CN107964556A - 一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，提供了一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，包括如下步骤：(1)选取蓝色犁头霉菌，菌种活化后，制成种子液转接到液体马铃薯培养基中培养；期间，于发酵液中加入山奈酚；(2)加入山奈酚后的第2‑4天向发酵液中添加8‑12％葡萄糖或13‑17％蔗糖作为转化促进剂，再继续培养；(3)加入山奈酚后的第5‑8天，取出发酵液并提取分离紫云英苷，得转化总提物；(4)将转化总提物通过硅胶柱层析分离、葡聚糖凝胶纯化，得目标产物‑紫云英苷。本发明的优点在于：制备快速简单、原材料来源限制少、生产成本低、可控性强、安全性高、低污染排放，且具有较高的转化率，具有推广应用价值。

Description

一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法。
背景技术
山奈酚是黄色精细粉末，属于黄酮醇类，黄色针晶，熔点276℃-278℃山。柰酚微溶于水，溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇。
微生物转化是指利用微生物将一种物质转化成为另一种物质的过程。微生物转化操作简单，利于大规模工业生产，具有低毒、低污染、能耗少、效率高、选择性良好等优点。
紫云英苷又名山奈酚-3-O-葡萄糖苷、百蕊草素Ⅱ、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，是一种天然的黄酮类化合物，分子式为C21H20O11，相对分子质量为448.38。紫云英苷在常温下呈黄色针晶状，熔点218-220℃，沸点823.2℃(760mmHg)，不溶于水，溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗过敏、镇痛、抗菌、抗肝毒、调节机体免疫等多种药理作用。研究发现，紫云英苷可减少过敏性皮炎Nc/Nga小鼠的表皮水分流失，抑制脾脏T淋巴细胞对IL-4和IL-13的分泌，减轻紫外照射对HaCaT细胞引起的损伤，从而减弱小鼠皮肤过敏反应和皮肤炎症反应。进一步研究发现，紫云英苷通过抑制细胞产生PGE2、NO、IL-6和TNF-α等细胞因子，从而发挥抗炎作用。紫云英苷还能清除活性氧自由基，避免皮肤受太阳照射引起的损伤，并能有效阻止胞内抗氧化物质谷脱甘肽(GSH)的衰竭和人红细胞自由基诱导的氧化溶血，同时增强小鼠红细胞内超氧化物歧化酶活性，降低小鼠肝内丙二醛含量。紫云英苷对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌亦有明显抑制作用，其半数抑菌浓度(MIC50)为80ug/mL。适当浓度的紫云英苷对人外周血NK细胞活性具有显著的促进作用,其作用强弱与机体的免疫水平有关。研究发现，紫云英苷还具有促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖与分化、强心、抗心律失常、扩张血管、保护心肌等药理作用。此外，紫云英苷还能控制大豆种子的颜色，可作为一种天然添加剂应用于食品行业。
目前，获得紫云英苷的方法主要有三种：
1、从富含紫云苷的植物中提取分离：
该方法周期长，得率低，需要大量的植物材料，成本较高，很难应用于大规模工业化生产。
2、化学法进行合成：
在对山奈酚进行区域选择性糖苷化修饰合成紫云英苷时，需要合适的糖基供体，在反应过程中需要对山奈酚和葡萄糖结构中的羟基采取保护措施，防止氧化，而且糖苷化的条件也极为苛刻，容易形成其他单糖苷类和多糖苷类化合物，从山奈酚开始，需经过二十多步反应才能得到紫云英苷，且紫云英苷的得率只能达到17％，而且合成过程中产生了大量副产物，因此，化学法合成紫云英苷，操作过程繁琐、耗时长、得率低、引入试剂多，并产生大量副产物，很难用于工业化生产。
3、生物转化：
2008年，Ikhlas Khan利用Medium-A培养基(20g葡萄糖、5g NaCl、5克K2HPO4、细菌蛋白胨5克、酵母提取物5克，加蒸馏水定容至1L)、采用小克银汉霉(Cunninghamellablakesleeana，ATCC 8688A)将山奈酚转化成紫云英苷，然而这种办法紫云英苷的得率仅有2.45％，而且培养基的配方复杂成本较高。此外，Sailesh Malla等在2013年将拟南芥的黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)和黄酮合酶基因(FLS1)以及及大豆的类黄酮-3-O-糖基转移酶基因(UGT78K1)转入到大肠杆菌BL21中，利用大肠杆菌的内源性葡萄糖途径合成的UDPG作为糖基供体，将柚皮素进行特异性修饰，最终合成紫云英苷。为了提高紫云英苷的产量，他们敲除了大肠杆菌的UDP-葡萄糖水解酶基因和葡萄糖异构酶基因，最优条件下转化率以柚皮素计仅为48.8％。该方法的缺点是由于基因敲出以及外源性的紫云英苷合成的关键酶等，影响了菌体生长，导致紫云英苷的产量很低。
随着对紫云英苷药用价值研究的深入，人们对紫云英苷的需求量不断扩大，迫切需要开发一种快速简单、原材料来源限制少、生产成本低、可控性强、安全性高、低污染排放的方法高效生产紫云英苷，以利于紫云英苷的产业化和在医药领域的广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速简单、原材料来源限制少、生产成本低、可控性强、安全性高、低污染排放的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，包括如下步骤：
(1)选取蓝色犁头霉菌，菌种活化后，制成种子液转接到液体马铃薯培养基中扩大培养；培养期间，于发酵液中加入山奈酚；
(2)加入山奈酚后的第2-4天向发酵液中添加8-12％葡萄糖或13-17％蔗糖作为转化促进剂以转化发酵液，再继续震荡培养；
(3)加入山奈酚后的第5-8天，取出发酵液并提取分离紫云英苷，得转化总提物；
(4)将上述步骤获得的转化总提物通过硅胶柱层析分离、葡聚糖凝胶纯化，最终获得目标产物-紫云英苷。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中蓝色犁头霉菌种具体为从霍山石斛根中分离得到的菌种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中菌种的活化方法为：将蓝色犁头霉菌菌株接种于固体马铃薯培养基平板上，置于恒温箱中，23-26℃培养1-2d，得活化的蓝色犁头霉菌菌株。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中蓝色犁头霉菌种子液的制备方法为：将活化后的蓝色犁头霉菌菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于液体马铃薯培养基中培养，计数，以浓度为(2-4)×108CFU/mL的菌液作为种子液。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中种子液转接到液体马铃薯培养基中扩大培养的具体方法为：取种子液接种至30-60倍体积的液体马铃薯培养基中，24-26℃恒温震荡培养22-26h，再将山奈酚溶于丙酮成饱和溶液，按丙酮含量4％加入发酵液。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中发酵液中紫云英苷的具体提取分离方法为：加入山奈酚后的第5-8天，取出发酵液，18-22kHz超声处理8-12min后，以等体积乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液，于48-52℃减压浓缩，获得转化总提物。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中硅胶柱层析分离的具体方法为：
a.15-30倍转化总提物质量的柱层层析硅胶作为分离硅胶，干法装柱；
b.将转化总提物溶于甲醇，加入1-3倍总提物质量的柱层层析硅胶作为拌样硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂，干法上样；
c.15-30倍总提物质量的柱层层析硅胶作为分离硅胶，干法装柱，乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，收集10:1洗脱部位。
作为本发明的优选方式之一，所述柱层层析硅胶为200-300目硅胶，在使用前先于100-110℃烘箱中活化1-3h。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中葡聚糖凝胶纯化的具体方法为：所获样品溶于甲醇，葡聚糖凝胶柱氯仿-甲醇＝1:1为洗脱剂纯化。
作为本发明的优选方式之一，所述蓝色犁头霉菌的拉丁名称为：Absidiacoerulea，于中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌株保藏编号为：CICC40302。
作为本发明的优选方式之一，上述试剂和培养基配方，如无特别说明，均为本领域常规试剂和培养基。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明能有效避免“从植物中提取法”对原材料来源的限制，缩短生产周期，减少污染排放，并能完成在有机合成条件下不能或很难进行的化学反应，进一步减少合成步骤和副产物的形成；此外，本发明还具有操作简便、条件温和、选择性强、后处理简单、生产成本低、安全性高、低污染排放等优点，非常适合紫云英苷的工业化生产；
(2)本发明采用的蓝色犁头霉菌是一种可以转化山奈酚为紫云英苷的菌，在PDA液体培养基中接种环挑取菌丝能显著减少菌体培养时间；
(3)本发明在投料后第2-4天时添加8-12％葡萄糖或13-17％蔗糖作为转化促进剂，可显著提高山奈酚的转化率；
(4)本发明制备的紫云英苷具有生产周期短、转化效率高、产品纯度高、安全可靠等显著优点，可应用于抗炎、抗氧化、抗病毒、抗过敏、镇痛、抗菌、抗肝毒、调节机体免疫等领域；且可根据需要对产品再进行不同程度的纯化或后加工以满足不同应用领域的纯度要求；
(5)本发明不仅为紫云英苷的工业化生产提供了一条新的路径，还对其他黄酮类化合物的开发利用具有指导意义。
附图说明
图1是实施例3中转化总提物的TLC检测结果图；
图2是实施例3中山奈酚样品的HPLC检测结果图；
图3是实施例3中空白对照样品的HPLC检测结果图；
图4是实施例3中紫云英苷样品的HPLC检测结果图；
图5是实施例3中转化总提物样品的HPLC检测结果图；
图6是实施例3中最终所获的紫云英苷的核磁共振氢谱图；
图7是实施例3中最终所获的紫云英苷的核磁共振碳谱图；
图8是实施例4中投料后发酵培养时间对山奈酚转化率的影响曲线图；
图9是实施例5中促进剂添加时间对山奈酚转化率的影响曲线图；
图10是实施例6中促进剂的添加量对山奈酚转化率的影响曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，包括如下步骤：
(1)选取从霍山石斛根中分离得到的蓝色犁头霉菌Absidia coerulea(于市场上购买)，将其接种于固体马铃薯培养基平板(PDA固体培养基的配制：去皮马铃薯200g切成小块，放入沸水中煎煮15min，以8层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后加入琼脂20g、3.0g KH2PO4、1.5g无水MgSO4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却备用)上，置于恒温箱中，23℃培养1d，得活化的蓝色犁头霉菌菌株；
将活化后的蓝色犁头霉菌菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于液体马铃薯培养基(PDA液体培养基的配制：去皮马铃薯200g切成小块，放入沸水中煎煮15min，以8层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入20g葡萄糖、3.0g KH2PO4、1.5g无水MgSO4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却备用)中培养，计数，以浓度为2×108CFU/mL的菌液作为种子液；
取种子液接种至30倍体积的液体马铃薯培养基中，24℃恒温震荡培养22h，再将山奈酚溶于丙酮成饱和溶液，按丙酮含量3％加入发酵液，继续震荡培养。
(2)加入山奈酚后的第2天向发酵液中添加8％葡萄糖(促进剂质量/发酵液体积，g/mL)或13％蔗糖(促进剂质量/发酵液体积，g/mL)作为转化促进剂以转化发酵液，再继续震荡培养。
(3)加入山奈酚后的第5天，取出发酵液，18kHz超声处理8min后，以等体积乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，于48℃减压浓缩，获得转化总提物。
(4)将上述步骤获得的转化总提物通过硅胶柱层析分离、葡聚糖凝胶纯化，最终获得目标产物-紫云英苷；其中，硅胶柱层析分离的具体方法为：
a.15倍转化总提物质量的柱层层析硅胶(200目)作为分离硅胶，干法装柱(使用前先于100℃烘箱中活化1h)；
b.将转化总提物溶于甲醇，加入1倍总提物质量的柱层层析硅胶作为拌样硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂，干法上样；
c.15倍总提物质量的柱层层析硅胶作为分离硅胶，干法装柱，乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，收集10:1洗脱部位。
葡聚糖凝胶纯化的具体方法为：所获样品溶于甲醇，葡聚糖凝胶柱氯仿-甲醇＝1:1为洗脱剂纯化。
实施例2
本实施例的一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，包括如下步骤：
(1)选取从霍山石斛根中分离得到的蓝色犁头霉菌Absidia coerulea(于市场上购买)，将其接种于固体马铃薯培养基平板(PDA固体培养基的配制：去皮马铃薯200g切成小块，放入沸水中煎煮15min，以8层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后加入琼脂20g、3.0g KH2PO4、1.5g无水MgSO4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却备用)上，置于恒温箱中，26℃培养2d，得活化的蓝色犁头霉菌菌株；
将活化后的蓝色犁头霉菌菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于液体马铃薯培养基(PDA液体培养基的配制：去皮马铃薯200g切成小块，放入沸水中煎煮15min，以8层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入20g葡萄糖、3.0g KH2PO4、1.5g无水MgSO4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却备用)中培养，计数，以浓度为4×108CFU/mL的菌液作为种子液；
取种子液接种至60倍体积的液体马铃薯培养基中，26℃恒温震荡培养26h，再将山奈酚溶于丙酮成饱和溶液，按丙酮含量5％加入发酵液，继续震荡培养。
(2)加入山奈酚后的第4天向发酵液中添加12％葡萄糖(促进剂质量/发酵液体积，g/mL)或17％蔗糖(促进剂质量/发酵液体积，g/mL)作为转化促进剂以转化发酵液，再继续震荡培养。
(3)加入山奈酚后的第8天，取出发酵液，22kHz超声处理12min后，以等体积乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，于52℃减压浓缩，获得转化总提物。
(4)将上述步骤获得的转化总提物通过硅胶柱层析分离、葡聚糖凝胶纯化，最终获得目标产物-紫云英苷；其中，硅胶柱层析分离的具体方法为：
a.30倍转化总提物质量的柱层层析硅胶(300目)作为分离硅胶，干法装柱(使用前先于110℃烘箱中活化3h)；
b.将转化总提物溶于甲醇，加入3倍总提物质量的柱层层析硅胶作为拌样硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂，干法上样；
c.30倍总提物质量的柱层层析硅胶作为分离硅胶，干法装柱，乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，收集10:1洗脱部位。
葡聚糖凝胶纯化的具体方法为：所获样品溶于甲醇，葡聚糖凝胶柱氯仿-甲醇＝1:1为洗脱剂纯化。
实施例3
本实施例的一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，包括如下步骤：
(1)选取从霍山石斛根中分离得到的蓝色犁头霉菌Absidia coerulea(于市场上购买)，将其接种于固体马铃薯培养基平板(PDA固体培养基的配制：去皮马铃薯200g切成小块，放入沸水中煎煮15min，以8层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入葡萄糖20g，再次煮沸后加入琼脂20g、3.0g KH2PO4、1.5g无水MgSO4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却备用)上，置于恒温箱中，25℃培养1d，得活化的蓝色犁头霉菌菌株；
将活化后的蓝色犁头霉菌菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于液体马铃薯培养基(PDA液体培养基的配制：去皮马铃薯200g切成小块，放入沸水中煎煮15min，以8层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入20g葡萄糖、3.0g KH2PO4、1.5g无水MgSO4，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，冷却备用)中培养，计数，以浓度为3×108CFU/mL的菌液作为种子液；
取种子液接种至58倍体积的液体马铃薯培养基中，25℃恒温震荡培养24h，再将山奈酚溶于丙酮成饱和溶液，按丙酮含量4％加入发酵液，继续震荡培养。
(2)加入山奈酚后的第3天向发酵液中添加10％葡萄糖(促进剂质量/发酵液体积，g/mL)或15％蔗糖(促进剂质量/发酵液体积，g/mL)作为转化促进剂以转化发酵液，再继续震荡培养。
(3)加入山奈酚后的第5天，取出发酵液，20kHz超声处理10min后，以等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，于50℃减压浓缩，获得转化总提物，再将获得的转化总提物分别进行TLC和HPLC检测。
TLC检测：TLC检测结果如图1所示，图中从左到右依次为：山奈酚标准品、空白对照、转化总提物、紫云英苷标准品；由图1可知，山奈酚转化为紫云英苷，其中的转化过程反应式如下：
HPLC检测：设置检测HPLC条件为：Agilent1260色谱柱为C18(4.6×250mm)；流动相为乙腈：水＝60：40(含0.1％的磷酸)；检测器为紫外检测器254nm；柱温为25℃；流速为1mL/min；进样量为10μL；紫云英苷保留时间为4.52min；山奈酚保留时间为9.633min。该条件下，测得山奈酚的标准曲线为：A＝125609C+357824，R2＝0.9998，其中A为山奈酚测得峰面积，C为山奈酚的浓度(μg/mL)，R2为相关系数，该曲线方程的线性范围为5.0μg/mL-2200μg/mL；该条件下，测得紫云英苷的标准曲线为：A＝650062C-678536，R2＝0.9998，其中A为紫云英苷测得峰面积，C为紫云英苷的浓度(μg/mL)，R2为相关系数，该曲线方程的线性范围为0.06μg/mL-1890μg/mL。
HPLC检测结果如图2-5所示，图2-5依次为：山奈酚、空白对照、紫云英苷、转化总提物样品的HPLC检测结果图；由图2-5可知，山奈酚转化为紫云英苷，且山奈酚转化率达98％。
(4)将上述步骤获得的转化总提物通过硅胶柱层析分离、葡聚糖凝胶纯化，最终获得目标产物-紫云英苷；
其中，硅胶柱层析分离的具体方法为：
a.20倍转化总提物质量的柱层层析硅胶(250目)作为分离硅胶，干法装柱(使用前先于105℃烘箱中活化2h)；
b.将转化总提物溶于甲醇，加入2倍总提物质量的柱层层析硅胶作为拌样硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂，干法上样；
c.20倍总提物质量的柱层层析硅胶作为分离硅胶，干法装柱；
d.乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，其中，乙酸乙酯∶甲醇＝1∶0梯度洗脱2个柱体积，乙酸乙酯∶甲醇＝40∶1梯度洗脱5个柱体积，乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1梯度洗脱10个柱体积；乙酸乙酯∶甲醇＝1∶0梯度、40∶1梯度每个馏分体积不限，乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1梯度每个馏分收集五分之一柱体积；其中，所述柱体积，1个柱体积(mL)＝拌样硅胶质量(克)×2.2+分离硅胶质量(克)×2.2；
e.将上述乙酸乙酯-甲醇10:1洗脱部位第15-30馏分合并，减压浓缩至干，紫云英苷得率为60％，纯度为93％；或者，直接将乙酸乙酯-甲醇10:1洗脱部位第6-第50个馏分合并，减压浓缩至干，紫云英苷得率为85％，纯度为78％。
葡聚糖凝胶纯化的具体方法为：将上述所获样品溶于甲醇，葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH20)氯仿-甲醇＝1:1为洗脱剂纯化，最终获纯度为95.6％的紫云英苷，紫云英苷丢失率＜1％；图6-7分别为最终所获的紫云英苷的核磁共振氢谱图以及核磁共振碳谱图，表1为紫云英苷核磁共振碳谱、氢谱信号归属(DMSO，300MHz)表。
表1紫云英苷核磁共振碳谱、氢谱信号归属(DMSO，300MHz)
Carbon No. δH(J,Hz) δC Carbon No. δH(J,Hz) δC
2 156.342 3ˊ，5ˊ 6.86(d,2H,J＝9.0) 115.055
3 133.147 4ˊ 159.901
4 177.416 1〞 100.825
5 161.182 2〞 74.175
6 6.206(d,1H,J＝2.1Hz) 98.652 3〞 76.385
7 164.143 4〞 69.861
8 6.432(d,1H,J＝2.1Hz) 93.605 5〞 77.458
9 103.944 6〞 60.806
10 156.190 5-OH 12.617(s)
1ˊ 120.860 7-OH 10.850(s)
2ˊ，6ˊ 8.04(d,2H,J＝9.0Hz) 130.834 4ˊ-OH 10.206(s)
实施例4
本实施例用以说明上述实施例过程中投料(加入山奈酚)后发酵培养时间对山奈酚转化的影响。
实验方法：按上述实施例所述方法，投料后发酵培养1、2、3、4、5、6、7、8、9天分别取样，再计算山奈酚的转化率；
实验结果：结果如图8所示，由图8可知，投料后发酵培养时间对山奈酚转化率有显著影响：投料后发酵培养1-5天，山奈酚转化率随发酵时间延长而增高，5天后趋于稳定。综合考虑，选择投料后发酵培养5-8天作为进一步优化的前提条件。
实施例5
本实施例用以说明上述实施例过程中促进剂添加时间对山奈酚转化率的影响。
实验方法：按上述实施例所述方法，分别在投料(加入山奈酚)后同时(0天)、投料后1、2、3、4天加入5％的蔗糖和葡萄糖作为促进剂，投料后第5天终止反应，再计算山奈酚的转化率；
实验结果：结果如图9所示，由图9可知，添加促进剂蔗糖、葡萄糖，可显著影响山奈酚的转化率：投料同时(0天)加入促进剂，明显抑制山奈酚的转化；投料1天后添加促进剂，可显著促进山奈酚的转化；投料3天加入促进剂，对山奈酚转化的促进最为显著。综合考虑，选择投料后发酵培养2-4天后添加促进剂作为进一步优化的前提条件，3天为最佳。
实施例6
本实施例用以说明上述实施例过程中促进剂的添加量对山奈酚转化率的影响。
实验方法：按上述实施例所述方法，分别在投料后第3天加入不同量的蔗糖和葡萄糖作为促进剂，投料后第5天终止反应，按按实施例9所述方法计算山奈酚的转化率；
实验结果：结果如图10所示，由图10可知，添加促进剂蔗糖、葡萄糖的量显著影响山奈酚的转化率：当促进剂的添加量为1-10g/100mL葡萄糖或1-15g/100mL蔗糖时，随着促进剂质量的增加，山奈酚转化率显著增加；当促进剂的添加量大于10g/100mL葡萄糖或15g/100mL蔗糖时，开始明显抑制山奈酚的转化。综合考虑，选择投料后发酵培养3天后添加8-12g/100mL葡萄糖或13-17g/100mL蔗糖作为转化促进剂，其中，10g/100mL葡萄糖或15g/100mL蔗糖作为促进剂最佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取蓝色犁头霉菌，菌种活化后，制成种子液转接到液体马铃薯培养基中扩大培养；培养期间，于发酵液中加入山奈酚；
(2)加入山奈酚后的第2-4天向发酵液中添加8-12％葡萄糖或13-17％蔗糖作为转化促进剂以转化发酵液，再继续震荡培养；
(3)加入山奈酚后的第5-8天，取出发酵液并提取分离紫云英苷，得转化总提物；
(4)将上述步骤获得的转化总提物通过硅胶柱层析分离、葡聚糖凝胶纯化，最终获得目标产物-紫云英苷。
2.根据权利要求1所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中蓝色犁头霉菌种具体为从霍山石斛根中分离得到的菌种。
3.根据权利要求1所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中菌种的活化方法为：将蓝色犁头霉菌菌株接种于固体马铃薯培养基平板上，置于恒温箱中，23-26℃培养1-2d，得活化的蓝色犁头霉菌菌株。
4.根据权利要求1所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中蓝色犁头霉菌种子液的制备方法为：将活化后的蓝色犁头霉菌菌株在无菌条件下以接种环挑取菌丝接种于液体马铃薯培养基中培养，计数，以浓度为(2-4)×108CFU/mL的菌液作为种子液。
5.根据权利要求1所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中种子液转接到液体马铃薯培养基中扩大培养的具体方法为：取种子液接种至30-60倍体积的液体马铃薯培养基中，24-26℃恒温震荡培养22-26h，再将山奈酚溶于丙酮成饱和溶液，按丙酮含量3-5％加入发酵液。
6.根据权利要求1所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵液中紫云英苷的具体提取分离方法为：加入山奈酚后的第5-8天，取出发酵液，18-22kHz超声处理8-12min后，以等体积乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液，于48-52℃减压浓缩，获得转化总提物。
7.根据权利要求1所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述步骤(4)中硅胶柱层析分离的具体方法为：
a.15-30倍转化总提物质量的柱层层析硅胶作为分离硅胶，干法装柱；
b.将转化总提物溶于甲醇，加入1-3倍总提物质量的柱层层析硅胶作为拌样硅胶，搅拌均匀后挥干溶剂，干法上样；
c.15-30倍总提物质量的柱层层析硅胶作为分离硅胶，干法装柱，乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，收集10:1洗脱部位。
8.根据权利要求7所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述柱层层析硅胶为200-300目硅胶，在使用前先于100-110℃烘箱中活化1-3h。
9.根据权利要求1所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述步骤(4)中葡聚糖凝胶纯化的具体方法为：所获样品溶于甲醇，葡聚糖凝胶柱氯仿-甲醇＝1:1为洗脱剂纯化。
10.根据权利要求1-9任一项所述的利用微生物转化山奈酚高效生产紫云英苷的方法，其特征在于，所述蓝色犁头霉菌的拉丁名称为：Absidia coerulea，于中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，菌株保藏编号为：CICC 40302。
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