CN111690073B - 一种绒白乳菇多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绒白乳菇多糖及其制备方法和应用。该多糖是由绒白乳菇子实体提取得到，其为α‑D‑半乳糖和α‑D‑葡萄糖组成的杂多糖，其中α‑D‑半乳糖与葡萄糖的残基的摩尔比为2:1。该多糖具有显著的免疫调节活性，可用于制备药物，也可用于制备增强免疫的保健品和食品，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提高绒白乳菇的利用价值。

Description

一种绒白乳菇多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于真菌多糖应用技术领域，具体地说，涉及一种绒白乳菇多糖及其制备方法和应用。

背景技术

由于中草药中所蕴含的内在潜力与疗效，近些年来，国家愈发重视中医药的研究，大型食药用真菌作为中国传统医药学的重要组成部分，对它的研究也最为广泛。我国地域辽阔，孕育了丰富的食药用真菌资源，大量的食药用真菌被收录于《本草纲目》等著作中，例如灵芝、羊肚菌、茯苓等。药用真菌不仅具有益气强身、祛病通经等功效，还具有增强人体免疫力，抑制肿瘤生长的功效。研究表明，食药用真菌中具有药用价值的主要活性成分为真菌多糖。

多糖是从各种生物材料中提取到的具有生理活性的一类大分子天然产物，通常为10个及以上的单糖单元所构成的天然高分子聚合物，是参与机体生长发育及各种生命活动的重要物质之一。多糖作为除核酸及蛋白质以外的一类重要大分子物质，其研究起步的时间与核酸、蛋白质不相伯仲，但至目前为止，对于核酸、蛋白质的研究还远高于对多糖的研究。

绒白乳菇(Lactarius vellereus Fr.)隶属真菌类、担子菌纲、伞菌目、红菇科、乳菇属，常与栎属植物形成外生菌根，有毒性，但加工后可食用。绒白乳菇作为一种传统中药被收录于《本草纲目》中。《本草纲目》中记载，绒白乳菇具有追风散寒、舒筋活络的药理作用，是‘舒筋丸’的原材料之一，具有一定的食药用价值。

目前关于绒白乳菇的研究主要集中在绒白乳菇提取物的生物活性成分分析方面，对于绒白乳菇多糖的精细结构与免疫活性的研究及其应用尚未见任何报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种绒白乳菇多糖及其制备方法和应用。

其具体技术方案为：

本发明提供一种绒白乳菇多糖，其为α-D-半乳糖和α-D-葡萄糖组成的杂多糖，特别是其中α-D-半乳糖与葡萄糖的残基的摩尔比为2:1。

进一步地，上述多糖的重均分子量为8000-20000Da(如8000、9000、10000、11000、11100、11200、11300、11400、11500、12000、13000、14000、15000、16000、18000、20000Da)；特别是，上述多糖的重均分子量为11176Da。

进一步地，上述多糖的化学结构中包含1,2,6-与1,3,6-连接的α-D-半乳糖残基和1,6-连接的α-D-葡萄糖残基。

再进一步地，上述多糖的化学结构中包含由(1→6)-α-D-葡萄糖的1位与(1,3→6)-α-D-半乳糖的3-相连，6位与(1,2→6)-α-D-半乳糖的2-连接，构成一个十三圆环结构。

具体地，上述多糖包含如下结构：

其中，n为15-38的整数(如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38)；在本发明的一个实施例中，n为21。

本发明还提供一种上述多糖的制备方法，其包括对绒白乳菇子实体进行提取的步骤。

具体地，上述制备方法包括通过水提醇沉法提取得到粗多糖的步骤。

具体地，上述制备方法还包括(例如通过离子交换柱层析)对粗多糖进行纯化的步骤。

在本发明的一个实施方式中，上述制备方法包括如下步骤：

(1)取绒白乳菇子实体粉末，用水浸提，将所得水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白得到粗多糖；

(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；

(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋进行透析浓缩。

任选地，(4)将步骤(3)完成后的透析袋内液体冷冻干燥。

具体地，步骤(1)中，浸提温度可以为80-100℃(如80、85、90、95、100℃)；在本发明的一个实施例中，该浸提温度为90℃。

具体地，步骤(1)中，绒白乳菇子实体粉末与水的料液比(W/V，mg/mL)为1:1-10(如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:8、1:10)；在本发明的一个实施例中，该料液比为1:3。

具体地，步骤(1)中，浸提次数可以为1次或多次(如2、3、4、5次)；在本发明的一个实施例中，该浸提次数为3次。

具体地，步骤(1)中，每次浸提时间可以为5-10小时(如5、6、7、8、9、10小时)；在本发明的一个实施例中，每次浸提时间为3小时。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中的浸提步骤可以包括：取绒白乳菇子实体粉末，与水混合，并置于水浴中煮沸。

具体地，步骤(1)中，醇沉步骤中，醇与水提物的浓缩液的体积比为1-10:1(如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1)；在本发明的一个实施例中，该体积比为4:1。

在本发明的一个实施例中，上述醇沉步骤中，醇为乙醇。

在本发明的一个实施例中，除蛋白采用Sevage法。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)包括：取绒白乳菇子实体粉末，热水浸提，收集上清液，浓缩，加入无水乙醇，收集沉淀，烘干，除去其中的蛋白质，得到粗多糖。

具体地，步骤(2)中，离子交换柱可以为纤维素柱，该纤维素柱的填料如DEAE-纤维素。

具体地，步骤(2)中，洗脱所用洗脱剂可以为NaCl溶液；具体地，该NaCl溶液浓度为0.01-1.0mol/L(如0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0)mol/L。

具体地，步骤(2)中，洗脱可以为梯度洗脱，洗脱剂浓度可以为0.01-1.0mol/L(如0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0)mol/L。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)包括：将步骤(1)所得粗多糖的水溶液通过纤维素柱，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩。

具体地，步骤(3)中，透析袋的截留分子量为5000-10000Da(如5000、6000、7000、8000、9000、10000Da)；在本发明的一个实施例中，该截留分子量为7000Da。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)包括：将步骤(2)所得洗脱液置于透析袋中进行透析，持续3天，透析两天。

本发明还提供一种上述方法制备得到的粗多糖。

本发明还提供一种上述多糖在制备增强免疫的药物、保健品和食品中的应用。

本发明还提供一种上述多糖在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物、保健品和食品中的应用。

上述应用中，上述多糖可单独使用，可也与其他活性成分联合使用。

本发明的发明人自绒白乳菇分离纯化得到多糖LV-1，并对其分子量、单糖组成、化学结构等进行了分析鉴定，确定了其重均分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著的免疫调节活性，特别在5μg/mL浓度时，B、T细胞和RAW264.7细胞促增殖率最高；该多糖同时还能促进B细胞分泌免疫球蛋白。基于此，该多糖可用于制备药物，也可用于制备增强免疫的保健品和食品，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提高绒白乳菇的利用价值。

附图说明

图1所示为LV-1的HPGPC谱图；

图2所示为LV-1的红外谱图；

图3所示为LV-1的HLPC谱图；

图4所示为LV-1的¹H NMR谱图；

图5所示为LV-1的¹³C NMR谱图；

图6所示为LV-1的¹H-¹H-COSY谱图；

图7所示为LV-1的HMQC谱图；

图8所示为LV-1的HMBC谱图；

图9所示为LV-1的化学结构；

图10所示为LV-1对B细胞增殖的影响的实验结果；

图11所示为LV-1对T细胞增殖的影响的实验结果；

图12所示为LV-1对RAW264.7细胞增殖的影响的实验结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

在本发明中，“绒白乳菇”是指担子菌纲、伞菌目、红菇科、乳菇属真菌(Lactariusvellereus Fr.)，其包含子实体和菌丝体。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：绒白乳菇多糖LV-1的分离提取

1、绒白乳菇多糖LV-1的分离提取

1.1、水提醇沉法提取绒白乳菇粗多糖

称取干燥的绒白乳菇子实体200g粉碎，于烧杯中以料液1:3的比例加入粉碎后的绒白乳菇子实体与蒸馏水，并在90℃条件下水浴6h，煮三次，静置过夜，离心收集上清液，使用旋转蒸发仪将上清液浓缩至粘稠状，加入4倍体积的无水乙醇，使其沉淀，收集沉淀并干燥。同时，用Sevage法除去提取液中的蛋白质而获得绒白乳菇粗多糖。

1.2、DEAE-纤维素柱层析法分离纯化绒白乳菇粗多糖

精确称取50g DEAE-52纤维素，并将其溶解在1L的超纯水中，充分搅拌，若无肉眼可见的纤维素颗粒则停止搅拌。静置过夜，弃去上清液，待用。配置0.5mol/L NaOH浸泡纤维素6h，用超纯水洗涤至中性后，弃去上清，加入0.5mol/L HCl浸泡6h，蒸馏水洗涤至中性，弃去上清，加入0.5mol/L NaOH再次浸泡6h，用蒸馏水洗涤至中性，即完成DEAE-52纤维素的活化，静置待用。

将活化的纤维素装柱后，经蒸馏水压柱平衡24h后即可进行粗多糖的分离纯化。将粗多糖稀释后的上清液(10mL)加入DEAE纤维素柱中，加入不同浓度的NaCl(0mol/L，0.05mol/L，0.1mol/L)进行洗脱。多糖用硫酸-苯酚法测定。将洗脱液浓缩至5mL，将样品在纤维素柱上纯化。用透析袋(Mw≥7kDa)透析，持续18h，除去小分子化合物，冻干，得到绒白乳菇多糖，命名为LV-1。

2、绒白乳菇多糖LV-1的结构鉴定

运用水解、甲基化分析、气相色谱和质谱联用技术、红外谱技术、核磁共振技术、高效液相色谱，对绒白乳菇多糖LV-1进行结构解析。

2.1、分子量的测定

将5mg绒白乳菇多糖LV-1样品用1mL ddH₂O溶解，超声5min，进行HPGPC分析。

2.2、绒白乳菇多糖LV-1的红外谱分析

将2mg LV-1样品与KBr混合压片，通过红外分光光度计扫描4000cm^-1-400cm^-1范围。

2.3、绒白乳菇多糖LV-1单糖组成分析

将三种标准品和经TFA酸水解后的LV-1样品用流动相(75％乙腈)溶解后进行HLPC分析。

2.4、绒白乳菇多糖LV-1的核磁共振分析

取50mg LV-1样品溶于0.7mL重水(D₂O)中，装入核磁管中，在核磁共振仪上检测。

2.5、绒白乳菇多糖LV-1的甲基化与硅烷化衍生后进行GC-MS分析

称取20mg LV-1样品，加入2mL DMSO(二甲基亚砜)，轻轻振荡烧杯，使LV-1充分溶解。待LV-1溶解后加入干燥后的NaOH，直至NaOH刚好不溶解为止并将其放置在摇床中室温振荡1h。振荡完成后，加入1.5mL碘甲烷，避光反应1h，反应后加水终止反应。用氯仿萃取产物，干燥后得甲基化多糖。甲基化多糖经TFA完全酸水解后，水洗三次，得甲基化完全酸水解产物。

将上述样品与2mL六甲基二硅烷胺、1mL三甲基氯硅烷水以及2mL的无水吡啶充分反应，并在50℃条件下水浴20min，采用低温高速离心机在转速12000rpm/min，4℃条件下离心10min，弃去沉淀，取上层溶液用于GC-MS分析。

3、结果

3.1、绒白乳菇多糖LV-1的基本性质结果

LV-1的HPGPC谱图如图1所示，其显示LV-1的重均分子量为11176Da。

3.2、绒白乳菇多糖LV-1的FTIR谱分析

本研究采用傅里叶红外光谱技术(FTIR)对LV-1进行分析在4000～400cm^-1范围内测定绒白乳菇多糖(LV-1)的红外吸收，并处理分析LV-1的红外光谱。如图2所示，波数在3050～3570cm^-1范围内所出现的峰归为O-H的伸缩振动吸收峰，所以3434.81cm^-1处与3196.93cm^-1处出现的吸收峰归为O-H的伸缩振动吸收峰；将波数为1730cm^-1～1 630cm^-1区域的吸收峰归属为醛羰基C＝O伸缩振动，1726.46cm^-1指定为C＝O醛羰基C＝O伸缩振动，1634.57cm^-1处的吸收峰则为多糖类物质的特征吸收峰，综上描述了绒白乳菇多糖在4000～1400cm^-1范围内的特征吸收峰。将波数为1308.55cm^-1与1384.39cm^-1的吸收峰归属为醛基-CHO的C-H面内弯曲振动峰。在1250～1000cm^-1指纹峰区域范围内的一组峰是由醚键C-O伸缩振动引起的，即在1109.66cm^-1处所出现的吸收峰，为葡聚糖典型的红外光谱信号。

3.3、绒白乳菇多糖LV-1的单糖组成分析

将LV-1水解后，采用HPLC对其进行单糖组成分析，结果如图3所示，其中峰1为葡萄糖，保留时间为14.193，峰2为半乳糖，保留时间为16.687，结果表明，LV-1主要由半乳糖和葡萄糖组成，根据峰面积计算可知其组成摩尔比为2:1。

3.4、绒白乳菇多糖LV-1的NMR谱分析

LV-1的¹H NMR谱图如图4所示，其中，LV-1具有两个异头氢信号(δ4.98和δ4.87)，结合HPLC与GC-MS结果可知，LV-1中的葡萄糖残基与半乳糖残基之比约为1:2，并且¹H-NMR谱积分曲线显示两种α-吡喃糖残基比约为1:2，所以化学位移为δ4.87位置的异头氢对应两个半乳糖残基，比例为1:1，因此分别命名为A峰(δ4.98)、B峰(δ4.87)、C峰(δ4.87)，表明LV-1多糖一个重复单元至少含有3种糖残基。δ4.98和δ4.87处的质子信号属于α-吡喃糖。δ3.35-δ4.07处的吸收峰为2-6位碳上氢信号的重叠峰。

LV-1的¹³C NMR谱图如图5所示，δ100.14、δ98.22、δ97.91处有异头碳信号，共振信号归为D型吡喃型单糖的异头碳原子，¹³C-NMR谱的碳信号有3个，与氢谱中的两个¹H-NMR氢信号结果有出入，但经过HMQC二维图谱比对后发现，氢谱中化学位移4.87处的信号峰分别对应化学位移为100.14、97.91两处异头碳信号，氢谱图化学位移4.98处对应碳谱图98.22处的异头碳信号。由此推出δ98.22处的信号归属为A残基的C1，δ100.14的信号归属为B残基的C1，δ97.91处信号归属于C残基的C1。综上结果，表明¹³C-NMR谱的碳信号与氢谱中的¹H-NMR氢信号结果一致。

所有的碳和氢的化学位移都总结于表1中。

LV-1的¹H-¹H-COSY谱图如图6所示，表明H2的化学位移为3.84ppm、3.89ppm和3.97ppm。

LV-1的HMQC、HMBC光谱图如图7、图8所示，据其可以鉴定碳和氢之间的重叠信号。

表1 LV-1的¹H NMR和¹³C NMR化学位移

3.5、绒白乳菇多糖LV-1的气相色谱与质谱分析

甲基化结果如表2所示，其表明LV-1的主要重复结构单元由以(1→6)-α-D-葡萄糖的1位与(1,3→6)-α-D-半乳糖的3-相连，6位与(1,2→6)-α-D-半乳糖的2-连接，构成一个十三圆环结构。综上可初步推断LV-1的结构如图9所示。

表2 LV-1甲基化分析结果

实施例2：绒白乳菇多糖LV-1的免疫调节活性研究

在体外运用CCK-8法测定绒白乳菇多糖LV-1的免疫调节活性。

1、试剂

CCK-8试剂盒、RPIM1640、FBS、DMSO、双抗等，均为市售产品。

2、仪器

酶标仪；流式细胞仪。

3、方法

3.1、LV-1对免疫细胞(B细胞、T细胞和RAW264.7细胞)的增殖影响

通过CCK-8法测定B、T和RAW264.7细胞上LV-1增殖影响。实验设置为药物组(LV-1)，脂多糖(LPS)阳性对照组(LPS)、空白对照组(Control)，以及纯空白组(仅加入细胞培养液)，每组设置6个生物学重复。首先将B、T淋巴细胞和RAW264.7细胞配置成细胞悬液，为了消除边缘效应，以每孔200μl的量向96孔板的四周加入PBS缓冲液。剩余的孔中分别加入100μL的细胞稀释液。37℃、5％CO₂的条件下在CO₂恒温培养箱中培养24h，然后向除加入PBS外的孔中依次加入100μL细胞培养液、质量浓度为(5、10、20μg/mL)的LV-1溶液以及质量浓度为10μg/mL的LPS，在CO₂恒温培养箱中继续培养24h。培养完成后，每孔加入5μL的CCK-8溶液，孵育3h，在酶标仪450nm的波长下测定OD值，记录结果、拍照。

4、结果

4.1、LV-1对B细胞的增殖影响

B细胞效应如图10所示，以5μg/mL LPS作为阳性对照组。当LV-1浓度在2.5-10μg/mL之间时，B细胞增殖效应极显著(P<0.01)，浓度为5μg/mL时达到最大值，增殖率高达141.81％。

4.2、LV-1对T细胞的增殖影响

LV-1对T细胞的刺激效果如图11所示。与对照组比较，在2.5-10μg/mL浓度范围内，LV-1显著促进T细胞增殖(P<0.01)。当LV-1浓度为5μg/mL时，T细胞增殖最大，增殖率为66.22％。值得注意的是，5μg/mL LPS诱导的细胞增殖活性显著。

4.3、LV-1对RAW264.7细胞的增殖影响

LV-1诱导RAW264.7细胞增殖的效果如图12所示，从图中可以明显看出，在一定浓度范围为内，LV-1能极显著地促进RAW264.7细胞的增殖(P<0.01)。浓度为5μg/mL时，LV-1对其促增殖作用是最强的，增殖率为86.78％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims (21)

1.一种绒白乳菇多糖，其为由α-D-半乳糖和α-D-葡萄糖组成的杂多糖，其中所述α-D-半乳糖与葡萄糖的残基的摩尔比为2:1。

2.如权利要求1所述的绒白乳菇多糖，其特征在于，所述多糖包含1,2,6-与1,3,6-连接的α-D-半乳糖残基、1,6-连接的α-D-葡萄糖残基。

3.如权利要求1所述的绒白乳菇多糖，其特征在于，所述多糖的化学结构中，(1→6)-α-D-葡萄糖的1位与(1,3→6)-α-D-半乳糖的3-相连，6位与(1,2→6)-α-D-半乳糖的2-连接，构成一个十三圆环结构。

4.如权利要求1所述的绒白乳菇多糖，其特征在于，所述多糖包含如下结构：

其中，n为15-38的整数。

5.如权利要求1-4任一项所述的绒白乳菇多糖，其特征在于，所述多糖的重均分子量为8000-20000Da。

6.如权利要求1-4任一项所述的绒白乳菇多糖，其特征在于，所述多糖的重均分子量为11176Da。

7.一种权利要求1-4任一项所述的绒白乳菇多糖的制备方法，其包括对绒白乳菇子实体进行提取的步骤。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)取绒白乳菇子实体粉末，用水浸提，将所得水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白得到粗多糖；

(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；

(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋进行透析浓缩。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸提的温度为80-100℃。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸提的温度为90℃。

11.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述绒白乳菇子实体粉末与水的料液比为1:1-10。

12.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述绒白乳菇子实体粉末与水的料液比为1:3。

13.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇与水提物的浓缩液的体积比为1-10:1。

14.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇与水提物的浓缩液的体积比为4:1。

15.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醇为乙醇。

16.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离子交换柱为纤维素柱，其填料为DEAE-纤维素。

17.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，洗脱所用洗脱剂为NaCl溶液。

18.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述洗脱为梯度洗脱，洗脱剂浓度为0.01-1.0mol/L。

19.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述透析袋的截留分子量为5000-10000Da。

20.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述透析袋的截留分子量为7000Da。

21.一种权利要求1-6任一项所述的绒白乳菇多糖在制备增强免疫、预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

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