21的培养
将-80℃低温冷冻保存的耐氧菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养6小时作为种子液。
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21在添加不同单一还原剂的培养基中共培养
将上述事先培养好的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21种子液按10%接种量分别转接到含有L-半胱氨酸、抗坏血酸或硫代硫酸钠的单一还原剂的BHI液体培养基中培养，以不添加还原剂的BHI液体培养基培养作为对照，分别同时加入母液浓度为40毫摩尔/升的黄豆苷原底物，使黄豆苷原的终浓度为1.6毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天，即可分别将底物黄豆苷原转化为DHD。
（3）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21在添加不同组合还原剂的培养基中共培养
将上述事先培养好的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21种子液按10% 接种量分别转接到含有不同组合还原剂的BHI液体培养基中培养，其中组合还原剂及其加入量分别为：0.10%L-半胱氨酸+0.10%硫代硫酸钠（简称L-Cys+STs），0.10%L-半胱氨酸+0.10%抗坏血酸（简称L-Cys+Vc），0.10%抗坏血酸+0.10%硫代硫酸钠（简称Vc+STs），0.10%L-半胱氨酸+0.10%抗坏血酸+0.10%硫代硫酸钠（简称L-Cys+Vc+STs）。向上述含有不同组合还原剂的BHI液体培养基中分别同时加入母液浓度为40毫摩尔/升的黄豆苷原底物，使黄豆苷原的终浓度为1.6毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天，即可分别将底物黄豆苷原转化为DHD。
（4）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21对底物黄豆苷原的转化情况
用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100% 甲醇溶液，并用HPLC检测底物黄豆苷原被转化情况，并根据标准曲线和出峰面积计算转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）。
结果表明：在不添加还原剂的BHI培养基中，耐氧菌Aeroto-AUH-JLD21对浓度为1.6毫摩尔/升的黄豆苷原的平均转化率仅为54.91%，当培养基中添加还原剂后，其转化活性显著提高：耐氧菌Aeroto-AUH-JLD21在添加浓度为0.10%的单一还原剂L-半胱氨酸、抗坏血酸和硫代硫酸钠的培养基中，对底物黄豆苷原的平均转化率分别为67.61%、79.77%和73.25%（见图7）；耐氧菌Aeroto-AUH-JLD21在添加组合还原剂L-Cys+STs、L-Cys+Vc、Vc+STs、L-Cys+Vc+STs培养基中，对底物黄豆苷原的平均转化率分别为69.99%，83.92%、75.83%和81.26%（见图8）。结果显示在培养基中添加0.10%L-半胱氨酸和0.10%抗坏血酸的组合还原剂后，耐氧菌Aeroto-AUH-JLD21对底物黄豆苷原的转化效果最好。
实施例3
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用，包括以下步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按15% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养18小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养4小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按15% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为60毫摩尔/升的底物黄豆苷原，使底物黄豆苷原的终浓度为1.2毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养1天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢黄豆苷原。
实施例4
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用，包括以下步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按12% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养20小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养8小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按12% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为50毫摩尔/升的底物黄豆苷原，使底物黄豆苷原的终浓度为2.4毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢黄豆苷原。
实施例5
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢染料木素有氧合成中的应用，包括以下步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按13% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养18小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养4小时作为种子液；
（2）底物染料木素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按13% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为60毫摩尔/升的底物染料木素，使底物染料木素的终浓度为2.0毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢染料木素。
实施例6
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的获得方法同实施例1。
耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢染料木素有氧合成中的应用，包括以下步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按15% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养22小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养8小时作为种子液；
（2）底物染料木素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按15% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为50毫摩尔/升的底物染料木素，使底物染料木素的终浓度为1.2毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养1天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢染料木素。

Claims (5)

1.一种耐氧夏普氏菌（sharpea sp.）Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCC No.9976。
2.如权利要求1所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用。
3.根据权利要求2所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢黄豆苷原有氧合成中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养18～24小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物黄豆苷原，使底物黄豆苷原的终浓度为1.2～2.4毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养1～2天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢黄豆苷原。
4.如权利要求1所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢染料木素有氧合成中的应用。
5.根据权利要求4所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在二氢染料木素有氧合成中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养
将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15% 接种量接种到添加0.05% L-半胱氨酸的BHI液体培养基中，37℃下活化培养18～24小时；再以10% 接种量将上述活化的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；
（2）底物染料木素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养
将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15% 接种量接种到添加0.10% L-半胱氨酸和0.10% 抗坏血酸的BHI液体培养基中，加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物染料木素，使底物染料木素的终浓度为1.2～2.4毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养1～2天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物二氢染料木素。
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