CN1202135C - 赤灵芝多糖及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种灵芝多糖粗品和两种赤灵芝单一多糖，它是由赤灵芝子实体粉用水提取，提取液浓缩，加入氯仿和正丁醇摇震，静置，水层对流水透析，浓缩透析液，加入乙醇，4℃放置，离心除去沉淀，上清液中加入其3倍体积的乙醇，4℃放置，离心，收集沉淀得到的平均分子量为4000-6000的赤灵芝多糖粗品。赤灵芝多糖粗品溶解于水，上硼酸型离子交换柱，依次用蒸馏水、0.05mol/L硼砂溶液洗脱，收集第一流出物和第二流出物的洗脱液，经透析后冷冻干燥而得到本发明的平均分子量为4,100的赤灵芝单一多糖GLPL1和平均分子量为5700的赤灵芝单一多糖GLPL2，它们都有抑制肿瘤生长的作用，可以用于制备抗肿瘤药物。
Description
一、技术领域
本发明涉及从赤灵芝[Ganoderma Lucidum(Leys.Fr.)Karst]子实体粉提取的赤灵芝多糖及其制备方法，也涉及抗肿瘤药物。
二、背景技术
由于肿瘤细胞与人体某些正常细胞有高度的相似性，能直接杀伤癌细胞的化疗药大多也能杀伤那些正常细胞，这正是大多数化疗药产生毒副作用的原因所在。由于肿瘤的发生和发展与机体免疫能力密切相关，因此，有专家提出‘肿瘤免疫疗法’的概念：在正常人体内存在着多种免疫因子，它们可对癌细胞实施有效攻击，例如，香菇多糖、云芝多糖具有广泛免疫调节和抗肿瘤活性，现已批准成为临床常用的抗癌药物。这种通过提高自身免疫力的疗法不失为治疗肿瘤的有效途径之一，肿瘤免疫疗法确有其独具的潜力和实用价值。
大量研究表明：来源于某些真菌的多糖(如香菇多糖、云芝多糖、裂褶菌多糖等)具有抗肿瘤作用。多糖作为一种广谱免疫调节剂，可通过多途径、多环节、多靶点调节机体的免疫功能，通过宿主中介，刺激机体的各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，促进各种淋巴因子的分泌，调节抗体和补体的形成，调节神经-内分泌-免疫调节网络(NIM)的平衡等使机体免疫系统恢复平衡，由机体的本身抵抗力吞噬驱除肿瘤细胞。另一方面，一些多糖还对癌细胞有直接抑制和杀伤作用。与传统抗肿瘤药物相比：多糖药物的毒副作用极小，对机体免疫力无损伤并有加强作用，不易引起放、化疗不可避免的因机体免疫力下降而引起的多种并发症。对因身体衰弱而不宜接受放、化疗放疗的患者尤其适用。和其他药物合用，既有抗肿瘤活性，还具有免疫药理的减毒作用。因此一直被认为是极有发展前途的一种抗癌药物。但由于多糖的结构功能研究相对滞后，目前正式用于临床的抗肿瘤多糖类药物仅香菇多糖和云芝多糖两种，在抗肿瘤药物的群体中所占比例甚少，尚有广阔的市场和产业空间。
灵芝是中医药学宝库中的珍品，属担子菌纲，多孔菌科，灵芝属，在我国有两千多年的药用史，国内外的大量研究结果证明，灵芝具有广泛的药理作用，且毒性极低。灵芝化学成分复杂，主要有多糖类，核苷类，呋喃类，三萜类，生物碱，氨基酸及微量元素。其中灵芝多糖是其扶正固本的有效成分，具有抗肿瘤作用。Miyazaki等从灵芝子实体中分离出一种分子量为40000的水溶性多糖，Mizuno等从灵芝子实体中提取获得了分子量分别为1050000和450000的两种多糖，经腹腔注射给药后，三种多糖均对小鼠肉瘤S180有显著抑制作用；李荣芷、何云庆等从赤芝中分离到了分子量分别为16200、24500、35000和40000四种多糖，均能显著增加正常小鼠脾细胞IL-2的产生，另外北京医科大学药学院分离出的分子量为7100---9300的灵芝多糖能促进TNF-α、TNF-γmRNA的表达，增加TNF-α、TNF-γ的分泌。目前已报道的具有抗肿瘤作用的灵芝多糖分子量绝大多数为高分子量(分子量为几万到几十万)多糖，对低分子量灵芝多糖的抗肿瘤研究较少。国内外研究表明：多糖的活性与许多因素有关，如分子量、溶解性、粘度等，特别是与其空间结构密切相关。一般来说，溶解性趋于易溶，能溶于水的其效果更好；多糖的相对分子量越大，其粘度也越大，而多糖的粘度也会影响其实际应用效果，如裂褶多糖是很有应用前景的抗肿瘤药物，但起初因粘度太大，无法临床使用，后通过部分降解，使分子量降低，粘度也减小，但由于其基本重复结构不变，还保持抗肿瘤活性，现已在临床使用并取得了良好的效果。近年来研究发现，许多小分子多糖及寡糖具有良好的生物活性和药理作用，而且作为药物，小分子多糖水溶性好、粘度低，易于制成各种制剂，给药方便，在制造、储存和使用中更具优越性。
三、发明内容
本发明的目的在于：
提供一种赤灵芝多糖粗品及其制法，赤灵芝多糖粗品用于制备抗肿瘤药物。提供二种赤灵芝单一多糖及其制法。二种赤灵芝单一多糖用于制备抗肿瘤药物。
本发明的技术方案如下：
一种灵芝多糖粗品，它是由赤灵芝子实体粉用水提取，将提取液浓缩，加入氯仿和F丁醇，剧烈震荡，静置，除去下层有机层和中间层，水层对流水透析，浓缩透析液，加入透析浓缩液体积的3/4体积的乙醇，4℃放置，离心除去沉淀，以除去高分子量的多糖，保留上清液，上清液中加入其3倍体积的乙醇，4℃放置，离心，收集沉淀得到的平均分子量为4000~6000的赤灵芝多糖粗品。
一种制备上述的赤灵芝多糖粗品的方法，它由下列步骤组成：
步骤一、取赤灵芝子实体粉，加10-30倍重量的水，90--100℃提取8--12小时，间歇搅拌，3000rpm离心去沉淀，得提取液，离心后的残渣再加5-15倍赤灵芝子实体粉重量的水，在90--100℃再提取4-8小时，离心除去残渣，合并两次提取的上清液，
步骤二、将步骤一所得的上清液浓缩至赤灵芝子实体粉8--12倍的重量，加入浓缩液1/5体积的氯仿及氯仿的1/5体积的正丁醇，剧烈震荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，重复4--5次，以彻底除去蛋白质，将所得溶液对流水透析48小时，以除去小分子物质，透析液浓缩至赤灵芝子实体粉8--12倍的重量，向透析液中缓慢加入透析液3/4体积的乙醇，4℃放置，离心除去沉淀，以除去高分子量的多糖，保留上清液，
步骤三、向步骤二所得的上清液中加入其3倍体积的乙醇，4℃放置，离心，得沉淀，将沉淀溶于水，加入其4倍体积的无水乙醇，4℃放置，离心去上清液，依次以无水乙醇，丙酮洗涤沉淀，真空干燥得到本发明产物赤灵芝多糖粗品(GLPL)。
赤灵芝多糖粗品也可以用下列方法制备。
一种制备上述的赤灵芝多糖粗品的方法，其特征是由下列步骤组成：
步骤一、取赤灵芝子实体粉，加20-25倍其重量的去离子水，在搅拌下90--100℃提取8--12小时，离心后残渣再加10倍赤灵芝子实体粉重量的去离子水于100℃提取6-8小时，离心后弃残渣，合并两次提取的上清液，
步骤二、将步骤一所得的上清液100℃浓缩至200L，向浓缩液中加入浓缩液体积的1/5体积的氯仿及氯仿体积的1/5体积的正丁醇，搅拌，静置分层，取上清液，如此去蛋白操作重复3次，
步骤三、将去蛋白后的上清液放入真空罐内抽真空，在60℃抽30分钟，缓慢加入去蛋白后上清液体积的3/4体积的工业乙醇，4℃放置，离心，保留上清液，加上清液3倍体积的工业乙醇，4℃放置，离心，得沉淀，将沉淀溶于水，加入其4倍体积的无水乙醇，4℃放置，离心去上清液，依次以无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥，得本发明的赤灵芝多糖粗品。
上述的赤灵芝多糖粗品在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种赤灵芝单一多糖，它是由上述的赤灵芝多糖粗品溶解于水，上硼酸型离子交换柱，依次用蒸馏水、0.05mol/L硼砂溶液洗脱，收集第一流出物的洗脱液，经透析后冷冻干燥而得到的本发明的赤灵芝单一多糖GLPL1，它的平均分子量为4,100，它由葡萄糖组成，糖苷键为β-构型。
一种制备上述的赤灵芝单一多糖GLPL1的方法，它由下列步骤组成：
步骤一、将赤灵芝多糖粗品GLPL溶于50倍重量的蒸馏水，上已平衡好的硼酸型离子交换柱，
步骤二、将上述的离子交换柱依次用2.6倍柱床体积的蒸馏水、1倍柱床体积的0.05mol/L硼砂溶液洗脱，分步收集洗脱液，硫酸蒽酮比色法跟踪检测糖含量，收集第一流出物的洗脱液，经透析后，冷冻干燥，得到本发明的赤灵芝单一多糖GLPL1。
上述的赤灵芝单一多糖GLPL1在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种赤灵芝单一多糖，它是由上述的赤灵芝多糖粗品溶解于水，上硼酸型离子交换柱，依次用蒸馏水、0.05mol/L硼砂溶液洗脱，收集第二流出物的洗脱液，经透析后冷冻干燥而得到的本发明的赤灵芝单一多糖GLPL2，它的平均分子量为5,700，它由葡萄糖和半乳糖组成，糖苷键为β-构型。一种制备上述的赤灵芝单一多糖GLPL2的方法，它由下列步骤组成：
步骤一、将赤灵芝多糖粗品GLPL溶于50倍重量的蒸馏水，上已平衡好的硼酸型离子交换柱，
步骤二、将上述的离子交换柱依次用2.6倍柱床体积的蒸馏水、1倍柱床体积的0.05mol/L硼砂溶液洗脱，分步收集洗脱液，硫酸蒽酮比色法跟踪检测糖含量，收集第二流出物的洗脱液，经透析后，冷冻干燥，得到本发明的赤灵芝单一多糖GLPL2。
上述的赤灵芝单一多糖GLPL3在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所得到的低分子量的赤灵芝多糖粗品GLPL分子量在6000以下，主要由GLPL1和GLPL2组成，单一赤灵芝多糖GLPL1和GLPL3的分子量分别为4,100和5,700，分子量较小，水溶性好，黏度低，易于制成各种剂型，给药方便。初步的药效研究结果表明：GLPL对实体荷瘤小鼠肿瘤(B16BL6)生长及腹水型荷瘤小鼠肿瘤(S180)生长具有明显的抑制作用。GLPL1对体外培养的KB细胞增殖有抑制作用，且这种作用呈一定的剂量依赖性。GLPL2对体外培养的KB，BGC，Caco细胞增殖有显著的抑制作用，且该作用也呈一定的剂量依赖性，因此它们是很有潜力的抗肿瘤药物。
四、具体实施方式
实施例1.赤灵芝多糖粗品GLPL的制备
称取50克赤灵芝子实体粉加蒸馏水1000mL，沸水浴提取10小时，间歇搅拌。3000rpm离心去沉淀，得提取液。离心后残渣加500mL蒸馏水，沸水浴提取6h，离心后去残渣。合并两次提取的上清液。将上清液浓缩至500mL。加入浓缩液1/5体积(100mL)的氯仿及氯仿1/5体积(20mL)的正丁醇，剧烈震荡，静置分层，至氯仿和水的界面无沉淀为止，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，以除去蛋白质，反复5次，将所得溶液对流水透析48小时以除去小分子物质，透析液浓缩至500mL。向透析液中缓慢加入375mL的工业乙醇，4℃放置4h，离心，保留上清液(体积为v1)，得沉淀组分A。向上清液中加入3倍v1体积的工业乙醇，4℃放置4h，离心，得沉淀组分B。将沉淀组分B溶于水，加入4倍体积的无水乙醇，4℃放置4h，离心去上清液，依次以无水乙醇，丙酮洗涤沉淀，真空干燥，得到本发明产物—赤灵芝多糖粗品(代号GLPL)。
将实施例1中第一次提取的蒸馏水改为500mL或1500mL，提取温度为90℃，提取8或12小时，第二次提取的蒸馏水改为250或1000mL，提取温度为90℃，提取4小时或8小时，其它条件不变，同样得到赤灵芝多糖GLPL，得率也基本相同。
将实施例1中除蛋白质操作反复4次，透析液浓缩至400mL或600mL，其它条件不变，同样得到赤灵芝多糖GLPL，得率也基本相同。
实施例2.赤灵芝多糖粗品GLPL的中试提取工艺
称取20kg的赤灵芝子实体粉，加400L的去离子水，投入提取罐中，搅拌下100℃提取10h。离心后残渣加200L去离子水，100℃提取6h，离心后去残渣。合并两次提取的上清液。将上清液100℃浓缩至200L。向浓缩液中加入浓缩液1/5体积的氯仿(40L)以及1/5氯仿体积的正丁醇(8L)，搅拌30min，放气，静置分层，虹吸得上清液。去蛋白操作重复3次。将去蛋白液体(体积v0)返回真空罐内抽真空(60℃，30min)，缓慢加入3/4倍v0体积的工业乙醇，4℃放置4h，离心，保留上清液(体积为v1)，除去沉淀组分A。向上清夜中加入3倍v1体积的工业乙醇，4℃放置4h，离心，得沉淀组分B。将沉淀组分B溶于水，加入水溶液4倍体积的无水乙醇，4℃放置4h，离心去上清液。沉淀依次以无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥，得到本发明产物--赤灵芝多糖粗品GLPL。
实施例3.单一多糖GLPL1和GLPL2的制备
将100mg赤灵芝多糖粗品GLPL充分溶解于5mL蒸馏水，上已平衡好的硼酸型DE-32离子交换柱(1.9×20cm)，上样流速为0.27mL/min，分别用蒸馏水146mL，0.05mol/L硼砂溶液56mL洗脱，流速20mL/h，分步收集洗脱液，硫酸蒽酮比色法跟踪检测糖含量，合并相同组分，将第一、第二份流出物的洗脱液透析，冷冻干燥，得到本发明赤灵芝单一多糖成品：GLPL1和GLPL2。
实施例4.赤灵芝单一多糖GLPL1和GLPL2的理化性质
1.光谱分析
紫外光谱：取GLPL1和GLPL2适量，0.9％NaCl溶液溶解，配置成浓度为1mg/mL的溶液，在200～400nm范围内扫描。GLPL1和GLPL2的紫外光谱在280nm和260nm处无吸收峰，表明不含蛋白质和核酸。
红外光谱：取GLPL1和GLPL2适量，溴化钟压片，4000～400cm-1区间扫描。IR光谱解析如下：3400(0-H)，2900(C-H)，1640(C＝0)，1400(C-O)。GLPL1和GLPL2红外光谱890-1处有吸收，说明GLPL1和GLPL2的糖苷键为β-构型。
2.纯度测定
凝胶柱色谱：取GLPL1和GLPL2适量，经Sephadex G-100凝胶柱层析，0.1mol/L NaCl洗脱，流速18mL/h，每管收集2mL，硫酸蒽酮比色法跟踪检测糖含量，合并相同组分。绘制洗脱管数与吸光度的关系曲线。GLPL1和GLPL2的Sephadex G-100凝胶柱层析洗脱曲线均为单一对称峰，表明该样品纯度较高。
3.平均分子量测定
采用凝胶过滤法：Sephadex G-100凝胶装柱(65cm×12mm)，样品相继上样，以0.1mol/L NaCl洗脱。先测出各标准品Dextran T-10，Dextran T-40，Dextran T-70的洗脱体积Ve及蓝色葡聚糖的外水体积Vo，绘制Ve/Vo与各分子量对数关系标准曲线，再测GLPL1和GLPL2的Ve，由标准曲线求得GLPL1和GLPL2的平均分子量分别为4,100和5,700。
4.单糖组成测定
4.1薄层层析
水解：取GLPL1和GLPL2适量，分别以2M三氟乙酸(TFA)水解。冷却后减压抽去TFA，加少量甲醇，减压抽干，反复几次，最后将水解产物溶于蒸馏水。
薄层层析：硅胶G铺板，CMC为粘合剂。将上述水溶液和单糖标准样品点样，展开剂为乙酸乙酯∶异丙醇∶水＝65∶23.5∶11.5。薄层板展开后晾干，喷洒苯胺-邻苯二甲酸试液，110℃烘箱中加热10min显色。薄层层析显色后阿拉伯糖呈红棕色斑点，其他标准单糖呈棕褐色斑点。结果表明，GLPL1只显示一个葡萄糖斑点；GLPL2显示葡萄糖斑点和很淡的半乳糖斑点。
4.2气相色谱分析
水解产物进行糖醇乙酸酯化。水解产物及标准单糖用硼氢化钠还原，滴入醋酸分解过量硼氢化钠，减压蒸干后加入甲醇反复处理蒸干。加入醋酐∶无水吡啶(1∶1)于100℃水浴乙酰化20min，重溶于氯仿即可进行气相分析。
气相色谱分析条件：惠普6890气相色谱仪，HP-5毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25um)。气化温度260℃。程序升温110℃至190℃：3℃/min；190℃至206℃：2℃/min；206℃至280℃：20℃/min，保留2min。FID检测器，载气为氮气，流速25.0mL/min，检测器温度300℃。
气相色谱分析：GLPL1和GLPL2的气相色谱分析结果见表1。对照单糖标准品色谱图可知，GLPL1由葡萄糖组成：GLPL2由葡萄糖和少量半乳糖组成。
表1.GLPL1和GLPL2的气相色谱结果
组别 保留时间(min)
23.981 24.358 31.807 32.128 32.339
D-rhamnose +
D-arabinose +
D-mannose +
D-glucose +
D-galactose +
GLPL1 +
GLPL2 + +
实施例5.本发明的赤灵芝多糖粗品GLPL及赤灵芝单一多糖GLPL1和GLPL2的活性研究
实验研究证明，本发明的多糖具有一定抗肿瘤作用，主要的实验结果如下：
1.GLPL对实体荷瘤小鼠肿瘤(B16BL6)生长的抑制作用
取C57BL6小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为GLPL组(0.1、0.2、0.4g/kg)、云芝多糖组(1.65g/kg)、5-FU组(0.02g/kg)、模型组(等体积NS)，除5-FU组腹腔注射给药外，其余各组均灌胃给药。以0.25％胰酶消化贴壁生长良好的B16BL6黑色素瘤细胞，加培养液800rpm离心弃上清，再以无血清培养基混悬肿瘤细胞，调整细胞数。然后于每只小鼠右侧腹股沟皮下处接种肿瘤细胞悬液0.2mL(约106个)，接种次日开始灌胃给药，连续20天，每日观察记录小鼠腹股沟皮下处肿瘤生长情况、小鼠活动状态以及小鼠死亡情况。给药结束后处死小鼠，剥取分离瘤组织，以电子天平称重，记录瘤重。计算抑瘤率。
抑瘤率＝(1-给药组瘤重/模型组瘤重)*100％
表2.GLPL对实体型(B16BL6)荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用(x±SD)
组别 剂量(g/kg) 实体瘤重(湿重) 抑瘤率(％)
模型组 - 5.419±1.201 100
5-Fu 0.02 1.278±0.439** 76.4
云芝多糖 1.65 4.296±1.180 20.7
GLPL 0.40 3.098±1.003** 42.8
0.20 3.611±1.092* 33.4
0.10 4.108±0.810* 24.2
注：*P＜0.05 **P＜0.01
在腹股沟处接种B16BL6肿瘤细胞后约6天，模型组开始有可触及之肿块，此后肿块逐渐增大，到20天模型组肿块已大如桃核，肿瘤在体生长良好。各给药组小鼠腹股沟处肿块生长速度较慢，表现为GLPL各剂量瘤重均较模型组小，三种剂量组瘤重与模型组比较有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)，说明GLPL在抑制移植性实体型肿瘤方面都有显著作用。
2.GLPL对腹水型荷瘤小鼠肿瘤(S180)生长的影响作用
取处于对数生长期的S180细胞，以0.25％胰酶消化，再以无血清培养基稀释成细胞悬液，将此细胞悬液腹腔注射接种到ICR小鼠体内，层流架中饲养观察，待小鼠腹部胀大时(即小鼠体内肿瘤已迅速增殖)，准备第二次小鼠接种。
取ICR小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为GLPL组(0.1、0.2、0.4g/kg)、云芝多糖组(0.4g/kg)、5-FU组、模型组(等体积NS)，除5-FU组腹腔注射给药外，其余各组均灌胃给药。
取上述接种过并且肿瘤生长正常的ICR小鼠，抽取腹水，以生理盐水稀释，制成肿瘤细胞悬液并调整细胞数，每只小鼠腹腔注射接种肿瘤细胞悬液0.2mL(约106个)，接种次日开始给药，连续20天，每日观察记录小鼠腹腔情况、活动状况以及小鼠死亡情况。根据小鼠死亡率采用卡方检验统计结果。
表3.多糖对腹水型荷瘤小鼠肿瘤(S180)生长的抑制作用(x±SD，n＝10)
组别 剂量(g/kg) 死亡率(％) X2
模型组 - 100 -
5-Fu 0.02 20 13.33**
云芝多糖 1.65 100 -
GLPL 0.40 30 11.00**
0.20 50 6.67**
0.10 60 5.00**
接种腹水型S180肿瘤细胞的小鼠在十天后表现为腹部肿大，精神萎靡，活动减少，并逐渐开始出现死亡，在20天左右模型组小鼠全部死亡，给药组小鼠亦出现上述表现，但其死亡率有所下降，与模型组比较有明显差异，显示其能延缓小鼠的死亡时间，对肿瘤有抑制作用。
3.GLPL1和GLPL2对体外培养的癌细胞增殖的抑制作用
取对数生长期的各种肿瘤细胞[实验所用细胞分别为：人子宫颈癌细胞(Hela)，人红白血病细胞(K562)，人胃癌细胞(BGC)，人鼻炎癌细胞(KB)，人结肠癌细胞(Caco)，人肝癌细胞(SMMC-7721)]用胰蛋白酶消化后接种于96孔板，实验组各孔加入终浓度为400，200，100，50ug/mL的GLPL1或GLPL2.阳性对照组各孔加入终浓度为1ug/mL的IFN-α，阴性对照每孔加入同体积的1640培养基，各组均设3个复孔，于37℃，5％CO2培养箱培养48h后，加入MTT，继续培养4h后测定OD570并按照下列公式计算细胞生长抑制率(IR)。结果见表4-7。
细胞生长抑制率(IR)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％
表4.GLPL1对体外培养的KB细胞增殖的抑制作用
组别 剂量(ug/mL) IR(％)
IFN-α 1 32.7
GLP1 50 11.5
100 17.3
200 25.0
400 42.3
表5.GLPL2对体外培养的KB细胞增殖的抑制作用
组别 剂量(ug/mL) IR(％)
IFN-α 1 32.7
GLP3 100 17.3
200 19.2
400 44.2
表6.GLPL2对体外培养的BGC细胞增殖的抑制作用
组别 剂量(ug/mL) IR(％)
IFN-α 1 32.7
GLPL3 100 22.7
200 22.7
400 27.3
表7.GLPL2对体外培养的Caco细胞增殖的抑制作用
组别 剂量(ug/mL) IR(％)
IFN-α 1 32.7
GLPL3 100 13.3
200 20.0
400 26.7
由表4-7可知，GLPL1，GLPL2对KB细胞增殖均具有显著的抑制作用，且这种作用呈剂量依赖性，而GLPL2对BGC、Caco细胞增殖也有一定的抑制作用。
Claims (10)
1.一种灵芝多糖粗品，其特征是：它是由赤灵芝子实体粉用水提取，提取液浓缩，加入氯仿和正丁醇，剧烈震荡，静置，除去下层有机层和中间层，水层对流水透析，浓缩透析液，加入透析浓缩液体积的3/4体积的乙醇，4℃放置，离心除去沉淀，保留上清液，上清液中加入其3倍体积的乙醇，4℃放置，离心，收集沉淀得到的平均分子量为4000~6000的赤灵芝多糖粗品。
2.一种制备权利要求1所述的赤灵芝多糖粗品的方法，其特征是由下列步骤组成：
步骤一、取赤灵芝子实体粉，加10-30倍重量的水，90--100℃提取8--12小时，间歇搅拌，3000rpm离心去沉淀，得提取液，离心后残渣再加5-15倍赤灵芝子实体粉重量的水，在90--100℃再提取4-8小时，离心除去残渣，合并两次提取的上清液，
步骤二、将上清液浓缩至赤灵芝子实体粉8--12倍的重量，加入浓缩液1/5体积的氯仿及氯仿1/5体积的正丁醇，剧烈震荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，重复4--5次，将所得溶液对流水透析48小时，透析液浓缩至赤灵芝子实体粉8--12倍的重量，向透析液中缓慢加入透析液3/4体积的乙醇，4℃放置，离心除去沉淀，保留上清液，
步骤三、向上清液中加入3倍体积的乙醇，4℃放置，离心，得沉淀，将沉淀溶于水，加入其4倍体积的无水乙醇，4℃放置，离心去上清液，依次以无水乙醇，丙酮洗涤沉淀，真空干燥得到本发明产物赤灵芝多糖粗品GLPL。
3.一种制备权利要求1所述的赤灵芝多糖粗品的方法，其特征是由下列步骤组成：
步骤一、取赤灵芝子实体粉，加20-25倍重量的去离子水，在搅拌下90--100℃提取8--12小时，离心后残渣再加赤灵芝子实体粉10倍重量的去离子水，100℃提取6-8小时，离心后弃残渣，合并两次提取的上清液，
步骤二、将步骤一所得的上清液100℃浓缩至200L，向浓缩液中加入浓缩液体积的1/5体积的氯仿及氯仿体积1/5体积的正丁醇搅拌，静置分层，取上清液，如此去蛋白操作重复3次，
步骤三、将去蛋白后的上清液放入真空罐内抽真空，在60℃抽30分钟，
缓慢加入去蛋白后上清液体积的3/4体积的工业乙醇，4℃放置，离心，保留上清液，加上清液3倍体积的工业乙醇，4℃放置，离心，得沉淀，将沉淀溶于水，加入其4倍体积的无水乙醇，4℃放置，离心去上清液，依次以无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥，得本发明的赤灵芝多糖粗品。
4.根据权利要求1所述的赤灵芝多糖粗品在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种赤灵芝单一多糖，其特征是：它是由权利要求1所述的赤灵芝多糖粗品溶解于水，上硼酸型离子交换柱，依次用蒸馏水、0.05mol/L硼砂溶液洗脱，收集第一流出物的洗脱液，经透析后冷冻干燥而得到的本发明的赤灵芝单一多糖GLPL1，它的平均分子量为4,100，它由葡萄糖组成，糖苷键为β-构型。
6.一种制备权利要求4所述的赤灵芝单一多糖GLPL1的方法，其特征是由下列步骤组成：
步骤一、将赤灵芝多糖粗品GLPL溶于50倍重量的蒸馏水，上已平衡好的硼酸型离子交换柱，
步骤二、将上述的离子交换柱依次用蒸馏水、0.05mol/L硼砂溶液洗脱，收集第一流出物的洗脱液，经透析后，冷冻干燥，得到本发明的赤灵芝单一多糖GLPL1。
7.根据权利要求5所述的赤灵芝单一多糖GLPL1在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.一种赤灵芝单一多糖，其特征是：它是由权利要求1所述的赤灵芝多糖粗品溶解于水，上硼酸型离子交换柱，依次用蒸馏水、0.05mol/L硼砂溶液洗脱，收集第二流出物的洗脱液，经透析后冷冻干燥而得到的本发明的赤灵芝单一多糖GLPL2，它的平均分子量为5,700，它由葡萄糖和半乳糖组成，糖苷键为β-构型。
9.一种制备权利要求8所述的赤灵芝单一多糖GLPL2的方法，其特征是由下列步骤组成：
步骤一、将赤灵芝多糖粗品GLPL溶于50倍重量的蒸馏水，上已平衡好的硼酸型离子交换柱，
步骤二、将上述的离子交换柱依次用蒸馏水、0.05mol/L硼砂溶液洗脱，收集第二流出物的洗脱液，经透析后，冷冻干燥，得到本发明的赤灵芝单一多糖GLPL2。
10.根据权利要求8所述的赤灵芝单一多糖GLPL2在制备抗肿瘤药物中的应用。
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