CN108530552A - 昆布多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

昆布多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用，属于植物活性成分的药物医疗和保健应用领域。依次采用纯水提取、醇沉、Sevag法脱蛋白、透析分离纯化，然后浓缩冷冻干燥。昆布多糖中多糖含量为≥93.9％，且昆布多糖中不含有蛋白质；肿瘤包括Hela(人宫颈癌细胞)，SH‑SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF‑7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)等。本发明将昆布多糖用于抗癌药物的制备，以供癌症的治疗使用。

Description

昆布多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种昆布多糖的抗肿瘤作用，属于海洋藻类活性成分的药物医疗和保健应用领域。
背景技术
白血病(Leukemia)，亦称作血癌，是一种造血系统的恶性肿瘤。病源是由于细胞内脱氧核糖核酸的变异形成的骨髓中造血组织的不正常工作。骨髓中的干细胞每天可以制造成千上万的红血球和白细胞。白血病病人过分生产不成熟的白细胞，妨害骨髓的其他工作，这使得骨髓生产其它血细胞的功能降低。白血病可以扩散到淋巴结、脾、肝、中枢神经系统和其它器官。
多糖(又名多聚糖)，一般指由个以上的单糖通过糖苷键链接而成的大分子化合物，如纤维素、半纤维素、树胶、糖元等。多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辅射、抗病毒、抗炎、抗疲劳、抗衰老等生理活性。
昆布(又名海带)是一类生活在海洋中的隐花植物类群，其主要含有多糖、天然蛋白质、纤维素、脂肪、矿物质及核酸等，是中国、日本、印度、韩国等国家的日常生活食材之一。现代药理研究表明，昆布中含有褐藻、褐藻淀粉、褐藻糖胶等在方面发挥着重要作用。因此从昆布中分离和寻找具有良好的生理活性的多糖也就成为了国内外专家和学者争先研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种昆布多糖的制备及在制备抗肿瘤药物方面的新用途。
本发明的技术方案为：对昆布进行多糖提取，再将提取的多糖作用于Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)等肿瘤细胞。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种昆布多糖的制备及在抗肿瘤中的应用。
本发明所提供的昆布多糖，经测试具有一定的抗肿瘤活性，在体外给药0.043-1.4mg/mL范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长，且呈现明显的量效关系。
本发明一种昆布多糖的制备，包括以下步骤：
1)昆布粗多糖提取：
秤取干燥昆布粉，按一定料液比加入缓冲液和酶，在一定温度和pH下酶解一段时间后，升温90℃灭酶；然后加入碳酸钠溶液进行消化；减压抽滤，取滤液，用盐酸使昆布多糖以胶态析出，静置过夜，然后再向静置液中缓缓加入盐酸，调pH 1.0～2.0后过滤；在常温下，边搅拌边向过滤固体中加入碳酸钠溶液溶解胶块，至中和完成；向中和后的溶液中加入无水乙醇析出沉淀；过滤，沉淀物于烘箱中干燥，即得昆布粗多糖；
每1.0g昆布粉对应20-50ml缓冲溶液；上述缓冲溶液可为：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-磷酸、柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；
上述酶选自：果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶中的一种或几种；
上述酶的质量浓度为：0.45～0.6g/L；
上述酶解时温度可为：35～55℃；
上述酶解时pH值为：5～6.5；
上述酶解时间可为：2～4h；
边搅拌边加入2％碳酸钠溶液溶解胶块。
每1.0g昆布粉对应加入2wt％碳酸钠溶液40ml于55℃消化2.0h。2)蛋白酶-Sevag法脱蛋白：
称取步骤1)昆布粗多糖，然后将多糖溶解于纯水中，加入木瓜蛋白酶，于40℃恒温水浴2h后，加入新鲜配制的Sevag溶液，在漩祸震荡仪震荡10min，离心，吸取上层水溶液；Sevag溶液为氯仿:正丁醇体积比＝4:1的混合液。
每0.5g昆布粗多糖对应溶解于200～300ml 40℃纯水中，对应加入0.1mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.9ml，于40℃恒温水浴2h后，对应加入新鲜配制的Sevag溶液20ml。
3)透析分离纯化：
取步骤2)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；透析后所得的浓缩液于-60℃下冷冻真空干燥，得昆布多糖。
4)柱层析分离纯化：
以Sephadex G-50葡聚糖凝胶为填料，进行柱层析分离纯化，以纯水为流动相进行洗脱，流速0.5mL/min，对得到的流分采用高效凝胶渗透色谱法检验纯度后，于-60℃下冷冻真空干燥，得昆布多糖单体。
昆布多糖含量测定，利用高效凝胶渗透色谱法对所得昆布多糖进行分析检测，结果表明昆布多糖单体纯度为82.3％以上；同时，用考马斯亮蓝G-250法测蛋白质为阴性，昆布多糖中不含有蛋白质。
昆布多糖的1H NMR，图1为昆布多糖的1H NMR图谱，图中显示异头碳区和糖环区的氢峰较多，根据积分面积推算出纯化后昆布多糖中氢的归属为：δ＝5.097-5.154(1H,-O-CH-),3.765-3.833(6H,-CH-),3.688(2H,-CH-),3.634(4H,-CH2-),3.501(1H,-O-CH-).
昆布多糖的红外光谱，取适量待测样品，用溴化钾(KBr)压片后置于IR检测台上,在4000～800cm-1进行扫描，观察谱峰情况，如图2所示。
昆布多糖的IR光谱中出现3400cm-1、3290cm-1、1700cm-1、1418cm-1、1153cm-1等典型的多糖特征吸收峰；850cm-1附近有α-糖苷键的特征吸收峰；830cm-1附近的吸收峰说明其含有吡喃环。
昆布多糖抗氧化活性：
①DPPH自由基清除能力的测定
将2.0mL DPPH乙醇溶液(0.1mmol/mL)、2.0mL昆布多糖溶液(浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.50、0.80、1.0mg/mL)放入10ml中容量瓶中，搅拌均匀后，避光室温反应30min后于517nm波长处测定混合物的吸光度。
清除率SD(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100
其中：Ac：2mLDPPH加2mL无水乙醇
Aj：2mL无水乙醇加2mL待测液
Ai：2mLDPPH加2mL待测液
②·OH自由基活性
将0.1mL 10mmol/L Fe3O4、0.1mL 10mmol/L水杨酸的乙醇溶液、以及0.1mL昆布多糖溶液(浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.50、0.80、1.0mg/mL)放入96孔板中。最后加0.1mL 8.8mmol/L H2O2，于37℃反应0.5h，以蒸馏水作参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。以蒸馏水作为空白。
清除率计算公式：清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100
其中：A0为参比溶液的吸光度
A1为加入昆布多糖溶液后的吸光度
A2为不加显色剂H2O2的吸光度
抗肿瘤活性检测：
根据样品溶解情况，用无菌生理盐水溶解样品并0.22μm滤膜过滤除菌，昆布多糖样品、阳性药的浓度均为10mg/ml。
将所选肿瘤细胞于37℃、5％CO2及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清的完全培养基，细胞呈对数增长时铺板，调整细胞悬浮浓度为3000个/ml，接种于96孔培养板，其中每孔180μl。待细胞贴壁生长12h后，加入检测样品(43.75、87.5、175、350、700、1400μl/ml)及阳性对照药各20μl，空白组同时加入等体积生理盐水，细胞共同孵育72h后，弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/ml MTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，置摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪450nm处测量吸光值。独立重复三次实验。
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/(OD对照-OD空白)×100。
MTT实验中，抑制率越高，说明受试物的作用活性越强。
本发明所提供的昆布多糖，主要用于白血病的治疗与辅助治疗，其中所述肿瘤不限于白血病，还进行了Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)等，其对MCF-7细胞株有较强的杀伤作用，用于制备抗肿瘤或治疗肿瘤的药物。
本发明所述的抗肿瘤药物包括昆布多糖和药学上可接受的载体或者常规食用辅料，如：淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、葡萄糖、甘露醇等。
本发明所述的抗肿瘤药物的剂型为药学上可接受的任意一种剂型。
本发明中采用的昆布多糖试样的制备方法与现有同类技术相比，具有如下优点：
1)极大的提高了昆布多糖的纯度；
2)利用海洋产品昆布获得天然昆布多糖，其原料充足、成本低廉；进一步提了高昆布产品附加值，实现了原材料的高值化利用；
3)与对照药5-氟尿嘧啶和紫杉醇相比，本发明的昆布多糖具有较好的抑制肿瘤生长的作用；
4)昆布作为传统食材，通过口服途径增强机体免疫活性，起到预防保健的作用。
附图说明
图1昆布多糖的1H NMR图谱
图2昆布多糖的红外谱图
图3昆布多糖的DPPH自由基清除率
图4昆布多糖的羟自由基清除率
图5昆布多糖，在作用72h后，对Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞的细胞生长抑制率的对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：昆布多糖的制备方法：
1)昆布粗多糖提取：
精密秤取干燥昆布细粉1.0g，按料液比(1g:40ml)加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和0.5g/L果胶酶，在35℃和pH＝5.5下酶解3h后，升温90℃灭酶；然后加入2％碳酸钠溶液40ml，于55℃消化2.0h；减压抽滤，取滤液，用5％盐酸使昆布多糖以胶态析出，静置过夜，向静置液中缓缓加入稀盐酸，调pH 1.0～2.0后过滤；在常温下，边搅拌边加入2％碳酸钠溶液溶解胶块，至pH 7.5中和完成；向中和后的溶液中加入一定量的无水乙醇析出沉淀；过滤，沉淀物于40～50℃烘箱中干燥，即得昆布粗多糖。
2)蛋白酶-Sevag法脱蛋白：
精密称取步骤1)昆布粗多糖0.5g，然后将多糖溶解于200～300ml40℃纯水中，加入0.1mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.9ml，于40℃恒温水浴2h后，加入新鲜配制的Sevag溶液20ml，在漩祸震荡仪震荡10min，以4000r/min离心在离心机上5min，小心吸取上层水溶液。取1.0ml上清液，测定蛋白质及多糖含量。
3)透析分离纯化：
取步骤2)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；透析后所得的浓缩液于-60℃下冷冻真空干燥，得昆布粗多糖II。
4)柱层析分离纯化：
以Sephadex G-50葡聚糖凝胶为填料，对步骤3)所得的昆布粗多糖II进行柱层析分离纯化，以纯水为流动相进行洗脱，流速0.5
mL/min，对得到的流分采用高效凝胶渗透色谱法检验纯度后，于-60℃下冷冻真空干燥，得昆布多糖单体。
实施例2：昆布多糖抗肿瘤活性检测
1)细胞株：Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)。
2)待测样品：提取的昆布多糖，完全培养基配制，终浓度为1500μg/mL；阳性药物：5-氟尿嘧啶和紫杉醇，完全培养基配制，终浓度为100μg/mL。
3)MTT法
肿瘤细胞于37℃、5％CO2及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清的完全培养基,细胞呈对数增长时铺板，调整细胞浓度至3000个/孔接种180μl完全于96孔培养板。待细胞贴壁生长12h后，加入检测样品及阳性对照药20μl，终浓度均为10μg/ml，空白组同时加入等体积生理盐水，细胞共同孵育72h后，弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/ml MTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，置摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪570nm处测量吸光值。独立重复三次实验。
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/(OD对照-OD空白)×100。
MTT实验中，抑制率越高，说明受试物的作用活性越强。
经MTT检测昆布多糖的肿瘤活性，昆布多糖能显著的抑制Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)的生长，见图1。实验表明，随着浓度增大对各肿瘤细胞的增殖抑制率呈明显的正相关，对MCF-7细胞具有非常强细胞毒活性；而对其他肿瘤细胞的增殖抑制相对较弱。
实施例3：昆布多糖样品制剂
昆布多糖胶囊的制备方法：取实施例1中昆布多糖粉末，加入1％～15％淀粉或其它药学上可接受的载体或者常规食用辅料(如蔗糖、糖粉、木糖醇、聚乙二醇、吐温-80、甘油、纤维素钠、糊精、硫代硫酸钠和明胶等常规辅料，制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术，本发明对此不作限定，故在此不予详述)，用90％乙醇为润湿剂，制备软材，过20目筛制粒，60℃下干燥，20目筛整理，即得合格颗粒，装胶囊，得0.050g昆布多糖/粒。

Claims (10)

1.一种昆布多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)昆布粗多糖提取：
秤取干燥昆布粉，按一定料液比加入缓冲液和酶，在一定温度和pH下酶解一段时间后，升温90℃灭酶；然后加入碳酸钠溶液进行消化；减压抽滤，取滤液，用盐酸使昆布多糖以胶态析出，静置过夜，然后再向静置液中缓缓加入盐酸，调pH 1.0～2.0后过滤；在常温下，边搅拌边向过滤固体中加入碳酸钠溶液溶解胶块，至中和完成；向中和后的溶液中加入无水乙醇析出沉淀；过滤，沉淀物于烘箱中干燥，即得昆布粗多糖；
2)蛋白酶-Sevag法脱蛋白：
称取步骤1)昆布粗多糖，然后将多糖溶解于纯水中，加入木瓜蛋白酶，于40℃恒温水浴2h后，加入新鲜配制的Sevag溶液，在漩祸震荡仪震荡10min，离心，吸取上层水溶液；Sevag溶液为氯仿:正丁醇体积比＝4:1的混合液。
3)透析分离纯化：
取步骤2)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；透析后所得的浓缩液于-60℃下冷冻真空干燥，得昆布多糖。
4)柱层析分离纯化：
以Sephadex G-50葡聚糖凝胶为填料，进行柱层析分离纯化，以纯水为流动相进行洗脱，流速0.5mL/min，对得到的流分采用高效凝胶渗透色谱法检验纯度后，于-60℃下冷冻真空干燥，得昆布多糖单体。
2.按照权利要求1所述的一种昆布多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)每1.0g昆布粉对应20-50ml缓冲溶液；上述缓冲溶液选自：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-磷酸、柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠的缓冲溶液。
3.按照权利要求1所述的一种昆布多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)酶选自：果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶中的一种或几种。
4.按照权利要求1所述的一种昆布多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)酶的质量浓度为：0.45～0.6g/L；步骤1)酶解时温度可为：35～55℃；上述酶解时pH值为：5～6.5；上述酶解时间可为：2～4h。
5.按照权利要求1所述的一种昆布多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)边搅拌边加入2％碳酸钠溶液溶解胶块。
6.按照权利要求1所述的一种昆布多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)每1.0g昆布粉对应加入2wt％碳酸钠溶液40ml于55℃消化2.0h。
7.按照权利要求1所述的一种昆布多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)每0.5g昆布粗多糖对应溶解于200～300ml 40℃纯水中，对应加入0.1mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.9ml，于40℃恒温水浴2h后，对应加入新鲜配制的Sevag溶液20ml。
8.按照权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的昆布多糖。
9.按照权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的昆布多糖的应用，作为制备抗肿瘤或治疗肿瘤的药物。
10.按照权利要求9的应用，所述的肿瘤为Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)。
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