CN114874344A - 青稞嫩叶碱提多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青稞嫩叶碱提多糖的制备方法及其应用；本发明所述的青稞嫩叶碱提多糖的制备方法可以得到高纯度的碱提多糖，碱提多糖的提取率可达4.58％，纯度可达98.29％。本发明研究发现所述的青稞嫩叶碱提多糖作为抗癌药物活性成分，可以显著抑制乳腺癌细胞和结直肠癌细胞增殖。尤其能够特异性地抑制结乳腺癌细胞4T1的增殖，且不影响人正常乳腺上皮细胞MCF‑10A的增殖。青稞嫩叶碱提多糖具有生物相容性好、特异性强、毒副作用低等特点，能够弥补传统癌症治疗手段的不足，具有广阔的应用前景。

Description

青稞嫩叶碱提多糖的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于抗癌活性成分技术领域，涉及一种青稞嫩叶碱提多糖的制备方法及其应用；具体涉及一种青稞嫩叶碱提多糖的制备方法及其在制备抗癌药物中的应用；尤其涉及一种从青稞嫩叶中提取和纯化的碱提多糖活性成分及其在抑制结直肠癌细胞和乳腺癌细胞增殖中的应用。

背景技术

青稞是禾本科、大麦属的大麦变种之一，是一种一年生草本植物，能够抵抗严寒、缺氧、干燥、强光照射、土地贫瘠等严酷环境，是高原地带的主要粮食作物，为藏族人民提供每日饮食当中最主要的碳水化合物。特殊的环境使青稞获得了较强的抗逆性，产生了丰富的次生代谢产物。青稞嫩叶一般是指高度为15～20cm的新鲜青稞嫩茎叶，俗称青稞苗。青稞嫩叶具有突出的医疗保健功效，部分医学史书中对其药用价值做了记载。青稞也因其营养组成全面且独特、食疗价值高而越来越受到民众青睐。有学者指出，青稞中的β-葡聚糖含量普遍高于世界其它地区种植的大麦品种。因此β-葡聚糖也被认为是青稞中与人体健康和长寿关系最为密切的营养物质。近些年来作物中阿拉伯木聚糖的生理功效也越来越多地见诸报道并被肯定。

青稞的营养成分比小麦、水稻、玉米较高，是食用、药用、酿造、饲用兼具的作物，具有高蛋白、高纤维、高维生素、低糖、低脂肪等特点。青稞作为西藏等地区的主要粮食，被制成糍粑食用，但其口感较差，难以提高其附加值。青稞具有一定的药用价值。据《本草拾遗》记载，青稞具有下气中宽、除湿发汗、状精益力、止泻等作用。青稞的药用价值与其特殊的生长环境密切相关。青稞膳食纤维中的主要成分为β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖。近些年来，许多报道中提及多种植物中含有阿拉伯木聚糖，且其具有调节免疫、降血脂、降血糖、抗氧化等功能。目前国内外对青稞嫩叶中的多糖研究较少，非碱提青稞嫩叶多糖的研究更少。

阿拉伯木聚糖(Arabinoxylans，AX)是一种非淀粉源的杂多糖，主要由木糖和阿拉伯糖构成，广泛存在于自然界特别是谷类作物中。根据其碱提特点，阿拉伯木聚糖又分为碱提和水不溶性两类。相比较而言，碱提阿拉伯木聚糖结构相对简单，含量也比较低，水不溶性阿拉伯木聚糖结构相对复杂，分子内及分子间交联程度较高。体内和体外实验表明，阿拉伯木聚糖具有增加排便量、降血糖、降胆固醇、抗氧化、调节免疫甚至抗肿瘤等功效，其应用价值高、应用前景广泛。对阿拉伯木聚糖的研究主要聚焦在小麦、大麦、玉米等谷类作物，其提取方法也主要分为水法、碱法、酶法以及这些方法的联用。国内外对青稞中阿拉伯木聚糖的研究相对较少。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种全新的从青稞嫩叶中提取和纯化的碱提多糖活性成分。

本发明第二目的在于提供一种所述的青稞嫩叶碱提多糖的制备方法。

本发明第三目的在于提供所述青稞嫩叶碱提多糖活性成分在制备抗癌药物中的应用。

本发明第四目的在于提供一种包含所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分的抗癌药物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种青稞嫩叶碱提多糖活性成分的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1、将青稞叶真空冷冻干燥、打粉后收集获得青稞嫩叶粉；

S2、将青稞嫩叶粉进行脱脂、水提、碱提、透析、酶解以及醇沉得到青稞嫩叶碱提粗多糖；

S3、将青稞嫩叶碱提粗多糖用纤维素柱进行分离纯化处理即得青稞嫩叶碱提多糖活性成分。

本发明研究发现，通过所述的方法、配合所述的洗脱工艺，可以获得所述的全新的青稞嫩叶碱提多糖活性成分。

作为本发明的一个实施方案，所述青稞的品种为青海黄。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述真空冷冻干燥的条件为-50～-60℃，4～6小时；-35～-40℃，10～15小时；-10～-20℃，10～15小时；20～25℃，24～48小时。在一些实施例中，所述真空冷冻干燥的条件为-50℃，4小时；-35℃，10小时；-10℃，10小时；25℃，24小时。

在一些实施例中，步骤S1，在种植盘中种植青稞种子，待青稞叶长度长到15cm左右时，将青稞叶从根部剪下，清洗、冷藏、真空冷冻干燥、打粉后收集获得的青稞嫩叶粉。

具体地，在每个种植盘中均匀种满100g左右用清水浸泡隔夜的青海黄青稞种子，之后用少量营养土覆盖青稞种子，充分浇水至营养土湿透，之后每天浇水少量，种植周期为14-21天。待青稞叶长度长到15cm左右时，将青稞叶从根部剪下，清洗、冷藏、真空冷冻干燥、打粉后过筛收集获得的青稞嫩叶粉。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，脱脂过程中以石油醚作溶剂进行脱脂，青稞嫩叶粉与石油醚的比例为1g：40～50ml。脱脂条件为：55～65℃浸泡60～90min，65～85℃抽提90～150min，75～95℃回收10～30min。脱脂处理后进行固液分离，获得的脱脂物进行后续的提取。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，水提过程按青稞嫩叶粉和水1:20～1:30的重量投加水。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，水提温度为80℃～90℃，提取时间为3～5小时。重复提取3次。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，水提处理后进行离心3000rpm，10～15min，获得沉淀。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，按1:20～1:30的重量比向水提处理所得沉淀中添加0.5-1mol/L的NaOH溶液进行碱提。重复提取三次后，离心获得上清液。碱提条件是60～80℃水浴3～3.5h；优选80℃水浴3～3.5h。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，用0.5％的盐酸将碱提所得上清液调节至6.5～6.8，经60～80℃水浴浓缩后透析48～60h；优选经80℃水浴浓缩后透析48h。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，所述酶解采用耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶依次进行酶解。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，酶解过程包括：向透析溶液中加入耐高温α-淀粉酶，80～90℃水浴1～2h；水浴温度调至60～80℃，加入木瓜蛋白酶，水浴1～2h；100℃水浴灭酶10～20min，冷却后加入糖化酶，60～80℃水浴1～2h；100℃水浴灭酶10～20min，冷却后60～90℃水浴2～4h，离心，收集上清液。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，将酶解所得上清液浓缩，冷却后加入3～5倍体积的乙醇，静置，离心，收集沉淀；用水复溶，真空冷冻干燥，获得青稞嫩叶碱提粗多糖。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，将酶解所得上清液于80℃下水浴浓缩至50mL～100mL，冷却后边搅拌边逐滴加入3～5倍体积的乙醇，静置，离心，收集沉淀；沉淀用去离子水复溶，冷冻，真空冷冻干燥，获得青稞嫩叶碱提粗多糖。

在一些实施例中，将酶解所得上清液于80℃下水浴浓缩至50mL～100mL，冷却后边搅拌边逐滴加入3～5倍体积的乙醇，溶液静置一天，离心，收集沉淀；用100mL去离子水重新溶解，加入3～5倍体积的乙醇；重复3次之后离心，收集沉淀；沉淀用50mL去离子水复溶，在-80℃下冷冻一天，真空冷冻干燥，获得青稞嫩叶碱提粗多糖。

作为本发明的一个实施方案，所述冷冻的温度为-80℃，冷冻时间为12-36h。

作为本发明的一个实施方案，所述真空冷冻干燥的条件为-50～-60℃，4～6小时；-35～-40℃，10～15小时；-10～-20℃，10～15小时；20～25℃，24～48小时。优选真空冷冻干燥的条件为-50℃，4小时；-35℃，10小时；-10℃，10小时；25℃，24小时。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，所述纤维素柱为DEAE-32纤维素离子交换柱，所述DEAE-32纤维素离子交换柱洗脱液为0.25mol/L NaCl。洗脱流速为0.5～0.7mL/min，洗脱时间为500～1000min；包括500～575min、500～600min、575～700min、700～800min、800～900min、900～1000min。

在一些具体实施例中，本发明提供了一种青稞嫩叶碱提多糖活性成分的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：在每个种植盘中均匀种满100g左右用清水浸泡隔夜的青海黄青稞种子，之后用少量营养土覆盖青稞种子，充分浇水至营养土湿透，之后每天浇水少量，种植周期为14-21天；待青稞叶长度长到15cm左右时，将青稞叶从根部剪下，清洗、冷藏、真空冷冻干燥、打粉后过筛收集获得的青稞嫩叶粉；

步骤(2)：以石油醚作溶剂将青稞嫩叶粉进行脱脂，青稞嫩叶粉与石油醚的比例为1g：50ml，脱脂条件为55～65℃浸泡60～90min，65～85℃抽提90～150min，75～95℃回收10～30min。脱脂处理后进行固液分离，获得的脱脂物进行后续的提取；

步骤(3)：将青稞嫩叶粉和水按1：20到1：30的重量投加，提取温度为80℃～90℃，提取时间为3小时，重复提取3次后进行离心3000rpm，10-15min，获得沉淀。

步骤(4)：按照1：20到1：30的比例向沉淀中添加0.5～1.0mol/L NaOH溶液，80℃水浴3～3.5h；然后用0.5％HCl溶液调节碱提液pH值至6.5～6.8，离心取上清。重复提取3次后向上清液中加入耐高温α-淀粉酶，80℃水浴30min，100℃下水浴10min灭活；待溶液冷却后加入木瓜蛋白酶，60℃水浴2h，100℃下水浴10min灭活；待溶液冷却后加入糖化酶，60℃水浴1h，100℃下水浴10min灭活，离心，收集上清；

步骤(5)：将收集的上清液于80℃下水浴浓缩至50mL～100mL，冷却后边搅拌边逐滴加入3～5倍体积的乙醇。溶液静置一天，离心，收集沉淀，用100mL去离子水重新溶解，加入3～5倍体积的乙醇。重复3次之后离心，沉淀用50mL去离子水复溶，在-80℃下冷冻一天，真空冷冻干燥，获得青稞嫩叶碱提粗多糖；

步骤(6)：将步骤(5)得到的青稞嫩叶碱提粗多糖通过纤维素柱层析(优选为DEAE-32纤维素离子交换柱)进行分离，使用纯水进行洗脱。收集洗脱液，浓缩，冻干，得到青稞嫩叶碱提多糖活性成分。

第二方面，本发明涉及一种根据上述方法制备得到的青稞嫩叶碱提多糖活性成分，其分子量为3.71×105Da，多分散指数(PDI)为1.38(纯度为98.29％)。采用本发明的方法，青稞嫩叶碱提多糖提取率可达4.58％，纯度可达98.29％，其分子量为3.71×105Da，多分散指数(PDI)为1.38。证明本发明中的碱提多糖为均一的纯多糖。该青稞嫩叶碱提多糖活性成分为一种全新的多糖化合物，且发现该全新的多糖化合物能够具有良好的特异性抗癌活性，例如，其对癌细胞具有优异的抑杀作用，此外，所述结构的多糖对正常细胞基本没有抑制活性。

作为本发明的一个实施方案，所述青稞嫩叶碱提多糖活性成分由含量比为6.76:10.00:1.00:2.6的阿拉伯糖，木糖，葡萄糖和半乳糖组成。

作为本发明的一个实施方案，所述青稞嫩叶碱提多糖活性成分含有β-糖苷键，且分子内含有阿魏酸。

作为本发明的一个实施方案，所述青稞嫩叶碱提多糖活性成分为易溶于水的黄褐色絮状物。

本发明所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分对乳腺癌细胞4T1抑制率可达50％-60％，对结直肠癌细胞HT29，Caco-2和CT26的抑制率可达30％-40％，25％-30％和10％-15％；对且给药浓度在达到10mg/mL下对人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A仍具有良好的细胞安全性。

第三方面，本发明涉及青稞嫩叶碱提多糖活性成分在制备抗癌药物中的应用，所述抗癌药物包含抗乳腺癌或结直肠癌药物。本发明制备的青稞嫩叶碱提多糖能够有效抑制乳腺癌4T1细胞的增殖，而不对正常细胞MCF-10A的正常生理活动产生显著影响。本发明所述的青稞嫩叶碱提多糖的抗乳腺癌活性的生理活性可以通过细胞增殖毒性实验进行证明。实验结果表明，青稞嫩叶碱提多糖可以大大降低4T1细胞的存活率，而对正常细胞的增殖无明显影响。

第四方面，本发明涉及一种抗癌药物，包含药学有效量的青稞嫩叶碱提多糖活性成分。

作为本发明的一个实施方案，所述抗癌药物还包含其他抗癌活性成分。

作为本发明的一个实施方案，还包含其他药学上可接受的辅料；

作为本发明的一个实施方案，具有药学上可接受的药学有效的任意剂型。

本发明研究发现，所述的全新的青稞嫩叶碱提多糖活性成分对多种乳腺癌和结直肠癌细胞具有良好的抑制作用，而对正常的细胞基本不具备抑杀作用。本发明通过乳腺癌和结直肠癌细胞模型(例如HT29，Caco-2和CT26结直肠癌细胞，以及4T1乳腺癌细胞)和正常细胞模型(人源正常乳腺上皮细胞MCF-10A)证实了所述的多糖活性成分的抗癌效果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明提供了全新的青稞嫩叶碱提多糖活性成分，本发明通过纯度分析、分子量测定以及单糖组成分析等手段，证明了青稞嫩叶碱提多糖为一种全新的均一性多糖；

2)本发明通过细胞毒性实验证明了青稞嫩叶碱提多糖对乳腺癌和结直肠癌均有良好的抑制作用，尤其是乳腺癌4T1细胞，为多糖作为抗癌药物的应用起到推动作用；另外，本发明所述的全新的多糖物质不仅可以有效抑制癌细胞如乳腺癌和结直肠癌细胞的增殖，还能避免对正常细胞增殖能力和细胞状态的损害，弥补了现有化学抗癌药物特异性不强，对人体副作用大的缺点；

3)本发明所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分的制备方法，通过添加木瓜蛋白酶和耐高温α-淀粉酶的方法，大大提高了蛋白和淀粉的脱除率，提高了青稞嫩叶碱提多糖的产率；通过上述的洗脱方法，可以获得能抑制结直肠癌细胞核乳腺癌细胞增殖，而不影响正常细胞代谢增殖的青稞嫩叶碱提多糖。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为青稞嫩叶碱提多糖的提取流程图；

图2为青稞嫩叶碱提粗多糖的纤维柱洗脱曲线；

图3为青稞嫩叶碱提多糖的高效液相色谱图(HPLC)；

图4为青稞嫩叶碱提多糖的相对分子质量标准曲线图；

图5标准单糖的气相色谱图(GC)；

图6为青稞嫩叶碱提多糖的气相色谱图(GC)；

图7为青稞嫩叶碱提多糖的红外光谱图(FT-IR)；

图8为青稞嫩叶碱提多糖对HT29的抑制率；

图9为青稞嫩叶碱提多糖对4T1的抑制率；

图10为青稞嫩叶碱提多糖对Caco-2的抑制率；

图11为青稞嫩叶碱提多糖对CT26的抑制率；

图12为青稞嫩叶碱提多糖处理后MCF-10A的存活率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种青稞嫩叶碱提多糖的制备方法，提取流程如图1所示，具体实施方法如下：

一、青稞嫩叶粉的制备

在种植盘中铺满约一指厚的营养土，在每个种植盘中均匀种满100g左右用清水浸泡隔夜的青海黄青稞种子，之后用少量营养土覆盖青稞种子，充分浇水至营养土湿透，之后每天浇水少量。待14天到21天左右，青稞嫩叶长度在15cm左右时，将青稞嫩叶从根部剪下，清洗、冷藏、真空冷冻干燥、打粉(研磨、过筛)后收集获得的青稞嫩叶粉。真空冷冻干燥的条件为-50℃，4小时；-35℃，10小时；-10℃，10小时；25℃，24小时。

二、青稞嫩叶碱提粗多糖的制备

脱脂：称取约1g青稞嫩叶粉，包裹于定性滤纸(直径：18cm)中，棉绳捆扎滤纸后将其置于索式脂肪提取器中，50mL石油醚作溶剂进行脱脂。脱脂条件为65℃浸泡90min，70℃抽提120min，80℃回收15min，然后在50℃下烘干即得脱脂粉末样品。

提取：称取约10g去脂后的青稞嫩叶粉于烧杯中，加入300mL去离子水，边搅拌边在80℃水浴条件下提取3h。提取完成后离心，收集上清液，沉淀重新加入300mL去离子水，重复提取3次，收集沉淀备用。按照1：20的比例向沉淀中添加0.5mol/L NaOH溶液，80℃水浴3h；然后用0.5％HCl溶液调节碱提液pH值至6.5，离心取上清。重复提取3次后将三次碱溶液提取的上清液合并，用0.5％的盐酸调节至中性；减压浓缩至180～200mL；将浓缩后的溶液装入透析袋中，并置于1L的纯水中透析48h以上，每12h换一次水；向上清液中加入耐高温α-淀粉酶，80℃水浴30min，100℃下水浴10min灭活；待溶液冷却后加入木瓜蛋白酶，60℃水浴2h，100℃下水浴10min灭活；待溶液冷却后加入糖化酶，60℃水浴1h，100℃下水浴10min灭活，离心，收集上清；

醇沉：将收集的上清液于80℃下水浴浓缩至50mL～100mL，冷却后边搅拌边逐滴加入3～4倍体积的乙醇。溶液静置一天，离心，收集沉淀，用100mL去离子水重新溶解，加入3～4倍体积的乙醇。重复3次之后离心，沉淀用50mL去纯水复溶，在-80℃下冷冻一天，真空冷冻干燥，获得青稞嫩叶碱提粗多糖。

三、青稞嫩叶碱提多糖的制备

称取0.5g粗多糖样品溶于10mL去离子水，55℃金属浴搅拌1h后，然后在4℃下搅拌过夜，离心并吸取上清液滴加至装填有DEAE-32的层析柱上端，用蒸馏水和0.25M、0.5M、1M氯化钠溶液先后洗脱。流速为：0.5mL/min，5min/管收集，各收集80管。每间隔4支试管取样，取0.1mL收集液，加入0.9mL去离子水，加入1mL 5％苯酚溶液后涡旋，加入5mL浓硫酸，涡旋后与空白样品比色并记录吸光度，绘制相应的洗脱曲线如图2。分开合并收集不同洗脱液的有糖组分，氯化钠洗脱的合并液置于透析袋中透析36h，每12h换一次去离子水。将透析完成后的样品溶液浓缩至约5mL，在-80℃下冷冻一天，真空冷冻干燥。由图2可知，由水洗脱的青稞嫩叶多糖从第25管开始出峰，第45管结束；由0.25mol/L NaCl洗脱的多糖从第115管开始出峰，第160管结束；由0.5mol/L NaCl洗脱的多糖没有明显的出峰；由1.0mol/L NaCl洗脱的多糖有三处出峰，分别为：235～245管，260～265管，285～290管。考虑到后两种浓度氯化钠洗脱得到的多糖的峰过小，不予以收集；分别收集水和0.25mol/L NaCl洗脱的溶液，经冷冻干燥后得到两种纯化多糖，得率分别为6.71％和41.73％，前者为纯白色絮状物，后者为黄褐色絮状物。由于水洗脱多糖的得率过低，后续实验均采用0.25mol/L NaCl洗脱得到的多糖。

将冻干后的碱提多糖用去离子水配置成10mg/mL的溶液，过0.45μm滤膜后进样于高效液相色谱仪检测，结果如图3，碱提多糖提取率可达4.58％，纯度可达98.29％，即获得精制青稞嫩叶碱提多糖。检测仪器为e2695高效液相色谱仪，配备Waters 2414示差检测器和SUGAR KS-805

(8.0mm ID×300mm L)糖柱；流动相：超纯水；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测器温度：30℃；进样量：20μL。

实施例2

实施例2说明了青稞嫩叶碱提多糖(由实施例1获得)的物化性质，具体表征方法如下：

分子量分析：取纯化后的青稞嫩叶碱提多糖用去离子水配置成5mg/mL的水溶液，分别取相对分子质量为4400、9900、21400、43500、124000、805000的糖酐标准品同样用去离子水配置成5mg/mL的水溶液，各溶液经0.45μm滤膜后进样检测，检测仪器为EcoSEC HLC-8320GPC。根据各糖酐标准品的出峰时间绘制相应的标准曲线，如图4所示。由相对分子质量的标准曲线可以计算出样品的相对分子质量，如表1所示，其重均分子量Mw及数均分子量Mn分别为371438Da和511475Da，相应多糖分子的多分散性系数(polydispersity index，PDI＝Mw/Mn)为1.38。由于PDI值越接近1，相应物质的均一性越好，可以认为制备的青稞嫩叶碱提多糖样品为相对均一的多糖。

表1青稞嫩叶碱提多糖相对分子质量测定结果

单糖组成：取纯化后的青稞嫩叶碱提多糖样品，配置成500μg/mL青稞多糖溶液。取1mL溶液，加入1mL 20μg/mL的肌醇溶液，涡旋。然后加入0.5mL的三氟乙酸溶液，涡旋。将混合溶液置于120℃下金属浴2h后，在氮气的保护下吹干。之后加入250μL异丙醇，涡旋，氮吹至完全干燥，重复2次。

取六种单糖标准品(鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖)及其混合物分别均配成20μg/mL的溶液。每种溶液各取1mL，加入1mL 20μg/mL的肌醇溶液，涡旋，在氮气的保护下吹干。

对处理后的青稞嫩叶碱提多糖样品和各单糖标准品及混标依次加入100μL氨水、0.5mL 20mg/mL硼氢化钠溶液(二甲基亚砜为溶剂)，充分涡旋。将混合溶液置于40℃中金属浴，90min，然后向混合溶液中滴加6～9冰醋酸，至不再有气泡冒出。向各样品中依次加入100μL 1-甲基咪唑，0.5mL乙酸酐，充分涡旋，室温反应10min。加入4mL去离子水和1mL二氯甲烷，充分涡旋，保留下层的有机相。将上层的水相移至另一试管，加入1mL二氯甲烷，充分涡旋，保留下层的有机相。合并两次获得的有机相并用4mL去离子水洗涤两次，在氮气的保护下吹干，置于冰箱冷藏待测。

用0.6mL丙酮溶解待测样品，充分涡旋后过0.45μm滤膜，用气相色谱仪检测。检测仪器为GC-2010plus气相色谱仪，配备(30meter,0.25mm ID,0.25μm df)色谱柱；进样口温度：240℃；柱温：100℃，2min；10℃/min，升至180℃；180℃，2min；4℃/min，升到240℃；240℃，5min；10℃/min，升到255℃；255℃，5min；载气为氮气，流速为1.9mL/min；进样量：1μL。

由各单糖标准品和肌醇的出峰时间在混标中确定各峰代表的单糖样品，如图5所示。各单糖标准品的出峰顺序依次为：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。色谱图中各峰数据如下表所示。计算可得鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的相对校正因子分别为：2.69、0.84、1.14、1.02、1.22、0.91。

表2单糖标品气相色谱图数据

峰号	组分名	保留时间(μV·min)	面积	峰高(μV)	面积％	校正因子
							1	Rha	17.955	3222.9	805.9	5.845	2.6989
2	Ara	18.26	10342.4	2682.3	18.7568	0.8410
							3	Xyl	18.665	7637.2	1921.1	13.8507	1.1389
4	肌醇	23.174	8698.2	1938.7	15.7748	1.0000
							5	Man	23.515	8519	2126.1	15.4499	1.0210
6	Glu	23.72	7111.7	1495.9	12.8975	1.2231
							7	Gal	23.893	9608.3	2345.8	17.4254	0.9053

青稞嫩叶碱提多糖的气相色谱图如图6所示，由混标的各单糖标准品出峰时间确定了样品中各峰代表的单糖，按出峰时间顺序依次为：阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖，其中以阿拉伯糖和半乳糖为主，含有少量的木糖和葡萄糖，具体出峰信息如表3所示。由混标气相色谱图计算的单糖标准品的相对校正因子可得多糖样品中阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖的含量比，约为6.76:10.00:1.00:2.62。说明该多糖主要由阿拉伯糖和木糖组成，这与小麦、黑麦、裸大麦、燕麦碱提多糖的单糖组成相似，均主要由阿拉伯糖和木糖组成。此外阿拉伯糖和木糖的比例(A/X)为0.68，A/X的值在0.4～1.2范围内的多糖一般为阿拉伯木聚糖，推测青稞嫩叶碱提多糖为阿拉伯木聚糖。

表3青稞嫩叶碱提多糖气相色谱图数据

红外光谱：取5mg青稞嫩叶碱提多糖冻干样品，以与0.75g KBr固体混合均匀，研磨成粉末，然后将粉末压入1mm厚的圆盘中进行压片，使用Nicolet 6700型傅立叶红外变换光谱仪，配备IR装置，扫描区间为4000–400cm^-1进行红外光谱分析。红外光谱如图7所示，其中，3438.12cm-1的吸收峰强度大、峰形宽，是O-H拉伸振动导致的，表明有分子间和分子内的氢键；2934.25cm-1处的吸收峰强度低，是C-H的不对位拉伸振动导致的，表明有不对称的CH2-；1640.96cm-1处的吸收峰表明分子内含有不对称的COO-，1415.91cm-1处的吸收峰也是COO-振动引起的；1253.27cm-1处的吸收峰可能是阿魏酸产生的；1043.73cm-1处的吸收峰表明有木糖存在；898.18cm-1处的吸收峰表明含有β-糖苷键；650～1350cm-1区间的吸收峰是多糖的“指纹”区，对指纹的识别具有较大的作用。

实施例3

本实施例提供了青稞嫩叶碱提多糖(由实施例1获得)在抗癌中的应用，具体实施过程如下：

一、青稞嫩叶碱提多糖对结直肠癌(HT29,Caco-2,CT26)细胞和乳腺癌4T1细胞的增殖抑制作用

将结直肠癌(HT29,Caco-2,CT26)细胞和乳腺癌4T1细胞复苏后，置于含有10％FBS的DMEM培养基中培养，并置于37℃、5％CO₂条件的培养箱中。当细胞长满细胞瓶底部时，使用胰酶将细胞消化，离心，弃去上清，向沉淀中加入2mL培基后，吹打，使用血球计数板计数，并按比例稀释细胞，向96孔板接种细胞(每孔100μL细胞悬液，即5000个细胞)，于培养箱中培养24h。向96孔板中分别加入含青稞嫩叶碱提多糖浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10mg/mL的DMEM培养基，37℃孵育48h。小心吸弃上清液，每孔加0.5mg/mL MTT 100μL，于37℃培养箱继续孵育4h，小心吸去MTT溶液，每孔加入DMSO 100μL，置37℃培养箱中继续孵育10min，振荡器上充分振荡至蓝紫色结晶完全溶解，经全自动酶标仪于570nm处检测各孔的OD值。按如下公式计算细胞活力。细胞活力(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％。结果如图8-11所示，经四种肿瘤细胞初筛后，青稞嫩叶碱提多糖样品对结直肠癌细胞的生长抑制效果不明显，对乳腺癌细胞4T1增殖的抑制作用较为显著。不同浓度的青稞嫩叶碱提多糖溶液(0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL)作用48h后对乳腺癌细胞4T1生长的影响，各组与空白比较得到的抑制率分别为21.17％、28.02％、33.91％、41.38％、53.17％。

二、青稞嫩叶碱提多糖对人源正常乳腺上皮细胞MCF-10A的增殖抑制作用

将人源正常乳腺上皮细胞MCF-10A复苏后，置于含有10％FBS的1640培养基中培养，并置于37℃、5％CO₂条件的培养箱中。当细胞长满细胞瓶底部时，使用胰酶将细胞消化，离心，弃去上清，向沉淀中加入2mL培基后，吹打，使用血球计数板计数，并按比例稀释细胞，向96孔板接种细胞(每孔100μL细胞悬液，即5000个细胞)，于培养箱中培养48h。向96孔板中分别加入含青稞嫩叶碱提多糖浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10mg/mL的1640培养基，37℃孵育24h。小心吸弃上清液，每孔加0.5mg/mL MTT 100μL，于37℃培养箱继续孵育4h，小心吸去MTT溶液，每孔加入DMSO 100μL，置37℃培养箱中继续孵育10min，振荡器上充分振荡至蓝紫色结晶完全溶解，经全自动酶标仪于570nm处检测各孔的OD值。按如下公式计算细胞活力。细胞活力(％)＝实验组OD值/对照组OD值×100％。细胞存活率结果如图12所示，MCF-10A细胞在用青稞嫩叶碱提多糖孵育后，细胞存活率无明显下降趋势。证明青稞嫩叶碱提对正常细胞的增殖并无抑制作用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种青稞嫩叶碱提多糖活性成分的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、将青稞叶真空冷冻干燥、打粉后收集获得青稞嫩叶粉；

S2、将青稞嫩叶粉进行脱脂、水提、碱提、透析、酶解以及醇沉得到青稞嫩叶碱提粗多糖；

S3、将青稞嫩叶碱提粗多糖用纤维素柱进行分离纯化处理即得青稞嫩叶碱提多糖活性成分。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述真空冷冻干燥的条件为-50～-60℃，4～6小时；-35～-40℃，10～15小时；-10～-20℃，10～15小时；20～25℃，24～48小时。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，脱脂过程中以石油醚作溶剂进行脱脂，青稞嫩叶粉与石油醚的比例为1g：40～50ml；脱脂条件为：55～65℃浸泡60～90min，65～85℃抽提90～150min，75～95℃回收10～30min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，水提过程按青稞嫩叶粉和水1:20～1:30的重量投加水，水提温度为80℃～90℃，提取时间为3～5小时；按1:20～1:30的重量比向水提处理所得沉淀中添加0.5～1mol/L的NaOH溶液在60～80℃水浴3～3.5h进行碱提；用0.5％的盐酸将碱提所得上清液调节至6.5～6.8，经60～80℃水浴浓缩后透析48～60h。

5.根据权利要求1所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述酶解采用耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、糖化酶依次进行酶解；将酶解所得上清液浓缩，冷却后加入3～5倍体积的乙醇，静置，离心，收集沉淀；用水复溶，真空冷冻干燥，获得青稞嫩叶碱提粗多糖。

6.根据权利要求1所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述纤维素柱为DEAE-32纤维素离子交换柱，所述DEAE-32纤维素离子交换柱洗脱液为0.25mol/L NaCl，洗脱流速为0.5～0.7mL/min，洗脱时间为500～1000min。

7.一种根据权利要求1所述的方法制备得到的青稞嫩叶碱提多糖活性成分，其分子量为3.71×10⁵Da，多分散指数PDI为1.38。

8.根据权利要求7所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分，其特征在于，所述青稞嫩叶碱提多糖活性成分由含量比为6.76:10.00:1.00:2.6的阿拉伯糖，木糖，葡萄糖和半乳糖组成。

9.一种根据权利要求7所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分在制备抗癌药物中的应用，所述抗癌药物包含抗乳腺癌或结直肠癌药物。

10.一种抗癌药物，其特征在于，包含药学有效量的根据权利要求7所述的青稞嫩叶碱提多糖活性成分。

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