CN103159864B - 一种黑果枸杞多糖的分离纯化方法及分离得到的五种多糖 - Google Patents
一种黑果枸杞多糖的分离纯化方法及分离得到的五种多糖 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种黑果枸杞多糖分离纯化制备方法及分离得到的五种多糖,以黑果枸杞果实为原料,通过超声加热法提取、三氯乙酸法脱蛋白、过氧化氢法脱色、DEAE纤维素柱层析、Sephadex?G-100柱层析等获得多糖纯品,结构分析表明黑果枸杞多糖为多分支的阿拉伯半乳聚糖。该提取工艺在比较温和的条件下进行,完好的保存了多糖分子上的糖链部分,纯化得到五种不同的多糖组分,结构明确,质量可控,在食品、化妆品、保健品、医药等领域有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种以黑果枸杞为原料提取纯化黑果枸杞多糖的方法及分离得到的五种多糖
背景技术
黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)系茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)。多年生灌木,具棘刺,浆果球形,成熟后为紫黑色,有很高的光合效率和较强抗逆性,是我国西北荒漠地区一种特有的、亟待开发的野生植物,分布于山西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等省。黑果枸杞果实味甜多汁,含丰富的维生素、有机酸及糖类,民间常生食或榨汁做饮料;黑果枸杞也具有一定的医疗保健功能,藏医用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症。多糖广泛存在于中药材中,现代药理学研究证明,多糖是中草药发挥独特疗效的重要物质基础。黑果枸杞多糖作为黑果枸杞的一个重要组成成分,研究表明其有降血糖和抗疲劳功效。因此提取其多糖并将其成分制成各种中成药的前景十分广阔。
目前关于黑果枸杞多糖提取工艺的研究比较粗浅,仅限于通过传统方法提取粗多糖,从黑果枸杞中提取的粗多糖含有大量的大分子蛋白质、色素、无机盐及其他小分子等杂质,产品纯度低,系属多种糖组分和蛋白色素的混合物,目前还未制备出黑果枸杞多糖纯品,对黑果枸杞多糖的结构研究也几乎空白。为了进一步开发黑果枸杞这一宝贵资源,发掘新药源,本发明以野生黑果枸杞为原料,采用超声加热法得到粗多糖,对提取的粗多糖进行脱蛋白及脱色工艺研究,然后利用离子交换层析和凝胶过滤层析方法纯化黑果枸杞多糖,首次制备出五种黑果枸杞多糖纯品,并且对五种组分多糖的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定,为将来在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用奠定了坚实的基础。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术提取的黑果枸多糖纯度低、多糖结构不明确,提供一种可尽快实现工业化生产,转化为应用的黑果枸杞多糖的提取纯化工艺,并对制备出的多糖进行结构鉴定。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
本发明涉及一种从黑果枸杞果实分离纯化多糖的方法及结构鉴定,包括以下步骤:
(1)原料粉碎:黑果枸杞果实加2~8倍体积的水用组织捣碎机打碎至均匀状态。
(2)超声提取:将黑果枸杞匀浆后放入超声提取设备,温度50~80℃,超声波频率20~60KHz,提取时间1~4h,功率50W,将提取液过滤,残渣用2~8倍体积水再次加热超声提取1~4h,合并两次提取液。
(3)醇沉:提取液40℃真空浓缩后,加乙醇调浓度至75~85%,静置12h后过滤得多糖沉淀。
(4)脱蛋白:将多糖沉淀加水溶解后,加三氯乙酸至浓度2~6%,搅拌15~60min后离心,保留上清糖液。
(5)脱色:将脱蛋白后的多糖液用氨水调pH值至8~9,30~60℃、时间15~60min、H2O2用量为2%~10%。
(6)超滤:将多糖液经过1~3万分子量的膜,冷冻干燥得黑果枸杞粗多糖(LRP)。
(7)离子交换柱层析:DEAE-纤维素用0.01~0.10mol/LNaHCO3溶液平衡为HCO3 -型,依次用蒸馏水、0.02~0.07、0.09~0.15、0.20~0.30、0.40~0.60mol/LNaHCO3溶液梯度洗脱,分别后获得五种多糖粗品LRP1、LRP2、LRP3、LRP4和LRP5。
(8)凝胶过滤柱层析:SephadexG-100凝胶色谱柱以0.05~0.20mol/LNaCl水溶液洗脱,使用SephadexG-25柱蒸馏水水洗脱盐,浓缩冷冻干燥后获得五种多糖纯品命名为LRGP1、LRGP2、LRGP3、LRGP4和LRGP5。
(9)多糖理化性质测定:多糖纯度及分子量测定采用HPGPC法,糖含量测定采用苯酚硫酸法,蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法,单糖组分采用糖醇乙酸酯气相色谱法,五种多糖组分理化性质如下:
表黑果枸杞多糖的理化性质
(Rha:鼠李糖;Ara:阿拉伯糖;Xyl:木糖;Man:甘露糖;Glc:葡萄糖;Gal:半乳糖;GalA:半乳糖醛酸)
(10)多糖连接方式分析:通过部分酸水解及甲基化分析测出LRGP1、LRGP2、LRGP3和LRGP4以→6)Gal(1→构成主链,部分半乳糖C3存在分支,由半乳糖以→3)Gal(1→连接在半乳糖C3位构成;支链由Ara(1→,→3)Ara(1→,→5)Ara(1→,Glc(1→,→2,4)Rha(1→连接而成。LRGP5主链由→4)GalA(1→2)Rha(1→重复单元构成,部分鼠李糖C4位存在分支。
LRGP1的重复单元结构为:
LRGP2的重复单元结构为:
LRGP3的重复单元结构为:
LRGP4的重复单元结构为:
LRGP5的重复单元结构为:
本发明具有如下优点:
1与传统水煮法提取黑果枸杞多糖方法相比,本发明采用的超声加热法提取的温度较低,可以避免多糖结构的破坏,完好的保存了多糖分子上的糖链部分。
2提取方法中三氯乙酸法脱蛋白操作简单,工艺步骤少,多糖损失小。采用过氧化氢法脱色使粗多糖的色素明显减少,对进一步柱层析纯化非常有益。
3本发明中通过膜分离技术,使用大柱径分离柱进行柱层析纯化黑果枸杞多糖,首次制备出五种黑果枸杞多糖纯品。
4本发明对制备出的五种多糖结构进行了鉴定,明确了各多糖组分的理化性质及结构,有利于进一步研究各组分的生理活性,使黑果枸杞多糖尽快转化为医药和保健食品,造福于社会。
具体实施方式
实施例1一种从黑果枸杞果实分离纯化多糖的方法,包括以下步骤:
(1)原料粉碎:黑果枸杞果实加4倍体积的水用组织捣碎机打碎至均匀状态。
(2)超声提取:将黑果枸杞果实匀浆后放入超声提取设备,温度70℃,超声波频率40KHz,功率50W,提取时间2h,提取液过滤,残渣用2倍体积水再次加热超声提取1h。
(3)醇沉:提取液40℃真空浓缩后,加乙醇调浓度至80%,静置12h后过滤得多糖沉淀。
(4)脱蛋白:将多糖沉淀加水溶解后,加三氯乙酸至浓度3%,搅拌30min后离心,保留上清糖液。
(5)脱色:将脱蛋白后的多糖液用氨水调pH值至8-9,加入质量分数为30%的H2O2的体积为多糖液体积的5%,在温度45℃条件下处理30min。
(6)超滤:将多糖液经过1万分子量膜。冷冻干燥得黑果枸杞粗多糖(LRP),粗多糖得率为2.1%。
(7)离子交换柱层析:DEAE-纤维素用0.05mol/LNaHCO3溶液平衡为HCO3 -型,黑果枸杞粗多糖上样,依次用蒸馏水、0.05、0.10、0.25、0.50mol/LNaHCO3溶液梯度洗脱,分别后获得五种多糖粗品LRP1、LRP2、LRP3、LRP4和LRP5。
(8)凝胶过滤柱层析:五种多糖粗品分别上样,SephadexG-100凝胶色谱柱以0.1mol/LNaCl水溶液洗脱,使用SephadexG-25柱蒸馏水水洗脱盐,浓缩冷冻干燥后儿得五种多糖纯品LRGP1、LRGP2、LRGP3、LRGP4和LRGP5。
(9)多糖理化性质测定:多糖纯度及分子量测定采用HPGPC法,糖含量测定采用苯酚硫酸法,蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法,单糖组分采用糖醇乙酸酯气相色谱法,五种多糖组分理化性质如下:
表黑果枸杞多糖的理化性质
(10)多糖连接方式分析:通过部分酸水解(Huang,L.,Lin,Y.,Tian,G.,&Ji,G.1998.Isolation,purificationandphysico-chemicalpropertiesofimmunoactiveconstituentsfromthefruitofLyciumbarbarumL.ActaPharmacologicaSinica,33(7),512-516.)及甲基化分析(Needs,P.W.,&Selvendran,R.R.1993.Avoidingoxidative-degradationduringdodium-hydroxidemethyliodlde-mediatedcarbohydratemethylationindimethyl-sulfoxide.CarbohydrateResearch,245(1),1-10.)测出LRGP1、LRGP2、LRGP3和LRGP4以→6)Gal(1→构成主链,部分半乳糖C3存在分支,由半乳糖以→3)Gal(1→连接在半乳糖C3位构成;支链由Ara(1→,→3)Ara(1→,→5)Ara(1→,Glc(1→,→2,4)Rha(1→连接而成。LRGP5主链由→4)GalA(1→2)Rha(1→重复单元构成,部分鼠李糖C4位存在分支。
LRGP1的重复单元结构为:
LRGP2的重复单元结构为:
LRGP3的重复单元结构为:
LRGP4的重复单元结构为:
LRGP5的重复单元结构为:
实施例2
按实施例1所述的提取方法,与实施例1不同之处在于,温度50℃,超声波频率40KHz,功率50W,提取时间2h,粗多糖(LRP)得率为1.2%。
实施例3
按实施例1所述的提取方法,与实施例1不同之处在于,温度70℃,超声波频率80KHz,功率50W,提取时间2h,粗多糖(LRP)得率为0.9%。
实施例4
取1g粗多糖(步骤4得到的糖液经透析冷冻干燥后获得的粗多糖)溶于100mL蒸馏水中,加入质量分数为30%双氧水3mL,用氨水调体系pH值至9,45℃搅拌30~240min,分别于450nm和490nm波长下测定吸光度,反应30min脱色率达45.2%,随着脱色时间的增加,脱色率无明显提高,而多糖损失率增加,所以脱色时间应控制在30min左右。
表脱色时间对脱色效果和多糖损失率的影响
实施例5
取1g粗多糖(步骤4得到的糖液经透析冷冻干燥后获得的粗多糖)溶于100mL蒸馏水中,分别用氨水调体系pH值至7、8、9、10,然后加入质量分数为30%双氧水3mL,45℃搅拌反应30min,比较脱色效果。结果为过氧化氢在碱性条件下脱色作用明显,而多糖含量变化不大。所以pH值应控制在8~9。
表pH值对脱色效果和多糖损失率的影响
实施例6
取1g粗多糖(步骤4得到的糖液经透析冷冻干燥后获得的粗多糖)溶于100mL蒸馏水中,加入质量分数为30%双氧水3mL,用氨水调体系pH值至9,不同温度条件下搅拌反应30min,比较脱色效果。结果为脱色率随着温度的升高而升高,在60℃后,变化不大,而多糖含量也随温度升高而降低。因此脱色温度不应过高,控制在45℃左右。
表脱色温度对脱色效果和多糖损失率的影响
实施例7
采用高效凝胶渗透色谱法对黑果枸杞多糖进行纯度及分子量的测定。色谱柱为TSK-GelG4000SW(7.5×300mm)柱。流动相为:磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH=6)+0.1mol/LNa2SO4。柱箱温度30℃,示差(IR)检测。
将葡萄糖、系列葡聚糖标准品(5200,11600,25000,48600,80000)、蓝色萄聚糖(Mw=2000KDa)分别用流动相配成浓度为0.2%(w/v)的溶液,按分子量由小到大的顺序依次进样,测定洗脱体积(Vc)。凝胶柱床总体积(Vt)和柱的空体积(V0)分别为葡萄糖和蓝色葡聚糖的洗脱体积。多糖的分子量(Mw)与其在色谱柱上的分配系数(Kav)和洗脱体积(Vc)存在如下关系:Kav=(Vc-Vo)/(Vt-Vo)
根据公式Kav=(Vc-Vo)/(Vt-Vo)求得各标准品的Kav,以lgMw(分子量对数)为纵坐标,以Kav(分配系数)为横坐标绘制标准曲线,即得到线性回归方程。
将样品用流动相配成浓度为0.2%(w/v)的溶液,于相同色谱条件下分析,测定洗脱体积,代入回归方程计算结果为LRGP1分子量5.62×104Da;LRGP2分子量6.82×104Da;LRGP3分子量7.56×104Da;LRGP4分子量9.02×104Da;LRGP5分子量2.25×105Da。
实施例8
黑果枸杞粗多糖(LRP)2mg,加入2mL2mol/LTFA,密闭,充氮气,121℃水解2h,减压抽干。水解后的样品加入1mL水溶解,加入100μL0.5mol/LNa2CO3调pH至9左右,于30℃水浴保温60min。加入0.5mLNaBH4溶液室温还原2h。加入冰醋酸中和至无气泡,过阳离子交换柱(H+型),将洗脱液旋转蒸发至干,加甲醇蒸干以除去硼酸盐。85℃真空加热2h,残渣溶于1mL吡啶中,加入1mL正丙胺,密封,55℃加热30min。旋转蒸发抽干溶剂,加入吡啶和乙酸酐各2mL,振荡后室温过夜。减压抽干后,用氯仿溶解并用水萃取3次,氯仿层进行气相色谱分析。色谱柱为rtx-50柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)。程序升温条件为:180℃(2min)-6℃/min,210℃-0.3℃/min,215℃-6℃/min,240℃(30min)。
经检测LRP糖组分质量含量Rha(4.6%)、Ara(38.8%)、Xyl(4.3%)、Man(1.3%)、Glc(2.6%)、Gal(23.2%)、GalA(25.2%)。
该提取工艺在比较温和的条件下进行,完好的保存了多糖分子上的糖链部分,纯化得到五种不同的多糖组分,结构明确,质量可控,在食品、化妆品、保健品、医药等领域有重要意义。
Claims (4)
1.一种以黑果枸杞为原料分离得到的五种黑果枸杞多糖,其特征在于:
五种多糖组分理化性质如下:
所述黑果枸杞多糖LRGP1、LRGP2、LRGP3和LRGP4以→6)Gal(1→构成主链,部分半乳糖C3存在分支,由半乳糖以→3)Gal(1→连接在半乳糖C3位构成;支链由Ara(1→,→3)Ara(1→,→5)Ara(1→,Glc(1→,→2,4)Rha(1→连接而成;LRGP5主链由→4)GalA(1→2)Rha(1→重复单元构成,部分鼠李糖C4位存在分支;
LRGP1的重复单元结构为:
LRGP2的重复单元结构为:
LRGP3的重复单元结构为:
LRGP4的重复单元结构为:
Rha:鼠李糖;Ara:阿拉伯糖;Xyl:木糖;Man:甘露糖;Glc:葡萄糖;Gal:半乳糖;GalA:半乳糖醛酸。
2.一种权利要求1所述的黑果枸杞多糖的分离纯化方法,其特征在于:
黑果枸杞加水匀浆、超声加热法提取、过滤滤液浓缩、醇沉、沉淀用三氯乙酸法脱蛋白、上清糖液用过氧化氢法脱色、超滤、滤液干燥后得黑果枸杞粗多糖,粗多糖上DEAE-纤维素柱层析得五种多糖粗品、五种多糖粗品分别上SephadexG-100柱层析、脱盐、冷冻干燥制备出五种多糖纯品LRGP1、LRGP2、LRGP3、LRGP4和LRGP5,结构分析表明,LRGP1、LRGP2、LRGP3和LRGP4是结构不同的阿拉伯半乳聚糖,LRGP5是一种鼠李半乳糖醛酸聚糖。
3.按照权利要求2所述的分离纯化方法,其特征在于:所述的过氧化氢法脱色条件为温度30~60℃、时间15~60min、用氨水调体系pH8~9后脱色、质量分数为30%的H2O2的体积用量为多糖液体积的2%~10%。
4.一种权利要求1所述的以黑果枸杞为原料分离得到的五种黑果枸杞多糖纯品在食品、化妆品、制备保健品和药物方面的应用。
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