CN103103227A - 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制备工艺 - Google Patents
一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制备工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制备工艺，将98%茶多酚与食品级漆酶按一定比例分别溶于蒸馏水中，待其充分溶解后调节反应液pH值为5.5，加热至60℃进行搅拌，同时通入空气或氧气，经过3小时催化氧化反应得到茶多酚的氧化聚合物，将获得的反应溶液进行减压浓缩，浓缩液使用大孔树脂进行柱层析分离，收集乙醇洗脱部分，获得具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物。采用本方法得到的茶多酚氧化聚合物具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用，反应及制备过程中未使用任何有毒试剂、溶剂。原料及制备工艺具有高度的安全性，使用设备要求简单，为控制餐后高血糖提供了很好的化合物来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制备工艺方法。
背景技术
近年来，糖尿病已经成为一种严重影响人类健康的常见病、多发病。在我国，随着人口的老龄化趋势，糖尿病发病率近10年逐年上升，平均每年增加100多万，其中Ⅱ型糖尿病占到90%以上。在Ⅱ型糖尿病的防治过程中，糖耐量异常（Impaired Glucose Tolerance,IGT）是糖尿病发生的一个重要阶段，是人体处于糖代谢紊乱的代偿性阶段，同时IGT阶段属于可逆阶段，如果在这一阶段实施有效的干预治疗，可使糖耐量异常者发展为糖尿病机率极大的降低，有效的预防糖尿病的发生。目前，临床对IGT阶段的干预药物应用尚处于实验阶段，国内外临床报道用于此阶段的药物主要有双胍类（如二甲双胍）和α-葡萄糖苷酶抑制剂类（如阿卡波糖）等药物，但是这些药物在毒副作用以及治疗成本等方面还存在一定的不足，所以研发适用于IGT阶段人群的安全、高效的干预治疗药物是防治糖尿病研究的一个重要研究方向。茶作为最早起源于中华民族的传统保健饮料已经有四五千年的历史，其主成分是以儿茶素为主的多酚类化合物，其中含量最高的为(-)-epigallocatechin-3-O-gallate(EGCg)。多项调查研究结果表明，茶叶中所含有的多酚类化合物的摄入量与高血糖的发生与发展呈负相关。特别是经过发酵处理的红茶、乌龙茶所含有的儿茶素氧化物类化合物，对与IGT阶段干预治疗密切相关的α-葡萄糖苷酶抑制方面有着很好的生物活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以含98%茶多酚为原料，安全高效的制备α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备工艺。
为了达到上述目的，本发明有如下技术方案：
本发明为一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制备工艺，使用绿茶叶片提取物98%茶多酚，在食品级漆酶的氧化催化作用下对其进行氧化，得到茶多酚氧化聚合物。
茶多酚氧化聚合物具体包括以下步骤：
①茶多酚溶液制备：将98%茶多酚与蒸馏水按1mg/0.5ml混合，加热到60℃，搅拌均匀，使其呈现透明澄清液体状态；
②漆酶溶液制备：将5000U/g食品级漆酶与蒸馏水按1mg/0.5ml比例混合，加热到50℃－60℃之间，搅拌均匀，滤去沉淀物；
③茶多酚氧化物制备：将步骤①制得的茶多酚溶液与步骤②制得的漆酶溶液按体积比1:5比例混匀，调节pH5.5，保持加热50℃－60℃之间，同时通入空气或氧气，保持反应进行3个小时；
④茶多酚氧化聚合聚合物精制：将步骤③所得的液体逐渐加入医药级D101大孔吸附树脂层析柱中，以蒸馏水洗脱3倍体积，再用99%乙醇洗脱至氧化聚合物完全流出，减压浓缩蒸馏，冷冻干燥，即得茶多酚氧化聚合物干燥粉末。
由于采取了以上技术方案，本发明的优点在于：
1、本发明使用的98%茶多酚主要化学成分是儿茶素类化合物，是日常饮用茶叶的主要化学成分，这类化合物具有高度的生物安全性，未见任何毒性及副作用报道，同时具有抗氧化等多种生物学功能。发明人将其作为原料应用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的研发原料具有高度的安全性和可靠性。
2、本发明涉及的漆酶是一类含铜的氧化还原酶，它们广泛地存在于自然界中，如植物以及真菌中都有存在。它是一种来源广泛的多酚氧化酶，适合催化氧化具有酚羟基的多酚类化合物，儿茶素正是一类这样的化合物。
3、利用漆酶进行催化的反应是利用分子氧，产生的副产物只有水，不产生其他任何具有毒副作用的化学产物。本发明所使用的漆酶来源于真菌，经过制备达到食品应用级别。同时在处理得到的儿茶素氧化聚合物时使用的分离大孔树脂为医药级，洗脱溶剂为蒸馏水和99%乙醇，符合食品及医药原料制备标准。
4、本发明将高纯度的98%茶多酚与食品级漆酶在温和条件下进行催化反应，生成的儿茶素氧化聚合物经过实验验证具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
该工艺使用的原料如下：
含98%茶多酚茶叶提取物；食品级漆酶（5000U/g），食品级漆酶即漆酶达到食用级的安全级别；蒸馏水。
反应体系包括：茶多酚1g、漆酶5g、蒸馏水1000mL。
1）将相应重量份的98%茶多酚加入带有搅拌子烧杯中，在恒温磁力搅拌器上均匀搅拌，并控制温度在60℃，搅拌至其呈现澄清透明液体状态；
2）在烧杯中加入相应重量份的漆酶，同时在烧杯中通入氧气，在恒温磁力搅拌器上均匀搅拌，使漆酶均匀分布于烧杯液体中，搅拌约10分钟至其呈现半透明液体状态，调节pH5.5；
3）维持反应温度50℃，反应3小时，通过TLC或HPLC确认儿茶素完全被氧化，及茶多酚氧化聚合物产生；
4）将反应所得的液体冷却并过滤后，逐渐加入装有D101大孔吸附树脂的层析柱中，用蒸馏水进行洗脱，至无浑浊液体流出，然后加入99%乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行减压浓缩蒸馏；
5）将浓缩液进行冷冻干燥处理，得到干燥的茶多酚氧化聚合物粉末备用。
实施例2：
该工艺使用的原料如下：
含98%茶多酚茶叶提取物；食品级漆酶（5000U/g），食品级漆酶即漆酶达到食用级的安全级别；蒸馏水。
反应体系包括：茶多酚1g、漆酶5g、蒸馏水1000mL。
1）将相应重量份的98%茶多酚加入带有搅拌子烧杯中，在恒温磁力搅拌器上均匀搅拌，并控制温度在60℃，搅拌至其呈现澄清透明液体状态；
2）在烧杯中加入相应重量份的漆酶，同时在烧杯中通入氧气，在恒温磁力搅拌器上均匀搅拌，使漆酶均匀分布于烧杯液体中，搅拌约10分钟至其呈现半透明液体状态；
3）维持反应温度55℃，反应3小时，通过TLC或HPLC确认儿茶素完全被氧化，及茶多酚氧化聚合物产生；
4）将反应所得的液体冷却并过滤后，逐渐加入装有D101大孔吸附树脂的层析柱中，用蒸馏水进行洗脱，至无浑浊液体流出，然后加入99%乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行减压浓缩蒸馏；
5）将浓缩液进行冷冻干燥处理，得到干燥的茶多酚氧化聚合物粉末备用。
实施例3：
该工艺使用的原料如下：
含98%茶多酚茶叶提取物；食品级漆酶（5000U/g），食品级漆酶即漆酶达到食用级的安全级别；蒸馏水。
反应体系包括：茶多酚1g、漆酶5g、蒸馏水1000mL。
1）将相应重量份的98%茶多酚加入带有搅拌子烧杯中，在恒温磁力搅拌器上均匀搅拌，并控制温度在60℃，搅拌至其呈现澄清透明液体状态；
2）在烧杯中加入相应重量份的漆酶，同时在烧杯中通入氧气，在恒温磁力搅拌器上均匀搅拌，使漆酶均匀分布于烧杯液体中，搅拌约10分钟至其呈现半透明液体状态；
3）维持反应温度60℃，反应3小时，通过TLC或HPLC确认儿茶素完全被氧化，及茶多酚氧化聚合物产生；
4）将反应所得的液体冷却并过滤后，逐渐加入装有D101大孔吸附树脂的层析柱中，用蒸馏水进行洗脱，至无浑浊液体流出，然后加入99%乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行减压浓缩蒸馏；
5）将浓缩液进行冷冻干燥处理，得到干燥的茶多酚氧化聚合物粉末备用。
实验例：将以上获得的茶多酚氧化聚合物组分精密称量8mg/ml，并分别稀释至4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml，以拜耳公司生产的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物阿卡波糖作为对照品，分别配置同等浓度溶液，使用糖尿病模型db/db小鼠肠道获得的α-葡萄糖苷酶进行体外酶活性抑制研究，实验步骤如下：
①将NaOH配制成浓度为67mmol/L的溶液，然后加入磷酸二氢钾调pH值至6.8的缓冲液；
②加入抑制剂200μl，阴性对照组和空白对照组补加相同体积的缓冲液；
③加入80μl浓度为0.25U/ml的酶液,及100μl浓度为1mg/ml的还原型谷胱苷肽。空白对照组不加酶液，补加80μl缓冲液。
④混匀后将反应体系在37℃水浴恒温振荡器中保温反应15min。
⑤向反应后的体系中加入2ml，1μmol/ml的底物PNPG。
⑥将其混匀后在37℃下保温反应30min。
⑦向反应后体系加入3ml，0.5mol/L终止液终止反应。
⑧利用紫外可见分光光度计在400nm处测其光吸收值。
计算各组分对α-葡萄糖苷酶抑制率，进行比较。
其抑制活性结果如下：
1、反应温度为50℃结果：
2、反应温度为55℃结果
3、反应温度为60℃结果
从上述的几个试验例可以看出：不同反应温度得到的茶多酚氧化聚合物在不同浓度梯度下对α-葡萄糖苷酶抑制率均较阿卡波糖较小，但较98%茶多酚的对α-葡萄糖苷酶抑制率高近一倍或更多。由于茶多酚中儿茶素是日常饮用茶叶的主要化学成分，这类化合物具有高度的生物安全性，利用漆酶进行催化的反应是利用分子氧，产生的副产物只有水，不产生其他任何具有毒副作用的化学产物，因此不论从食用安全性还是对α-葡萄糖苷酶抑制率均较阿卡波糖有更强的食用选择性。
Claims (2)
1.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制备工艺，其特征在于：使用绿茶叶片提取物98%茶多酚，在食品级漆酶的氧化催化作用下对其进行氧化，得到茶多酚氧化聚合物。
2.根据权利要求1所述的一种具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的茶多酚氧化聚合物的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
①茶多酚溶液制备：将98%茶多酚与蒸馏水按1mg/0.5ml混合，加热到60℃，搅拌均匀，使其呈现透明澄清液体状态；
②漆酶溶液制备：将5000U/g食品级漆酶与蒸馏水1mg/0.5ml比例混合，加热到50℃－60℃之间，搅拌均匀，滤去沉淀物；
③茶多酚氧化聚合物制备：将步骤①制得的茶多酚溶液与步骤②制得的漆酶溶液按体积比1:5混匀，调节pH5.5，保持加热50℃－60℃之间，同时通入空气或氧气，保持反应进行3个小时；
④茶多酚氧化聚合物精制：将步骤③所得的液体逐渐加入医药级D101大孔吸附树脂层析柱中，以蒸馏水洗脱3倍体积，再用99%乙醇洗脱至氧化聚合物完全流出，减压浓缩蒸馏，冷冻干燥，即得茶多酚氧化聚合物干燥粉末。
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