CN117024613A - 一种天府花生18叶片多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天府花生18叶片多糖(AHL‑P)及其制备方法及应用。AHL‑P由(1→4)‑葡萄糖、(1→4)‑木糖、(1→4,6)‑葡萄糖、→1)‑葡萄糖、(1→4)‑半乳糖、和(1→4)‑阿拉伯糖组成，其中葡萄糖:木糖:半乳糖:阿拉伯糖摩尔比例为7:2:1:1，(1→4)‑葡萄糖、(1→4,6)‑葡萄糖、→1)‑葡萄糖的摩尔比例为3:2:2。该多糖的制备过程包括热水浸提、醇沉、除蛋白、纯化等步骤，操作简单，方便。本发明揭示了AHL‑P的结构，同时研究了该多糖的免疫调节活性，为进一步研究、开发天府花生18叶片多糖产品提供了新的思路和技术基础。
Description
技术领域
本发明属于植物多糖应用技术领域，具体涉及一种天府花生18叶片多糖及其制备方法和应用。
背景技术
花生(Arachis hypogaea)又名落花生、长生果，是豆科植物落花生的成熟种子，具有补虚、益寿、抗衰老、美容之功效，因而被誉为“长生果”。花生是全球重要的油料作物之一，种植面积仅次于油菜，居油料作物第二位。中国是花生种植的主要产地，年产量为1500万吨左右，位居世界第一。
花生多糖是花生中除蛋白质以外的第二大营养成分，多糖含有的生物信息量比蛋白质和核酸复杂。近几年专家学者对于花生多糖的研究呈现上升趋势。跟其它植物多糖一样，花生多糖也具有一级结构和高级结构。由于单糖的种类比构成蛋白质的氨基酸种类多，连接的位点也多，故具有多分支结构的杂多糖的结构确定比蛋白质困难得多，因此深入研究花生多糖的一级结构与高级结构对于花生多糖的开发应用具有重要作用。许多学者研究了从花生中提取花生多糖的方法，包括热水提取、酸碱液提取、酶法提取、辅助技术提取等，这些方法各有优缺点，多糖提取率在5.6％～13.78％。Song等(SongY，Du B J，ZhouY，etal.Optimization of extraction process by response surface methodology andpreliminary structural analysis of polysaccharides from defatted peanut(Arachis hypogaea)cakes[J].Carbohydrate research，2011(346)：305-310)采用乙醇法提取花生中的多糖，经分离纯化后得到多糖组分DPCP-1，采用FT-IR技术分析该多糖的结构，通过图谱发现该多糖在1023、1079、1154cm-1附近存在强吸收峰，表明存在吡喃糖环；1415和1239cm-1附近的吸收峰表明存在C-O和O-H结构；1730cm-1附近的吸收峰表明不存在糖醛酸；在3368和2931cm-1附近存在的吸收峰表明该多糖具有多糖的典型结构。花生多糖的单糖组成较为复杂，含有鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖，结构分析表明，其单糖为α型吡喃环，有乙酰氨基修饰。
植物多糖具有多种生物活性，包括免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、抗辐射、抗菌、抗病毒等保健作用。植物多糖的活性主要是利用其相似结构，构建免疫调节机制从而产生免疫活性。目前关于花生多糖的研究中，仅有关于肝脏保护、降血糖、抗氧化方面的报道。姚秀芬等(花生粗多糖对四氯化碳及酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].食品科学，2011(32)：261-265)从花生中提取的花生粗多糖对四氯化碳(CCl4)及酒精所致的小鼠急性肝损伤的保护作用做了研究。结果显示：50、100、200mg/kg剂量的多糖均能显著抑制CCl4急性肝损伤所引起的丙二醛含量、肝脏指数、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的升高，有效抑制肝脏中超氧化物歧化酶活性的降低，能不同程度改善小鼠的肝组织损伤程度。这说明花生多糖可提高机体超氧化物歧化酶活力，及时清除体内CCl4和酒精代谢产生的自由基，避免活性氧自由基在体内的大量积累，减少脂质过氧化产物丙二醛的生成，稳定细胞膜，在抗脂质过氧化损伤方面起了积极的作用。刘辉等(酶法提取花生多糖及其抗氧化活性研究[J].油脂工程，2012(12)：54-56)以花生为原料，采用酶法提取花生多糖，并对其抗氧化活性进行研究。结果显示，花生多糖对·OH、·O2-自由基表现出较强的清除能力，其IC50分别为0.81mg/mL和0.17mg/mL，这可能是由于花生多糖的存在使得一部分自由基得到抑制，一部分自由基直接被清除，因而具有良好的抗氧化性能。杨卫等(水提花生粕多糖降血糖活性的研究[J].食品工业科技，2010(12)：330-332)研究花生多糖对四氧嘧啶致糖尿病小鼠的降血糖作用，并初步探讨降血糖活性的作用机理。研究结果表明，不同剂量的花生多糖均能使小鼠的血糖水平降低，且200mg/kg的浓度能显著降低糖尿病小鼠的血糖水平，不同剂量的多糖均能增加糖尿病小鼠的免疫能力和缓解体重的减轻。由此可见，花生多糖在一定程度上具有降血糖，提高免疫能力的作用。
目前，对天府花生18叶片多糖的精细结构及其在免疫调节活性中应用的研究尚未见任何报道。
发明内容
为了填补天府花生18叶片多糖的技术研究空白和开发利用天府花生18叶片多糖，发明人首次对天府花生18叶片多糖进行了长期研究，特别针对该多糖的结构、提取工艺以及生理活性开展了大量的实验。为天府花生18叶片多糖的应用奠定了坚实的基础。
第一方面，本发明提供了一种天府花生18叶片多糖(AHL-P)。该多糖由(1→4)-葡萄糖、(1→4)-木糖、(1→4,6)-葡萄糖、→1)-葡萄糖、(1→4)-半乳糖、和(1→4)-阿拉伯糖组成，其中葡萄糖:木糖:半乳糖:阿拉伯糖摩尔比例为7:2:1:1，葡萄糖的三种残基(1→4)-葡萄糖、(1→4,6)-葡萄糖、→1)-葡萄糖的摩尔比例为3:2:2。
优选地，所述多糖的化学结构式如下：
其中，n为整数，3≤n≤10。
优选地，所述多糖的重均分子量为6000-20000Da，进一步优选为12837Da。
第二方面，本发明还提供上述天府花生18叶片多糖(AHL-P)的制备方法，具体制备过程包括以下步骤：
1、取天府花生18叶子实体粉末，用热水浸提，将所得水提物依次经过醇沉、烘干、除去蛋白质，得到粗多糖。
2、将步骤1制得的粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液。
3、将收集的洗脱液用透析袋透析浓缩，然后将透析袋内的液体冷冻干燥，得到所述的多糖。
优选地，在步骤1中，热水浸提的温度为80-100℃(如80℃、83℃、85℃、88℃、90℃、93℃、95℃、98℃、100℃)，进一步优选为98℃。
优选地，在步骤1中，天府花生18叶片子实体粉末与热水的料液比(W/V，mg/mL)为1:1-10(如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、17、1:8、1:9、1:10)，进一步优选为1:3。
优选地，在步骤1中，热水浸提的次数为1-5次(如1次、2次、3次、4次、5次)，进一步优选为4次。
优选地，在步骤1中，每次热水浸提时间为1-10小时(如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时)，进一步优选为8小时。
在本发明的一个具体实施方式中，在步骤1中进行醇沉操作时，乙醇与水提物浓缩液的体积比为1-10:1(如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1)，优选为4:1。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤1中除蛋白的方法选自Sevag法、三氟三氯乙烷法或三氯醋酸法中的一种，进一步优选为Sevag法。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤2中的离子交换柱层析的填料为DEAE-纤维素，如DEAE-52或DEAE-32，优选为DEAE-52。
优选地，在步骤2中采用梯度洗脱方式。洗脱剂为NaCl溶液，其浓度为0.05-0.3mol/L，如0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L。
在本发明的一个具体实施方式中，步骤3中透析袋的截留分子量为5000-10000Da(如5000Da、6000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10000Da)，优选为7000Da。
优选地，在步骤3中，透析时间为2-4天(如2天、2.5天、3天、3.5天、4天)，进一步优选为2天。
第三方面，本发明还提供上述天府花生18叶片多糖(AHL-P)的应用。例如将该多糖开发为增强机体免疫力的产品、细胞培养的活性成分、细胞培养试剂等。
优选地，所述产品为药品、保健品或食品。
优选地，AHL-P能单独使用或者与其他活性成分联合使用。
本发明的有益效果如下：
一、本发明确定了天府花生18叶片多糖(AHL-P)的分子量、单糖组成、化学结构等，为进一步研究、开发天府花生18叶片多糖产品提供了技术基础。
二、本发明对天府花生18叶片多糖(AHL-P)的免疫调节活性进行了研究，为开发增强机体免疫力的产品(如药品、食品或保健品)提供了技术基础，提高了天府花生18的应用价值。
三、本发明还提供了天府花生18叶片多糖(AHL-P)的提取方法，为其它植物多糖的提取和研究提供了新的技术思路。
附图说明
图1所示为AHL-P的HPGPC谱图；
图2所示为AHL-P的红外谱图；
图3所示为AHL-P的1H NMR谱图；
图4所示为AHL-P的13C NMR谱图；
图5所示为AHL-P的1H-1H-COSY谱图；
图6所示为AHL-P的HMQC谱图；
图7所示为AHL-P的HMBC谱图；
图8所示为AHL-P的化学结构；
图9所示为AHL-P对B细胞增殖的影响的实验结果；
图10所示为AHL-P对RAW264.7细胞增殖的影响的实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。
需要说明的是除非另有定义，本发明中所使用的科学和技术术语为本技术领域常规的含义。
在本发明中，“天府花生18(Pleurotus cornucopiae)”是指担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属真菌，其包含子实体和菌丝体。
实施例1天府花生18叶片多糖AHL-P的分离提取
1、天府花生18叶片多糖AHL-P的分离提取
1.1、天府花生18叶片粗多糖的提取
称取干燥的天府花生18叶片子实体600g，粉碎成子实体粉末。然后按照1:3的料液比例，将天府花生18叶片子实体与蒸馏水加入烧杯中，在98℃水浴6h，将浸提混合液在5000r/min下离心10min，收集上清液后再次离心浓缩，重复3次，最终将全部的上清液浓缩至200mL。再将浓缩液和800mL无水乙醇混合，静置、沉淀，将沉淀收集后于40-50℃下烘干。然后采用Sevag法除去干燥样品中的蛋白质，从而获得天府花生18叶片粗多糖。
1.2、DEAE-纤维素柱层析法分离纯化天府花生18叶片粗多糖
精确称取50g DEAE纤维素，并将其溶解在1L的超纯水中，充分搅拌，待无肉眼可见的纤维素颗粒时，停止搅拌。静置24h，将上清液弃去后加入0.5mol/LNaOH浸泡纤维素6h，用超纯水洗涤至中性，弃去上清液后加入0.5mol/L HCl浸泡6h，蒸馏水洗涤至中性，弃去上清后加入0.5mol/LNaOH浸泡6h，用蒸馏水洗涤至中性，静置待用。
将活化的DEAE-52纤维素装柱，然后以蒸馏水压柱平衡24h。然后将步骤1.1制备的天府花生18叶片粗多糖加入200mL纯水中，混合均匀。将混合液在12000r/min下离心10min，取5mL上清液加入DEAE-52纤维素柱中，以不同浓度的NaCl溶液(0.05mol/L，0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L)为流动相进行洗脱，采用硫酸-苯酚法对多糖测定。收集洗脱液，将洗脱液浓缩至5mL。
将洗脱浓缩液用透析袋(Mw≥7kDa)透析，持续48h，然后在12000r/min下离心10min，离心后收集沉淀，将沉淀冷冻干燥，得到天府花生18叶片多糖，命名为AHL-P。
2、天府花生18叶片多糖AHL-P的结构鉴定
运用酸水解、甲基化分析、高效凝胶渗透色谱法、气相色谱和质谱联用技术、红外谱技术、核磁共振技术，对天府花生18叶片多糖(AHL-P)进行结构解析。
2.1、分子量的测定
精确称取10mg天府花生18叶片多糖AHL-P样品，加1mL ddH2O溶解，超声5min，进行HPGPC分析。HPDPC谱图(见图1)显示，18叶片多糖AHL-P的重均分子量为12837Da。
2.2、天府花生18叶片多糖AHL-P的傅里叶变换红外光谱分析
精确称取2mg天府花生18叶片多糖AHL-P样品，与KBr进行混匀、研磨、压片，然后采用傅里叶变换红外光谱仪在4000cm-1-400cm-1范围内扫描。FTIR谱图(见图2)显示，波数在3431.036cm-1、2930.688cm-1、1636.342cm-1、1401.732cm-1、1153.556cm-1、1084.932cm-1和1026.867cm-1等处具有典型的多糖吸收峰。天府花生18叶片多糖AHL-P傅里叶红外光谱图表明：3431.036cm-1处是O-H伸缩振动峰；2930.688cm-1处是-CH2伸缩振动峰；1636.342cm-1处是C＝O伸缩振动峰；1401.732cm-1处是C-H面内弯曲振动峰；1153.556cm-1处、1084.932cm-1处和1026.867cm-1处是C-O伸缩振动峰；671.568cm-1处是＝C-H面内弯曲振动峰。傅里叶红外光谱图结果说明AHL-P具有典型的多糖结构特征。
2.3、天府花生18叶片多糖AHL-P的核磁共振分析
精确称取50mg 18叶片多糖AHL-P样品，溶于0.6mL重水(D2O)中，装入核磁管中，在核磁共振仪上检测，结果见图3、图4、图5、图6和图7。
AHL-P的1H NMR谱图结果(见图3)表明，AHL-P有六个异头氢信号，化学位移分别是δ5.29、δ5.23、δ5.10、δ4.96、δ4.84、δ4.53，积分比为3:2:2:2:1:1。δ3.0-4.2ppm之间的信号归属为糖残基中C2-C6的氢信号。
AHL-P的13C NMR谱图结果(见图4)表明，AHL-P一共有6个异头碳信号，化学位移分别是δ107.49、δ99.74、δ99.52、δ98.57、δ95.75和δ91.87。δ60-80ppm之间的信号归属为糖残基中C2-C6的碳信号。
AHL-P的1H-1H-COSY谱图结果(见图5)表明了相邻氢核间的耦合关系。信号A(δ5.29/δ3.46)、B(δ5.23/δ3.47)、C(δ5.10/δ3.42)、D(δ4.96/δ4.01)、E(δ4.84/δ3.46)和F(δ4.53/δ3.15)分别归属于(1→4)-葡萄糖、(1→4,6)-葡萄糖、→1)-葡萄糖、(1→4)-木糖、(1→4)-半乳糖和(1→4)-阿拉伯糖的H1与H2的耦合信号。
所有氢的化学位移结果见表1。
表1AHL-P的H原子的化学位移
AHL-P的HMQC谱图结果(见图6)标明了近程相关的1H和13C间的耦合关系。信号A(H1/C1δ5.29/δ99.52)、B(H1/C1δ5.23/δ99.74)、C(H1/C1δ5.10/δ91.87)、D(H1/C1δ4.96/δ107.49)、E(H1/C1δ4.84/δ98.57)和F(H1/C1δ4.53/δ95.75)分别归属于(1→4)-葡萄糖、(1→4,6)-葡萄糖、→1)-葡萄糖、(1→4)-木糖、(1→4)-半乳糖和(1→4)-阿拉伯糖残基上H1与C1的共振耦合信号。
AHL-P的HMBC谱图结果(见图7)标明了远程相关的1H和13C间的耦合关系。信号δ5.29/δ73.07、δ5.10/δ69.84、δ4.96/δ76.76和δ4.84/δ72.76分别归属于(1→4)-葡萄糖、→1)-葡萄糖、(1→4)-木糖和(1→4)-半乳糖的H1和C3的之间的共振耦合信号，信号δ3.61/δ72.61归属于(1→4,6)-葡萄糖的H5和C3之间的共振耦合信号，信号δ3.29/δ73.07归属基团(1→4)-阿拉伯糖的H4和C2之间的共振耦合信号。
所有碳的化学位移结果见表2。
表2AHL-P的C原子的化学位移
2.4、天府花生18叶片多糖AHL-P的甲基化与硅烷化衍生后GC-MS分析
精确称取20mgAHL-P样品，加入烧杯后密封，然后向密封的烧杯中加入2mL DMSO(二甲基亚砜)，轻轻振荡烧杯，使AHL-P充分溶解。然后加入200mg的NaOH，直至NaOH刚好不溶解为止。将烧杯放置在摇床中，室温下振荡1h后，加入1.5mL碘甲烷，避光反应1h，加水终止反应。用氯仿萃取产物，干燥后得甲基化多糖。
将甲基化多糖经三氟乙酸(TFA)进行水解，水解完全后，加水洗三次，得到甲基化完全酸水解产物。然后将水解产物与2mL六甲基二硅烷胺，1mL三甲基氯硅烷以及2mL的无水吡啶充分反应，并在50℃条件下水浴20min，采用低温高速离心机在12000rpm/min，4℃条件下离心10min，弃去沉淀。将上清液用0.22μm过滤器过滤，取上层溶液用于GC-MS分析，结果见表3。
表3：AHL-P甲基化结果分析
表3结果表明AHL-P具有吡喃糖环，由葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Arab)组成，其一级结构是以(1→4,6)-D-葡萄糖和(1→4)-葡萄糖为骨架，(1→4)-木糖、(1→4)-阿拉伯糖和(1→4)-半乳糖作为支链，→1)-葡萄糖为末端糖的重复结构单位的多糖。
根据实验2.1-2.4的结果得到AHL-P的化学结构(见图7和图8)。
实施例2：天府花生18叶片多糖AHL-P的免疫调节活性研究
1.1、AHL-P对B细胞增殖的影响
将培养B细胞在体外培养至对数生长期，然后用细胞计数板计数，再将B细胞培养液用新的培养液稀释至1×105个/mL。将细胞悬液加入96孔板，每孔100μL，将96孔板放入CO2培养箱中培养24h。24h后，实验组分别加入不同质量浓度的AHL-P溶液(最终质量浓度为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)，阳性对照加入100μL LPS溶液(最终质量浓度5μg/mL)，空白组加入100μL细胞培养液。在CO2培养箱中培养24h后，分别向每孔加入5μl的CCK-8溶液，放入CO2培养箱中孵育3h，然后使用酶标仪检测波长450nm处的吸光度值，记录并分析测定结果(见图9)。
由如图9可以看出，与空白组(CK)相比，LPS组能极显著(P<0.01)地促进B细胞增殖，增殖率为124.46％。在不同质量浓度的AHL-P时，各实验组均能极显著(P<0.01)地促进B细胞的增殖，当AHL-P质量浓度为10μg/mL时，AHL-P对B细胞的增殖效果最为明显，最大增殖率达到104.39％。说明AHL-P能有效促进B细胞的增殖。
1.2、AHL-P对RAW264.7细胞增殖的影响
具体实验过程同1.1，唯一不同的是将1.1中的B细胞换成RAW264.7细胞，实验结果见图10。
由图10可以看出，与空白组(CK)相比，LPS组能显著(P<0.05)促进RAW264.7细胞增殖，增殖率为55.55％。在不同质量浓度的AHL-P时，各实验组均能极显著(P<0.01)促进RAW264.7细胞的增殖，当AHL-P质量浓度为10μg/mL时，AHL-P对RAW264.7细胞的增殖效果最为明显，最大增殖率达到32.25％。说明AHL-P能有效促进RAW264.7细胞的增殖。
实验1.1和1.2的结果说明，天府花生18叶片多糖AHL-P能有效增强机体免疫能力。为了进一步提高天府花生18叶片多糖AHL-P的价值，可以将AHL-P用于食品或保健品的开发。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种多糖，其特征在于：所述多糖由(1→4)-葡萄糖、(1→4)-木糖、(1→4,6)-葡萄糖、→1)-葡萄糖、(1→4)-半乳糖、和(1→4)-阿拉伯糖组成，其中葡萄糖:木糖:半乳糖:阿拉伯糖摩尔比例为7:2:1:1，(1→4)-葡萄糖、(1→4,6)-葡萄糖、→1)-葡萄糖的摩尔比例为3:2:2。
2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：所述多糖的结构式为：
其中，n为整数，3≤n≤10。
3.根据权利要求2所述的多糖，其特征在于：所述多糖的重均分子量为8000-20000Da。
4.根据权利要求3所述的多糖，其特征在于：所述多糖的重均分子量为12837Da。
5.权利要求1至4中任一项所述多糖的制备方法，其特征在于：所述多糖的制备过程包括以下步骤：
取天府花生18叶子实体粉末，用热水浸提，将所得水提物依次经过醇沉、烘干、除去蛋白质，得到粗多糖；
将所述粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；
将所述洗脱液用透析袋透析浓缩，然后将透析袋内的液体冷冻干燥，得到所述的多糖。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述热水的温度为80-100℃，所述天府花生叶子实体粉末与所述热水的料液比为1:1-10，所述热水浸提次数为1-5次，每次浸提时间为1-10小时；
所述醇沉中乙醇与水提物浓缩液的体积比为1-10:1。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述离子交换柱层析的填料为DEAE-纤维素。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述DEAE-纤维素为DEAE-52或DEAE-32。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述洗脱为梯度洗脱，洗脱剂为NaCl溶液，NaCl浓度为0.05-0.3mol/L。
10.权利要求1-4中任一项所述的多糖在制备增强机体免疫力的药品、保健品或食品中的应用。
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