CN112724275B - 一种柞树皮多糖的制备及应用 - Google Patents

一种柞树皮多糖的制备及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112724275B
CN112724275B CN202110122502.1A CN202110122502A CN112724275B CN 112724275 B CN112724275 B CN 112724275B CN 202110122502 A CN202110122502 A CN 202110122502A CN 112724275 B CN112724275 B CN 112724275B
Authority
CN
China
Prior art keywords
qmbp
polysaccharide
oak bark
activity
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110122502.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112724275A (zh
Inventor
周鸿立
刘杨
赵淑庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Institute of Chemical Technology
Original Assignee
Jilin Institute of Chemical Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Institute of Chemical Technology filed Critical Jilin Institute of Chemical Technology
Priority to CN202110122502.1A priority Critical patent/CN112724275B/zh
Publication of CN112724275A publication Critical patent/CN112724275A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112724275B publication Critical patent/CN112724275B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及功能性食品、药物开发领域，具体涉及一种具有抗氧化和抗肿瘤活性的柞树皮多糖的制备及应用。本发明通过水提醇沉法进行柞树皮多糖的提取、采用棉状DEAE进行纯化、DEAE‑52柱层析进一步分离、得到了四个组分的柞树皮单体多糖，采用UV、IR、HPLC等方法对柞树皮多糖不同组分进行表征。通过DPPH自由基清除实验、总还原力测定实验、ABTS自由基清除实验得出四个组分的多糖具有较好的抗氧化活性；通过抗A549细胞增殖活性实验得出柞树皮多糖具有抗肿瘤活性，其有望作为潜在的抗氧化剂和抗肿瘤剂，用于功能性食品、药物的开发。

Description

一种柞树皮多糖的制备及应用
技术领域
本发明涉及药物开发、功能性食品领域，具体涉及一种柞树皮多糖的制备及应用。
背景技术
蒙古柞属花科植物，又名橡子树。蒙古柞资源丰富，主要分布在黑龙江，吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东等省份。蒙古柞的树皮含有黄酮、多糖等有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等药理作用。在夏季，蒙古柞的枝条一般被修剪后丢弃，由于生物量大，会造成大量的资源浪费并污染环境。因此，充分利用这些副产物具有重要的意义。
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，广泛存在于自然界中。其被认为是一种重要的生物反应调节剂，具有多种生物活性功能，如降血糖、免疫调节、抗肿瘤等。植物中一般均能提取到多糖，但其结构不同，表现出的生物活性亦不同，目前未见国内外关于柞树皮多糖结构和用途的报道。
抗氧化是许多植物有效成分均具有的生物活性，并且是预防衰老的重要步骤，多篇文献报道菟丝子多糖、甜菜树多糖等多糖也均具有较好的抗氧化活性。[叶春林、KHUDOYBERDIEV, Ilkhomjon,陈颖,李瀚鑫. 菟丝子多糖的抗氧化活性和抑制肿瘤细胞增殖的研究[J]. 河南工业大学学报(自然科学版), 2020, v.41;No.197(05):79-84.]通过实验得到菟丝子多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除率随质量浓度的增大而升高，对于DPPH自由基，菟丝子多糖的IC50为0. 25 mg /mL，Vc 的IC50为 0. 26 mg /mL，说明菟丝子多糖具有很强的DPPH 自由基清除能力，且与 Vc作用很接近。对于羟基自由基，菟丝子多糖的IC50为0. 36 mg /mL，Vc 的 IC50为 0. 29 mg /mL，表明菟丝子多糖具有强的羟自由基清除活性。以上均表明菟丝子多糖具有较好的抗氧化活性。为探究柞树皮多糖的抗氧化活性，本专利对其DPPH自由基清除活性、总还原力、ABTS自由基清除活性展开了研究。
肺癌是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一。其中非小细胞肺癌(N SCLC)占所有肺癌病例的80%。[叶春林、KHUDOYBERDIEV, Ilkhomjon,陈颖,李瀚鑫. 菟丝子多糖的抗氧化活性和抑制肿瘤细胞增殖的研究[J]. 河南工业大学学报(自然科学版), 2020,v.41;No.197(05):79-84.]通过实验得到菟丝子多糖对人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2 和人胰腺癌细胞 PANC－1 的生长均有抑制作用，且随着多糖质量浓度的增加，抑制率也增加。当菟丝子多糖质量浓度分别为 137. 6、341. 7、625. 4 μg /mL 时，对 A549、HepG2 和 PANC－1 生长抑制率可达 50%。证明了菟丝子多糖能有效地抑制肿瘤细胞增殖，且对不同肿瘤细胞表现的抑制效果存在一定的差异。为探究柞树皮多糖的抗肿瘤活性，本专利对其抗A549细胞增殖活性展开了研究。
目前，关于柞树皮多糖抗肿瘤活性的评价未见报道,对其进行研究、开发具有较大现实意义，本专利为柞树皮多糖应用于抗氧化及抗肿瘤药物的开发研究提供了新思路、新资源发明内容
发明内容
本发明旨在提供一种柞树皮多糖的制备方法及应用
一种柞树皮多糖的制备，其特征在于，所述包括如下步骤：取柞树皮多糖，采用水提醇沉法制得柞树皮粗多糖；采用预处理后的棉状DEAE纤维素，对柞树皮粗多糖进行纯化得纯化后的柞树皮多糖；采用DEAE-52纤维素对纯化后的柞树皮多糖进行分离，得柞树皮单体多糖。
进一步地，进行柞树皮多糖提取的具体方法为：干燥的树皮粉末用60%的乙醇在90℃下回流4h，回流两次，去除脂溶性成分。将干燥后的残渣用沸水按1：20g/ml的比例提取2h。在两次提取后，用旋转蒸发器在55℃减压下将上清液合并浓缩至1/4-1/5体积，然后加入一定量的乙醇(95%)沉淀，直到乙醇含量下降到80%，在4°C下沉淀12h。沉淀物在离心机上离心，然后冷冻干燥得到蒙古柞树皮的最终粗多糖。
进一步地，进行柞树皮多糖纯化的具体方法为：将500mg粗多糖溶于去离子水中，装入前处理后的棉状DEAE柱(2.6×30cm)。柱用0.6MNaCl溶液洗脱，流速1.0ml/min。将多糖洗脱液浓缩，用水透析，冷冻干燥得纯化后柞树皮多糖。
进一步地，进行柞树皮多糖分离的具体方法为：将300mg纯化后的多糖溶解在蒸馏水中，装入到DEAE-52纤维素柱上(2.6×30cm)。分别用200ml蒸馏水和不同浓度的NaCl溶液(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5MNaCl)洗脱，流速为1.0ml/min，由于0.4M和0.5M分数太小，故舍弃。收集的每种多糖的体积为5ml，最终得到了QMBP-1（63mg），QMBP-2（8mg），QMBP-3（29mg）和QMBP-4（42mg）四个组分的多糖。
进一步地，经紫外-可见光谱及红外光谱分析表明，四个组分的多糖含有-OH和-CH2。QMBP-3和QMBP-4在1741.9cm-1存在弱特征峰，表明存在糖醛酸。两个特征吸收峰在1627.6cm-1和1427.1cm-1 处表示COO-的不对称拉伸振动和对称拉伸振动。QMBP-3和QMBP-4在1247.9cm-1和892.9cm-1附近具有吸收峰，表明存在S=O和C-O-S。此外，1000-1200cm-1之间的吸收峰可归因于与C-OH侧基的伸缩振动和C-O-C糖苷键振动重叠的环振动。
进一步地，单糖组成及分子量的测定表明，QMBP-1，QMBP-2，QMBP-3和QMBP-4的分子量分别为：1960kDa、1036kDa、922kDa和919kDa。其中QMBP-1单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：核糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：木糖＝1.62：0.24：0.68：0.32：1.00：4.97：4.88：35.92；QMBP-2单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：木糖＝0.62：0.45：0.21：1.00：0.50：1.42：3.31；QMBP-3单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：阿拉伯糖＝0.15：0.23：0.04：1.00：0.15：0.30：0.80；QMBP-4单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：阿拉伯糖＝0.85：0.69：0.07：1.00：0.38：0.79：1.45。
进一步地，对柞树皮多糖进行抗氧化活性测定，结果表明柞树皮多糖在浓度为0.0025-0.01mg/ml的范围内，对DPPH自由基的清除作用随浓度的增加而增加。在0.01mg/ml浓度下，粗多糖和抗坏血酸对DPPH自由基的清除率分别为56.43%±1.8%和80.83%±3.1。在相同浓度(0.01mg/ml)下，抗坏血酸比粗多糖具有更强的DPPH清除活性。粗多糖和抗坏血酸的IC50分别为8.7±0.25μg/ml和6.6±0.16μg/ml。
进一步地，粗多糖具有较强的还原力。随着浓度从0.05增加到0.25mg/ml，粗多糖的吸收从0.314±0.65增加到0.997±0.62。在0.2mg/ml时，粗多糖的吸光度为0.894±0.57，与抗坏血酸的吸光度大致相等（吸光度为0.903±0.29）。粗多糖和抗坏血酸的IC50分别为0.09±0.36mg/ml和0.08±0.23μg/ml。
进一步地，粗多糖浓度在0.001~0.009mg/ml范围内的清除率对ABTS自由基的清除作用随浓度的增加而增加且接近抗坏血酸。粗多糖和抗坏血酸的IC50分别为8.3±0.16μg/ml和6.3±0.09μg/ml。
进一步地，对柞树皮多糖进行抗A549细胞增殖活性测定，结果表明四个组分对A549细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。在24h内，最大抑制浓度为0.4mg/ml时，QMBP-1的抑制效果最好，抑制率为37.5%；其次为QMBP-2，抑制率为30.0%；QMBP-4的抑制率为22.5%；QMBP-3的抑制率为15.0%。在48h内，最大抑制浓度为0.4mg/ml时，QMBP-1的抑制效果最好，抑制率为40%（p<0.001）；其次为QMBP-3，抑制率为20.0%，而QMBP-4和QMBP-2的抑制率则较24h时有些降低，为10%左右。综上可得到，QMBP-1和QMBP-3在体外具有剂量依赖性和时间依赖性的抗肺癌活性，而QMBP-2和QMBP-4仅以剂量依赖性而不是时间依赖性的方式发挥体外抗癌活性。
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明进行了柞树皮多糖的制备，首次对柞树皮多糖的化学结构进行了探究；本发明也是探索蒙古柞皮多糖组分在抗癌细胞中的首次研究，所提供的数据表明蒙古柞树皮多糖具有较高的抗癌潜力。本发明将柞树皮多糖应用于抗氧化及抗肿瘤药物的开发研究，开拓了柞树皮提取物在食品及保健品、抗肿瘤的新药研发方面的新思路。
附图说明
图1为 QMBP的DEAE-52纤维素快速流动色谱图
图2为QMBP的紫外光谱
图3为QMBP的红外光谱
图4为QMBP的FT-IR光谱二阶导数
图5为单糖标准品(A)、QMBP-1(B)、QMBP-2(C)、QMBP-3(D)和QMBP-4(E)水解液的HPLC图谱。 Man：甘露糖，Rib：核糖，Rha：鼠李糖，GluA：葡萄糖醛酸，GalA：半乳糖醛酸，Glu：葡萄糖，Gal：半乳糖，Xylose：木糖，Ara：阿拉伯糖，Fuc：岩藻糖
图6为QMBP的抗氧化活性。DPPH自由基清除活性(A)、还原力(B)、ABTS+自由基清除活性(C)。对不同自由基的IC50值进行统计分析。数据以均数±SD表示(n = 3)。符号表示差异有统计学意义，***P < 0.01 vs VC (D)
图7为不同浓度和不同时间点的QMBP-1、QMBP-2、QMBP-3和QMBP-4对A549细胞活力的影响。7(A)显示了用不同浓度的QMBP-1、QMBP-2、QMBP-3和QMBP-4处理24h后的细胞活力。7(B)显示的为48h。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
柞树皮多糖的提取
干燥的树皮粉末用60%的乙醇在90℃下回流4h，回流两次，去除乙醇可溶性成分。将干燥后的残渣用沸水按1：20g/ml的比例提取2h。在两次提取后，用旋转蒸发器在55℃减压下将上清液合并浓缩至1/4-1/5体积，然后加入一定量的乙醇(95%)沉淀，直到乙醇含量下降到80%，在4°C下沉淀12h。沉淀在离心机上分离，然后冻干得到蒙古柞树皮的最终粗多糖。
柞树皮粗多糖的纯化
将棉花DEAE浸入蒸馏水中除去杂质后浸泡在0.5M的HCl溶液中1-2h，然后用去离子水洗涤至pH中性后排出。在0.5M的NaOH溶液中浸泡1-2h，用去离子水清洗至pH中性。将500mg粗多糖溶于去离子水中，装入棉DEAE柱(2.6×30cm)。柱用0.6MNaCl溶液洗脱，流速1.0ml/min。将多糖洗脱液浓缩，用水透析，冻干备用。
粗多糖总碳水化合物含量为37.32%±1.53%，纯化后碳水化合物含量增加到68.42%±3.25。此外，粗多糖的蛋白质含量为6.14±1.07%，纯化多糖为1.43±0.26%。结果表明，多糖的蛋白质含量降低。多糖回收率、脱蛋白率、脱色率分别为54.82±1.24%、79.06±2.31%和87.12±1.51。经棉DEAE 纯化后，其蛋白质与色素的残留量有效的降低。
柞树皮粗多糖的分离
将300mg纯化后的多糖溶解在蒸馏水中，装入到DEAE-52纤维素柱上(2.6×30cm)。柱分别用200ml蒸馏水和不同浓度的NaCl溶液(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5MNaCl)洗脱，流速为1.0ml/min。由于0.4M和0.5M分数太小，故舍弃。收集的每种多糖的体积为5ml，用苯酚-硫酸法检测。得到QMBP−1(63mg)、QMBP-2(8mg)、QMBP-3(29mg)和QMBP-4(42mg)四个组分的多糖，将多糖浓缩，用水透析、冷冻干燥、进行进一步研究。四个组分的多糖、糖醛酸及蛋白质含量如表1所示。
表1 四个组分的多糖、糖醛酸及蛋白质含量
含量（%） QMBP-1 QMBP-2 QMBP-3 QMBP-4
多糖 91.32±0.29 52.54±0.17 53.72±0.16 60.41±0.17
糖醛酸 5.21±0.21 15.00±0.25 31.92±0.21 35.57±0.25
蛋白质 0.35±0.16 0.84±0.12 0.55±0.12 0.69±0.29
紫外-可见光谱和红外光谱分析
用FT-IR分光光度计对QMBP-1、QMBP-2、QMBP-3和QMBP-4的官能团进行了鉴定。将每一组分的多糖与KBr粉末彻底混合，研磨，压片。红外光谱扫描范围从4000到400cm-1。此外，对每个FT-IR光谱进行平滑处理，平滑因子为13，然后用OMN IC8.0Savitsky-Golay导数得到光谱的二阶导数。
四个组分的紫外和红外光谱如图2和图3所示。用紫外光谱（图2）在280nm波长处吸收QMBP-1，QMBP-2，QMBP-3和QMBP-4，观察到的微弱吸收表明含有微量蛋白质，这也可能是由于四个组分中存在糖蛋白所导致。红外光谱(图3 )的四种多糖在3410.4cm-1左右表现出宽而强的吸收峰，归因于-OH的拉伸振动，峰在2925.3-1归因于-CH2拉伸振动。QMBP-3和QMBP-4在1741.9cm-1存在弱特征峰，表明存在糖醛酸。两个特征吸收峰在1627.6cm-1 和1427.1cm-1 处表示COO-的不对称拉伸振动和对称拉伸振动。QMBP-3和QMBP-4在1247.9cm-1和892.9cm-1附近具有吸收峰，表明存在S=O和C-O-S。此外，1000-1200cm-1之间的吸收峰可归因于与C-OH侧基的伸缩振动和C-O-C糖苷键振动重叠的环振动。
图4中所示的FT-IR光谱二阶导数 ，QMBP-1和QMBP-2在1731.7cm-1和1743.3cm-1处有一个糖醛酸的吸收峰。红外光谱中只有一个肩峰可见。从红外光谱可以看出，QMBP-3和QMBP-4的糖醛酸含量均高于QMBP-1和QMBP-2，这与糖醛酸离子浓度实验结果一致。结合红外光谱和二阶导数光谱，观察到β-吡喃葡萄糖苷键在860cm-1处有特征吸收。红外光谱二阶导数可以提高一维红外光谱图的分辨率，各分数的红外光谱和二阶导数光谱不完全相同，这些特征峰的差异证明了四个组分的结构差异。
单糖组成及分子量的测定
每2mg样品在120°C的烘箱中用三氟乙酸(2M，2ml)在水热反应器中完全水解为单糖。水解完成后，将溶液浓缩至干燥(<45°C)，然后将残渣溶于3ml甲醇中，再蒸发至干燥。这个过程重复五次以完全去除过量的TFA。干燥水解产物用PMP标记，加入200μ的L0.3MNaOH、200μL的0.5M的PMP-CH3OH溶液，混合物在70°C下反应60min。 随后，用200μL 0.3 M HCl溶液中和反应产物，并用1 ml氯仿萃取三次。然后通过0.45μm膜过滤含有PMP标记衍生物的水层，并对其进行Ultimate3000的高效液相色谱检测，配备SupersilODS2柱(5μm，4.6×250mm2)和Ultimate3000二极管阵列检测器(DAD，Thermo)。色谱条件设置为：含PBS(pH6.8)和乙腈(82：18v/v)的流动相；流速为0.8ml/min；柱温为30°C；检测器波长为245nm；运行速率为85min。 以不同的单糖为标准（甘露糖，核糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖，岩藻糖），用相应的峰面积和响应因子计算各糖的含量。
分子量用与折射率检测器相关的高性能尺寸排斥色谱仪测定。20μL的样品溶液(2.0mg/ml)通过0.45μm过滤器，然后将Shodex糖注入KS-804柱(8.0mm×300mm)，并用HPLC配有折射率检测器(RID)进行分析。数据处理记录在N2000GPC色谱工作站上。色谱条件为：超纯水流动相；流速为1.0ml/min；柱温为50°C；RID温度为35°C；运行速率为30min。 用不同分子量的葡聚糖标准建立校准曲线。
图5表明这四个组分是杂多糖。如表2所示，其中QMBP-1单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：核糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：木糖＝1.62：0.24：0.68：0.32：1.00：4.97：4.88：35.92；QMBP-2单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：木糖＝0.62：0.45：0.21：1.00：0.50：1.42：3.31；QMBP-3单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：阿拉伯糖＝0.15：0.23：0.04：1.00：0.15：0.30：0.80；QMBP-4单糖组成的摩尔比为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：阿拉伯糖＝0.85：0.69：0.07：1.00：0.38：0.79：1.45。此外，QMBP-1，QMBP-2，QMBP-3和QMBP-4的分子量分别为：1960kDa、1036kDa、922kDa和919kDa。
表2 单糖组成（摩尔比）和分子量（kDa）
Figure 350979DEST_PATH_IMAGE001
柞树皮多糖药效试验
对柞树皮多糖进行如下实验，以验证本发明提供的柞树皮多糖药效。
柞树皮多糖进行抗氧化活性测定
柞树皮多糖对DPPH自由基清除实验
将2ml不同浓度(2.5、3.75、5、7.5、10μg/ml)的QMBP样品与2ml0.2M DPPH-C2H5OH溶液混合。剧烈摇晃混合液，室温暗反应30 min，用紫外可见分光光度计在517nm处测定还原DPPH的吸光度。在1.25，2.5，5，7.5，10μg/ml浓度下，以乙醇为阴性对照，以抗坏血酸为阳性对照。所有测试一式三份。计算DPPH自由基清除活性公式如下：
DPPH自由基清除活性（%）=[1−(A1−A0)/A2] ×100% (1)
A0 仅为样品的吸光度(不含DPPH溶液的样品)，A1 是含DPPH自由基溶液的样品吸光度，A2 是对照(不含DPPH溶液)的吸光度。
图6（a）表明了以抗坏血酸作为阳性对照时，粗多糖对DPPH自由基的清除能力。粗多糖在试验浓度范围内具有中等的抗氧化活性，而抗坏血酸具有较强的清除DPPH自由基的能力。在0.0025-0.01mg/ml范围内，粗多糖的清除作用随浓度的增加而增加，能够更好的清除DPPH自由基。在0.01mg/ml浓度下，粗多糖和抗坏血酸对DPPH自由基的清除率分别为56.43%±1.8%和80.83%±3.1。在相同浓度(0.01mg/ml)下，抗坏血酸比粗多糖具有更强的DPPH清除活性。粗多糖和抗坏血酸的IC50分别为8.7±0.25μg/ml和6.6±0.16μg/ml。
还原力实验
将浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.20和0.25mg/ml的1ml样品与2.5ml0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.6)和2.5ml铁氰化钾（1%）混合， 混合物在50℃下反应20min。 加入2.5mlTCA溶液(10%)终止反应，混合物在3000rpm下离心10min。 将2.5ml上清液与2.5ml蒸馏水和0.5ml三氯化铁（0.1%）溶液混合，在700nm处测定空白吸光度。以蒸馏水为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。其较高的吸光度表明还原力较高。
被测样品中存在抗氧化成分，会将Fe3+的铁氰化合物还原到Fe2+的亚铁形式。颜色的变化反映了抗氧化剂的还原能力。较高的吸光度值表明其还原力较强。图6(b)描述了样品和抗坏血酸的还原能力，且粗多糖在各浓度点均表现出显著的还原力。随着浓度从0.05增加到0.25mg/ml，粗多糖的吸收从0.314±0.65增加到0.997±0.62。在0.2mg/ml时，粗多糖的吸光度为0.894±0.57，与抗坏血酸的吸光度大致相等（吸光度为0.903±0.29）。粗多糖和抗坏血酸的IC50分别为0.09±0.36mg/ml和0.08±0.23μg/ml。数据表明，粗多糖的强还原力在抗氧化中起着重要的作用。
柞树皮多糖对ABTS自由基清除实验
将88μL K2S2O8 (2.45 mmol/L) 注入ABTS (7 mmol/L)中制得ABTS溶液。在室温黑暗中反应12~16h。然后用磷酸盐缓冲液(pH=7.4)进一步稀释所得混合物，使溶液在734nm处的吸光度达到0.70±0.02。将2ml的浓度为2.5~15μg/ml的多糖水溶液加入上述稀释溶液中，用ABTS(2.0ml)混合。混合溶液反应5min后在734nm处测其吸光度。计算ABTS自由基清除活性公式如下：
ABTS自由基清除活性(%)=
Figure 634193DEST_PATH_IMAGE002
×100% (2）
Ai是活性产物的吸光度，Aj是空白试剂的吸光度，A0是空白对照样品的吸光度。
如图6（c）表明，粗多糖浓度在0.001~0.009mg/ml范围内的清除率接近抗坏血酸。粗多糖和抗坏血酸的IC50分别为8.3±0.16μg/ml和6.3±0.09μg/ml。
抗氧化活性研究表明，柞树皮多糖具有较高的DPPH自由基清除能力、还原力和ABTS自由基清除能力。根据离子浓度实验，粗多糖中总碳水化合物、蛋白质的含量分别为37.32%±1.53%、6.14±1.07。可见，总碳水化合物是粗多糖的主要成分，在抗氧化方面起着重要作用。因此，柞树皮多糖具有较强的抗氧化活性。
抑制A549细胞增殖活性测定
细胞和细胞培养
在37℃、5%CO2的条件下，将A549细胞放入添加10%(v/v)FBS和1%(v/v)抗生素溶液的RPMI培养基中培养。制备100mg/mlQMBP-1，QMBP-2，QMBP-3和QMBP-4的原液，与DMSO混合后在-20℃、避光条件下储存，直至使用。在细胞反应开始前，于含有10%FBS的RPMI培养基中进行进一步稀释。最终浓度和与样品反应时间在每个图中表示。
细胞活力和增殖
用MTT法测定纯化后的多糖对A549细胞活力的影响。在96孔板中，用浓度为50-400μg/ml的纯化多糖处理在培养基中生长的细胞，对照细胞在不含纯化多糖的培养基中生长。在细胞反应24或48h后加入MTT(20μL，5mg/ml)，反应4h后，将培养基吸出，在每孔中加入150μLDMSO，在96孔微板酶标仪的570nm处测量吸光度。所有实验均进行3次。
统计分析
采用SPSS17.0程序的单因素方差分析和最不显著差异检验(LSD)来确定组间的显着性，p值小于0.05被认为具有统计学意义。
MTT实验显示，与空白组对比，四个组分对A549细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。图7（a）（b）表明了分别用0.05、0.1、0.2和0.4mg/ml QMBP-1、QMBP-2、QMBP-3和QMBP-4处理细胞24h和48h。如图7（a）所示，在24h内，最大抑制浓度为0.4mg/ml时，QMBP-1的抑制效果最好，抑制率为37.5%；其次为QMBP-2，抑制率为30.0%；QMBP-4的抑制率为22.5%；QMBP-3的抑制率为15.0%。
如图7（b）所示，在48h内，最大抑制浓度为0.4mg/ml时，QMBP-1的抑制效果最好，抑制率为40%（p<0.001）；其次为QMBP-3，抑制率为20.0%，而QMBP-4和QMBP-2的抑制率则较24h时有些降低，为10%左右。
综上可得出，QMBP-1和QMBP-3在体外具有剂量依赖性和时间依赖性的抗肺癌活性，而QMBP-2和QMBP-4仅以剂量依赖性而不是时间依赖性的方式发挥体外抗肺癌活性。柞树皮多糖可能是一种细胞周期特异性抗肿瘤药物，在细胞周期的某一阶段抑制肿瘤细胞生长，四种组分分别在不同阶段抑制肺癌细胞周期。由于QMBP-1在浓度和时间上都显著降低了细胞活力，所以QMBP-1对A549肺癌细胞的抑制作用优于QMBP-3。
本文研究了QMBP-1，QMBP-2，QMBP-3和QMBP-4四个组分具有丰富的单糖组成和较大的分子量分布，且QMBP-1对肺癌A549细胞增殖有显著抑制作用。本研究也是探索首次蒙古柞皮多糖组分在抗癌细胞中的研究，所提供的数据表明蒙古柞树皮多糖具有较高的抗癌潜力，因此为肺癌的治疗提供了一种新的策略。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解:依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换;而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (2)

1.一种柞树皮多糖的制备方法，其特征在于所制备的QMBP-1，QMBP-2，QMBP-3和QMBP-4四个多糖的分子量分别为1960kDa、1036kDa、922kDa和919kDa；所述的多糖制备工艺如下步骤：
（1）干燥的树皮粉末用60%的乙醇在90℃下回流4h，回流两次，去除脂溶性成分；将干燥后的残渣用沸水按1：20g/ml的比例提取2h；在两次提取后，用旋转蒸发器在55℃减压下将上清液合并浓缩至1/4-1/5体积，然后加入一定量的95%乙醇沉淀，直到乙醇含量下降到80%，在4°C下沉淀12h；沉淀物在离心机上离心，然后冷冻干燥得到蒙古柞树皮的粗多糖；粗多糖含量为37.32%±1.53%，粗多糖的蛋白质含量为6.14±1.07%；
（2）将500mg粗多糖溶于去离子水中，装入预先处理好的2.6×30cm的棉状DEAE柱；用0.6MNaCl溶液洗脱，流速1.0ml/min；将多糖洗脱液浓缩，用水透析，冷冻干燥得纯化后柞树皮多糖；提取得到纯化后含量增加到68.42%±3.25，蛋白质下降为1.43±0.26%；
（3）将300mg纯化后的多糖溶解在蒸馏水中，装入到2.6×30cm的DEAE-52纤维素柱上，分别用200ml蒸馏水和0.1、0.2、0.3、0.4和0.5MNaCl溶液洗脱，流速为1.0ml/min，由于0.4M和0.5M分数太小，舍弃；收集的每种多糖的体积为5ml，用苯酚-硫酸法检测，最终得到63mg的QMBP-1、8mg的QMBP-2、29mg的QMBP-3和42mg的QMBP-4四个组分的多糖，将多糖浓缩，用水透析、冷冻干燥；
（4）所制备四个组分的多糖的单糖组成的摩尔比分别为：QMBP-1的为D-甘露糖：核糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：木糖＝1.62：0.24：0.68：0.32：1.00：4.97：4.88：35.92；QMBP-2的为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：木糖＝0.62：0.45：0.21：1.00：0.50：1.42：3.31；QMBP-3的为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：阿拉伯糖＝0.15：0.23：0.04：1.00：0.15：0.30：0.80；QMBP-4的为D-甘露糖：鼠李糖：D-葡萄糖醛酸：D-半乳糖醛酸：D-葡萄糖：D-半乳糖：阿拉伯糖＝0.85：0.69：0.07：1.00：0.38：0.79：1.45；
（5）所制备的柞树皮粗多糖对DPPH自由基的清除率的IC50为8.7±0.25μg/ml；总还原力的IC50为0.09±0.36mg/ml；对ABTS自由基的清除率的IC50为8.3±0.16μg/ml，说明其具有较好的抗氧化活性；
（6）所制备的四种柞树皮多糖对A549细胞增殖活性实验均具有一定的抗肿瘤活性，其中QMBP-1具有显著的活性，最大抑制浓度为0.4mg/ml时，在48h内的最大抑制率为40%。
2.根据权利要求1所述的柞树皮多糖的制备方法，其特征在于，由紫外-可见光谱及红外光谱分析得到，四个组分的多糖含有-OH、-CH2、COO-和糖醛酸；在QMBP-3和QMBP-4中另存在S=O、C-O-S、C-OH和C-O-C。
CN202110122502.1A 2021-01-29 2021-01-29 一种柞树皮多糖的制备及应用 Active CN112724275B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110122502.1A CN112724275B (zh) 2021-01-29 2021-01-29 一种柞树皮多糖的制备及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110122502.1A CN112724275B (zh) 2021-01-29 2021-01-29 一种柞树皮多糖的制备及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112724275A CN112724275A (zh) 2021-04-30
CN112724275B true CN112724275B (zh) 2022-07-26

Family

ID=75594490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110122502.1A Active CN112724275B (zh) 2021-01-29 2021-01-29 一种柞树皮多糖的制备及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112724275B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101015613A (zh) * 2005-12-09 2007-08-15 范建荣 杏树皮及其提取物在制备治疗糖尿病的药物中的用途
CN104606265B (zh) * 2014-12-30 2017-12-08 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 一种柞树叶提取物及其制备方法及应用
CN104758327B (zh) * 2015-04-30 2017-11-10 辽宁省农业科学院大连生物技术研究所 一种具有抗癌作用的柞树叶提取物及其制备方法和用途
CN110731977B (zh) * 2019-11-28 2021-11-26 吉林省蚕业科学研究院 一种柞树皮提取物的制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112724275A (zh) 2021-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jeong et al. Structure analysis and antioxidant activities of an amylopectin-type polysaccharide isolated from dried fruits of Terminalia chebula
Ma et al. Extraction, characterization and antioxidant activity of polysaccharide from Pouteria campechiana seed
Wu et al. Comparison of different extraction methods of polysaccharides from cup plant (Silphium perfoliatum L.)
Meng et al. Structural characterization and immunomodulating activities of polysaccharides from a newly collected wild Morchella sextelata
Chen et al. Antitumor activities of different fractions of polysaccharide purified from Ornithogalum caudatum Ait
Huang et al. Structural characterization and antioxidant activity of a novel heteropolysaccharide from the submerged fermentation mycelia of Ganoderma capense
Wang et al. Physicochemical properties and bioactivities of original and Se-enriched polysaccharides with different molecular weights extracted from Pleurotus ostreatus
Lin et al. Characterization and comparison of bioactive polysaccharides from the tubers of Gymnadenia conopsea
CN110437288A (zh) 一种新型海参岩藻多糖及其制备方法和应用
Zhao et al. Extraction, characterization and antioxidant activity evaluation of polysaccharides from Smilacina japonica
CN110128562B (zh) 一种抗肿瘤补骨脂多糖及其提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用
CN108727509B (zh) 一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖及其制备和用途
CN114163545B (zh) 一种枸杞多糖及其在降血糖中的应用
Seedevi et al. Chemical structure and biological properties of a polysaccharide isolated from Pleurotus sajor-caju
Rovkina et al. Water-soluble polysaccharides of Alfalfa (Medicago sativa (Fabaceae)) of flora of Krasnoyarsk krai
Deng et al. Synergistic immunomodulatory effect of complex polysaccharides from seven herbs and their major active fractions
Brito et al. Partially methylated galactans containing different proportions of 3-O-methyl-galactose from Pleurotus citrinopileatus
Ting et al. Purification, characterization and antioxidant activities of enzymolysis polysaccharide from Grifola frondosa
CN109160954B (zh) 一种香瓜茄酸性多糖及其提纯方法和用途
CN110256593B (zh) 一种大球盖菇多糖及其制备方法和应用
CN112724275B (zh) 一种柞树皮多糖的制备及应用
CN110317844B (zh) 一种具有抗肿瘤活性的亚麻籽胶低聚糖及其制备方法和用途
CN112961261B (zh) 阳春砂根茎多糖及其制备方法和抗氧化的应用
CN111154006B (zh) 一种天然低分子量独活多糖及其制备方法和应用
Qiao et al. Antioxidant activity and rheological properties of the polysaccharides isolated from Ribes stenocarpum maxim with different extraction methods

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant