CN116814476A - 贝莱斯芽孢杆菌br-1在拮抗稻米镰刀真菌中的应用 - Google Patents
贝莱斯芽孢杆菌br-1在拮抗稻米镰刀真菌中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌BR‑1在拮抗稻米镰刀真菌中的应用，该贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR‑1的保藏编号为CCTCC NO:26867，保藏日期：2023年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BR‑1在拮抗稻米镰刀真菌中的新用途，该贝莱斯芽孢杆菌BR‑1能够有效拮抗镰刀真菌，尤其是稻米内生镰刀真菌，且抑制率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及贝莱斯芽孢杆菌BR-1在拮抗稻米镰刀真菌中的应用。
背景技术
研究表明水稻存在不同程度的真菌污染，这些污染发生在收获之前和贮藏期间。真菌可通过作物疾病和真菌毒素的产生造成重大的经济损失，从而阻碍谷物作为食品和饲料的商业化。稻米常见产毒真菌分为田间真菌和储藏真菌。田间真菌主要为镰刀菌属。在水稻的不同种植阶段侵染，容易引发赤霉病、茎基腐病等病害的发生。镰刀菌属的侵染，不仅会使作物出现产量损失和品质下降，镰刀菌属产生的次生代谢物，也被认为是食品和饲料产品中最重要的污染物，包括玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马毒素等。
生物防控技术在农作物病害综合治理中具有重要作用，不仅能够有效保证农作物的质量和环境安全，而且对农业的可持续发展有重大意义。研究表明，芽孢杆菌已经成为镰刀菌生物防治中研究最广泛的菌株。例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AF0907及Zl-2、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefacien)WPS4-1及CPLK1314其不仅对镰刀菌菌丝生长和孢子萌发具有显著的拮抗效果，而且对毒素也具有一定的降解能力。研究表明贝莱斯芽孢杆菌CE100显示出对P.carotovorum的抗菌活性，该细菌病原体，会导致不同蔬菜作物软腐烂，导致收获前后的产量损失，通过体内试验表明CE100有效地控制了细菌性软腐病，可显著改善黄瓜的生长。贝莱斯芽孢杆菌Jt84菌株表现出对稻瘟病的生物防治活性，并证实了其产生的抗真菌化合物surfactins、iturins和fengycins的存在显著降低病害生防效果。贝莱斯芽孢杆菌是一种广谱拮抗细菌，具有作为高效防治多种水稻病害的理想生防剂的潜力。
芽孢杆菌是一种好氧、产孢细菌，与非产孢细菌相比，其产孢能力有利于长期生存。但对贝莱斯芽孢杆菌的研究应用较少。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是首次在西班牙南部马拉加省Málaga的Velez河岸分离出的一种革兰氏阳性细菌。
发明内容
本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌BR-1在拮抗稻米镰刀真菌中的新用途，该贝莱斯芽孢杆菌BR-1能够有效拮抗镰刀真菌，尤其是稻米内生镰刀真菌，且抑制率高。
具体技术方案如下：
本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌BR-1在拮抗稻米镰刀真菌中的应用，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1的保藏编号为CCTCC NO:26867，保藏日期：2023年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
进一步地，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1菌体呈杆状，为革兰氏阳性菌，16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。
进一步地，所述稻米镰刀真菌为内生镰刀真菌或外源镰刀真菌。
更进一步地，所述内生镰刀真菌为Fusarium sp.WF5、厚垣镰孢菌WF9、厚垣镰孢菌WF12、厚垣镰孢菌WF13、木贼镰孢菌WF16、Fusarium sp.WF24、厚垣镰孢菌WF32、Fusariumsp.WF38、层出镰刀菌WF66、层出镰刀菌WF68、厚垣镰孢菌WF69、亚洲镰孢菌WF78；所述外源镰刀真菌为禾谷镰刀菌。
进一步地，所述的应用，包括：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1接种于液体培养基中，进行发酵培养，获得发酵产物
(2)将发酵产物制成菌剂，喷洒于受镰刀真菌侵染的稻米表面。
进一步地，步骤(1)中，所述液体培养基为LB培养基或M9培养基；所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的接种量为1～2％。
进一步地，步骤(1)中，所述发酵培养的条件为：以M9培养基为培养基质，30℃～37℃下培养18～24h，pH为7～9。
进一步地，所述菌剂为下列之一：
i上清夜；
ii菌体悬浮液；
iii胞内提取物；
iv以上清夜、菌体悬浮液和胞内提取物中的一种为有效成分的生防菌液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BR-1在拮抗稻米镰刀真菌中的新用途，该贝莱斯芽孢杆菌BR-1能够有效拮抗镰刀真菌，尤其是稻米内生镰刀真菌，且抑制率高。
(2)本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BR-1对BR-1菌株具有广谱抗菌活性，对所有试验镰刀菌株均具有拮抗作用，抑菌率在45％～87％不等。BR-1菌株对其镰刀菌孢子萌发抑制率达到95％左右。BR-1菌株对镰刀菌菌丝生长有明显抑制作用，镰刀菌菌丝发生扭曲变形，顶端囊泡化。
(3)本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌BR-1的上清液喷洒在人工污染产ZEN禾谷镰刀菌的稻米中，与空白对照相比，其镰刀菌菌落数降低2个对数级。
附图说明
图1为实施例1中稻米内生BR-1菌株的显微镜(1000X)形态学(a)和16S rDNA鉴定(b)。
图2为实施例2中不同培养时间的BR-1菌株无菌发酵液对镰刀菌的菌落拮抗(A：LB培养基，B：M9培养基)；其中，禾谷镰刀菌为Fusarium graminearum BNCC113713；WF32为Fusarium chlamydosporum strain WF32。
图3为实施例2中BR-1菌株无菌发酵液对镰刀菌的平板对峙图。
图4为实施例2中BR-1菌株的M9不同培养时间的无菌发酵液对禾谷镰刀菌孢子的抑制率。
图5为实施例2中BR-1菌株的M9无菌发酵液对镰刀菌菌丝生长的抑制作用(A：经BR-1菌株M9无菌发酵液处理；B：对照)。
图6为实施例3中BR-1菌株拮抗染禾谷镰刀菌稻米应用(A：菌落计数变化；B：ZEN毒素含量变化)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1菌株的获取
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1从经过表面消毒的健康稻米内部分离筛选、纯化得到。
根据《常见细菌系统鉴定手册》中的实验方法，对BR-1菌株进行形态特征鉴定。同时提取菌株基因组总DNA，用16S rRNA通用引物扩增，测序。
形态学鉴定结果显示，BR-1菌体呈杆状，革兰氏阳性菌，经16S rRNA基因PCR扩增测序和BLAST对比鉴定(图1)为芽孢杆菌属(Bacillus cereus)。
测序结果与NCBI中的GenBank数据库进行BLAST，分析序列同源性。将BR-1菌株单菌落接种于LB培养基中，在37℃，180rpm振荡下培养18h。将OD600值为0.6～0.8的菌液高速离心1min收集沉淀细菌，液氮速冻1h，干冰送样到生物科技有限公司进行全基因组测序分析。
对Nanopore测序的下机数据的原始数据，经过过滤接头、低质量及短片段后，BR-1菌株得到高质量测序长片段共150,118条，平均长度为7,138bp，N50为9,137bp。总碱基对为1,071,550,432bp。BR-1基因组由一条4,165,730bp的单环染色体组成，平均GC含量为46.03％。BR-1菌株16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)与贝莱斯芽孢杆菌16S rRNA序列同源性高达99.93％％。同源性比对数据证明菌株BR-1为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis。
SEQ ID NO.1：
TTATCGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT
BR-1菌株的全基因组预计有4027个蛋白质编码基因，占基因组的88.70％，平均长度为917bp。对不同数据库的蛋白质序列相似性预测结果显示，eggNOG、GO、KEGG、Nr、Pfam、Swiss-Prot和TrEMBL数据库中分别有3072(76.55％)、2908(72.46％)、2187(54.50％)、4004(99.78％)、3462(86.27％)、2870(71.52％)和2870(71.52％)蛋白质编码基因匹配。其中Nr数据库4004条比对到的序列中，有1773条比对为芽孢杆菌，且注释到种的序列中，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)有457条，占大多数。
上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)已于2023年3月23日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号：CCTCC NO:26867，保藏日期：2023年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)；故命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1CCTCC NO:26867，简称BR-1菌株。
培养特征为：最适生长温度30～37℃，pH为7～9。生长于LB培养基中，培养基成分：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10g/L。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1对稻米内生镰刀菌及外源禾谷镰刀菌的影响
1、BR-1菌株对内生镰刀菌及禾谷镰刀菌的菌落面积拮抗
将活化好的菌株BR-1按1％的接种量分别接种至LB培养基中，37℃，180rpm振荡下培养，离心取24h的无菌上清液。用已灭菌的打孔器(Φ＝6mm)在镰刀菌菌落边缘附近打孔，用镊子移取直径6mm的菌饼置于PDA固体培养基的中央，在距离中心2cm处对称放置2个牛津杯，每个杯中加入250μL无菌发酵液，置于培养箱中28℃培养5-7天，测定菌落直径，计算抑菌率。
BR-1菌株LB无菌发酵液对16株内生镰刀菌和外源镰刀菌的抑制率如表1所示，BR-1菌株具有广谱抗菌活性，对所有试验镰刀菌株均具有拮抗作用，抑菌率在45％～87％不等。因稻米内生代表镰刀菌株产毒量低，后续在BR-1生物防治效果实验效果不明显，故加入1株外源产毒强的禾谷镰刀菌进行后续实验。
表1BR-1菌株LB无菌发酵液对稻米内生镰刀菌的抑制率汇总表
2、培养基和培养时间对BR-1产生拮抗镰刀菌活性物质的影响
将活化好的菌株BR-1按1％的接种量分别接种至M9和LB两种培养基中，37℃，180rpm振荡下培养，离心取6、12、18、24、48h的无菌上清液，得到菌株BR-1不同生长时期的无菌发酵液。用已灭菌的打孔器(Φ＝6mm)在指示菌(WF32和禾谷镰刀菌)菌落边缘附近打孔，用镊子移取直径6mm的菌饼置于PDA固体培养基的中央，在距离中心2cm处对称放置2个牛津杯，每个杯中加入250μL无菌发酵液，置于培养箱中28℃培养5-7天，观察抑菌情况，测定菌落直径，计算抑菌率。
研究BR-1菌株不同培养时间的LB和M9无菌发酵液对镰刀菌的拮抗效果如图2所示，培养6h处于迟缓期的BR-1无菌发酵液对禾谷镰刀菌以及WF32基本无抑菌效果。培养12h的LB和M9无菌发酵液对WF32有抑菌效果，抑菌率为48.62～49.82％。培养12h的LB无菌发酵液对禾谷镰刀菌有抑菌效果，抑菌率为44.44％。培养18h、24h和48h均处于稳定期，其抑菌效果差不多，抑菌率在60～80％间。BR-1菌株无菌发酵液对镰刀菌的平板对峙图如图3所示。
3、BR-1菌株无菌发酵液对镰刀菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用
将BR-1菌接种1％到M9培养基中，37℃，180rpm下分别培养6、12、18、24、48h后，离心取上清液。1mL新鲜制备的禾谷镰刀菌孢子液(4.15x105 CFU/mL)离心后留沉淀，每管中加入制备的1ml拮抗菌无菌上清液，以加入相同体积的M9培养液作对照，所有处理于28℃下180r/min培养24h，每个处理重复3次。显微镜观察孢子萌发状况，当孢子萌发产生菌丝长度等于或超过孢子长度时视为已萌发，每次统计40个孢子400倍光学显微镜下观察镰刀菌菌丝生长情况。
孢子萌发率与孢子萌发抑制率：孢子萌发抑制率(％)＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100。
由图4可知，BR-1菌株不同培养时间的无菌发酵液对禾谷镰刀菌孢子萌发的效果也不同，在培养6h时，BR-1菌株处于迟缓期，其孢子萌发抑制率仅为20％左右。而培养12h和18h的BR-1菌株处于对数期，其孢子萌发抑制率为70％、78％左右。培养到24h和48h的BR-1菌株处于稳定期，其孢子萌发抑制率均为95％左右。
用培养24h的BR-1M9无菌发酵液处理镰刀菌菌丝悬液24h后，在400倍的光学显微镜下观察菌丝生长情况，结果见图5。由图5可知，对照组的菌丝生长正常(B)，粗细均匀，表面光滑，加入BR-1M9无菌发酵液处理镰刀菌24h后，发现菌丝生长有明显抑制作用(A)，镰刀菌菌丝发生扭曲变形，顶端囊泡化。
实施例3BR-1菌株无菌发酵液在稻米中拮抗霉菌和降解ZEN的应用
培养BR-1菌(将BR-1菌株单菌落接种于LB培养基中，在37℃，180rpm振荡下培养18h。)，培养禾谷镰刀菌制备孢子液(5×105CFU/mL)，取50g稻米，表面消毒后20℃干燥，分别在C组和D组中加入10mL BR-1M9上清液和BR-1M9菌液混合，并在20℃下彻底摇动30min，直到实现细菌菌液的均匀分布。A组喷洒无菌水作为对照，B组、C组和D组喷洒5mL禾谷镰刀菌孢子液。每组3个重复，在28℃下培养，7天后表面进行观察，并检测毒素含量，感染禾谷镰刀菌菌落数计数。
表2BR-1拮抗人工感染禾谷镰刀菌稻米的应用分组
本实施例进一步研究BR-1对稻米中禾谷镰刀菌菌丝生长的影响。如图6所示，喷洒禾谷镰刀菌孢子液7天后，可在稻米上观察到明显的菌丝，而仅加无菌水的对照组无发霉迹象。而经过BR-1菌上清液以及BR-1菌发酵液处理后的稻米，无被禾谷镰刀菌菌丝侵染的迹象。对处理后第7天的稻米进行霉菌菌落计数，结果发现经过BR-1菌处理的真菌菌落数为5×102CFU/g，显著低于对照的1.05×104CFU/g。
检测ZEN毒素含量发现，只感染禾谷镰刀菌的对照组B其ZEN含量高达93.98μg/kg；经过BR-1上清液处理的C组其ZEN含量为34.48μg/kg，比B组降低了63.31％；经过BR-1发酵液处理的D组其ZEN含量为42.51μg/kg，比B组降低了54.77％。
本发明从健康稻米中分离出一株贝莱斯芽孢杆菌BR-1。当BR-1菌株通过生化鉴定及全基因组测序分析表明，BR-1菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。菌株BR-1对镰刀菌的菌落直径、孢子萌发和菌丝生长均有较强的拮抗效果。在稻米的镰刀菌防控应用中，菌株BR-1对禾谷镰刀菌人工感染的稻米具有显著拮抗镰刀菌的效果，贝莱斯芽孢杆菌BR-1表现出较好的谷物储藏防霉应用的潜力。
Claims (8)
1.贝莱斯芽孢杆菌BR-1在拮抗稻米镰刀真菌中的应用，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1的保藏编号为CCTCC NO:26867，保藏日期：2023年3月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1菌体呈杆状，为革兰氏阳性菌，16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述稻米镰刀真菌为内生镰刀真菌或外源镰刀真菌。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述内生镰刀真菌为Fusarium sp.WF5、厚垣镰孢菌WF9、厚垣镰孢菌WF12、厚垣镰孢菌WF13、木贼镰孢菌WF16、Fusarium sp.WF24、厚垣镰孢菌WF32、Fusarium sp.WF38、层出镰刀菌WF66、层出镰刀菌WF68、厚垣镰孢菌WF69或亚洲镰孢菌WF78；所述外源镰刀真菌为禾谷镰刀菌。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BR-1接种于液体培养基中，进行发酵培养，获得发酵产物
(2)将发酵产物制成菌剂，喷洒于受镰刀真菌侵染的稻米表面。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述液体培养基为LB培养基或M9培养基；所述贝莱斯芽孢杆菌菌株的接种量为1～2％。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养的条件为：以M9培养基为培养基质，30℃～37℃下培养18～24h，pH为7～9。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菌剂为下列之一：
i上清夜；
ii菌体悬浮液；
iii胞内提取物；
iv以上清夜、菌体悬浮液和胞内提取物中的一种为有效成分的生防菌液。
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