CN114874346B - 一种紫丁香蘑多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种紫丁香蘑多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于真菌多糖领域，公开了一种紫丁香蘑多糖及其制备方法和应用。该紫丁香蘑多糖为由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖。其单糖组成岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖的摩尔比为1.00：1.78：1.45：3.72。该多糖具有制备增强免疫、抗氧化、抗黑色素瘤等功能性食品和药物的应用潜质，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提高紫丁香蘑的利用价值。

Description

一种紫丁香蘑多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于真菌多糖领域，特别涉及一种紫丁香蘑多糖及其制备方法和应用。
背景技术
紫丁香蘑又名紫晶蘑、裸口蘑。
食用菌是一类大型真菌的总称。一般食用菌的子实体为食用的主要部分，富含蛋白质、氨基酸、维生素以及多糖等营养物质。
食用菌多糖是一种天然大分子化合物，具有抗氧化、抗癌、降血糖、抗炎、降血脂和抑菌等生物功效。此外，食用菌多糖还具有无毒无害、无残留的特点，使其在功能性食品和生物医药等领域收到广泛关注。
如今，关于多糖的研究越来越多地集中在纯化多糖的结构与生物活性关系上。研究表明，多糖的生物活性表达与其结构特点密切相关，如单糖组成和比例、分子量、糖苷键的类型等。
紫丁香蘑(Lepistanuda)又名紫晶蘑、裸口蘑，隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomyeetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Trieholomataeeae)香蘑属(Lepista)。紫丁香蘑菌肉厚，香气浓，味鲜美，是一种优良食用菌，分布于我国黑龙江、云南、福建、青海、新疆、西藏、山西等地区。
Lee Y等在Study on the Anti-tumor Effects of Extracts from Lepistanuda Mushroom.(Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition2005；34:317-322.)和Omenz A等在In vitro anticancer and apoptotic activity ofedible mushroom Lepista nuda(Bull.)Cooke on leukemia and breast cancercompared with protocatechuic acid,paclitaxel and doxorubicin.(Indian J ExpBiol 2021；59:147-152.)报道了紫丁香蘑的水提物和甲醇提取物在体外对多种肿瘤系的细胞的抑制作用，证明了紫丁香蘑具有抗肿瘤特性。
李男男等在《紫丁香蘑粗多糖的体外抗氧化活性研究》(安徽农业科学.2017,45(14))报道了两种紫丁香蘑粗多糖的抗氧化能力比较。Shu等在Extraction,purificationand properties of water-soluble polysaccharides from mushroom Lepista nuda.(Int J Biol Macromol 2019；128:858-869.)中提取了两种纯化紫丁香蘑多糖，分析了这两种纯化紫丁香蘑多糖的基本组成，从对铁离子的螯合能力、对DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼基)自由基的清除能力和对超氧阴离子自由基的清除能力三个方面探究了紫丁香蘑多糖的抗氧化能力。
可见，现有研究缺少对紫丁香蘑多糖的精细结构的研究，且未从细胞实验层面评价紫丁香蘑多糖的生物活性。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种紫丁香蘑多糖。
本发明另一目的在于提供上述紫丁香蘑多糖的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述紫丁香蘑多糖的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种紫丁香蘑多糖(LNP-Ⅱ)，其为由岩藻糖(Fucp)、甘露糖(Manp)、葡萄糖(Glcp)、半乳糖(Galp)组成的杂多糖。其单糖组成岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖的摩尔比为1.00：1.78：1.45：3.72。
进一步地，上述多糖的重均分子量为8000-20000Da；在本发明的一个实施例中，上述多糖的重均分子量为17687Da。
再进一步地，上述多糖包含如下结构式:
Figure BDA0003657009430000031
上述多糖结构式中，R1/R2/R3代表此位置可分别与R1、R2、R3三种基团相连。
上述多糖结构式中，MeO指的是氧甲基。
一种上述的紫丁香蘑多糖的制备方法，包括对紫丁香蘑子实体进行提取的步骤。
进一步地，上述制备方法包括通过超声辅助热水浸提法提取得到粗多糖的步骤。
进一步地，上述制备方法包括对粗多糖进行纯化的步骤，如脱色、脱蛋白、离子交换柱层析等。
在本发明的一个实施方式中，上述制备方法包括如下步骤：
(1)取紫丁香蘑子实体粉末，用超声波辅助热水浸提法进行提取，将所得水提物经浓缩、脱色、脱蛋白、醇沉得到粗多糖；
(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，然后洗脱，收集洗脱液；
(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋透析浓缩；
(4)将步骤(3)完成后的浓缩液冷冻干燥得到纯化的紫丁香蘑多糖。
进一步地，步骤(1)中，超声波辅助热水浸提法是指先热水浸提后再超声波辅助，其中超声参数可以为40-80KHZ超声10-30min(如10、15、20、25、30min)；在本发明的一个实施例中，超声时间为25min。
进一步地，步骤(1)中，热水浸提法温度可以为80-100℃，热水浸提时间为5-8h；在本发明的一个实施例中，热水浸提温度为85℃。
进一步地，步骤(1)中，紫丁香蘑子实体粉末与水的料液比(W/V，g/mL)为1:10-1:50(如1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)；在本发明的一个实施例中，该料液比为1:30。
进一步地，步骤(1)中，浸提次数为1次或多次(如2、3、4、5次)；在本发明的一个实施例中，该浸提次数为2次。
进一步的，步骤(1)中，脱色步骤中，所用到的是大孔树脂D354FD，泡发后与浓缩液体积比1:1混匀，55℃下搅拌脱色。
进一步的，步骤(1)中，脱蛋白步骤中，是采用Sevag法脱蛋白。
进一步的，步骤(1)中，醇沉步骤中，醇与水提物的浓缩液的体积比为1-10:1(如1:1、3:1、4:1、5:1、10:1)；在本发明的一个实例中，该体积比为4:1。
在本发明的一个实施例中，上述醇沉步骤中，醇为95乙醇。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)包括：取紫丁香蘑子实体粉末，超声辅助热水浸提法，收集上清液，浓缩；采用大孔树脂D354FD脱色，去除树脂回收浓缩液，用Sevag法脱蛋白，收集上清液；醇沉过夜，收集多糖，烘干得到粗多糖。
进一步的，步骤(2)中，离子交换柱可以为纤维素柱，该纤维素柱的填料为DEAE-52。
进一步的，步骤(2)中，洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱所用洗脱剂为浓度为0-0.5mol/L的NaCl溶液。
在本发明的一个实施办法中，步骤(2)包括：将步骤(1)所得粗多糖的水溶液通过DEAE-52纤维素离子交换柱，不同浓度洗脱液洗脱，收集洗脱液，浓缩；优选为收集由0.025mol/LNaCl洗脱剂洗脱的洗脱液进行浓缩。
进一步地，步骤(3)中，透析袋的截留分子量为6000-10000Da(如6000、7000、8000、9000、10000Da)；在本发明的一个实施例中，该截留分子量为8000Da。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)包括：将步骤(2)所得洗脱液置于透析袋中，用蒸馏水进行透析，每隔2h更换蒸馏水，直至盐度计检测结果与蒸馏水一致。
本发明还包括一种上述方法制备得到的粗多糖(LNPs)和一种洗脱液为纯水的纯化多糖(LNP-Ⅰ)。
上述的紫丁香蘑多糖(LNP-Ⅱ)在制备增强免疫、抗氧化、抗黑色素瘤等功能性食品以及药物中的应用。
上述应用中，上述多糖可单独使用，也可与其它活性成分联合使用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明的发明人自紫丁香蘑分离得到纯化多糖LNP-Ⅱ，并对其分子量、单糖组成、化学结构进行了分析鉴定，确定了其重均分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著的抗氧化能力；对人黑色素瘤细胞A375有显著的抑制作用；可以通过调控免疫相关因子表达，增加细胞因子积累量，从而增强免疫活性；可以通过抑制炎症相关基因表达，抑制细胞因子分泌，具有抗炎活性。基于此，该多糖具有制备增强免疫、抗氧化、抗黑色素瘤等功能性食品的应用潜质，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提高紫丁香蘑的利用价值。
附图说明
图1为LNP-Ⅱ的HPGPC谱图；
图2为LNP-Ⅱ的IR谱图；
图3为标准品的气相色谱图；
图4为LNP-Ⅱ的气相色谱图；
图5为LNP-Ⅱ的1H核磁谱图；
图6为LNP-Ⅱ的13C核磁谱图；
图7为LNP-Ⅱ的HSQC谱图；
图8为LNP-Ⅱ的HMBC谱图；
图9为LNP-Ⅱ的结构图；
图10为紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ在62.5-1000μg/mL范围内对A375细胞的生长抑制率；
图11为紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ在62.5-1000μg/mL范围内对RAW264.7细胞的毒性作用图；
图12为紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ对RAW264.7细胞吞噬中性红能力的影响图；
图13为紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ对巨噬细胞RAW264.7分泌IL-6的影响
图14为紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ对巨噬细胞RAW264.7 IL-6基因表达量的影响。
图15为槲皮素标准品和紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ细胞抗氧化实验的动力学曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
在本发明中，“紫丁香蘑(Lepista nuda)”是指担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、香蘑属真菌，其包含子实体和菌丝体。
实施例1
紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的分离提取
1、超声波辅助热水浸提法提取紫丁香蘑粗多糖
称取干燥的紫丁香蘑子实体100g粉碎，于烧杯中以料液比1:30(W/V，g/mL)的比例混合紫丁香蘑子实体粉末和蒸馏水，在85℃下水浴6h，再使用超声仪在40kHZ参数下超声15min，收集上清液浓缩，重复2次，最终将全部的上清液浓缩至200mL。将泡发的大孔树脂D354FD与浓缩液体积比1:1混合，55℃下水浴搅拌2小时脱色。脱色完毕后去除大孔树脂，采用Sevag法脱蛋白，脱蛋白完毕后收集上清液，浓缩至200mL，加入四倍体积的95乙醇，醇沉过夜，收集多糖样品并干燥，得到紫丁香蘑粗多糖。
2、DEAE-52纤维素柱层析法分离纯化紫丁香蘑粗多糖
将DEAE-52纤维素填料浸泡于蒸馏水中12h后，使用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2小时，用蒸馏水洗至中性后，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡2h，继续用蒸馏水洗至中性，精致待用。
将活化后的纤维素填料置于旋转蒸发仪中，不加热使用减压蒸馏除气处理30-60min。将除气后的填料装柱，调整横流泵，静置以压实填料后即可进行粗多糖的分离纯化。将粗多糖复溶至10mg/mL的溶液，缓缓平铺至DEAE-52填料上层，加入不同浓度的NaCl溶液(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5mol/L)进行梯度洗脱。多糖用苯酚-硫酸法测定。将由浓度为0.025mol/LNaCl洗脱液洗脱洗脱液浓缩至20mL，用8000Da的透析袋进行透析，每隔2h更换蒸馏水，直至盐度计检测结果与蒸馏水一致。透析结束后，冷冻干燥，得到由浓度为0.025mol/LNaCl洗脱液洗脱的紫丁香蘑多糖组分，命名为LNP-Ⅱ。
实施例2：紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的结构鉴定
运用气相法测单糖组成、甲基化分析、高效凝胶渗透色谱法、气相色谱和质谱联用技术、红外光谱技术、1D/2D核磁共振技术，对紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ进行结构解析。
1、分子量的测定
将2mg紫丁香蘑纯化多糖LNP-Ⅱ样品用1mL的20mmol/L磷酸二氢钾溶液溶解，过0.45μm水相膜，进行HPGPC分析。
2、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的红外光谱分析
将2mg LNP-Ⅱ与光谱级KBr混合压片，在4000-500cm-1范围进行红外扫描。
3、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的单糖组成分析
将LNP-Ⅱ用2mol/L三氟乙酸溶液(TFA)水解为单糖后，经过衍生化，过0.22μm有机膜进行气相分析。设置鼠李糖，岩藻糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖作为标准品。分别准确称取10mg的7种标准品，混合后经过衍生化制成混标，过0.22μm有机膜进行气相分析。
4、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的甲基化分析
称取20mg LNP-Ⅱ样品，加入10mL DMSO(二甲基亚砜)，加入200mg干燥的NaOH粉末，50℃摇床下溶解6h，使其达到饱和状态。在冰水浴状态下缓慢加入5mL碘甲烷，避光反应至溶液变成淡黄色后，加5mL的超纯水终止反应。重复操作3次直至样品完全甲基化，用氯仿萃取甲基化产物，干燥后得到甲基化多糖。甲基化多糖经2mol/L TFA水解，水解完毕后，去除TFA，用蒸馏水溶解，10％的NaOH调节pH至10-12，加入100mg NaBD4，还原过夜。还原后产物用50％醋酸调节pH至中性，衍生化后溶解于2mL的二氯甲烷，过0.22μm有机膜进行GC-MS分析。
5、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的核磁共振分析
称取50mg LNP-Ⅱ样品溶解于0.8mL D2O中，转入核磁管，在核磁共振仪上检测分析。
6、结果
6.1、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的分子量结果
LNP-Ⅱ的HPGPC谱图如图1所示，其显示的LNP-Ⅱ的重均分子量为17687Da。
6.2、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的红外光谱分析
如图2所示，LNP-Ⅱ在3451cm-1处的强而宽的吸收峰为多糖分子间缔合的O-H伸缩振动的特征吸收峰；2923cm-1处的吸收峰是吡喃环和CH2中的C-H伸缩振动峰；在1400-1200cm-1范围内显示的吸收峰可能与C-H的变角振动或-COO中的C＝O的对称伸缩振动有关。通过以上三种糖类物质的特征吸收峰，可以验证LNP-Ⅱ为多糖类物质。
6.3、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的单糖组成分析
图3为标准品的气相色谱图，图4为LNP-Ⅱ的气相色谱图，通过对比可以得出LNP-Ⅱ的主要单糖组成及其摩尔比值为岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖＝1.00：1.78：1.45：3.72。
6.4、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的甲基化分析
将甲基化后的GC-MS报告结合GC/MS光谱数据库(Agilent,USA)和已报道的光谱结果等，分析各峰保留时间和主要特征片段，甲基化分析结果总结于表1中。
表1 LNP-Ⅱ的甲基化分析结果
Figure BDA0003657009430000091
6.5、紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的NMR谱图分析
LNP-Ⅱ的1H和13C核磁谱图如图5和图6所示，LNP-Ⅱ有6个异头氢信号δ5.38，δ5.08，δ5.16，δ5.01，δ4.51和7个异头碳信号δ99.33，δ98.11，δ98.25，δ97.83，δ101.64，δ102.69，δ101.54。1H谱中的强信号峰δ1.24和13C谱中的强信号峰δ15.68处为岩藻糖H-6和C-6的特征信号，与单糖结果一致。
结合1D NMR谱图，在2D NMR谱图HSQC(图7)中，显示了δ3.92/99.33，δ3.92/98.25，δ5.08/78.15，δ3.71/98.11，δ5.01/68.19，δ3.71/97.83，δ3.41/101.64，δ4.51/70.12，δ3.87/97.83，结合单糖组成，甲基化分析和参考文献，它们分别归属于T-ɑ-Manp，T-ɑ-Glcp，1,3-ɑ-Galp，1,6-ɑ-Galp，1,2,4-ɑ-Manp，1,2,3,6-β-Glcp，T-ɑ-Fucp，将7种糖残基H1-H5/C1-C5的信号归属制得表2。
表2 LNP-Ⅱ的NMR化学位移
Figure BDA0003657009430000101
在图8的HMBC谱图中，交叉信号峰δ3.92/99.33，δ3.92/98.25，δ5.08/78.15，δ3.71/98.11，δ5.01/68.19，δ3.71/97.83，δ3.41/101.64，δ4.51/70.12，δ3.87/97.83，说明存在A(C1)-E(H2)，C(C1)-E(H2)，B(H1)-C(C3)，G(H1)-C(C3)，B(C1)-D(H6)，D(H1)-F(C6)，D(C1)-D(H6)，E(C1)-F(H2)，D(C6)-F(H1)，D(C1)-E(H4)的连接，此处的A-G分别对应上表表2中的糖残基编号。综上所述，可初步判断LNP-Ⅱ的结构图如图9所示。
实施例3：紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ对人黑色素瘤细胞A375的抑制作用
试剂：DMEM高糖培养基(美国Gibco公司生产)、FBS(美国Gibco公司生产)、双抗(美国Gibco公司生产)、MTT(美国Gibco公司生产)、DMSO(美国Sigma公司生产)等，均为市售产品。将DMEM高糖培养基和胎牛血清按照9:1(v/v)的比例混合，加入1％的双抗，充分混匀，得到DMEM完全培养基。
仪器：细胞培养箱、酶标仪、低速离心机等。
方法：
采用MTT法测定紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ对A375细胞(ATCC编号：CRL-1619)的生长抑制能力：通过细胞计数法，将对数生长期的细胞用DMEM完全培养基稀释，以5×104个/mL的细胞密度均匀接种于无菌96孔板中，每孔100μL。最外一圈加100μL的PBS缓冲溶液，不铺细胞，以避免边缘效应。在细胞培养箱中孵育24h后，吸弃96孔板中旧培养液并用PBS溶液清洗1次，加入100μL不同浓度的LNP-Ⅱ样品溶液(以DMEM完全培养基为溶剂)，以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为阳性对照，空白对照组为DMEM完全培养基，每组样品设置三个平行，继续培养24h。孵育完成后，弃去旧培养基，每孔加入含有MTT终浓度为0.5mg/mL的DMEM完全培养基200μL。细胞培养箱中继续孵育4h后，弃去上清液，用PBS小心清洗2次后，每孔加入150μL的DMSO溶液，将96孔板避光置于酶标板振荡器上振荡10min使得DMSO溶液充分溶解细胞中的蓝紫色甲臜晶体。使用多功能酶标仪测定490nm处的吸光值，根据如下公式计算各样品对A375细胞存活率的影响。
抑制率(％)＝(1-A样品/A空白对照)×100％
结果如图10所示，LNP-Ⅱ对人黑色素瘤细胞A375的增殖具有显著的作用，并呈现出浓度依赖性，随着多糖浓度的升高，对A375细胞增殖的抑制率越强，在1000μg/mL时抑制率最大，达到了44.89±1.89％。
实施例4：紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的免疫活性研究
通过测定LNP-Ⅱ对单核巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，RAW264.7细胞因子(NO，TNF-α和IL-6)的积累量及其mRNA表达量的影响，评价LNP-Ⅱ的免疫活性。
1、LNP-Ⅱ对巨噬细胞RAW264.7的毒性作用
培养小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7(ATCC编号：TIB-71)。当细胞生长至对数期，采用细胞计数法，用DMEM完全培养基调整细胞密度至8×104个/mL，然后每孔100μL细胞液均匀接种在96孔板上，最外圈不铺细胞，加入100μL PBS缓冲液以避免边缘效应，在5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养24h。孵育结束后，弃去原有培养基，加入100μL不同浓度的LNP-Ⅱ多糖溶液(62.5-1000μg/mL)(DMEM完全培养基作为溶剂)，空白对照为DMEM完全培养基，每组设置三个平行，继续在细胞培养箱中培养24h。采用MTT法计算细胞的相对增殖率以评价紫丁香蘑多糖对RAW264.7的毒性作用，相对增殖率在80％以上可认为毒性在可接受范围内，相对增殖率的计算根据如下公式：
相对增殖率(％)＝(A样品/A空白对照)×100％
2、LNP-Ⅱ对巨噬细胞吞噬能力的影响
采用中性红来测定紫丁香蘑多糖对巨噬细胞吞噬能力的影响。将培养至生长对数期的RAW264.7细胞采用上述方法铺板，孵育24h后，设置样品组为含不同浓度LNP-Ⅱ多糖的DMEM完全培养基(无毒性作用的浓度范围)，空白对照为DMEM完全培养基，以LPS(1μg/mL)为阳性对照，每个组分设置三个平行。继续孵育24h后，弃去培养液，加入150μL的0.1％的中性红溶液(DMEM完全培养基配制)，在细胞培养箱继续孵育1h染色后，吸弃上清液并用PBS清洗2次，每孔加入150μL的裂解液(乙酸：乙醇＝1:1,v/v)，在37℃避光环境下裂解2h，用酶标仪测定570nm处的吸光值，吞噬能力大小与其吸光值大小呈正比。
3、LNP-Ⅱ对巨噬细胞产生细胞因子NO和IL-6的影响
将培养至生长对数期的RAW264.7细胞以每孔1.5mL(细胞密度为6×105个/mL)铺在六孔板中，置于细胞培养箱中孵育24h后，移除原有培养基，设置样品组为含不同浓度紫丁香蘑多糖的DMEM完全培养基，空白对照为DMEM完全培养基，阳性对照为1μg/mL的LPS，每组设置三个平行。继续培养孵育24h后，收集上清液。
根据碧云天生产的一氧化氮NO检测试剂盒说明书，绘制NaNO2标准曲线，使用Griess试剂后检测在540nm处的吸光值，根据标准曲线计算得到细胞分泌NO的积累量。
采用华美生物的小鼠白介素IL-6的ELISA试剂盒，严格遵照试剂盒说明书的要求操作，测定细胞上清液中IL-6的积累量。
4、LNP-Ⅱ对RAW264.7细胞因子mRNA表达的影响
将培养至生长对数期的RAW264.7细胞以每孔1.5mL(细胞密度为6×105个/mL)铺在六孔板中，置于细胞培养箱中孵育24h后，移除原有培养基，设置样品组为含不同浓度紫丁香蘑多糖的DMEM完全培养基，空白对照为DMEM完全培养基，阳性对照为1μg/mL的LPS，每组设置三个平行，继续培养孵育24h。参照EZ-press RNA Purification Kit说明书，采用柱法提取细胞的RNA。参照Roche逆转录试剂盒说明书，对提取的RNA进行逆转录，得到cDNA，配制对应的反应体系置于荧光实时定量PCR扩增仪上进行反应，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内标，采用2^ΔΔCT法测定基因相对表达量。
结果：紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ在62.5-1000μg/mL范围内对RAW264.7细胞的毒性作用如图11，62.5-500μg/mL浓度下其对RAW264.7细胞的相对增殖率高于90％，因此选取此浓度范围进行后续实验。
图12为LNP-Ⅱ对RAW264.7细胞吞噬中性红能力的影响，结果表明LNP-Ⅱ能明显增强RAW264.7细胞的吞噬能力，与空白组相比，具有统计学差异。
图13和图14结果显示LNP-Ⅱ可以通过调控IL-6mRNA的表达，促进巨噬细胞分泌细胞因子IL-6，进而其增强免疫活性。
实施例5：紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的细胞抗氧化活性研究
1、试剂：WME培养基(美国Gibco公司生产)、FBS(美国Gibco公司生产)、双抗(美国Gibco公司生产)、活性氧荧光探针2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，美国Gibco公司生产)、氢化可的松(美国Gibco公司生产)等，均为市售产品。
2、仪器：细胞培养箱、酶标仪、低速离心机等
3、方法：采用以HepG-2细胞为载体的细胞抗氧化模型，以槲皮素为标品，测定LNP-Ⅱ的细胞抗氧化能力。使用CM完全培养基(WME培养基,5％FBS,10mM Hepes,2mM谷氨酰胺,5μg/mL胰岛素,0.05μg/mL氢化可的松,1％双抗)培养HepG-2细胞。不同浓度紫丁香蘑多糖样品和槲皮素标准品用抗氧化培养基(含2mM谷氨酰胺,10mM Hepes溶液的WME培养基)溶解，得到多糖样品和槲皮素标准品的工作液。
待细胞培养24h至贴壁生长后，去除上清液并用PBS清洗2次。样品组加入100μL含有活性氧荧光探针DCFH-DA(终浓度为25μM)的样品溶液。标准品组加入100μL含有活性氧荧光探针DCFH-DA(终浓度为25μM)的槲皮素标准品工作液，设置对照组和空白组，只向细胞中加入含25μM DCFH-DA的抗氧化培养基，每组设置三个平行。在培养箱中继续培养1h。取出96孔板，设置PBS组(用PBS清洗每个孔)和No PBS wash组(不加PBS清洗)，样品组、标准品组和对照组每孔加入100μL无酚红的HBSS(含有600μM ABAP)，而空白组加入100μL氧化培养基(由无酚红的HBSS和10mM Hepes溶液配制，含有600μM ABAP)，立即将96荧光酶标板置于酶标仪中，保持恒温37℃，程序设定激发光为485nm，发射光为535nm，每5min扫描一次，共13个循环。检测完毕用Sigmaplot 12.0绘图，扣除空白和初始荧光值后，各组分紫丁香蘑多糖浓度对应时间-荧光值曲线下的面积即为CAA值。
4、结果
活性氧荧光探针DCFH-DA被HepG-2细胞吸收后，被细胞内的酯酶水解成DCFH，DCFH由于其极性较强而不能透过细胞膜，从而被固定在细胞内。ABAP作为自由基发生剂进入细胞后，裂解并产生自由基，同时会攻击细胞膜产生更多的自由基，自由基将DCFH氧化成具有荧光特性的DCF。
根据槲皮素标准品和紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ在不同浓度下对HepG-2细胞中ABAP产生的自由基氧化DCFH的影响，绘制动力学曲线，如图15所示。图15中a)和b)的荧光值变化的动力学曲线，反映了槲皮素标准品对具有荧光特性的DCF产生的变化具有浓度依赖性的抑制作用，槲皮素PBS wash组的结果也显示出细胞对槲皮素有较好的吸收和利用能力，说明槲皮素标准品在细胞内和细胞外均表现出抗氧化能力，且与浓度呈正相关。同理，图15的c)和d)结果显示LNP-Ⅱ具备细胞抗氧化能力，No PBS wash组显示，当LNP-Ⅱ浓度升至250μg/mL以上，细胞外表现出浓度依赖性的抗氧化作用；PBS wash组的结果表明500μg/mL以上的LNP-Ⅱ多糖可以很好地被细胞吸收并表现出抗氧化活性。通过计算，得到LNP-Ⅱ的EC50和CAA值如下表3。
表3 LNP-Ⅱ的EC50和CAA值
Figure BDA0003657009430000151
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ，其特征在于为由岩藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，其单糖组成岩藻糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖的摩尔比为1.00：1.78：1.45：3.72；
所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的结构如下所示：
Figure FDA0003940520990000011
R1/R2/R3代表此位置分别与R1、R2、R3三种基团相连，MeO指的是氧甲基。
2.根据权利要求1所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ，其特征在于：
所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的重均分子量为8000-20000Da。
3.根据权利要求2所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ，其特征在于：
所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的重均分子量为17687Da。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取紫丁香蘑子实体粉末，用超声波辅助热水浸提法进行提取，将所得水提物经浓缩、脱色、脱蛋白、醇沉得到粗多糖；
(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，然后洗脱，收集洗脱液；
(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋透析浓缩；
(4)将步骤(3)完成后的浓缩液冷冻干燥得到纯化的紫丁香蘑多糖；
步骤(2)中，离子交换柱为纤维素柱，该纤维素柱的填料为DEAE-52；
步骤(2)中，洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱所用洗脱剂为浓度为0-0.5mol/L的NaCl溶液，收集由0.025mol/L NaCl洗脱剂洗脱得到的洗脱液进行浓缩。
5.根据权利要求4所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，超声波辅助热水浸提法是指先热水浸提后再超声波辅助，其中超声参数为40-80KHZ超声10-30min；热水浸提法温度可以为80-100℃，热水浸提时间为5-8h。
6.根据权利要求4所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中，紫丁香蘑子实体粉末与水的料液比为1g:10mL-1g:50mL；
步骤(1)中，浸提次数为至少一次。
7.根据权利要求4所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的制备方法，其特征在于：步骤(1)的脱色步骤中，所用到的是大孔树脂D354FD，泡发后与浓缩液体积比1:1混匀，55℃下搅拌脱色；
步骤(1)的脱蛋白步骤中，是采用Sevag法脱蛋白；
步骤(1)中，醇沉步骤中，醇与水提物的浓缩液的体积比为1-10:1。
8.根据权利要求4所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中，透析袋的截留分子量为6000-10000Da。
9.根据权利要求1-3任一项所述的紫丁香蘑多糖LNP-Ⅱ在制备增强免疫的食品或药物、制备抗氧化的食品或药物、制备抗黑色素瘤的食品或药物中的应用。
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