CN103837384A - 一种可溶性糖的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可溶性糖的测定方法，该具体过程为：样品前处理；蒸馏水提取可溶性糖；显色和比色；制作标准曲线；计算可溶性糖含量。本发明针对不同的实验条件和测定内容，选择不同的样品前处理方法，以保证实验条件一致；简化实验步骤，即减少取样质量，取消离心、收集上清液、合并上清液、定容等步骤，在带塞的刻度试管中完成提取过程的探索，减少了时间和成本，尤其特别适合于大批量样品的测定。

Description

一种可溶性糖的测定方法

技术领域

本发明涉及一种可溶性糖的测定方法，尤其涉及一种可溶性糖的快速、经济的测定方法。 

背景技术

现有技术中可溶性糖的测定方法一般以葡萄糖作为可溶性糖的测定指标，测定方法有4种，苯酚硫酸法测定时试剂反应剧烈，液体容易溅出，苯酚易被氧化；斐林试剂比色法会使次甲基兰与空气接触被氧化；3、5-二硝基水杨酸比色法仅是还原糖的测定；蒽酮硫酸比色法显色稳定，重现性好，操作简便，比较稳定，结果准确可靠，原理是可溶性糖在硫酸作用下生成糖醛或羟甲基糠醛化合物，而后者可与蒽酮作用形成蓝绿色络合物(糖醛衍生物)，在620nm波长下的吸光值与可溶性糖含量成正比。可溶性糖易溶于水及乙醇溶液，可用温水或乙醇溶液提取试样中的可溶性糖。 

请参阅图1所示，其为本发明的现有技术中可溶性糖的测定方法，其具体过程为： 

方法一：(1)乙醇提取可溶性糖：各种植物叶片或种子在110℃的烘箱内鼓风固定15min，然后调温至70℃过夜。干叶片磨碎后称取50mg样品倒入10mL刻度离心管内加入4mL80％乙醇，置于80℃水浴不断搅拌40min，离心(如3000rpm，30min)，收集上清液，其残渣加80％乙醇重复提2次，合并上清液。在上清液中加10mg活性炭，80℃脱色30min，定容至10mL，过滤后取滤液测定。 

(2)可溶性糖的测定：取一定量的乙醇提取液，浓缩至0.05～0.1mL(或者取乙醇提取液1mL)，加入3mL蒽酮试剂[150mg蒽酮溶于100mL稀硫酸(76mL浓硫酸入30mL水中)]，90℃保温15min，在620nm处测定OD值。取20～50ug葡萄糖同法测定，做成标准曲线进行计算。 

蒽酮硫酸比色的测定方法也存在一定弊端，如操作步骤繁琐，耗费时间长；叶绿素对测定有干扰；蒽酮试剂配制时，因蒽酮分子比较活泼，光 和热均易改变其分子结构，在硫酸配制后降温不充分或配制试剂延迟都会影响蒽酮试剂质量，容易出现黄绿色；若叶绿素含量高，加入活性碳质量少，会影响比色效果；若可溶性糖含量高，蒽酮体积少，反应不充分，容易出现浑浊。 

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种可溶性糖的测定方法，用以克服上述技术缺陷。 

为实现上述目的，本发明提供一种可溶性糖的测定方法，该具体过程为： 

步骤a1.样品前处理： 

将植物组织在110℃杀青15min，70℃烘干，粉碎，过40目筛； 

步骤a2.蒸馏水提取可溶性糖： 

称取20mg样品于10mL带塞的刻度试管中，加入10mL蒸馏水至该刻度试管中，盖好塞子，放在铝制试管架上；将其置于80℃水浴中浸提60min，向其中加40mg活性碳，盖好塞子，反复震荡摇匀；在该80℃水浴中脱色30min，过滤后取滤液测定； 

步骤a3.显色和比色： 

取1mL蒸馏水提取液，向其内加入10mL蒽酮试剂，盖好塞子，反复震荡摇匀；在90℃水浴中保温15min，取出冷却，在620nm处测定OD值； 

步骤a4.制作标准曲线： 

样品测定前，配制并测定葡萄糖标准溶液的OD值，以OD值对葡萄糖标准溶液浓度数值绘标准曲线并得到回归方程； 

步骤a5.计算可溶性糖含量： 

将测得的各样品OD值代入回归方程得到各样品浓度，并计算可溶性糖含量： 

进一步，上述步骤a5中，由下式计算可溶性糖含量： 

$C=\frac{\mathrm{SC}\×\mathrm{SV}\×\mathrm{SDR}}{\mathrm{SM}\×{10}^3}\×100\%$

式中，C表示可溶性糖含量；SC表示样品浓度；SV表示溶液体积；SDR表示样品溶液稀释倍数；SM表示样品质量。 

进一步，上述步骤a4中，获取葡萄糖标准溶液的OD值的具体过程为： 

取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，转入500mL容量瓶中，制成200ug/mL的标准葡萄糖母液，然后再制成0～200ug/mL葡萄糖标准溶液，测定不同浓度葡萄糖标准溶液的OD值。 

进一步，上述步骤a1中，若在野外，尤其还需测定其他数量指标如激素或酶，用记号笔于封口袋上分别标记，将样品迅速放入封口袋中，用细绳绑好放入液氮罐中冰冻至少15min，以减少可溶性糖、激素和酶等被呼吸的消耗量。 

进一步，上述步骤a3中，OD值在0.2～0.8之间。 

进一步，上述步骤a3、a4中，提前1h配置硫酸溶液，待温度降低至室温时，再准确称量蒽酮，立即进行蒽酮试剂的配置，即现用现配置。 

进一步，上述步骤a4中，葡萄糖标准溶液浓度依次为0，40，80，120，160，200ug/mL，测定OD值。 

进一步，上述步骤a4中，用SPSS13.0进行直线回归分析，检验直线回归方程的显著性；利用Excel获取标准曲线，要求横坐标是葡萄糖标准溶液浓度，纵坐标是OD值。 

与现有技术相比较本发明的有益效果在于： 

(1)针对不同的实验条件和测定内容，选择不同的样品前处理方法，以保证实验条件的一致。 

(2)简化实验步骤，即减少取样质量，取消离心、收集上清液、合并上清液、定容等步骤，在带塞的刻度试管中完成提取过程的探索，减少了时间和成本，尤其特别适合于大批量样品的测定。 

(3)小细节上减少实验误差 

提前1h配置硫酸溶液，待温度降低至室温时，再准确称量蒽酮，立即进行蒽酮试剂的配置，即现用现配置，且每次开机都重新做标准曲线；提高活性碳质量至取样质量2倍，以去除所有的叶绿素；增加蒽酮体积为10mL，保证溶液澄清、透明。 

附图说明

图1为本发明现有技术的可溶性糖的测定方法的流程图； 

图2为本发明可溶性糖的测定方法的流程图； 

图3为本发明的计算样品浓度的示意图； 

图4为本发明的计算可溶性糖含量的示意图。 

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的 说明。 

请参阅图2所示，本发明可溶性糖的测定方法包括下述步骤： 

步骤a1.样品前处理： 

将植物组织(如叶片)在110℃杀青(或液氮中)15min，70℃烘干，粉碎，过40目筛； 

步骤a2.蒸馏水提取可溶性糖： 

称取20mg样品于10mL带塞的刻度试管中，加入10mL蒸馏水至该刻度试管中，盖好塞子，放在铝制试管架上；将其置于80℃水浴中浸提60min，向其中加40mg活性碳，盖好塞子，反复震荡摇匀；在该80℃水浴中脱色30min，取出冷却至室温(将铝制试管架置于盛有自来水的盆中)，过滤后取滤液测定。 

步骤a3.显色和比色： 

取1mL蒸馏水提取液，向其内加入10mL蒽酮试剂，盖好塞子，反复震荡摇匀；在90℃水浴中保温15min，取出冷却至室温，在620nm处测定OD值。在本发明中OD值在0.2～0.8之间。 

步骤a4.制作标准曲线： 

样品测定前，配制并测定葡萄糖标准溶液的OD值，以OD值对葡萄糖标准溶液浓度数值绘标准曲线并得到回归方程，并对回归方程进行显著性检验。 

具体操作过程是：取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，转入500mL容量瓶中，制成200ug/mL的标准葡萄糖母液，然后再制成0～200ug/mL葡萄糖标准溶液，浓度依次为0，40，80，120，160，200ug/mL，测定OD值。 

请参阅表1所示，其为本发明各浓度的葡萄糖标准溶液的配置。 

表1.葡萄糖标准溶液的配置 

利用SPSS13.0确立回归方程，并对回归方程进行显著性检验。 

例如，第1列，葡萄糖标准溶液浓度(在SPSS中标记为糖浓度)依次为：40，80，120，160，200ug/mL；第2列对应的OD值(在SPSS中标记 为消光度值)分别为：0.184，0.294，0.491，0.664，0.791。SPSS操作步骤如下： 

Analyze→Regression→Linear，糖浓度→Independent(s)，消光度值→Dependent List，Statistics→Estimates，Model fit→Continue→Ok。回归分析结果形成下述表2、3和4。表2表明，相关系数为0.996；表3表明，r＝0.996，F＝398.432，P＝0.0000＜0.001(将表3中的表从SPSS输出结果拷贝至Excel中→选择性粘贴→Unicode文本→设置单元格格式→数值→小数点位数→4)，即直线回归效果极显著。由表4得到回归方程的系数和常数项。 

表2.相关系数和决定系数 

a.Predictors：(Constant)，糖深度 

表3.方差分析结果 

a.Predctors：(Constant)，糖浓度 

b.Dependent Variable：消光度值 

表4.回归系数的显著性检验 

a.Dependent Variable：消光度值 

利用Excel也可获得回归方程，且方便、快捷(见图3)，但对回归方程显著性检验还需要在SPSS中进行。在Excel中，横坐标必须是葡萄糖标准溶液浓度(在Excel中标记为葡萄糖浓度)，纵坐标是OD值。具体作法是：选定葡萄糖浓度和OD值2列数据→图表向导→散点图→完成→点击数据点→右键→添加趋势线→类型中选择线性→选项中选择显示公式、 显示R平方值，即可获得回归方程： 

$\hat{y}=a+\mathrm{bx}=0.004x+0.0096$

步骤a5.计算可溶性糖含量： 

将测得的各样品OD值代入回归方程得到各样品浓度，再由下式计算可溶性糖含量： 

$C=\frac{\mathrm{SC}\×\mathrm{SV}\×\mathrm{SDR}}{\mathrm{SM}\×{10}^3}\×100\%$

式中，C表示可溶性糖含量；SC表示样品浓度；SV表示溶液体积；SDR表示样品溶液稀释倍数；SM表示样品质量。 

可利用Excel计算样品浓度和可溶性糖含量，尤其数据量较大时更加方便，请参见图3和图4所示。以图3为例，插入函数→=(D3-0.0096)／0.004→计算出第一个样品浓度，其余样品浓度通过直接下拉第一个样品浓度右下角黑色十字光标即可获得。 

本发明： 

(1)针对不同的实验条件和测定内容，选择不同的样品前处理方法，以保证实验条件的一致。 

在上述步骤a1中，将植物组织(如叶片)110℃杀青15min，若在野外，尤其还需测定其他数量指标如激素或酶，用记号笔于封口袋上分别标记，将样品迅速放入封口袋中，用细绳绑好放入液氮罐中冰冻至少15min，以减少可溶性糖、激素和酶等被呼吸的消耗量，这样可以保证实验条件的一致。然后70℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛。过40目筛子，可提高可溶性糖的提取效果。 

(2)简化实验步骤，即减少取样质量，取消离心、收集上清液、合并上清液、定容等步骤，在带塞的刻度试管中完成提取过程的探索，减少了时间和成本，尤其特别适合于大批量样品的测定。 

取样质量少，通常情况下不需稀释；取消离心、收集上清液、合并上清液、定容等步骤，在带塞的刻度试管中完成提取过程，减少了样品中可溶性糖损失和产生误差的可能性。 

(3)小细节上减少实验误差 

提前1h配置硫酸溶液，待温度降低至室温时，再准确称量蒽酮，立即进行蒽酮试剂的配置，即现用现配置，且每次开机都重新做标准曲线；提高活性碳质量至取样质量2倍；增加蒽酮试剂体积为10mL。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。 

Claims (7)

1.一种可溶性糖的测定方法，其特征在于，该具体过程为：

步骤a1.样品前处理：

将植物组织在110℃杀青15min，70℃烘干，粉碎，过40目筛；

步骤a2.蒸馏水提取可溶性糖：

称取20mg样品于10mL带塞的刻度试管中，加入10mL蒸馏水至该刻度试管中，盖好塞子，放在铝制试管架上；将其置于80℃水浴中浸提60min，向其中加40mg活性碳，盖好塞子，反复震荡摇匀；在该80℃水浴中脱色30min，取出冷却至室温，过滤后取滤液测定；

步骤a3.显色和比色：

取1mL蒸馏水提取液，向其内加入10mL蒽酮试剂，盖好塞子，反复震荡摇匀；在90℃水浴中保温15min，取出冷却至室温，在620nm处测定OD值；

步骤a4.制作标准曲线：

样品测定前，配制并测定葡萄糖标准溶液的OD值，以OD值对葡萄糖标准溶液浓度数值绘标准曲线并得到回归方程；

步骤a5.计算可溶性糖含量：

将测得的各样品OD值代入回归方程得到各样品浓度，并计算可溶性糖含量。

2.根据权利要求1所述的可溶性糖的测定方法，其特征在于，上述步骤a1中，若在野外，还需测定其他数量指标如激素或酶，用记号笔于封口袋上分别标记，将样品迅速放入封口袋中，用细绳绑好放入液氮罐中冰冻至少15min，以减少可溶性糖、激素和酶等被呼吸的消耗量。

3.根据权利要求1或2所述的可溶性糖的测定方法，其特征在于，上述步骤a3中，OD值在0.2～0.8之间。

4.根据权利要求1或2所述的可溶性糖的测定方法，其特征在于，上述步骤a4中，获取葡萄糖标准溶液的OD值的具体过程为：

取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解，转入500mL容量瓶中，制成200ug/mL的标准葡萄糖母液，然后再制成0～200ug/mL葡萄糖标准溶液，浓度依次为0，40，80，120，160，200ug/mL，测定不同浓度葡萄糖标准溶液的OD值。

5.根据权利要求1或2所述的可溶性糖的测定方法，其特征在于，上述步骤a3、a4中，提前1h配置硫酸溶液，待温度降低至室温时，再准确称量蒽酮，立即进行蒽酮试剂的配置，即现用现配置。

6.根据权利要求1或2所述的可溶性糖的测定方法，其特征在于，上述步骤a4中，用SPSS13.0进行直线回归分析，检验直线回归方程的显著性；利用Excel获取标准曲线，要求横坐标是葡萄糖标准溶液浓度，纵坐标是OD值。

7.根据权利要求1或2所述的可溶性糖的测定方法，其特征在于，上述步骤a5中，由下式计算可溶性糖含量：

$C=\frac{\mathrm{SC}\×\mathrm{SV}\×\mathrm{SDR}}{\mathrm{SM}\×{10}^3}\×100\%$

式中，C表示可溶性糖含量；SC表示样品浓度；SV表示溶液体积；SDR表示样品溶液稀释倍数；SM表示样品质量。

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