CN110317844B - 一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽胶低聚糖及其制备方法和用途 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽胶低聚糖及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种亚麻籽抗氧化抗癌活性低聚糖及其制备方法。将适量的亚麻籽粗多糖用双氧水溶液溶解，在高温高压下水解，利用纤维素酶降解亚麻籽多糖，然后依次用减压过滤、透析、旋转蒸发浓缩和冷冻干燥获得所述产物。本发明亚麻籽低聚糖及其方法，纯度均一，对正常细胞的生长无不良影响，对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞HepG2的生长均表现出明显的抑制作用，可用于抗癌产品的开发。

Description

一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽胶低聚糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及到一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽低聚糖及其制备的方法和用途，属于食品加工领域。
背景技术
亚麻是我国重要的六大油料作物之一，也是西北高寒地区、华北地区的特色经济作物。我国是亚麻生产大国，种植面积和总产量居世界第二位，亚麻籽油年产值超过了30亿。亚麻籽具有很高的营养价值，并富含多种生物活性物质。亚麻籽多糖分子量巨大、特性不稳定、结构组成复杂，较难穿越机体各种屏障直接发挥功效,因而大大限制了其在食品化学中的应用。近年来，越来越多的研究表明，低聚糖能与蛋白质、脂类和多肽等形成糖缀合物参与生命活动。
功能性低聚糖作为新兴生理活性物质，具有低热量、稳定、无毒等优点，在医药、食品、化妆品、畜牧业等领域的应用广泛，尤其是参与免疫功能的调节，在恶性肿瘤治疗和防治方面具有巨大的潜能。近年来恶性肿瘤极大的危害人类的人体健康，发病率极高，治愈率低，因此人们对天然抗癌药物的研究逐渐的深入和关注。一些研究表明香菇子实体低聚糖、木耳低聚糖、冬虫低聚糖都被证明有明显的航肿瘤活性和免疫活性。
低聚糖可以直接从天然动植物体中提取，也可以通过化学合成或者酶解、酸解天然多糖等方法制备。其中，直接提取得到低聚糖效率低，含杂多；通过化学方法合成的低聚糖虽然得率较高，但成本高，污染大。而通过酶解或酸解多糖制备低聚糖是目前应用较为广泛、研究较全面的一种方式，具有效率高，特异性好，对环境友好等优势。亚麻籽多糖分子量巨大，结构组成复杂，糖链连接方式特异，目前使用生物酶无法降解亚麻籽多糖。另一方面，亚麻籽多糖虽能被双氧水高温水解，但降解效果差，产物得率低，还原糖含量低，大大影响了其生物活性。而在本发明中发现的具有抗肿瘤活性的亚麻籽低聚糖并未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽胶低聚糖及其制备方法和用途。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)取亚麻籽粗多糖溶解在过氧化氢水溶液中，料液比为1：100～2：100，放入高压蒸汽灭菌锅中水解1h-2h，得到水解糖液；
(2)将将步骤(1)所得水解液中添加果胶酶或者纤维素酶进行酶解反应，得到酶解的产物，即亚麻籽胶低聚糖粗提液；
(3)将步骤(2)所得亚麻籽胶低聚糖粗提液进行减压过滤，所得滤液再进行透析处理后，得到亚麻籽低聚糖液；
(4)将步骤(3)所得亚麻籽低聚糖液经浓缩、冷冻干燥后，得到亚麻籽低聚糖的固体粉末，即具有抗肿瘤活性的亚麻籽低聚糖(FGOS)。
按上述方案，所述步骤(1)中过氧化氢水溶液的浓度为0.15mol/L-0.2mol/L。
按上述方案，所述步骤(2)中酶浓度20-100u/ml，在pH为3.5-5.5的范围内，温度40- 60℃酶解反应4-12h。
按上述方案，所述步骤(3)中透析时的截留分子量为0-500Da，处理时间优选为20-24h，每3-5h换一次水。
按上述方案，所述步骤(4)中浓缩采用旋转蒸发仪，温度为40-60℃，转速50-150rpm；冷冻干燥的温度为-50℃，真空度为50Pa，冻干时间为48h。
上述制备方法所得的具有抗肿瘤活性的亚麻籽低聚糖，为接近白色的固体粉末，有特殊香味，易溶于水，易吸湿；经红外光谱分析显示FGOS是具有吡喃糖环结构的糖类物质；经 HPLC-SEC测定的平均分子量为1.5kDa；经单糖组成成分分析是有甘露糖、半乳糖、葡萄糖，阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，木糖，鼠李糖，核糖，半乳糖醛酸，摩尔比分别为34.91％，27.3％，22.86％，5.21％，5.43％，1.06％，1.21％，0.37％和1.66％。
[体外抗氧化检测]
将本发明所得的FGOS配制成不同浓度溶液，分别进行羟自由基清除检测、DPPH自由基清除检测和ABTS自由基清除检测，以葡萄糖溶液为阴性对照，Vc溶液作为阳性对照，结果显示，FGOS相比于阳性对照Vc在相同的浓度下，其羟自由基、DPPH自由基和ABTS 自由基清除能力低尚有较大差距，但相比于FG和对照葡萄糖，FGOS自由基清除能力明显较强。
[抗肿瘤活性检测]
1、细胞毒性检测：将本发明所得的FGOS配制成不同梯度溶液分别加入到生长状态良好的癌细胞(Hela和HepG2)以及正常细胞(RAW264.7)，FG处理组作为阴性对照，菊粉inulin处理组作为阳性对照，利用MTT检测样品对细胞的抑制率；2、本发明所述方法制备的FGOS对正常细胞RAW264.7生长无不良影响，对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞 HepG2的生长均表现出明显的抑制作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
第一，本发明所得亚麻籽胶低聚糖不仅具有体外抗氧化活性，而且发现具有抗肿瘤活性，对肿瘤细胞有很高的抑制活性，对正常细胞没有毒副作用，是潜在的天然抗氧化剂和在抗肿瘤药物的应用中具有重要的价值；
第二，本发明针对传统的酶解方法和化学方法降解亚麻籽胶的局限性，首次采用酶解辅助双氧水氧化降解法对亚麻籽多糖进行降解，仅需用透析工艺纯化即可获得新型低聚合度的小分子糖-FGOS，该方法具有高效性、较好的特异性和环保性，绿色安全等优势。
附图说明
图1是FG和FGOS的红外光谱。
图2是FG和FGOS分子量测定结果，其中，A代表FG,B代表FGOS。
图3是抗氧化活性评价结果，其中A代表羟自由基清除实验；B代表DPPH自由基清除实验；C代表ABTS自由基清除实验。
图4是亚麻籽粗多糖体外肿瘤活性检测，其中A代表Hela细胞存活率实验，B代表HepG2细胞存活率实验，C代表RAW264.7细胞存活率实验。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽低聚糖的制备方法
(1)H2O2初步水解亚麻籽多糖：称取2.0g亚麻籽多糖粉末，溶解在100ml，0.2M的过氧化氢溶液中，置于水解瓶中磁力搅拌均匀，然后放入自动高压蒸汽灭菌器中反应(0.1MPa，120℃，1h)；水解反应后，将水解液在冷水中冷却至室温，得到水解糖液；
(2)酶解深度降解亚麻籽多糖：将上述步骤(1)所得水解液加入纤维素酶，酶浓度100u/ml，在pH为4.5，反应温度为50℃，水解反应12h，得到亚麻籽胶低聚糖粗提液；
(3)透析：将步骤(2)中获得的粗提液使用三层滤纸减压抽滤，然后采用MD34(500)即用型透析袋(截留分子量为500Da)进行透析处理，透析时间为24h，期间每隔4h换一次水，透析结束后取袋内截留液，即为亚麻籽低聚糖液；
(4)将步骤(3)所得亚麻籽低聚糖液用旋转蒸发仪减压浓缩，水浴液温度为50℃，转速为100rpm；然后，采用Scientz-10N冷冻干燥机，控制温度为-50℃，真空度为50Pa进行冷冻干燥，冻干时间为24h左右(视样品干燥情况可适当延长或缩短干燥时间)，得到亚麻籽胶低聚糖固体粉末(FGOS)。
通过上述方法获得的亚麻籽低聚糖为无色固体粉末，有特殊香味，易溶于水。
实施例2亚麻籽低聚糖理化性质分析
本发明利用红外光谱分析，HPLC-SEC(高效液相色谱和体积排阻色谱)和单糖组成成分分析对所制备的亚麻籽低聚糖进行理化性质的分析，并通过羟自由基清除实验、DPPH自由基清除实验和ABTS自由基清除实验表明FGOS具有较强的抗氧化能力。
1、FTIR光谱分析：采用Nicolet 5700傅里叶红外光谱仪对亚麻籽粗多糖(FG)和实施例1制备的亚麻籽低聚糖(FGOS)的红外光谱进行测定。
分别将干燥的FG和FGOS样品和KBr粉末一起碾磨并挤压成片状，在频率范围为4000-400cm-1下进行光谱测量，收集数据并绘制透射比(％)与波数(cm-1)的函数关系图，并用Ominic 7.2软件分析。
如图1所示，FGOS在3406cm-1附近具有较宽的吸收峰，可能为O-H的伸缩振动，在2937cm-1附近具有强吸收峰为烷基的C-H伸缩振动，在波长为1597cm-1附近有较强的 C＝O不对称伸缩振动或多糖水合振动，1257cm-1附近的弱吸收峰为C-H变角振动，1072 cm-1和1404cm-1附近分别为C-O和C-OH的振动吸收峰，也是吡喃糖特征吸收峰，872cm-1附近是C-H变形振动，是β-d-吡喃糖特征吸收峰。图中显示对照样品FG红外光谱振动吸收峰，在3400cm-1(O-H),2924cm-1(C-H2),1645cm-1(C＝O),1414cm-1(C-OH),1252cm-1(C- H),1067cm-1(C-O),874cm-1(C-H变形振动，为β-d-吡喃糖),812cm-1(吡喃半乳糖特征吸收峰)。FG和FGOS两种样品的红外光谱结果显示，实施例1的降解方法获得的低聚糖FGOS与 FG的主要结构并没有改变，均具有典型的糖类结构，FGOS在1354cm-1附近的特征峰发生微小的改变以及其他各主要结构片段特征吸收的微小位移及相对强度的改变，可能是由于亚麻籽多糖被降解的过程中分子链断裂形成小分子糖类碎片产生特征峰的微小变化。
2、分子量测定：分别取FG和FGOS固体粉末样品以及不同分子量的葡聚糖标准品(800Da,2000Da,5000Da,10,000Da,126,000Da,289,000Da和500,000Da)，充分溶解于超纯水中，配成2.0mg/mL的样品溶液，过0.45μm聚醚砜微孔滤膜，自动采样10μL进行HPLC- SEC液相分析。液相条件分析条件为：采用LC-20AD高效液相色谱仪，ELSD检测器(漂移管温度为110℃，气流速度为3.0L/min)，色谱柱为TSKgel G5000PWXL，流动相为 Milli-Q超纯水，等度洗脱，流速0.5ml/min，时间30min。柱温为40℃。以各种分子量的葡聚糖为标准品，绘制标准曲线，以洗脱时间(t)为横坐标，分子量对数值(logMw)为纵坐标，所得到的葡聚糖标准曲线为logMw＝-0.0127t+11.6113(R2＝0.9863)。
从图2中FG和FGOS两种样品分子量测定的结果可以得到，FG有两个峰位组分，相对分子量分别约为18.3kDa和26.8kDa，由此可见组成亚麻籽多糖的分子具有较高的聚合度，且分布不均。而FGOS仅有一个洗脱峰，大分子量组分峰消失，其相应的分子量分别为1.5kDa，因此说明实施例1的降解方法能将亚麻籽多糖降解，并且获得较小分子量的亚麻籽低聚糖。
3、单糖组成分析：吸取100μL质量浓度为4-5g/L的单糖样品标准品(鼠李糖Rham,阿拉伯糖Ara,木糖Xyl,甘露糖Man,葡萄糖Glc,半乳糖Gal,核糖Rib,葡萄糖醛酸GlcUA, 半乳糖醛酸GaUA)。离子色谱条件：色谱柱：CarboPac PA20 3mm×150mm；流动相：A为 H2O2，B为250mmol/L NaOH，C为1mol/L NaAc，三元梯度洗脱程序：0～21.0min，99.2％ A，0.8％B，0％C；21.1min，94.2％A，0.8％B，5％C；30.0min，79.2％A，0.8％B，20％ C；30.1～50.0min，20％A，80％B，0％C。流速：0.5ml/min，积分脉冲安培检测器，金电极，四电位波形；进样体积：20μL。
实施例1所得亚麻籽胶低聚糖固体粉末(FGOS)经HPLC-SEC测定的平均分子量为1501Da；产率为66.1％，还原糖含量为38.39％，经单糖组成成分分析是有甘露糖、半乳糖、葡萄糖，阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，木糖，鼠李糖，核糖，半乳糖醛酸，摩尔百分比分别为34.91％，27.3％，22.86％，5.21％，5.43％，1.06％，1.21％，0.37％和1.66％见表1。
表1
Figure RE-GDA0002161753050000051
实施例3亚麻籽胶低聚糖抗氧化活性评价
按照下述方法实施例1制备的亚麻籽胶低聚糖FGOS进行抗氧化活性评价
(1)羟自由基清除检测：
50μL不同浓度的亚麻籽低聚糖FGOS溶液，依次加入50μL FeSO4(6mM),100μL H2O2(6mM)，充分摇匀后室温放置10min；加入50μL水杨酸(6mmol，乙醇溶解)充分摇匀室温放置30min。510nm处测定吸光度值。重复3次取平均值，葡萄糖溶液(Glucose)为阴性对照；Vc作为阳性对照；亚麻籽胶FG也作为对照。A0为空白吸光度值，以50μL蒸馏水代替样品；Ax为所测样品的吸光光度值。羟自由基清除率＝(A0-Ax)/A0×100％
(2)DPPH自由基清除检测：
1ml不同浓度的亚麻籽低聚糖溶液与2ml蒸馏水混合，加入0.2ml 400μM DPPH乙醇溶液，室温下在暗处反应30min，以葡萄糖溶液为阴性对照，Vc溶液作为阳性对照，在517nm处测OD值。重复测三次取平均值。DPPH自由基清除率＝(A0-Ax)/A0×100％
(3)ABTS自由基清除检测：
等体积的7mM ABTS与2.45mM K2S2O8室温避光反应24h，配制成ABTS储备液，用10mM磷酸盐缓冲剂(PH＝7.4)稀释成ABTS工作溶液；取30μL亚麻籽胶低聚糖FGOS溶液与3mlABTS工作溶液反应，以葡萄糖溶液为阴性对照，Vc溶液作为阳性对照，亚麻籽胶 FG也作为对照，在734nm处测OD值。重复测三次取平均值。ABTS自由基清除率＝(A0- Ax)/A0×100％
上述实验均将亚麻籽粗多糖(FG)、葡萄糖作为阴性对照，Vc作为阳性对照，测定样品FGOS的抗氧化活性评价，结果见图3。图3中A图的羟自由基清除实验结果可知，作为阳性对照，Vc随着浓度的升高，清除羟自由基的能力也增强，当浓度达到2mg/ml时，Vc 的清除能力接近100％；FG及葡萄糖清除羟自由基的能力较低，FGOS最大清除能力达到 37.56％，其清除率高于FG及葡萄糖，由此可见FGOS具有一定的羟自由基清除能力。
图3中B图的显示DPPH自由基清除实验，结果显示FGOS的清除能力随着浓度的升高而增强，其最大的清除率为42.72％；Vc即使较低的浓度下，DPPH自由基清除率也能达到98％以上；葡萄糖几乎没有DPPH自由基清除能力；FG的清除能力较低，因此，FGOS 清除DPPH自由基能力高于FG和葡萄糖低于Vc，具有一定的DPPH自由基清除能力。
图3中C图的所示ABTS自由基清除能力检测结果，FGOS清除自由基的能力随浓度的升高而增强，这种趋势几乎呈线性关系，当浓度达到25mg/ml，其自由基清除率分别61.34％，Vc即使在低浓度下也具有较强的自由基清除能力，FG与葡萄糖清除能力较弱，因此FGOS具有较强的ABTS自由基清除能力。
总的来说，FGOS相比于阳性对照Vc在相同的浓度下，其羟自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力低尚有较大差距，但相比于FG和对照葡萄糖，FGOS自由基清除能力明显较强。
实施例4体外抗肿瘤活性测定
(1)亚麻籽胶低聚糖(FGOS)进行体外抗肿瘤实验，分别对人宫颈癌细胞(Hela)和人肝癌细胞(HepG2)毒性试验。
取生长状态良好的Hela细胞，接种于96孔板，每孔加入3×103个细胞。置于5％CO2培养液箱中适应培养24h，吸收培养板中的培养基，空白对照组加入新鲜培养基，样品处理组FGOS(浓度设定为25、50、100、200、400μg/ml、800ug/ml)，继续放入培养基中培养 48h。然后除培养液，FG处理组作为阴性对照，菊粉inulin处理组作为阳性对照，利用 MTT检测样品对细胞的抑制率。对肿瘤细胞Hela、HepG2的毒性结果如图4A，4B。
(2)正常细胞毒性的检测
取生长状态良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7，接种于96孔板，每孔加入3×103个细胞。置于5％CO2培养液箱中适应培养24h，空白对照组加入新鲜培养基，样品处理组FGOS(浓度设定为25、50、100、200、400μg/ml、800ug/ml)，继续放入培养基中培养48h。然后除培养液，FG处理组作为阴性对照，菊粉inulin处理组作为阳性对照，对RAW264.7细胞毒性结果见图4C。
以图4中A、B图可知：在浓度0.4mg/mL时，菊粉处理组Hela和HepG2细胞的存活率分别为74.8％和81.3％，FGOS处理组Hela和HepG2细胞的存活率分别为22.8％和 42.9％，对正常细胞RAW264.7生长无不良影响(图4中C图)。而本发明所述方法制备的亚麻籽低聚糖(FGOS)对肿瘤细胞具有明显的毒性作用，对人宫颈癌细胞Hela和人肝癌细胞HepG2的生长均表现出明显的抑制作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.亚麻籽低聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述亚麻籽低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）取亚麻籽粗多糖粉溶解在过氧化氢水溶液中，料液比为1：100~2：100，放入高压蒸汽灭菌锅中水解1h-2h，得到水解糖液；
（2）将步骤（1）所得水解液中添加果胶酶或者纤维素酶进行酶解反应，得到酶解的产物，即亚麻籽胶低聚糖粗提液；
（3）将步骤（2）所得亚麻籽胶低聚糖粗提液进行减压过滤，所得滤液再进行透析处理后，得到亚麻籽低聚糖液；
（4）将步骤（3）所得亚麻籽低聚糖液经浓缩、冷冻干燥后，得到亚麻籽低聚糖的固体粉末，即具有抗肿瘤活性的亚麻籽低聚糖；
其中，肿瘤指的是人宫颈癌细胞或人肝癌细胞中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的亚麻籽低聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述步骤（1）中过氧化氢水溶液的浓度为0.15mol/L-0.2mol/L。
3.根据权利要求1所述的亚麻籽低聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述步骤（2）中酶浓度20-100u/ml，在pH为3.5-5.5的范围内，温度40-60℃酶解反应4-12h。
4.根据权利要求1所述的亚麻籽低聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述步骤（3）中透析时的截留分子量为0-500Da，处理时间为20-24h，每3-5h换一次水。
5.根据权利要求1所述的亚麻籽低聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述步骤（4）中浓缩采用旋转蒸发仪，温度为40-60℃，转速50-150rpm；冷冻干燥的温度为-50℃，真空度为50Pa，冻干时间为48-72h。
6.根据权利要求1所述的亚麻籽低聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述亚麻籽低聚糖为具有吡喃糖环结构的糖类物质，平均分子量为1.4-1.6kDa；性状为固体粉末，有香味，易溶于水，易吸湿。
7.根据权利要求1所述的亚麻籽低聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述亚麻籽低聚糖经单糖组成成分分析是有甘露糖、半乳糖、葡萄糖，阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，木糖，鼠李糖，核糖，半乳糖醛酸，摩尔比分别为34.91%，27.3%，22.86%，5.21%，5.43%，1.06%，1.21%，0.37%和1.66%。
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