CN112457422A - 一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，过程包括：将暗褐脉柄牛肝菌菌丝接种于液体发酵培养基中，进行发酵，得发酵液；对所得发酵液进行浓缩，得浓缩液；对所得浓缩液进行离心，取上清液，并向上清液中加入乙醇，离心，收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖；制备粗多糖溶液，以DEAE‑52纤维素柱对粗多糖溶液进行洗脱，并对洗脱液浓缩，得粗多糖浓缩液；将所得粗多糖浓缩液装入透析袋中进行透析，并对透析液冷冻干燥，得暗褐脉柄牛肝菌多糖。该方法提高了暗褐脉柄牛肝菌多糖的纯度，便于后续对真菌多糖结构和组成的探究，为暗褐脉柄牛肝菌多糖药用价值的研制拓宽了发展空间和途径。

Description

一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及多糖提取技术领域，更具体地说是涉及一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法。

背景技术

暗褐脉柄牛肝菌[Phlebopus portentosus(Berk.&Broome)Boedijn]为小牛肝菌科(Boletinellaceae)，脉柄牛肝菌属(Phlebopus)真菌，又名暗褐网柄牛肝菌，俗称“黑牛肝菌”。主要分布在中国海南、云南和广西等地区。暗褐脉柄牛肝菌不仅味道好，而且还含有各类营养成分，如氨基酸、多糖、蛋白质等，是营养成分较高的一种食用菌。

暗褐脉柄牛肝菌中含有大量的真菌多糖，实验研究发现，真菌多糖对小鼠的心脏具有保护作用，且可明显抑制小鼠体内的肾癌细胞。但是，目前暗褐脉柄牛肝菌多糖的分离、纯化方法获得的多糖纯度较低，很难对暗褐脉柄牛肝菌多糖的结构和组成进行研究，也无法将其应用于实际生产中。

因此，如何提供一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的分离纯化方法，便于后续对真菌多糖结构和组成的探究，为暗褐脉柄牛肝菌多糖药用价值的研制拓宽了发展空间和途径。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，包括下述步骤：

1)制备发酵液：将暗褐脉柄牛肝菌菌丝接种于液体发酵培养基中，进行发酵，得发酵液；

2)浓缩：对步骤1)所得发酵液进行浓缩，得浓缩液；

3)离心、醇沉、干燥：对步骤2)所得浓缩液进行离心，取上清液，并向上清液中加入乙醇，离心，收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖；

4)洗脱、浓缩：制备粗多糖溶液，以DEAE-52纤维素柱对粗多糖溶液进行洗脱，并对洗脱液浓缩，得粗多糖浓缩液；

5)纯化、干燥：将步骤4)所得粗多糖浓缩液装入透析袋中进行透析，并对透析液冷冻干燥，得暗褐脉柄牛肝菌多糖。

以上技术方案达到的技术效果是：暗褐脉柄牛肝菌多糖主要存在于暗褐脉柄牛肝菌的发酵液中，为了获得大量的发酵液，将菌丝接种于液体培养基中进行培养，以此来获得提取暗褐脉柄牛肝菌多糖的原料；对发酵液进行浓缩，可以减少发酵液体积，便于离心；利用乙醇能够溶解小分子杂质、而不溶解多糖等大分子的特性，初步对暗褐脉柄牛肝菌多糖进行沉淀，得到了暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，粗多糖中含有多糖、蛋白质等杂质，因此对沉淀进行洗脱和纯化可去除其中的杂质，获得纯度较高的暗褐脉柄牛肝菌多糖。本发明对粗多糖进行DEAE-52纤维素柱洗脱、透析两步纯化，显著提高了暗褐脉柄牛肝菌多糖的得率和纯度。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述发酵为在25～32℃、100～200r/min下恒温培养10～15d。

以上技术方案达到的技术效果是：25～32℃下，菌丝可以快速生长，便于在短时间内获得多糖含量高的液体发酵液；恒温培养的时间决定了菌丝的生长量，若时间过长，发酵液的营养不能满足菌丝生长的需求，造成菌丝的老化，因此，在25～32℃下培养10～15d时，既可以使得菌丝正常生长，又可以获得多糖含量高的液体发酵液。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，上清液和乙醇的体积比为1:(3～5)。

以上技术方案达到的技术效果是：当上清液与乙醇的体积比为1:(3～5)时，上清液中的小分子如无机盐、色素等可充分溶解在乙醇中，进而达到对暗褐脉柄牛肝菌多糖进行初步纯化的目的。

作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，所述洗脱为依次以蒸馏水、0.1mol/LNaCl溶液、0.2mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液、0.4mol/L NaCl溶液和0.5mol/L NaCl溶液洗脱。

以上技术方案达到的技术效果是：根据不同物质在纤维柱上吸附能力的不同，依次将物质洗脱下来，蒸馏水在重力的作用下，通过纤维柱流出，可以将纤维柱的孔隙“压实”，缩短纤维柱的洗脱路径；不同浓度的NaCl溶液对多糖分子、蛋白质、无机盐、色素的洗脱作用不同，浓度越高，对多糖分子的洗脱的力度越大，因此，不断增加NaCl溶液的浓度，可以将多糖分子完全洗脱出来，提高了多糖的得率。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)和步骤4)中，所述浓缩为在0.08～0.09MPa、40～60℃下浓缩10～20min。

作为本发明优选的技术方案，步骤5)中，所述透析为在MD34透析袋中透析20～24h。

以上技术方案达到的技术效果是：MD34透析袋可以将大分子蛋白质去除，进一步达到了纯化暗褐脉柄牛肝菌多糖的目的。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)和步骤5)中，所述冷冻干燥为在-40～-50℃干燥1～2h。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的分离纯化方法，以水提、醇沉的方法，对暗褐脉柄牛肝菌多糖进行分离和初步纯化，再以DEAE-52纤维素柱洗脱和MD34透析袋纯化，得到纯度较高的暗褐脉柄牛肝菌多糖，为结构分析和鉴定提供了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为暗褐脉柄牛肝菌多糖的DEAE-52纤维素色谱洗脱曲线图；

图2附图为葡萄糖标准曲线图；

图3附图为暗褐脉柄牛肝菌多糖的紫外扫描图谱；

图4附图为暗褐脉柄牛肝菌多糖的红外图谱；

图5附图为暗褐脉柄牛肝菌多糖的¹H-NMR图；

图6附图为暗褐脉柄牛肝菌多糖的¹³C-NMR图；

图7附图为14种单糖标准品的HPLC色谱图；

图8附图为样品中单糖的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

表1

仪器设备	商家
		JB-3A磁力搅拌器	上海雷磁新泾仪器有限责任公司
CBS-A程控全自动部分收集器	上海沪西仪器厂有限公司
		HH-4数显恒温水浴锅	金坛市亿能实验仪器厂
N-1300S-WB型旋转蒸发器	日本东京理化器械株式会社
		Benchtop 6.0KEL冷冻真空干燥机	美国Virtis
80-3电动离心机	金坛市新瑞仪器厂
		电子天平	梅特勒-托利多仪器有限公司
IP-520C电子天平	湘仪天平仪器设备有限公司
		T6新世纪紫外可见分光光度计	北京普析通用仪器有限责任公司
V650紫外可见分光光度计	日本JASCO公司
		JNM-ECZ400S/L1核磁共振谱仪	日本电子株式会社
UPLC-MS/MS	沃特世科技上海有限公司
		Waters 1515 GPC凝胶色谱仪	沃特世科技上海有限公司

表2 试剂

本发明中用到的液体发酵培养基为马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL。

实施例1

多糖的提取与预处理

在无菌条件下，用直径为10mm的打孔器，在暗褐脉柄牛肝菌菌丝的培养皿上打孔，镊子夹取五片菌丝碟接种于盛有200mL液体发酵培养基的三角瓶中，25℃，100r/min恒温培养10d，取出后滤去菌丝，合并发酵液后在0.08MPa、60℃下浓缩10min。量取暗褐网柄牛肝菌发酵液(6L，每次有多个200mL发酵培养基同时发酵，总共做了4批)，在0.08MPa、60℃下浓缩10min，浓缩液先进行离心处理，合并上清液，将其放在磁力搅拌器上缓慢地加入3倍体积乙醇，用保鲜膜封口，放置常温后放入冰箱沉淀24h。醇沉后进行离心处理，两次离心的条件为8000rpm，15min，离心乙醇沉淀后，上清液合并装入烧杯里，置旋转蒸发仪中浓缩，回收乙醇；醇沉离心后沉淀放入冷冻真空干燥机，-40℃下冷冻干燥20h，得到暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，经苯酚-硫酸法检测，多糖纯度为47.2％。

多糖的分离纯化

(1)DEAE-52纤维素预处理

用电子天平称取25g的DEAE-52纤维素，将其倾入烧杯(500mL)，加入去离子水200mL，搅拌处理后密封，置冰箱中溶胀48h，弃去上层浑浊液，加100mL 0.5mol/L的NaOH，浸泡2h后用去离子水过滤并洗至中性。

(2)DEAE-52纤维素装柱

将层析柱(2.5×50cm)垂直固定，加入去离子水50mL，把DEAE-52纤维素(预处理好的)缓慢倒入，用去离子水平衡12h。

(3)DEAE-52柱色谱分离

称取0.5100g暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，加水溶解，超速离心，取上清液，上样。依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、0.2mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液、0.4mol/L NaCl溶液和0.5mol/L NaCl溶液洗脱，控制好洗脱速度，设定自动收集装置3分30秒一次，以8mL装一管，用苯酚-硫酸法检测。将各级洗脱液浓缩至10mL。

(4)粗多糖纯化

浓缩液装入透析袋MD34中置于恒温磁力搅拌器中，透析20h。透析后浓缩液转移置培养皿中，-40℃下冷冻干燥20h，即得暗褐脉柄牛肝菌精制多糖，经苯酚-硫酸法检测，粗多糖纯度为84.2％。

实施例2

多糖的提取与预处理

在无菌条件下，用直径为10mm的打孔器，在暗褐脉柄牛肝菌菌丝的培养皿上打孔，镊子夹取五片菌丝碟接种于盛有200mL液体发酵培养基的三角瓶中，32℃，200r/min恒温培养15d，取出后滤去菌丝，合并发酵液后在0.09MPa、40℃下浓缩20min。量取暗褐脉柄牛肝菌发酵液(6L，每次有多个200mL发酵培养基同时发酵，总共做了4批)，在0.09MPa、40℃下浓缩20min，浓缩液先进行离心处理，合并上清液，将其放在磁力搅拌器上缓慢地加入5倍体积乙醇，用保鲜膜封口，放置常温后放入冰箱沉淀24h。醇沉后进行离心处理，两次离心的条件为8000rpm，15min；离心乙醇沉淀后，上清液合并装入烧杯里，置旋转蒸发仪中浓缩，回收乙醇；醇沉离心后沉淀放入冷冻真空干燥机，-50℃下冷冻干燥22h，得到暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，经苯酚-硫酸法检测，粗多糖纯度为46.8％。

多糖的分离纯化

(1)DEAE-52纤维素预处理

用电子天平称取25g的DEAE-52纤维素，将其倾入烧杯(500mL)，加入去离子水200mL，搅拌处理后密封，置冰箱中溶胀48h，弃去上层浑浊液，加100mL 0.5mol/L的NaOH，浸泡2h后用去离子水过滤并洗至中性。

(2)DEAE-52纤维素装柱

将层析柱(2.5×50cm)垂直固定，加入去离子水50mL，把DEAE-52纤维素(预处理好的)缓慢倒入，用去离子水平衡12h。

(3)DEAE-52柱色谱分离

称取0.5100g暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，加水溶解，超速离心，取上清液，上样。依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、0.2mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液、0.4mol/L NaCl溶液和0.5mol/L NaCl溶液洗脱，控制好洗脱速度，设定自动收集装置3分30秒一次，以8mL装一管，用苯酚-硫酸法检测。将各级洗脱液浓缩至20mL。

(4)粗多糖纯化

浓缩液装入透析袋MD34中置于恒温磁力搅拌器中，透析20h。透析后浓缩液转移置培养皿中，-50℃下冷冻干燥22h，即得暗褐脉柄牛肝菌精制多糖，经苯酚-硫酸法检测，多糖纯度为83.8％。

实施例3

多糖的提取与预处理

在无菌条件下，用直径为10mm的打孔器，在暗褐脉柄牛肝菌菌丝的培养皿上打孔，镊子夹取五片菌丝碟接种于盛有200mL液体发酵培养基的三角瓶中，28℃，150r/min恒温培养12d，取出后滤去菌丝，合并发酵液后在0.085MPa、50℃下浓缩15min。量取暗褐脉柄牛肝菌发酵液(6L，每次有多个200mL发酵培养基同时发酵，总共做了4批)，在0.085MPa、50℃下浓缩15min，浓缩液先进行离心处理，合并上清液，将其放在磁力搅拌器上缓慢地加入4倍体积乙醇，用保鲜膜封口，放置常温后放入冰箱沉淀24h。醇沉后进行离心处理，两次离心的条件为8000rpm，离心15min，离心乙醇沉淀后，上清液合并装入烧杯里，置旋转蒸发仪中浓缩，回收乙醇；醇沉离心后沉淀放入冷冻真空干燥机，-45℃下冷冻干燥24h，得到暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，经苯酚-硫酸法检测，粗多糖纯度为47.5％。

多糖的分离纯化

(1)DEAE-52纤维素预处理

用电子天平称取25g的DEAE-52纤维素，将其倾入烧杯(500mL)，加入去离子水200mL，搅拌处理后密封，置冰箱中溶胀48h，弃去上层浑浊液，加100mL 0.5mol/L的NaOH，浸泡2h后用去离子水过滤并洗至中性。

(2)DEAE-52纤维素装柱

将层析柱(2.5×50cm)垂直固定，加入去离子水50mL，把DEAE-52纤维素(预处理好的)缓慢倒入，用去离子水平衡12h。

(3)DEAE-52柱色谱分离

称取0.5100g暗褐脉柄牛肝菌粗多糖，加水溶解，超速离心，取上清液，上样。依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、0.2mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液、0.4mol/L NaCl溶液和0.5mol/L NaCl溶液洗脱，控制好洗脱速度，设定自动收集装置3分30秒一次，以8mL装一管，用苯酚-硫酸法检测。将各级洗脱液浓缩至15mL。

(4)粗多糖纯化

浓缩液装入透析袋MD34中置于恒温磁力搅拌器中，透析24h。透析后浓缩液转移置培养皿中，-45℃下冷冻干燥24h，即得暗褐脉柄牛肝菌精制多糖，经苯酚-硫酸法检测，粗多糖纯度为84.0％。

实施例4

按照实施例3的方式对暗褐脉柄牛肝菌精制多糖进行提取，其中，步骤(3)中的洗脱曲线如图1所示，通过DEAE-52纤维素柱色谱后，得到三个明显的洗脱峰，含量各有不同。其中，蒸馏水洗脱峰与NaCl(0.1moL/L)的洗脱峰面积比较大，含量相对较多，将相应部分的洗脱液收集一起，经透析袋处理，冷冻干燥后称得蒸馏水组分多糖0.1071g。

对本实施例提取的暗褐脉柄牛肝菌精制多糖进行下述分析和鉴定：

多糖的含量测定

(1)葡萄糖标准曲线制备

称取0.1g的葡萄糖(干燥至恒重)，加入到烧杯(50mL)，然后加适量的蒸馏水，进行搅拌溶解以后，定容在容量瓶(100mL)中。用吸量管吸取10mL，定容在容量瓶(100mL)中。吸取0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0mL的标准溶液，放入比色管(10mL的)，加水使其成为2mL，再加苯酚1.0mL，摇晃均匀后，各滴加5mL的浓硫酸，再次摇晃均匀，迅速放入水浴锅内煮沸15min。空白组以2mL的水加苯酚1mL，浓硫酸5mL。15min后，应迅速放入冰水中进行冷却，在490nm紫外下检测吸光度值，标准曲线如图2所示；

从图2中可以得到标准曲线方程。

回归方程：Y＝1.8669x+0.0038R²＝0.9991；

(2)多糖的含量测定

取醇沉干燥物0.1g，用葡萄糖标准曲线制备方法，配制溶液，取0.7mL用苯酚-硫酸法测定。取蒸馏水组分干燥物(精密称定)0.01g，放在容量瓶(10mL)中，加水进行溶解，定容，用吸量管取1mL，定容在容量瓶(10mL)中，取0.7mL，用苯酚-硫酸法测定。醇沉干燥物吸光度0.073，代入方程x为0.037，X含量为47.6％；蒸馏水组分吸光度0.126，代入方程x为0.065，X含量为84.0％。

(3)紫外光谱分析法

将暗褐脉柄牛肝菌多糖配成1mg/mL的水溶液，在200～400nm范围内扫描，扫描图如图3所示；暗褐脉柄牛肝菌多糖的紫色扫描曲线比较平滑，在260、280nm处无明显吸收峰，可以认为，暗褐脉柄牛肝菌多糖基本不含有杂蛋白、多肽和核酸。

(4)多糖的红外光谱分析

称取暗褐脉柄牛肝菌精多糖2mg与KBr混合，压片，在4000～400cm^-1的测定红外吸收光谱，结果如图4所示，图中出现宽而强的吸收峰，在3377cm^-1处，为羟基的O-H的伸缩振动；2928cm^-1处有C-H键的伸缩振动为烷基吸收峰；1641cm^-1处出现羰基C＝O的较强吸收峰的伸缩振动；1411cm^-1处为C-H键的弯曲振动，吸收峰较弱；在1152cm^-1、1079cm^-1和1025cm^-1三处吸收峰为多糖骨架C-O-H和C-O-C键的伸缩振动，是吡喃糖环的特征吸收峰。在762cm^-1处为α-糖苷键，吸收峰微弱；在576cm^-1处是硫酸酯键的吸收峰，吸收峰微弱，多糖含有硫酸基团。红外光谱数据分析暗褐脉柄牛肝菌多糖为吡喃糖，糖苷键类型为α构型。

(5)多糖的核磁共振法分析

称取暗褐脉柄牛肝菌粗多糖16mg溶于0.7mL重水(D₂O)中，混匀后加入核磁管中，密封。在核磁共振波谱仪上进行¹H-NMR和¹³C-NMR检测。

核磁共振法可以用来鉴定暗褐脉柄牛肝菌多糖的糖苷键构型。核磁共振氢谱如图5所示，在δ4.7～5.5ppm之间有异头质子的化学位移，表明多糖含α型吡喃糖。δ3.2～4.2ppm是糖连接氧碳上氢信号。δ1.17ppm处信号峰是C-6位脱氧糖的甲基质子。核磁共振碳谱如图6所示，在δ99.66ppm处有信号说明其主链糖苷键为α-D型，在小于δ80ppm处有信号峰为吡喃糖的C3和C5的化学位移。在δ60.48ppm处有较强的信号峰，说明存在未发生取代的C-6。

(6)多糖的分子量

称取10mg暗褐脉柄牛肝菌粗多糖并溶解于3mL蒸馏水中。超声振动5min后，用0.45μm的滤膜进行过滤。采用HPGPC测定多糖的分子量。

结果如表3所示；

表3 多糖的分子量测定结果

由表3可知，暗褐脉柄牛肝菌多糖的HPGPC洗脱曲线出现了两个峰，其中一个重均相对分子量为2963Da，小于3500Da，可能透析不完全，还存在杂质。峰1的洗脱面积最大，为多糖，其重均相对分子量Mw为926522Da，分散度为11.53。

多糖的单糖组分分析

采用液质联用测定暗褐脉柄牛肝菌粗多糖中的单糖组成。

多糖水解：将多糖样品用天平称取10mg(并精确到0.1mg)，然后放入钳口瓶(20mL)中，量取2mol/LTFA5mL并加入，用N₂密封管(10L/min，1min)，在100℃中水解2h；冷却以后，将密封管的盖打开，取出1mL并加入1mL甲醇，在70℃水浴下用N₂吹干，重复加入甲醇，用N₂吹干2次，除去TFA；加入1mL 0.3mol/LNaOH溶解残渣，得到多糖水解液，进行一定的稀释后衍生测定。

游离单糖的提取：称取约0.4g的干样、1.5g的湿样，精密称定以后，放具塞刻度管中，并加入80％的乙醇10mL，在70℃水浴中，超声提取30min；10000rpm离心，取滤液用80％乙醇定容至10mL以后，取2mL加入试管用氮气吹干，之后加入1mL 0.3mol/LNaOH去溶解残渣。

分别取混合单糖标准液或多糖水解液400μL加入具塞试管(5mL)中，并加入400μLPMP甲醇溶液，漩涡混匀；在70℃水浴中，混合2h；然后取出冷却至室温；加HCl 400μL0.3mol/L中和至pH 6～7；加1200μL的水后加体积相等的氯仿，涡旋混匀，静置，弃去氯仿相，反复萃取2次。再用0.45μm微孔膜(水系统)过滤水相，然后进样到高效液相色谱中进行分析。

色谱条件，质谱扫描条件，梯度洗脱程序分别如表4、表5、表6所示；结果如表7、图7和图8所示，由图7和图8可知，与14种单糖混合对照品进行比对，可以检测到12种单糖，其中含量较高的4种分别为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖，其摩尔质量比为2.07：1.95：1：1.58。

表4 色谱条件

表5 质谱扫描条件

表6 梯度洗脱程序

T/min	A％	B％
			0	86	14
1	86	14
			7	81.5	18.5
11	80	20
			13	40	60
14.5	40	60
			14.6	86	14
17	86	14

结论：暗褐脉柄牛肝菌多糖通过DEAE-52纤维素层析柱进行分离和纯化得到的多糖不是均一多糖，不含蛋白质、多肽和核酸。其重均相对分子量Mw为926522Da。经过红外光谱数据分析暗褐网柄牛肝菌多糖为吡喃糖，其糖苷键类型为α构型。暗褐脉柄牛肝菌多糖完全水解液里含有12种单糖，含量较高的有4种：D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖，其摩尔质量比为2.07：1.95：1：1.58。本研究为进一步得到单一均多糖提供了科学实验依据，通过对暗褐脉柄牛肝菌多糖进行了分离纯化和结构表征，对其分子结构、生物学活性及其作用机制还需要继续研究。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)制备发酵液：将暗褐脉柄牛肝菌菌丝接种于液体发酵培养基中，进行发酵，得发酵液；

2)浓缩：对步骤1)所得发酵液进行浓缩，得浓缩液；

3)离心、醇沉、干燥：对步骤2)所得浓缩液进行离心，取上清液，并向上清液中加入95％的乙醇，静置24h，离心，收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖；

4)洗脱、浓缩：制备粗多糖溶液，以DEAE-52纤维素柱对粗多糖溶液进行洗脱，并对洗脱液浓缩，得粗多糖浓缩液；

5)纯化、干燥：将步骤4)所得粗多糖浓缩液装入透析袋中进行透析，并对透析液冷冻干燥，得暗褐脉柄牛肝菌多糖。

2.根据权利要求1所述的一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述发酵为在25～32℃、100～200r/min下恒温培养10～15d。

3.根据权利要求1所述的一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤3)中，上清液和乙醇的体积比为1:(3～5)。

4.根据权利要求1所述的一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述洗脱为依次以蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、0.2mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液、0.4mol/L NaCl溶液和0.5mol/L NaCl溶液洗脱。

5.根据权利要求1所述的一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)和步骤4)中，所述浓缩为在0.08～0.09MPa、40～60℃下浓缩10～20min。

6.根据权利要求1所述的一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述透析为在MD34透析袋中透析20～24h。

7.根据权利要求1所述的一种暗褐脉柄牛肝菌多糖的制备方法，其特征在于，步骤3)和步骤5)中，所述冷冻干燥为在-40～-50℃干燥20～24h。

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