CN101230368A - 绒白乳菇素的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种绒白乳菇素的分离纯化方法。本发明涉及一种生物提取，分离纯化工艺：绒白乳菇子实体鉴别——菌种分离、纯化——菌株鉴定——菌丝体液体培养——绒白乳菇素萃取——绒白乳菇素分离——绒白乳菇素纯化。本发明具有抑制杨树叶枯病菌，菌丝生长及孢子萌发。同时对杨树叶锈病菌和杨树烂皮病菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌也有显著的抑制作用。高效、低毒、无公害。

Description

绒白乳菇素的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种生物提取，尤其是涉及一种利用绒白乳菇菌丝体发酵液中的抑菌活性成分--绒白乳菇素防治林木病害。

背景技术

目前，绒白乳菇(Lactarius vellereus(Fr.)Fr.)是隶属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、红菇科(Russulaceae)、乳菇属(Lactarius)的真菌，具微毒且具有一定的药用价值，对小白鼠肉瘤S-180及艾氏癌的抑制率均为60％。目前尚未有利用绒白乳菇菌丝体发酵液中的抑菌活性成分--绒白乳菇素防治林木病害的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绒白乳菇素的分离纯化方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：分离纯化工艺：绒白乳菇子实体鉴别--菌种分离、纯化--菌株鉴定--菌丝体液体培养--绒白乳菇素萃取--绒白乳菇素分离--绒白乳菇素纯化。

a、绒白乳菇子实体鉴别：子实体群生，菌盖直径6-10cm，初期白色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛，边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3-5cm，直径1.5-2.5cm，内实，白色，有绒毛，

b、菌种分离、纯化：采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方，马铃薯150-250g，葡萄糖15-25g，琼脂15-25g，水1000ml，

c、菌株鉴定：采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌丝体分别进行rDNAITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所分离的子实体，

d、液体发酵培养：采用培养基配方为0.05％～0.5％(g/mL)葡萄糖、1％～10％(g/mL)麸皮、0.01％～0.25％(g/mL)硫酸铵、0.01％～0.25％(g/mL)g黄豆粉，1％～3％无机盐及0.008％～0.016％(g/mL)烟酸，

e、发酵生产绒白乳菇素的培养条件：接种量5％～15％、装液量100～300mL/500mL、pH值5～7、摇床转速100～140r/min、温度20～28℃、发酵时间10～20d。

f、绒白乳菇素萃取：将上述培养液超声破碎1～4h，过滤除菌后与正丁醇以1∶2～5比例萃取1～5h，

g、绒白乳菇素分离：采用硅胶柱层析法分离，

h、绒白乳菇素纯化：采用薄层层析(TLC)。

本发明的优点是：

抑制杨树叶枯病菌(Alternaria alternate)菌丝生长及孢子萌发。同时对杨树叶锈病菌(Melampsors larici|populina)和杨树烂皮病菌(Cytospora chrysosperma)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)也有显著的抑制作用。高效、低毒、无公害。

具体实施方式

下面结合对本发明的实施例作进一步详细描述。

实施例1、

a、绒白乳菇子实体鉴别：子实体群生，菌盖直径6-10cm，初期白色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛，边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚。乳汁少，白色，不变色，味苦。菌褶直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3-5cm，直径1.5-2.5cm，内实，白色，有绒毛，

b、菌种分离、纯化：采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼脂，马铃薯200g，葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，

C、菌株鉴定：采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌丝体分别进行rDNA ITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所分离的子实体，

d液体发酵培养：采用培养基配方为2g葡萄糖、50g麸皮、1.25g硫酸铵、1.25g黄豆粉，20mL无机盐溶液、120mg烟酸，

e、发酵生产绒白乳菇素的培养条件：接种量12.5％、装液量300mL/500mL、pH6、摇床转速120r/min、温度26℃、发酵天数12d。

f、绒白乳菇素萃取：将培养液超声破碎2h，过滤除菌后与正丁醇以1∶3比例萃取3h，

g、绒白乳菇素分离：采用硅胶柱层析法分离，

h、绒白乳菇素纯化：采用薄层层析(TLC)。

实施例2、

a、绒白乳菇子实体鉴别：子实体群生，菌盖直径6-10cm，初期白色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛，边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3-5cm，直径1.5-2.5cm，内实，白色，有绒毛，

b、菌种分离、纯化：采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上。马铃薯葡萄糖琼脂，马铃薯180g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml，

C、菌株鉴定：采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌丝体分别进行rDNA ITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所分离的子实体，

d、液体发酵培养：采用培养基配方为1.5g葡萄糖、55g麸皮、1.20g硫酸铵、1.35g黄豆粉，18mL无机盐溶液、118mg烟酸，

e、发酵生产绒白乳菇素的培养条件：接种量10％、装液量250mL/500mL、pH6、摇床转速125r/min、温度23℃、发酵天数15d，

f、绒白乳菇素萃取：将培养液超声破碎3h，过滤除菌后与正丁醇以1∶4比例萃取2h，

g、绒白乳菇素分离：采用硅胶柱层析法分离，

h、绒白乳菇素纯化：采用薄层层析(TLC)。

实施例3、

a、绒白乳菇子实体鉴别：子实体群生，菌盖直径6-10cm，初期白色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛，边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3-5cm，直径1.5-2.5cm，内实，白色，有绒毛，

b、菌种分离、纯化：采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼脂，马铃薯210g，葡萄糖17g，琼脂17g，水1000ml，

c、菌株鉴定：采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌丝体分别进行rDNA ITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所分离的子实体，

d、液体发酵培养：采用培养基配方为2.1g葡萄糖、48g麸皮、1.23g硫酸铵、1.20g黄豆粉、22mL无机盐溶液、125mg烟酸，

e、发酵生产绒白乳菇素的培养条件：接种量15％、装液量240mL/500mL、pH7、摇床转速110r/min、温度28℃、发酵天数20d，

f、绒白乳菇素萃取：将培养液超声破碎1.5h，过滤除菌后与正丁醇以1∶2比例萃取5h，

g、绒白乳菇素分离：采用硅胶柱层析法分离，

h、绒白乳菇素纯化：采用薄层层析(TLC)。

本发明的抑菌机理为，绒白乳菇素能够抑制菌体4种保护酶的活性，破坏了保护酶系统原有的平衡状态，导致氧自由基清除系统出现障碍，MDA含量升高，膜脂过氧化严重，绒白乳菇素能够引起ATP酶阶段性的增强，这个阶段也致使HK、PK、LDH、SDH、MDH活力与辅酶I含量下降，更加剧了对ATP的水解，ATP合成受阻，使菌体内许多需能的合成代谢与物质运输受阻，干扰了糖酵解与TCA循环的顺利进行，严重破坏了糖类、脂类、蛋白质代谢相互间的动态平衡，直接以菌体电导率、呼吸强度、蛋白质含量的下降及菌体与孢子形态发生非正常的变化表现出来，最终使菌体膜系统完整性丧失，大量的内含物被释放到胞外，菌体变得十分粘稠，濒临死亡。

Claims (2)

1.一种绒白乳菇素的分离纯化方法，包括

，其特征在于：分离纯化工艺：绒白乳菇子实体鉴别——菌种分离、纯化——菌株鉴定——菌丝体液体培养——绒白乳菇素萃取——绒白乳菇素分离——绒白乳菇素纯化。

2.根据权利要求1所述的绒白乳菇素的分离纯化方法，其特征在于：

a、绒白乳菇子实体鉴别：子实体群生，菌盖直径6-10cm，初期白色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛，边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3-5cm，直径1.5-2.5cm，内实，白色，有绒毛，

b、菌种分离、纯化：采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方，马铃薯150-250g，葡萄糖15-25g，琼脂15-25g，水1000ml，

c、菌株鉴定：采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌丝体分别进行rDNA ITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所分离的子实体，

d、液体发酵培养：采用培养基配方为0.05％～0.5％(g/mL)葡萄糖、1％～10％(g/mL)麸皮、0.01％～0.25％(g/mL)硫酸铵、0.01％～0.25％(g/mL)g黄豆粉，1％～3％无机盐及0.008％～0.016％(g/mL)烟酸，

e、发酵生产绒白乳菇素的培养条件：接种量5％～15％、装液量100～300mL/500mL、pH值5～7、摇床转速100～140r/min、温度20～28℃、发酵时间10～20d。

f、绒白乳菇素萃取：将上述培养液超声破碎1～4h，过滤除菌后与正丁醇以1∶2～5比例萃取1～5h，

g、绒白乳菇素分离：采用硅胶柱层析法分离，

h、绒白乳菇素纯化：采用薄层层析(TLC)。