CN114163545B - 一种枸杞多糖及其在降血糖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种枸杞多糖及其在降血糖中的应用，该枸杞多糖是枸杞的水提液经过分子量为30kDa的超滤膜进行分离，将截留的枸杞水提液组分冷冻干燥，溶于蒸馏水中，脱除蛋白、色素后，再进行透析后冷冻干燥；将干燥的产物再次溶解进行离子交换树脂柱层析，使用氯化钠溶液洗脱，收集组分，使用3500Da的透析袋进行透析，透析产物冷冻干燥后再次溶于蒸馏水中，用葡聚糖凝胶进一步分离，收集组分后冷冻干燥完成制备。本发明所提供的枸杞多糖可用于制备降血糖的制品，包括但不限于功能食品、保健食品、特殊医学用途食品或新药。

Description

一种枸杞多糖及其在降血糖中的应用
技术领域
本发明属于天然活性物质制备技术领域，具体涉及一种枸杞多糖及其在降血糖中的应用。
背景技术
糖尿病是一种常见的临床代谢疾病，是由于胰岛素分泌不足或其生物效应受损而引起的，而其发病率也与遗传环境因素密切相关。近几十年来，糖尿病的流行率和发病率有所增加，全球大约有10％的人已经患有或可能患有2型糖尿病(T2DM)。目前，临床上最有效及应用最广泛的治疗糖尿病的化学药物包括磺脲类药物、噻唑烷二酮类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、双胍类药物等。但由于糖尿病需要长期用药，治疗药物的副作用和毒性不容忽视。因此，开发更安全、更有效、无毒副作用的降血糖药物是科学研究的主要方向之一。
枸杞是一种多用途的药食兼用植物，含有丰富的天然活性成分。许多医学研究表明，枸杞具有多种药用特性，包括抗衰老作用、神经保护、改善免疫功能、降血糖、降脂、抗肿瘤作用、抗氧化作用等。现代药理学研究发现枸杞提取物可以降血糖，越来越多的研究表明，枸杞降血糖的主要物质基础是枸杞多糖。但是枸杞多糖的分子量分布广泛，糖链连接形式复杂，导致发挥降血糖作用的枸杞多糖含量偏低，倘若要达到降血糖目的，则需要大量食用枸杞提取物，从而会发生免疫过激，导致过敏等副作用。
发明内容
本发明提供一种枸杞多糖及其在降血糖中的应用，该枸杞多糖是从枸杞子中制备获得的一种酸性杂多糖，体外活性试验表明，该多糖具有显著的抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的作用。动物模型验证，该组分具有显著的降血糖作用。因此，所述的多糖具有降血糖的前景，有望用于功能食品、保健食品领域。
本发明所提供的枸杞多糖LICP007-S5，其采用多角度激光光散射仪与尺寸排阻色谱法联用(SEC-MALLs)测定的Peak I的数均分子量Mn为4.769×103，重均分子量Mw为9.202×103，平均分子量Mz为1.690×104g/mol，分散性指数PDI为2.002，Peak II的数均分子量Mn为7.871×104，重均分子量Mw为1.031×105，平均分子量Mz为2.101×105g/mol，分散性指数PDI为1.310。
更进一步的，所述的枸杞多糖LICP007-S5中鼠李糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖和的含量分别为4.6％、21.6％、2.5％、12.4％、31.4％、27.5％。
更进一步的，所述的枸杞多糖LICP007-S5的红外特征图谱在3410.1cm-1处有吸收峰为OH的伸缩振动，在2926.4cm-1处有C-H的吸收峰，在1723.6cm-1有糖醛酸的吸收峰，在1269.9和1409.9cm-1处有C-OH的吸收峰。
更进一步的，所述的枸杞多糖LICP007-S5的1H NMR信号中，在δ5.43、5.05、5.03、5.00、4.54和4.36ppm处有6个质子化学位移，高于或低于δ5.0ppm；
所述的枸杞多糖LICP007-S5的制备方法，包括如下的步骤：
将枸杞的水提液经过分子量为30kDa的超滤膜进行分离，将截留的枸杞水提液组分冷冻干燥，溶于蒸馏水中，脱除蛋白、色素后，再进行透析后冷冻干燥；将干燥的产物再次溶解进行离子交换树脂柱层析，使用氯化钠溶液洗脱，收集组分，使用3500Da的透析袋进行透析，透析产物冷冻干燥后再次溶于蒸馏水中，用葡聚糖凝胶进一步分离，收集组分后冷冻干燥完成制备。
所述的脱除蛋白，是使用氯仿和正丁醇混合溶液(4:1)脱除蛋白；
所述的脱除色素，是使用30％的过氧化氢脱和氨水溶液脱除色素；
所述的柱层析，是使用DEAE-52层析柱和Sephadex G-200层析柱。
所述的氯化钠溶液，其浓度为0.5mol。
本发明所提供的枸杞多糖LICP007-S5在抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶活性中的应用。
本发明所提供的枸杞多糖LICP007-S5用于制备降血糖的制品，包括但不限于功能食品、保健食品、特殊医学用途食品或新药。
附图说明
图1：本发明中从枸杞中筛选分离纯化枸杞多糖LICP007-S5的流程图。
图2：A：枸杞多糖部位LICP007，LICP008，LICP009和LICP010对α-淀粉酶的抑制活性；B：枸杞多糖部位LICP007，LICP008，LICP009和LICP010对α-葡萄糖苷酶的抑制活性；C：枸杞多糖组分LICP007-N1,LICP007-S2和LICP007-S5对α-淀粉酶的抑制活性；D：枸杞多糖组分LICP007-N1,LICP007-S2和LICP007-S5对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
图3：LICP007-S5在DEAE-52纤维素柱上分离纯化图。
图4：LICP007-S5的SEC-MALLs分析图谱。
图5：LICP007-S5的红外光谱图。
图6：LICP007-S5的热重分析谱图。
图7：LICP007-S5的原子力显微镜图。
图8：LICP007-S5的核磁图谱。
具体实施方式
本发明采用α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性筛选评价试验，从枸杞总多糖中筛选发现了一种具有潜在良好降血糖作用的枸杞多糖组分。
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述。
实施例1：制备具有潜在降血糖作用的枸杞多糖LICP007-S5
1、枸杞多糖组分LICP007-S5的制备方法
1.1仪器、试剂与材料
枸杞子干果、DEAE-52纤维素、Sephadex G-50、单糖标准品(阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖酸、葡萄糖醛酸和甘露糖酸)。所有其他化学物质都至少为分析级。高效液相色谱的溶剂为色谱纯度。真空冷冻干燥机、紫外分光光度计、电子分析天平、离心机、高剪切分散乳化、超滤膜元件、蠕动泵、马尔文激光光散射仪与尺寸排阻色谱法联用系统(SEC-MALLs)。
1.2枸杞粗多糖的制备
图1是从枸杞中分离纯化获得枸杞多糖组分LICP007-S5的流程图。
100g枸杞加入1L的蒸馏水，用高速剪切分散乳化机辅助提取，转速为15000转/分钟，提取温度60℃，提取30分钟。8000转/分钟离心15min，除去残渣。收集含有粗多糖的上清液。然后用分子量为30、10、5、2kDa的膜分离设备截留分离，膜分离过程为:将上述离心后得到的枸杞粗多糖上清液通过蠕动泵泵入截留分子量为30kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LICP007；收集透过液通过蠕动泵泵入截留分子量为10kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LICP008；收集透过液通过蠕动泵泵入截留分子量为5kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LICP009，收集透过液通过蠕动泵泵入截留分子量为2kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LICP010，弃去透过液。将LICP007、LICP008、LICP009、LICP010放入真空冷冻干燥机中，冷肼温度-60℃，样品温度-55℃，真空度10Pa，冷冻干燥36h，密封保存。上述4个组分采用苯酚-硫酸法测定总糖的含量，采用DC蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量，用咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量，结果如表1。
表1：四个多糖部位总糖、蛋白和糖醛酸含量表
Figure BDA0003472279780000051
将5克LICP007溶于100mL蒸馏水中，用氯仿:正丁醇4:1脱除蛋白，重复5次直至溶液中间没有絮状物质，以表示蛋白除去完全。然后加入氨水，将溶液调至pH＝8，在热水浴下边搅拌边加入20mL 30％的过氧化氢对其进行脱色，脱色结束后，再用分子量1000Da的透析袋透析3天，冷冻干燥得纯化多糖LICP007。
将纯化后的枸杞多糖LICP007溶于蒸馏水，用蠕动泵泵入事先处理好的DEAE-52层析柱，分别用蒸馏水，0.2和0.5mol氯化钠溶液分步洗脱，流速为1mL/min，每管收集8mL。采用苯酚-硫酸法对洗脱部分进行了监测。得到3个组分，如图3所示。然后将水洗脱的组分直接冷冻干燥，0.2mol和0.5mol氯化钠洗脱得到的组分合并收集，用3500Da透析袋透析2天，冷冻干燥，依次得到枸杞多糖LICP007-N1，LICP007-S2和LICP007-S5组分。将上述各组分用10mL蒸馏水溶解，分别用蠕动泵泵入Sephadex G-200层析柱，用水洗脱。流速为1mL/min，每管收集8mL。采用苯酚-硫酸法对洗脱部分进行了监测。收集得到的相应组分合并，用旋转蒸发仪浓缩至10mL，冷冻干燥得到的3个组分也相应的命名为枸杞多糖LICP007-N1，LICP007-S2和LICP007-S5组分。
实施例2：枸杞多糖不同部位和组分降血糖活性评价(α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性筛选评价)。
2.1.α-淀粉酶抑制活性评价
测定了4种枸杞多糖部位LICP007、LICP008、LICP009和LICP010的α-淀粉酶抑制活性。取LICP007～LICP010溶液(0.5，1.0，5.0，10.0和20.0mg/mL)各45μL，加入15μLα-淀粉酶(0.02mg/mL)后在37℃水浴下保温10min，然后加入60μL淀粉溶液(0.08％)，于37℃水浴反应15min后加入60μL盐酸溶液(1mol/L)，终止反应后再加入20μL碘液(0.01mol/L)得到反应液。同时用15μL的PBS缓冲液替代α-淀粉酶解液作为空白。最后在酶标仪630nm下测吸光度。LICP007-N1、LICP007-S2和LICP007-S5采用相同的方法进行测定。
抑制率计算公式如下所示。
Figure BDA0003472279780000071
其中，Ab表示阴性空白吸光度，Ac表示阴性对照吸光度，Asb表示样品空白吸光度，Asc表示样品对照吸光度。
2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性评价
测定了4种多糖组分LICP007、LICP008、LICP009和LICP010的α-葡萄糖苷酶抑制活性。取LICP007～LICP010溶液(0.5，1.0，5.0，10.0和20.0mg/mL)各50μL，α-葡萄糖苷酶溶液50μL加入到96孔板中，在37℃下孵育15min；再加入50μL 1mmol/L的pNPG溶液作为反应底物，在37℃下继续孵育15min；最后加入50μL 0.2mol/L Na2CO3溶液终止反应，在405nm处测吸光度值。LICP007-N1、LICP007-S2和LICP007-S5采用相同的方法进行测定。抑制率计算公式如下所示。
Figure BDA0003472279780000072
其中，Ab表示阴性空白吸光度，Ac表示阴性对照吸光度，Asb表示样品空白吸光度，Asc表示样品对照吸光度。
2.3α-淀粉酶抑制率
4个枸杞多糖部位抑制α-淀粉酶活性评价结果如图2A所示，LICP007对α-淀粉酶的抑制活性最高，在浓度为1-50mg/mL时，LICP007的抑制率高达61.42±0.29％，LICP008的抑制率最低，为21.29±0.22％。实验结果表明多糖部位LICP007是最有潜力的降血糖成分，具有进一步分离纯化的意义。LICP007继续分离纯化后得到的3个组分LICP007-N1、LICP007-S2和LICP007-S5的α-淀粉酶抑制活性评价结果显示(图2C)，所有样品均表现出抑制活性。LICP007-N1、LICP007-S2和LICP007-S5对α-淀粉酶的抑制率随样品浓度的增加而逐渐上升，在0.5-20mg/mL浓度下对α-淀粉酶具有剂量依赖性作用。LICP007-S5对α-淀粉酶的抑制作用强于LICP007-N1和LICP007-S2。当浓度在0.5-20.0mg/mL时，LICP007-S5的抑制率分别为13.41％、16.32％、75.35％、89.88％和98.38％。
2.4α-葡萄糖苷酶抑制率
4个枸杞多糖部位抑制α-葡萄糖苷酶评价结果如图2B所示，随着浓度的增加，4种多糖部位对α-葡萄糖苷酶活性均有一定的抑制作用。在浓度为1-50mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制作用显著。其中，LICP007的抑制作用显著高于其他3个多糖部位，在浓度为50mg/mL时，抑制率可达40.69±0.35％，LICP010对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果最弱。对降血糖活性最高的LICP007继续分离纯化后得到了3个组分，如图2D所示，LICP007-N1、LICP007-S2和LICP007-S5对α-葡萄糖苷酶抑制率的抑制率分别为14.48％、30.46％和43.45％。LICP007-S5对α-葡萄糖苷酶抑制率最高，该实验数据说明LICP007-S5具有较强的降血糖活性潜力。
实施例3：枸杞多糖LICP007-S5结构分析
3.1分子量测定
采用多角度激光光散射仪与尺寸排阻色谱法联用(SEC-MALLs)来测定多糖的分子量。如图4所示，结果表明LICP007-S5由两个主要的峰Peak I和Peak II构成，Peak I的数均分子量Mn，重均分子量Mw和平均分子量Mz分别为4.769×103,9.202×103和1.690×104g/mol，分散性指数PDI为2.002，Peak II的数均分子量Mn，重均分子量Mw，平均分子量Mz分别为7.871×104，1.031×105和2.101×105g/mol，分散性指数PDI为1.310。因此，LICP007-S5是一种多分散杂多糖。
3.2单糖组成分析
单糖组成分析是质量控制和获取多糖基本信息的重要手段。利用离子色谱法对LICP007-S5的组成和比例进行了分析。根据标准单糖的保留时间可知，枸杞多糖LICP007-S5由4.6％的鼠李糖，21.6％的阿拉伯糖，2.5％的氨基葡萄糖，12.4％的半乳糖，31.4％的葡萄糖和27.5％的半乳糖醛酸组成。因此，LICP007-S5是一种新型杂多糖。
3.3傅里叶变换红外光谱分析
傅里叶变换红外光谱分析通常用于部分揭示多糖的特征官能团的存在。如图5所示，LICP007-S5在3410.1cm-1处有OH的强的伸缩峰，表明多糖链之间存在强烈的分子间和分子内相互作用。2926.4cm-1处的弱吸收带是由于C-H的不对称伸缩振动引起的，1723.6cm-1处的强吸收峰是由于C＝O或COOH的不对称伸缩振动引起的，表明多糖中存在糖醛酸，这与单糖组成分析结果一致。
3.4热重分析
通过热重分析法考察了多糖的热稳定性。如图6所示，在LICP007-S5的热分解过程中发生了四个主要过程。第一阶段在100℃以上失重15％，主要是由于多糖孔隙中吸附水的损失所致，说明LICP007-S5在较低的温度下是稳定的。第二阶段在100～500℃失重13％，主要是结合水和有机溶剂的挥发所致。第三阶段在500～600℃失重20％左右，在这个阶段LICP007-S5经历了强烈的热裂化反应，骨架开始断裂。与第一阶段相似，第四阶段是一个缓慢的失重过程，在这个过程中多糖被完全分解，LICP007-S5的重量下降较慢，几乎未见重量的损失。
3.5原子力显微镜分析
原子力显微镜是表征多糖形态结构的有效方法。枸杞多糖LICP007-S5的原子力显微镜分析如图7所示，微观形态是松散的团聚体聚集在一起，形成密度大、孔隙大的大聚集体。分子高度约为35.4nm，具有三螺旋结构。
3.6核磁分析
枸杞多糖LICP007-S5的1H NMR信号如图8所示，在δ5.43、5.05、5.03、5.00、4.54和4.36ppm处有6个明显的反常质子化学位移，高于或低于δ5.0ppm，说明α构型和β构型都存在。化学位移出现在δ5.65ppm左右，说明LICP007-S5中含有大量的糖醛酸。在δ5.43ppm和δ5.03ppm处的质子信号来源于α-D-葡萄糖，而在δ5.05ppm处的质子信号来源于α-1,5-阿拉伯糖，δ3.68ppm的强信号来自甲氧基。提示LICP007-S5含有α-D-葡萄糖、α-1,5-阿拉伯糖残基。
实施例4：枸杞多糖LICP007-S5对小鼠血糖影响
4.1剂量设计及给药方式的选择
给药途径：灌胃给药(ig)；给药体积：小鼠0.2mL/10g；剂量设计：10、5、1、0.5g/kg进行降血糖实验研究；达美康人日用量160mg，人体重70kg，小鼠体重20g计算，小鼠等效剂量为25mg/kg，达美康剂量设计为：50mg/kg。
4.2实验动物
种属：ICR小鼠，体重：18-20g，90只，雄性。
4.3饲养条件
温度范围20℃-26℃；湿度范围40％～70％；换气次数不少于15次全新风/小时；12小时明12小时暗交替。
4.4试验方法与结果
试验选用雄性ICR小鼠90只，体重18-22g，小鼠尾部静脉针刺取血(取血前动物禁食4h)，用罗氏卓越型血糖仪及专用试纸条测定小鼠空腹血糖。挑选出血糖值在5.0-6.5mmol/l小鼠80只，按血糖水平分层随机分为8组，每组10只，分别为对照组、模型组、阳性药组、10、5、1、0.5g/kg剂量的LICP007-S5组。试验当天各组灌胃给予相应的受试物，对照组灌胃同体积去离子水，测定给予受试物后1h血糖值，同时继续给药2周，每天给药1次，每周测血糖1次，末次给药后1h(小鼠禁食4小时)于小鼠尾部静脉针刺取血，用血糖仪测定血糖，作为0点血糖，除对照组外，其余小鼠ig给予1.5g/kg葡萄糖溶液。以上述方法测定给予葡萄糖后30分钟、60分钟、120分钟时的血糖，并计算血糖曲线下面积(AUC)，将所得结果进行统计学处理。结果如表2所示，与对照组比较，给药1次，LICP007-S5仅10.0g/kg剂量组对正常小鼠的血糖有明显的降低作用，继续给药1周后，10、5、1g/kg剂量的LICP007-S5组对正常小鼠的血糖均有明显的降低作用。
对正常小鼠糖耐量的试验结果如表3所示，由于提前给药2周，10、5、1g/kg剂量的LICP007-S5组对正常小鼠的血糖有明显的降低作用(0点血糖)，ig葡萄糖后，10、5、1g/kg剂量的LICP007-S5均能够非常显著地抑制30分钟和60分钟时间点的血糖升高；10、5、1g/kg剂量组AUC显著低于模型组，说明给予2周LICP007-S5非常显著地增强了小鼠的糖耐量，而且各组之间有较好的量效关系。
表2：对正常小鼠血糖的影响表(n＝10)
Figure BDA0003472279780000121
给药组与对照组比较*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001
表3：对正常小鼠糖耐量的影响表(n＝10)
Figure BDA0003472279780000122
模型组与对照组比较ΔΔΔp<0.001；给药组与模型组比较*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过以上实验发现，枸杞多糖组分LICP007-S5具有显著的降血糖作用。

Claims (5)

1.一种枸杞多糖，其特征在于，所述的枸杞多糖，其制备方法如下：
将枸杞的水提液经过分子量为30kDa的超滤膜进行分离，将截留的枸杞水提液组分冷冻干燥，溶于蒸馏水中，使用体积比为4:1的氯仿和正丁醇混合溶液脱除蛋白，使用30%的过氧化氢脱除色素后，再用分子量1000 Da的透析袋进行透析后，透析液冷冻干燥；将干燥的产物再次溶解蒸馏水，再使用DEAE-52层析柱进行离子交换树脂柱层析，分别用蒸馏水、0.2mol和0.5 mol氯化钠溶液分步洗脱，流速为1mL/min；采用苯酚-硫酸法对洗脱部分进行监测，收集0.5 mol氯化钠洗脱得到的组分，使用3500Da的透析袋进行透析，透析产物冷冻干燥后再次溶解于蒸馏水中，用葡聚糖凝胶进一步分离，用水洗脱，流速为1mL/min，收集组分后冷冻干燥完成制备。
2.权利要求1所述的枸杞多糖在非疾病诊断治疗目的的抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶活性中的应用。
3.权利要求1所述的枸杞多糖在制备降血糖的制品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为功能食品、保健食品、特殊医学用途食品或药物。
5.一种降血糖的制品，其特征在于，所述的制品中包含有药理有效浓度的权利要求1所述的枸杞多糖。
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