CN102286565B - 一种茶黄素单体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种茶黄素单体的制备方法，以茶多酚为原料，由灵芝真菌通过液体发酵培养得到的含有漆酶的粗酶液以1∶20-30的体积比加入质量百分浓度1-3％茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空气作为催化氧化的氧气来源，30-60℃水浴振荡10-40min，然后超声振荡1-2min，反应结束后旋转蒸发乙酸乙酯，加入萃取剂4-甲基-2-戊酮得到萃取液，脱去萃取剂得到茶黄素单体TF-3-G。纯度达95％。

Description

一种茶黄素单体的制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种茶黄素单体制备新方法，特别是一种利用微生物来源的漆酶在有机体系中将茶多酚通过生物转化而制备茶黄素单体之一的新方法。

二、背景技术

茶黄素(TFs)最早在红茶中发现的，但含量很少，只占茶叶干物质的0.3-1.5％，但对红茶的色香味和品质起着决定性作用。早在上世纪六十年代我国学者楼福庆等就发现茶黄素具有抗动脉粥样硬化与促纤溶作用。近年来大量的研究表明，茶黄素具有极强的生理活性和广泛的药理功能，被誉为茶叶中的脑黄金。茶黄素重要的药理功效引起国内外研究者极大的兴趣，越来越多的科技工作者对茶黄素进行深入研究，不仅得到了茶黄素的多种单体，还掌握了茶黄素的药效机理，并且发现了茶黄素更多的功能，其主要功能和应用领域有：

一、对心脑血管疾病方面的功效，主要表现为调节血脂、抗凝、促纤溶、降低血粘度、抗氧化、改善微循环、对动物心肌细胞急性缺血损伤有保护作用等。

二、抗菌消炎，茶黄素及其单体在0.6mg/ml的浓度下对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、志贺细菌均有显著的抑制作用；

三、抗氧化剂，可用于清除自由基，已被应用于化妆品中。

另外，茶黄素还具有抑制肿瘤生长，抑制艾滋病病毒转录功效，研究表明，茶黄素及没食子酸酯对艾滋病毒的逆转录酶及各种细胞的DNA和RNA聚合酶活性有抑制作用。茶黄素及其单体不仅抑制逆转录酶，而且抑制人体DNA聚合酶α、β、γ以及大肠杆菌的RNA聚合酶。茶黄素强大的药理功效已被应用到多个领域，目前已有茶黄素的保健药品，抗氧化剂制品及肿瘤和艾滋病的辅助治疗用品，随着功效应用的研究和临床试验的深入，茶黄素将被应用到更广泛的领域。

随着人们生活水平的提高，对身体健康越来越重视。而茶黄素降血脂、防治心血管病、抗氧化、延缓衰老等作用显著，又具有抗肿瘤、抗病毒等功效，成为影响人们生活质量的重要产品，被人们接纳。目前，国内外市场对茶黄素需求旺盛，仅依靠自红茶中提取天然茶黄素不能满足市场需要。

目前，国内人工合成茶黄素的方法有：采用K₃Fe(CN)₆等化学氧化法将茶多酚转化为茶黄素、采用多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)等游离酶发酵生产茶黄素、利用固定化技术将酶固定化后进行催化合成茶黄素。这些技术方法工艺工业化能力差；操作程序复杂，产物茶黄素得率低，生产成本高；副产物复杂，而且产生大量的废水，环境污染严重。

曲文娟等对茶黄素的形成机理和制备方法进行了深入的研究，认为只有B环上有两个邻位羟基的儿茶素(即茶多酚)和B环上有三个邻位羟基的儿茶素同时存在时，通过氧化两邻醌B环之间偶联形成茶黄素。因此茶黄素是含有二羟基苯骈卓酚酮(1′，2′-二羟基-3，4-苯骈卓酚酮)的一类化合物，无论是酶促氧化或化学氧化，结构和生物活性相同(《食品工业科技》Vol.27.No.06，2006)。

现有的制备方法无论是酶促氧化法还是化学氧化法，所得到的茶黄素均为多种单体的混合物。李大祥等研究表明，人工制备的茶黄素主要含以下三种单体：茶黄素(R₁＝R₂＝H)、茶黄素-3-单没食子酸酯(R₁、R₂中一为H、另一为没食子酰基)、茶黄素-3，3′-双没食子酸酯(R₁、R₂均为没食子酰基)，三者的比例为11∶52∶36(《安徽农业大学学报》，2006，33(1)：87-89)。由此可见茶黄素的上述各种生物活性主要取决于茶黄素-3-单没食子酸酯(TF-3-G)。

三、发明内容

本发明针对现有茶黄素制备方法的缺陷，旨在提供一种酶法催化氧化茶多酚制备茶黄素单体的方法，所要解决的技术问题是遴选高选择性的酶，通过酶促氧化得到一种主要单体茶黄素-3-单没食子酸酯(TF-3-G)。

本发明所称的茶黄素单体是分子量为715.1的茶黄素-3-单没食子酸酯(TF-3-G)。

本发明遴选的酶是以真菌灵芝(Ganoderma Lucidum)经发酵培养得到的漆酶。

本发明的技术方案以茶多酚为原料，包括漆酶的制备和茶多酚的氧化以及分离、浓缩等单元过程，与现有技术的区别是所述的漆酶的制备是将灵芝真菌接种到液体种子培养基中于20-60℃条件下培养5-7天得到种子发酵液，经离心分离得到酶活为3-10000U/L漆酶粗酶液；然后将活力为3-10000U/L漆酶粗酶液以1∶20-30的体积比加入质量百分浓度1-3％茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空气作为催化氧化的氧气来源，30-60℃水浴振荡，转速为30-300转/分钟，10-40min，接着超声振荡1-2min。所述的液体种子培养基为每升培养基中含玉米粉6-18g、酶母膏8-12g、葡萄糖8-12g、NaH₂PO₄1-2g。

反应结束后经真空旋转蒸发回收乙酸乙酯。然后用4-甲基-2-戊酮(IBMK)作为萃取剂萃取TF-3-G至少两次，合并萃取液，蒸干IBMK即得到TF-3-G粉末，纯度达到95％(HPLC法)，分子量715.2(LC-MS法)。

本发明使用真菌灵芝菌发酵而来的漆酶催化氧化茶多酚生成单体茶黄素TF-3-G，而且纯度高，从而解决了现有技术中难以直接制备茶黄素单体的难题，本方法工艺简单，过程中所使用的有机溶剂均回收利用，基本无废水，绿色环保。

四、附图说明

图1是TF-3-G HPLC图谱。

图2是TF-3-GLC-MC图谱。

五、具体实施方式

1、漆酶的制备

灵芝菌种购自中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心。每升水中加入玉米粉7g酵母膏10g、葡萄糖10g、NaH₂PO₄1.5g配制液体培养基，接种量1平方厘米菌块，20-60℃条件下培养5-7天得到种子发酵液，发酵液经5000r/min离心10min后取上清液为粗酶液，酶活力测定。

2、漆酶的检测

漆酶酶活测定：以愈创木酚为底物，3mL反应混合液中，含50mmol/L琥珀酸钠缓冲液(pH＝4.5)，1mmol/L底物和0.6mL粗酶液(发酵液经5000r/min离心10min后取上清液作为粗酶液)，25℃水浴保温反应30min，于300nm处测定吸光度(300nm处愈创木酚摩尔消光系数ξ₄₆₅＝1.21×10⁴L·mol^-1·cm^-1)，以100℃灭活的粗酶液与测酶缓冲液混合为对照。酶活定义为每分钟内催化氧化1μmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位(U)。本发酵液酶活为3U/L。

3、茶黄素单体TF-3-G的制备

将活力为3U/L漆酶以1∶20的体积比加入质量百分浓度1-3％茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空气作为催化氧化的氧气来源，35-45℃水浴振荡，转速为30-300转/分钟，15-25min，接着超声振荡1-2min，反应结束后经真空旋转蒸发回收乙酸乙酯。然后用4-甲基-2-戊酮(IBMK)作为萃取剂萃取TF-3-G，至少两次，萃取率为90％。合并萃取液蒸干IBMK即得到TF-3-G粉末纯度达到95％

4、茶黄素单体TF-3-G HPLC以及LC-MS检测条件和结果

采用高效液相(HPLC，waters 600 controller；C₁₈色谱柱(25mm×46mm))分析标准样品和酶促反应产物。结果如图1所示。采用A、B两相梯度洗脱，A相是2％的乙酸，B相是乙腈-乙酸乙酯(21∶3，v/v)；流动相A在保留时间35min内线性梯度变化为82-74％。进样量10μl，流速为0.8mL/min，柱温为40℃，检测波长为280nm。结果如图2所示。

Claims (3)

1.一种茶黄素单体的制备方法，以茶多酚为原料，包括漆酶的制备和茶多酚的氧化以及分离、浓缩和萃取各单元过程，其特征在于：所述的漆酶的制备是将灵芝真菌接种到液体培养基中于20-60℃下培养5-7天得到种子发酵液，经离心分离得到酶活为3U/L的漆酶粗酶液；所述的液体培养基是每升培养基中含玉米粉6-18g、酵母膏8-12g、葡萄糖8-12g、NaH₂PO₄1-2g；所述的茶多酚氧化是将上述粗酶液以1∶20-30的体积比加入质量百分浓度1-3%茶多酚乙酸乙酯溶液中，以空气作为催化氧化的氧气来源，30-60℃水浴振荡10-40min，然后超声振荡1-2min，反应结束后旋转蒸发乙酸乙酯，加入萃取剂4-甲基-2-戊酮得到萃取液，脱去萃取剂得到茶黄素单体茶黄素-3-单没食子酸酯。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：液体培养基为玉米粉7g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖10g/L、NaH₂PO₄1.5g/L。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：茶多酚氧化时的条件为35-45℃水浴振荡15-25min。

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