CN115028751B - 一种天山雪莲多糖的制备方法及其用途 - Google Patents

一种天山雪莲多糖的制备方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种天山雪莲多糖的制备方法及其用途。该方法取天山雪莲全草，粉碎、提取、浓缩后，经乙醇沉淀后获得雪莲粗多糖，再将粗多糖进行纯化，分别脱蛋白，离子交换柱和凝胶柱层析分离得到酸性均一天山雪莲多糖，该多糖平均分子量为237.57kDa，包含鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖等单糖。通过本发明所述方法获得的天山雪莲多糖，纯度高，经检测表明：具有优异的祛斑美白活性。

Description

一种天山雪莲多糖的制备方法及其用途
技术领域
本发明属于雪莲多糖制备工艺技术领域，涉及一种雪莲多糖的制备方法及其用途。
背景技术
在日常紫外线的照射下，人表皮内产生过多自由基，致使细胞发生氧化应激损伤，继而促进酪氨酸酶活性，最终导致黑色素增多而沉着。酪氨酸酶是催化黑色素生成的关键酶，黑色素是一种主要分布在人体表皮细胞和角质细胞中的高分子生物色素，决定了人的肤色和发色。然而，当黑色素积累过多时，不但会引起色斑、雀斑等问题，还有可能发生癌变，产生黑色素瘤。因此，可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等疾病的药物及化妆品研发受到研究人员的重视。如今市面上具有美白和抗氧化功效的成分主要以小分子化合物为主，如熊果苷、氢醌和曲酸等，以上化合物虽具有良好的美白和抗氧化效果，但有一定副作用，从绿色草本植物中提取的美白活性成分相对安全、温和，同时也越来越受到消费者青睐。
多糖是由各种单糖通过糖苷键结合而组成的天然高分子碳水化合物，其广泛存在于动物，植物，微生物及海藻等机体中。研究表明，多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、促进免疫等方面都具有生物活性。另外，天然植物多糖对人体较为安全，吸收、利用率较高。因此，随着分子生物学的发展，多糖所具有的各种生理功能逐渐为人们所重视，尤其是增强免疫力的功能被广泛认同。
雪莲是中国著名的珍贵药材，广泛分布于新疆、西藏、青海、甘肃等高海拔地区，因其具有良好的生物活性而备受关注。天山雪莲是新疆特有的一种名贵的生草本植物，为新疆稀有名贵中草药，生长于新疆天山海拔3000米以上终年积雪的悬崖峭壁上。雪莲从种子萌发到抽苔、开花需要6-8年时间，最后1年7月到8月开花，特殊的生长环境使其天然而稀有，并造就其独特神奇的药理作用。
雪莲多糖是雪莲中主要活性成分之一，然而目前关于天山雪莲多糖的研究十分匮乏，至今还没有关于从天山雪莲中提取纯化获得均一多糖并对其美白作用的研究报道。因此，本发明从天山雪莲中制备获取一种均一多糖使其质量、性质相对稳定并活性更显著，为新疆雪莲资源高效利用和开发提供了新途径。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种天山雪莲多糖的制备方法及其用途，该方法取天山雪莲全草，粉碎、提取、浓缩后，经乙醇沉淀后获得雪莲粗多糖，再将粗多糖进行纯化，分别脱蛋白，离子交换柱和凝胶柱层析分离得到酸性均一天山雪莲多糖，该多糖平均分子量为237.57kDa，包含鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖等单糖。通过本发明所述方法获得的天山雪莲多糖，纯度高，经检测表明：具有优异的祛斑美白活性。
本发明所述的一种天山雪莲多糖的制备方法，按下列步骤进行：
a、将选取的天山雪莲全草药材进行粉碎得到雪莲全草粉，加入料液比为1:10-1:50的水，在温度为60-90℃水中提取2次，提取时间为1.5-3.5小时，过滤，合并上清液，得到总提取液；
b、将步骤a得到的总提取液进行浓缩，温度为40-60℃，得到浓缩至原提取液的1/40—1/10浓缩液；
c、按体积比为1:3-5将步骤b得到得浓缩液与食用酒精沉淀并过夜，再将沉淀物离心或抽滤，得到沉淀物；
d、将步骤c得到的沉淀物用食用酒精洗涤，温度为20-55℃干燥，粉碎得到粗提取物；
e、将步骤d得到的粗提取物经Sevag法脱蛋白3-5次，透析，透析袋内的部分采用DEAE-650M或DEAE-52纤维素柱层析，依次用纯化水及0.1—0.8mol/L的NaC1溶液梯度洗脱，收集以0.4mol/L的NaCl为洗脱液的纯化组分；再用SephadexG-150凝胶柱或Sephacryl S-300为分离柱，蒸馏水为流动相进行第二次纯化，并收集组分，冷冻干燥，得到酸性天山雪莲多糖。
所述方法获得的天山雪莲多糖在制备美白化妆品中的用途。
附图说明
图1为本发明雪莲多糖对B16F10小鼠黑素瘤细胞活率的影响图；
图2为本发明雪莲多糖对FSK诱导B16F10小鼠黑素瘤细胞黑色素含量的影响(与FSK模型对照组比**P<0.01,***P<0.001,****<0.0001)图；
图3为本发明雪莲多糖对FSK诱导B16F10小鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响(与FSK模型对照组比*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****<0.0001)图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施列对本发明做进一步说细描述，且所描述的施例是仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
a、将选取的天山雪莲全草药材50克进行粉碎得到雪莲全草粉，加入原料重量的20倍纯净水1000mL，在温度70℃水中提取2次，提取时间为1.5小时，过滤，合并两次的上清液，得到总提取液；
b、将步骤a得到的总提取液进行浓缩，采用旋转蒸发仪在温度50℃下进行减压浓缩至1/10体积，得到浓缩液；
c、将步骤b得到得浓缩液用4倍体积的食用酒精沉淀并过夜，再将沉淀物离心，得到沉淀物；
d、将步骤c得到的沉淀物用食用酒精洗涤，温度为50℃干燥，粉碎得到粗提取物；即为雪莲多糖粗品9.8g，多糖提取率为19.6％；分析结果表明，提取物的多糖含量为22.5％，蛋白质含量为23.1％；
e、将步骤d得到的粗提取物经Sevag法脱蛋白4次，用3500Da的透析袋透析48h；透析袋内的部分采用DEAE-650M纤维素柱层析，依次用纯化水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L和0.8mol/L的NaC1溶液梯度洗脱，收集0.4mol/L的NaC1溶液洗脱液，用3500Da的透析袋透析48h；再用SephadexG-150凝胶柱，蒸馏水为流动相进行第二次纯化，以纯化水洗脱，并收集组分，冷冻干燥，得到酸性天山雪莲多糖。
实施例2
a、将选取的天山雪莲全草药材50克进行粉碎得到雪莲全草粉，加入原料重量的25倍纯净水1250ml，在温度为80℃水中提取2次，提取时间为2.5小时，过滤，合并两次的上清液，得到总提取液；
b、将步骤a得到的总提取液进行浓缩，采用旋转蒸发仪在温度45℃下对提取液进行减压浓缩至1/30体积，得到浓缩液；
c、将步骤b得到得浓缩液用4倍体积的食用酒精中沉淀并过夜，将沉淀物抽滤，得到沉淀物；
d、将步骤c得到的沉淀物用食用酒精洗涤，温度为55℃干燥，粉碎得到粗提取物；即为雪莲多糖粗品10.5g，多糖提取率为21％；分析结果表明，提取物的多糖含量为23.15％、蛋白质含量为24.5％；
e、将步骤d得到的粗提取物经Sevag法脱蛋白3次，用3500Da的透析袋透析48h，透析袋内的部分采用DEAE-650M纤维素柱层析，依次用纯化水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L和0.8mol/L的NaC1溶液梯度洗脱，收集以0.4mol/L的NaC1溶液洗脱液，用3500Da的透析袋透析48h；再用Sephacryl S-300分离柱，蒸馏水为流动相进行第二次纯化，以纯化水洗脱，并收集洗脱液组分，冷冻干燥，得到酸性天山雪莲多糖。
实施例3
a、将选取的天山雪莲全草药材50克进行粉碎得到雪莲全草粉，加入原料重量的30倍纯净水1500ml，于温度85℃提取2次，每次提取3.0h；过滤，合并2次上清液，得到总提取液；
b、将步骤a得到的总提取液进行浓缩，采用旋转蒸发仪在温度40℃下对提取液进行减压浓缩至1/35体积，得到浓缩液；
c、将步骤b得到得浓缩液在4.5倍体积的食用酒精中沉淀并过夜，将沉淀物离心，得到沉淀物；
d、将步骤c得到的沉淀物用食用酒精洗涤，温度为20℃干燥，粉碎得雪莲提取物，即为雪莲多糖粗品9.45g，多糖提取率为18.9％；分析结果表明，提取物的多糖含量为24.15％、蛋白质含量为22.7％；
e、将步骤d得到的粗提取物经Sevag法脱蛋白5次，用3500Da的透析袋透析48h，透析袋内的部分采用DEAE-52纤维素柱层析，依次用纯化水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L和0.8mol/L的NaC1溶液梯度洗脱，收集以0.4mol/L的NaC1溶液洗脱液，用3500Da的透析袋透析48h；再用Sephacryl S-300为分离柱，蒸馏水为流动相进行第二次纯化，并收集洗脱液组分，冷冻干燥，得到酸性天山雪莲多糖。
实施例4
a、将选取的天山雪莲全草药材50克进行粉碎得到雪莲全草粉，加入原料重量的50倍纯净水2500ml，于温度90℃提取2次，每次提取1.5h，过滤、合并2次上清液，得到总提取液；
b、将步骤a得到的总提取液进行浓缩，采用旋转蒸发仪在60℃下对提取液进行减压浓缩至1/30体积，得到浓缩液；
c、将步骤b得到得浓缩液在4倍体积的食用酒精中沉淀并过夜，将沉淀物抽滤，得到沉淀物；
d、将步骤c得到的沉淀物用食用酒精洗涤，温度为50℃干燥、粉碎得到粗提取物；即为雪莲多糖粗品7.60g，多糖提取率为15.2％；分析结果表明，提取物的多糖含量为20.10％、蛋白质含量为19.7％；
e、将步骤d得到的粗提取物经Sevag法脱蛋白4次，用3500Da的透析袋透析48h，透析袋内的部分采用DEAE-52纤维素柱层析，依次用纯化水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L和0.8mol/L的NaC1溶液梯度洗脱，收集以0.4mol/L的NaC1溶液洗脱液，用3500Da的透析袋透析48h；再用SephadexG-150凝胶柱，蒸馏水为流动相进行第二次纯化，以纯化水洗脱，收集的洗脱液组分，冷冻干燥，得到酸性天山雪莲多糖。
实施例5
a、将选取的天山雪莲全草药材50克进行粉碎得到雪莲全草粉，加入原料重量的10倍纯净水500ml，于温度60℃提取2次，每次提取2.0h，过滤，合并2次上清液，得到总提取液；
b、将步骤a得到的总提取液进行浓缩，采用旋转蒸发仪在50℃下对提取液进行减压浓缩至1/20体积，得到浓缩液；
c、将步骤b得到得浓缩液用4倍体积的食用酒精中沉淀并过夜，将沉淀物离心，得到沉淀物；
d、将步骤c得到的沉淀物用食用酒精洗涤，温度为20℃干燥、粉碎得到粗提取物；即为雪莲多糖粗品6.50g，多糖提取率为13.0％；分析结果表明，提取物的多糖含量为17.10％、蛋白质含量为18.7％；
e、将步骤d得到的粗提取物经Sevag法脱蛋白4次，透析袋内的部分采用DEAE-650M纤维素柱层析，依次用纯化水、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L和0.8mol/L的NaC1溶液梯度洗脱，收集以0.4mol/L的NaC1溶液洗脱液，用3500Da的透析袋透析48h；再用SephadexG-150凝胶柱，蒸馏水为流动相进行第二次纯化，以纯化水洗脱，收集的洗脱液组分，冷冻干燥，得到酸性天山雪莲多糖。
实施例6
CCK-8法测定评价雪莲多糖对B16F10细胞毒性：
小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16F10细胞传代后在含10％胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基DMEM中培养，将1×104个/孔B16F10细胞接种于96孔板，培养24h，将0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL不同浓度雪莲多糖加入96孔板中，处理细胞48h，采用CCK-8法测定细胞存活率，结果见表1，图1所示：
表1.雪莲多糖对B16F10小鼠黑素瘤细胞活率的影响
Figure BDA0003695052040000051
注：多糖样品在加入细胞之前已使用0.22μM滤过膜过滤除菌：
从表1中看出：0.1-1mg/mL浓度的天山雪莲多糖对细胞无毒性，该结果表明，在0.1-1mg/mL浓度的雪莲多糖作用于B16F10细胞是属安全浓度范围。
实施例7
B16F10小鼠黑素瘤细胞的细胞内黑色素含量测定：
小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16F10细胞传代后在含10％胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基DMEM中培养，将1×105个/孔B16F10细胞接种于6孔板，培养24h，B16-F10细胞经曲酸(Kojic Acid)，雪莲多糖处理0.5h后,加入4μM毛喉素(FSK)继续培养72h后收集样本，用100μL细胞裂解液(RIPA)进行裂解，离心后去上清，加入200μL含有10％二甲基亚砜(DMSO)的1MNaOH，置于温度80℃水浴1h，在405nm处检测吸光度，每组重复3次，计算黑色素相对含量和黑色素生成抑制率；
结果表明：与空白对照组比较，毛喉素(FSK)色素沉着模型组细胞黑色素含量显著增加；与毛喉素(FSK)色素沉着模型组比较，结果见表2，图2；
表2.雪莲多糖对FSK诱导B16F10小鼠黑素瘤细胞黑色素含量的影响
Figure BDA0003695052040000052
注：多糖样品在加入细胞之前已使用0.22μM滤过膜过滤除菌：
从表2中可以看出：不同浓度的雪莲多糖组黑色素含量显著减少，雪莲多糖在0.1-1mg/mL具有显著地抑制黑色素生成活性，在0.1mg/mL浓度时黑色素含量抑制率39.4％，高于同浓度阳性对照药的抑制率22.8％，随着浓度增加至0.5mg/mL时抑制率也上升至54.7％，在雪莲多糖浓度为1mg/mL时，对黑色素含量的抑制率可达到60％，具有显著的抑制黑色素生成活性。
实施例8
对B16F10小鼠黑素瘤细胞的细胞内酪氨酸酶活性测定：
小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16F10细胞传代后在含10％胎牛血清(FBS)的高糖细胞培养基DMEM中培养，将1×105个/孔B16F10细胞接种于6孔板，培养24h，B16F10细胞经曲酸(Kojic Acid)，雪莲多糖处理0.5h后,加入4μM毛喉素(FSK)继续培养48h后收集样本，用含1％曲拉通(Triton X-100)和1％脱氧胆酸钠的缓冲液(PBS)pH 6.8)裂解30min，取10μL裂解液加入10μL左旋多巴(L-DOPA)10mM中，温度37℃避光反应30min，在475nm进行测定，计算酪氨酸酶的相对活性和酪氨酸酶活性的抑制率，结果见表3、图3；
表3.雪莲多糖对FSK诱导B16F10小鼠黑素瘤细胞相酪氨酸酶活性的影响
Figure BDA0003695052040000061
注：多糖样品在加入细胞之前已使用0.22μM滤过膜过滤除菌：
从表3中可以看出：与空白对照组比较，毛喉素(FSK)色素沉着模型组细胞酪氨酸酶活性增加至123％；与毛喉素(FSK)色素沉着模型组比较，不同浓度天山雪莲多糖组细胞酪氨酸酶活性均降低，0.1-1mg/mL雪莲多糖能显著地抑制细胞酪氨酸酶的活性；浓度为0.1mg/mL时，雪莲多糖对毛喉素(FSK)诱导B16F10细胞酪氨酸酶活性的抑制率可达到13.1％，优于阳性对照药抑制率9.6％，在浓度为0.5mg/mL时，雪莲多糖对毛喉素(FSK)诱导B16F10细胞酪氨酸酶活性的抑制率可达到16.7％，浓度上升至1mg/mL时，抑制率可达19％，具有良好的抑制酪氨酸酶活性。

Claims (1)

1.一种天山雪莲多糖在制备美白化妆品中的用途，其特征在于，所述天山雪莲多糖的制备方法，按下列步骤进行：
a、将选取的天山雪莲全草药材进行粉碎得到雪莲全草粉，加入料液比为1:10-1:50的水，在温度为60-90℃水中提取2次，提取时间为1.5-3.5小时，过滤，合并上清液，得到总提取液；
b、将步骤a得到的总提取液进行浓缩，温度为40-60℃，得到浓缩至原提取液的1/40—1/10浓缩液；
c、按体积比为1:3-5将步骤b得到的浓缩液与食用酒精沉淀并过夜，再将沉淀物离心或抽滤，得到沉淀物；
d、将步骤c得到的沉淀物用食用酒精洗涤，温度20-55℃干燥，粉碎得到粗提取物；
e、将步骤d 得到的粗提取物经Sevag 法脱蛋白3-5次，透析，透析袋内的部分采用DEAE-650M或DEAE-52 纤维素柱层析，依次用纯化水及0.1—0.8mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，收集以0.4mol/L的NaCl为洗脱液的纯化组分；再用SephadexG-150凝胶柱或SephacrylS-300为分离柱，蒸馏水为流动相进行第二次纯化，并收集组分，冷冻干燥，得到酸性天山雪莲多糖。
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