CN112961260A - 一种具有显著抗炎活性龙须菜多糖及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于龙须菜多糖深加工的技术领域，公开了一种具有显著抗炎活性龙须菜多糖及其制备方法与应用。所述方法：将龙须菜多糖、水和H2O2混合，紫外辐照，获得改性的龙须菜多糖；所述龙须菜多糖为热水法提取的龙须菜多糖；龙须菜多糖主要含有半乳糖、葡萄糖和木糖。本发明的方法简单，条件温和，无污染，通过UV/H2O2的处理，且能显著提高龙须菜多糖的抗炎活性。所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖用于制备抗炎药或保健品。
Description
技术领域
本发明属于龙须菜多糖深加工领域，具体涉及一种具有显著抗炎活性龙须菜多糖及其制备方法与应用。
背景技术
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)，又名麒麟菜、发菜、海菜、江蓠菜、凤菜等，系红藻门(Rhodophyta)，江蓠属(Gracilaria)，是一种大型经济药食两用类海藻。龙须菜原产于我国的山东省和辽宁省，现已从青岛引种至福建省和广东省沿海地区，广东省汕头市南澳岛已成为我国龙须菜重点种植基地。《本草纲目》记载“龙须菜，甘，无毒。治瘿，结热气，利小便”，龙须菜作为药食两用类海藻，源于其含有丰富的多糖、蛋白质、脂肪酸、氨基酸、矿物质等功能性成分。
研究发现，龙须菜多糖具有抗氧化，降血糖，降血脂，免疫调节，抗肿瘤等多种生物活性，可广泛应用于食品、保健品行业。近年来，龙须菜多糖的提取与生物活性逐渐被研究者所关注。专利申请CN201010188414.3公开了一种龙须菜提取物及其制备方法和应用，该提取物对DPPH自由基、羟自由基、超氧离子自由基的清除率在90％以上。中国专利CN201410252784.7公开了一种龙须菜多糖提取物及其制备方法与应用，所得多糖具有较好的抑制二肽基肽酶IV的活性，该多糖可应用于降血糖药物或保健品的研发中。中国专利申请CN201610378853.8公开了一种龙须菜多糖的应用，该多糖与化疗药一起使用对胃癌MKN45、肺癌A549和宫颈癌Hela细胞具有较高的抑瘤效果，在应用于抗肿瘤化疗药增效剂的抗肿瘤药物或预防保健品中具有应用前景。中国专利申请CN201810686604.4公开了一种龙须菜多糖的制备方法与应用，运用动态高压微射流技术提取龙须菜多糖，所得多糖对高血脂小鼠的总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸具有明显降低作用，可应用于制备降血脂药物或保健品。目前尚未见文献报道采用UV结合H2O2方法制备龙须菜多糖，并测定其生物活性。
发明内容
针对传统水提龙须菜多糖功效不显著的现状，本发明的目的在于提供一种具有显著抗炎活性的龙须菜多糖及其制备方法。本发明的方法绿色安全无污染，操作简单、经济省时，实用性强；且得到的龙须菜多糖具有显著的抗炎活性，可应用于抗炎药物或保健品。
本发明的另一目的在于提供上述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的应用。所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖用于制备抗炎药物或保健品。
本发明目的由以下技术方案实现：
一种具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，包括以下步骤：
1)将龙须菜多糖、水和H2O2混合，紫外辐照，获得改性的龙须菜多糖。
所述龙须菜多糖为热水法提取的龙须菜多糖。
所述龙须菜多糖的分子量为700-2000kDa；主要含有半乳糖、葡萄糖和木糖；半乳糖∶葡萄糖∶木糖的质量比为(78～81)∶(12～14)∶(1.8～2.4)；所述龙须菜多糖还含有甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，岩藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的质量比为(0.5～0.8)∶(0.15～0.25)∶(1.2～1.5)∶(0.3～0.5)∶(2.2～3.5)。
半乳糖∶岩藻糖的质量比为(78～81)∶(0.5～0.8)。
龙须菜多糖中各单糖组分的总含量满足100％。
龙须菜多糖、水和H2O2混合后，龙须菜多糖的终浓度为2.5～20mg/mL，H2O2的终浓度为25～150mmol/L。
所述紫外辐照的条件为平均辐射量为1000-8000mJ/cm2，辐照时间为5～120min。
紫外辐照后，透析，冷冻干燥。
所述龙须菜多糖的具体制备方法为
S1、原料预处理：将龙须菜经粉碎及超微粉碎，采用乙醇水溶液回流处理，收集沉淀，烘干，得到预处理的龙须菜粉；所述乙醇水溶液的体积分数为90～98％，优选为95％；超微粉碎的时间为1～30min；
S2、龙须菜多糖的提取：将预处理的龙须菜粉通过热水法提取多糖，提取条件为：料液比为1g∶(30～50)mL，提取温度为60～100℃，提取时间为2～6h；提取完后，离心，将上清液浓缩，醇沉，烘干，加水复溶，真空冷冻干燥，获得龙须菜多糖。所述醇沉是指采用乙醇溶液进行沉淀，乙醇溶液为体积分数为95％乙醇溶液。所述烘干的温度为40～55℃。
所述改性的龙须菜多糖通过上述方法得到。所述改性的龙须菜多糖为具有显著抗炎活性的龙须菜多糖。
所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖用于制备抗炎药或保健品。
本发明的有益效果：
本发明的方法简单，条件温和，无污染，通过UV/H2O2的处理，且能显著提高多糖的抗炎活性。
附图说明
图1为实施例1～4以及对比例1～3所制备的多糖对IEC-6产生NO的影响图；
图2为实施例1～4以及对比例1～3所制备的多糖对IEC-6分泌TNF-α的影响图；
图3为实施例1～4以及对比例1～3所制备的多糖对IEC-6分泌IL-6的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细地描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1(无UV/H2O2法处理)
龙须菜多糖的制备：
(1)洗净、烘干、粉碎后的龙须菜经超微粉碎5min后，取100g与400mL 95％乙醇混合，微沸状态下回流2次，共3h，以去除脂质、色素和小分子物质，然后离心收集沉淀并烘干，即为预处理后的龙须菜超微粉。
(2)预处理后龙须菜超微粉按料液比1g∶50mL的比例，采用热水法提取龙须菜多糖，提取条件为100℃下提取2h，提取液经离心后所得上清液经真空旋转蒸发仪浓缩，然后缓慢加入适量95％乙醇使乙醇在溶液中最终体积浓度为80％，搅拌混匀，然后置于4℃静置过夜，次日离心弃上清液，所得沉淀于50℃烘箱中挥干乙醇，加入适量纯水复溶，真空冷冻干燥，即得龙须菜多糖A。本实施例提取的龙须菜多糖的分子量为＞700kDa，单糖组成测定半乳糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分别为79.59％、13.45％、2.16％、0.63％、0.18％、1.33％、0.33％和2.33％。
实施例2
通过UV/H2O2法对龙须菜多糖进行辐照处理：
(1)洗净、烘干、粉碎后的龙须菜经超微粉碎5min后，取100g与400mL 95％乙醇混合，微沸状态下回流2次，共3h，以去除脂质、色素和小分子物质，然后离心收集沉淀并烘干，即为预处理后的龙须菜超微粉。
(2)预处理后龙须菜超微粉按料液比1g∶50mL的比例，采用热水法提取龙须菜多糖，提取条件为100℃下提取2h，提取液经离心后所得上清液经真空旋转蒸发仪浓缩，然后缓慢加入适量95％乙醇使乙醇在溶液中最终体积浓度为80％，搅拌混匀，然后置于4℃静置过夜，次日离心弃上清液，所得沉淀于50℃烘箱中挥干乙醇，加入适量纯水复溶，真空冷冻干燥，即得龙须菜多糖。本实施例提取的龙须菜多糖的分子量为＞700kDa，单糖组成测定半乳糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分别为79.59％、13.45％、2.16％、0.63％、0.18％、1.33％、0.33％和2.33％。
(3)取适量上述所得龙须菜多糖，溶解于含有H2O2的纯水中，使得多糖终浓度为10mg/mL，H2O2终浓度为50mmol/L；然后将其置于紫外光下进行辐照处理5min(辐照的强度为6500mJ/cm2)，透析48h(500Da截留透析袋)，冷冻干燥后，记为B1。
实施例3
通过UV/H2O2法对龙须菜多糖溶液进行辐照处理：
(1)洗净、烘干、粉碎的龙须菜经超微粉碎10min后，取100g与400mL95％乙醇混合，微沸条件下回流2次，共3h，以去除脂质、色素和小分子物质，然后离心收集沉淀并烘干，即为预处理后的龙须菜粉。
(2)预处理后龙须菜粉按料液比1g∶40mL的比例，采用热水法提取龙须菜多糖，提取条件为100℃下提取3h，提取液经离心后所得上清液经真空旋转蒸发仪浓缩，然后缓慢加入适量95％乙醇使乙醇在溶液中最终体积浓度为80％，搅拌混匀，然后置于4℃静置过夜，次日离心弃上清液，所得沉淀于50℃烘箱中挥干乙醇，加入适量纯水复溶，真空冷冻干燥，即得龙须菜多糖。本实施例提取的龙须菜多糖的分子量为＞700kDa，单糖组成测定半乳糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分别为79.28％、13.01％、2.29％、0.58％、0.16％、1.41％、0.36％和2.91％。
(3)取适量上述所得龙须菜多糖，溶解于含有H2O2的纯水中，使得多糖终浓度为5.0mg/mL，H2O2终浓度为100mmol/L；然后将其置于紫外光下进行辐照处理30min(辐照的强度为5500mJ/cm2)，透析48h(500Da截留透析袋)，冷冻干燥后，记为B2。
实施例4
通过UV/H2O2法对龙须菜多糖溶液进行辐照处理：
(1)洗净、烘干、粉碎后的龙须菜经超微粉碎15min后，取100g与400mL 95％乙醇混合，微沸状态下回流3h，以去除脂质、色素和小分子物质，然后离心收集沉淀并烘干，即为预处理后的龙须菜粉。
(2)预处理后龙须菜粉按料液比1g∶30mL的比例，采用热水法提取龙须菜多糖，提取条件为100℃下提取4h，提取液经离心后所得上清液经真空旋转蒸发仪浓缩，然后缓慢加入适量95％乙醇使乙醇在溶液中最终体积浓度为80％，搅拌混匀，然后置于4℃静置过夜，次日离心弃上清液，所得沉淀于50℃烘箱中挥干乙醇，加入适量纯水复溶，真空冷冻干燥，即得龙须菜多糖。本实施例提取的龙须菜多糖的分子量为＞700kDa，单糖组成测定半乳糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分别为78.92％、12.98％、2.02％、0.65％、0.23％、1.39％、0.45％和3.36％。
(3)取适量上述所得龙须菜多糖，溶解于含有H2O2的纯水中，使得多糖终浓度为20.0mg/mL，H2O2终浓度为150mmol/L；然后将其置于紫外光下进行辐照处理120min(辐照的强度为6500mJ/cm2)，透析48h(500Da截留透析袋)，冷冻干燥后，记为B3。
对比例1
通过UV/H2O2法对裙带菜多糖进行辐照处理：
(1)洗净、烘干、粉碎后的裙带菜经超微粉碎5min后，取100g与400mL 95％乙醇混合，微沸状态下回流2次，共3h，以去除脂质、色素和小分子物质，然后离心收集沉淀并烘干，即为预处理后的裙带菜超微粉。
(2)预处理后裙带菜超微粉按料液比1g∶50mL的比例，采用热水法提取裙带菜多糖，提取条件为100℃下提取2h，提取液经离心后所得上清液经真空旋转蒸发仪浓缩，然后缓慢加入适量95％乙醇使乙醇在溶液中最终体积浓度为80％，搅拌混匀，然后置于4℃静置过夜，次日离心弃上清液，所得沉淀于50℃烘箱中挥干乙醇，加入适量纯水复溶，真空冷冻干燥，即得裙带菜多糖。
(3)取适量上述所得裙带菜多糖，溶解于含有H2O2的纯水中，使得多糖终浓度为10mg/mL，H2O2终浓度为50mmol/L；然后将其置于紫外光下进行辐照处理5min(辐照的强度为6500mJ/cm2)，透析48h(500Da截留透析袋)，冷冻干燥后，记为C1。
对比例2
按以下步骤制备龙须菜多糖：
(1)洗净、烘干、粉碎后的龙须菜经超微粉碎5min后，取100g与400mL 95％乙醇混合，微沸状态下回流2次，共3h，以去除脂质、色素和小分子物质，然后离心收集沉淀并烘干，即为预处理后的龙须菜超微粉。
(2)预处理后龙须菜超微粉按料液比1g∶50mL的比例，采用热水法提取龙须菜多糖，提取条件为100℃下提取2h，提取液经离心后所得上清液经真空旋转蒸发仪浓缩，然后缓慢加入适量95％乙醇使乙醇在溶液中最终体积浓度为80％，搅拌混匀，然后置于4℃静置过夜，次日离心弃上清液，所得沉淀于50℃烘箱中挥干乙醇，加入适量纯水复溶，真空冷冻干燥，即得龙须菜多糖。
(3)取适量上述所得龙须菜多糖，溶解于含有H2O2的纯水中，使得多糖终浓度为10mg/mL，H2O2终浓度为50mmol/L，然后静置5min，透析48h(500Da截留透析袋)，冷冻干燥后，记为C2。
对比例3
按以下步骤制备龙须菜多糖：
(1)洗净、烘干、粉碎后的龙须菜后，取100g与400mL 95％乙醇混合，微沸状态下回流2次，共3h，以去除脂质、色素和小分子物质，然后离心收集沉淀并烘干，即为预处理后的龙须菜粗粉。
(2)预处理后龙须菜粗粉按料液比1g∶50mL的比例，采用热水法提取龙须菜多糖，提取条件为100℃下提取2h，提取液经离心后所得上清液经真空旋转蒸发仪浓缩，采用传统Savage法脱蛋白，然后收集多糖溶液层，缓慢加入适量95％乙醇使乙醇在溶液中最终体积浓度为80％，搅拌混匀，然后置于4℃静置过夜，次日离心弃上清液，所得沉淀于50℃烘箱中挥干乙醇，加入适量纯水复溶，真空冷冻干燥，即得龙须菜多糖，记为C3。
性能测试：
将实施例1、2、3和4方法制得的龙须菜多糖A、B1、B2和B3以及对比例1、2和3方法制得的多糖样品C1、C2和C3进行抗炎活性对比：
(1)细胞培养：将IEC-6细胞接种在含有10％胎牛血清，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素，0.1IU/mL胰岛素的DMEM培养基中，放在37℃，含有5％CO2的恒温培养箱中培养。间隔2～3天更换培养液，待其贴壁生长到所用培养瓶底面积的80％～90％时进行传代，用于后续实验。
(2)MTT细胞活力实验：将IEC-6细胞从培养瓶中转移至96孔板中，通过细胞计数按照细胞密度1×104个/孔，每孔100μL，随后放置在37℃，含有5％CO2的恒温培养箱中进行培养。待细胞贴壁后弃培养基，加入用完全培养基配成不同浓度的龙须菜多糖(0，6.25，12.5，25，50，100，200，400μg/mL)，每个浓度梯度设置5个复孔，进行24h的培养处理后将培养液弃掉，每孔加入50μL 1×MTT溶液，在37℃孵育4h，使MTT还原为甲臜；随后吸出上清液，每孔加入150μL DMSO使甲臜溶解，用平板摇床摇匀，采用酶标仪在570nm波长处检测每孔的吸光度；计算不同浓度与对照组吸光度的比值，根据细胞活力值来判断用龙须菜多糖处理IEC-6细胞的最佳浓度。
(3)NO和炎症因子含量测定：将IEC-6细胞从培养瓶中转移至12孔板中，通过细胞计数按照细胞密度4×105个/孔，随后放置在37℃，含有5％CO2的恒温培养箱中进行培养。根据MTT实验结果，确定高中低三个浓度，向各孔加入用完全培养基配好的龙须菜粗多糖A和样品C2、C3(6.25，12.5，25μg/mL)，B1、B2、B3、C1(50，100，200μg/mL)和空白培养基；预培养6h后，加入LPS使得其终浓度为100μg/mL，混合均匀后继续孵育24h，收集上清液测定NO和细胞炎症因子的含量；其中未加LPS的为对照组(Control)，只加LPS的为模型组(Model)。NO的测定采用NO检测试剂盒(Griess试剂比色法)，采用酶标仪读取波长为540nm处的吸光值；TNF-α和IL-6的测定采用ELISA试剂盒。测试结果如图1～3所示。
图1为实施例1～4以及对比例1～3所制备的多糖对IEC-6产生NO的影响图；图2为实施例1～4以及对比例1～3所制备的多糖对IEC-6分泌TNF-α的影响图；图3为实施例1～4以及对比例1～3所制备的多糖对IEC-6分泌IL-6的影响图。*表示与模型组存在显著性差异。
NO、TNF-α和IL-6是炎症产生的关键指标，由图1、图2和图3显示，Model组IEC-6产生的NO含量和分泌的TNF-α和IL-6的含量远远高于Control组，表示炎症模型造模成功。与无处理龙须菜多糖相比，UV/H2O2处理后的龙须菜多糖B1可以显著抑制NO和炎症因子TNF-α和IL-6的产生，抑制率分别达到60.49％、62.81％和36.29％；UV/H2O2处理后的龙须菜多糖B2可以显著抑制NO和炎症因子TNF-α和IL-6的产生，抑制率分别达到55.19％、52.04％和43.10％；UV/H2O2处理后龙须菜多糖的B3可以显著抑制NO和炎症因子TNF-α和IL-6的产生，抑制率分别达到53.56％、55.38％和42.85％。然而，未处理的龙须菜粗多糖A、UV/H2O2处理后裙带菜多糖的C1、仅用H2O2处理的组分C2和传统方法脱蛋白的龙须菜粗多糖C3仅在高浓度下表现出一定的抗炎活性。UV/H2O2处理时，紫外辐照强度和辐照时间以及过氧化氢浓度对龙须菜多糖的分子量和抗炎活性影响较大，综上说明，H2O2结合UV处理是一种可行且有效地提高龙须菜多糖抗炎活性的方法。
Claims (9)
1.一种具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将龙须菜多糖、水和H2O2混合，紫外辐照，获得改性的龙须菜多糖；
所述龙须菜多糖为热水法提取的龙须菜多糖；所述龙须菜多糖主要含有半乳糖、葡萄糖和木糖；半乳糖∶葡萄糖∶木糖的质量比为(78～81)∶(12～14)∶(1.8～2.4)。
2.根据权利要求1所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，其特征在于：所述龙须菜多糖的分子量为700-2000kDa；所述龙须菜多糖还含有甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，岩藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的质量比为(0.5～0.8)∶(0.15～0.25)∶(1.2～1.5)∶(0.3～0.5)∶(2.2～3.5)。
3.根据权利要求1所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，其特征在于：龙须菜多糖、水和H2O2混合后，龙须菜多糖的终浓度为2.5～20mg/mL，H2O2的终浓度为25～150mmol/L。
4.根据权利要求1所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，其特征在于：所述紫外辐照的条件为平均辐射量为1000-8000mJ/cm2，辐照时间为5～120min。
5.根据权利要求1所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，其特征在于：
所述龙须菜多糖的具体制备方法为：
S1、原料预处理：将龙须菜经粉碎及超微粉碎，采用乙醇水溶液回流处理，收集沉淀，烘干，得到预处理的龙须菜粉；
S2、龙须菜多糖的提取：将预处理的龙须菜粉通过热水法提取多糖，提取条件为：料液比为1g∶(30～50)mL，提取温度为60～100℃，提取时间为2～6h；提取完后，离心，将上清液浓缩，醇沉，烘干，加水复溶，真空冷冻干燥，获得龙须菜多糖。
6.根据权利要求5所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述乙醇水溶液的体积分数为90～98％；
步骤S2中，所述醇沉是指采用采用乙醇溶液进行沉淀；所述烘干的温度为40～55℃。
7.根据权利要求1所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的制备方法，其特征在于：紫外辐照后，透析，冷冻干燥。
8.一种由权利要求1～7任一项所述制备方法得到的具有显著抗炎活性的龙须菜多糖。
9.根据权利要求1所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖的应用，其特征在于：所述具有显著抗炎活性的龙须菜多糖用于制备抗炎药或保健品。
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