CN108467438A - 灵芝孢子粉壁多糖及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灵芝孢子粉壁多糖，所述灵芝孢子粉壁多糖由四种糖残基构成主链，由β‑D‑Glcp‑(1→和β‑D‑Glcp‑(1→4)‑β‑D‑Glcp‑(1→构成支链的葡聚糖。本发明还提供上述灵芝孢子粉壁多糖的制备方法。本发明方法处理后的灵芝孢子中可以获得两种多分支的β‑葡聚糖，在细胞水平没有表现出免疫作用，意外地，在多种动物免疫模型实验上，发现该多糖具有多种免疫调节活性，是灵芝孢子粉中的主要活性成分。因此，极大地扩展了灵芝孢子粉壁的再利用应用范围。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种灵芝孢子粉壁多糖及其提取方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)为多孔菌科灵芝属真菌，是一种具有扶正固本的传统珍贵药材。灵芝孢子粉是灵芝生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞。随着灵芝栽培技术的发展，灵芝孢子粉的产量越来越高，甚至超过子实体的产量。多糖是孢子粉中的主要活性成分之一，近十几年对灵芝孢子粉的功效也进行了大量的研究，发现具有多种生物活性，如提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤、抗辐射等。
灵芝孢子粉是灵芝的精华，是灵芝中主要药效和保健营养成份，但灵芝孢子服用后不易被人体消化。目前，灵芝孢子粉破壁方法主要是利用化学方法破壁或加热方法破壁，利用化学方法破壁是将灵芝孢子粉加入化学溶剂浸泡，然后再进行其它工艺处理，采用化学方法破壁，化学溶剂的成份难易分离干净，当人们与其它药物服用时，残留的化学物质可能与其它药物起反应，或者化学成份直接对人体造成损害；利用加热的方法，由于反复加热，温度过高，孢子内含活性物质被杀灭或其成份改变。
灵芝孢子化学成分有蛋白质、氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子等。灵芝孢子粉破壁后经二氧化碳超临界提取后，其中95％以上的孢子油被提取，剩下部分再用热水提取，游离的多糖、蛋白也大部分被提取。经两步法提取后的孢子粉壁中水和有机溶剂的可溶部分均较少，难以再进一步利用，目前作为废弃物处理。灵芝孢子粉的价格较高，提取后剩下的孢子粉壁占灵芝孢子粉总量的50-60％，因此有必要对灵芝孢子粉壁的再利用进行研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种灵芝孢子粉壁多糖，所述灵芝孢子粉壁多糖具有以下结构中的一种：
优选地，本发明所述的灵芝孢子粉壁多糖中，所述灵芝孢子粉壁多糖为由→3)-β-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Glcp-(1→、→4,6)-β-D-Glcp-(1→和→6)-β-D-Glcp-(1→四种糖残基构成主链，由β-D-Glcp-(1→和β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→构成支链的葡聚糖。
优选地，本发明所述的灵芝孢子粉壁多糖中，所述灵芝孢子粉壁多糖中单糖为葡萄糖。
本发明的另一方面为提供上述灵芝孢子粉壁多糖的制备方法，包括以下步骤：
1)称取灵芝孢子粉，沸水提取两次，离心后的残渣烘干破壁、脱脂后，再经沸水提取，离心后上清分级醇沉，经醇沉得到GLW和GLM两个灵芝孢子粉的胞壁多糖；
2)所述GLW胞壁多糖，利用50％的乙醇沉淀，沉淀部分命名为GLSW50；
3)用离子交换柱层析分离纯化所述GLSW50，水和氯化钠梯度洗脱，收集多糖分别命名为GLSW50A和GLSW50B；
4)所述GLSW50A经凝胶柱Sephacryl S-300HR进一步分离纯化，得到两个均一多糖GLSW50A-Ⅰ和GLSW50A-Ⅱ，即得。
优选地，本发明所述的灵芝孢子粉壁多糖的制备方法中，所述步骤1)中所述分级醇沉为分别经60％、75％醇沉得到GLW和GLM两个灵芝孢子粉的胞壁多糖。
优选地，本发明所述的灵芝孢子粉壁多糖的制备方法中，所述步骤1)中 GLW胞壁多糖的比例为大于70％。
优选地，本发明所述的灵芝孢子粉壁多糖的制备方法中，所述步骤4中所述GLSW50A-Ⅰ的含量为95.94％，分子量为1.526×105 Da；所述 GLSW50A-Ⅰ的含量为97.81％，分子量分别为3.860×104 Da。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：灵芝孢子化学成分有蛋白质、氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子等。而灵芝孢子粉破壁后经两步法提取后的孢子粉壁中水和有机溶剂的可溶部分均较少，难以再进一步利用，目前作为废弃物处理。灵芝孢子粉的价格较高，提取后剩下的孢子粉壁占灵芝孢子粉总量的50-60％。
然而，本发明发现处理后的灵芝孢子中可以获得两种多分支的β-葡聚糖，在细胞水平没有表现出免疫作用，但意外地，在多种动物免疫模型实验上，发现该多糖具有多种免疫调节活性，是灵芝孢子粉中的主要活性成分。因此，极大地扩展了灵芝孢子粉壁的再利用应用范围。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中的灵芝孢子粉壁多糖提取流程图；
图2为本发明的一个实施例中的GLSW50离子交换层析的洗脱曲线图；
图3为本发明的一个实施例中的GLSW50A-Ⅰ的HPGPC图谱；
图4为本发明的一个实施例中的GLSW50A-Ⅱ的HPGPC图谱；
图5为本发明的一个实施例中的多糖组分GLSW50A提升环磷酰胺免疫抑制小鼠碳粒廓清指数图。
具体实施方式
图1为本发明中一个实施例中的提取灵芝孢子粉壁多糖示意图。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，称取灵芝孢子粉，沸水提取两次，离心后的残渣烘干破壁、脱脂后，再经沸水提取，离心后上清分级醇沉，经60％、75％醇沉得到GLW 和GLM两个灵芝孢子粉的胞壁多糖。
其中GLW多糖的比例高，多糖含量大于70％，为灵芝胞壁多糖的主要成分，对这部分多糖进行进一步的分离纯化。GLW运用50％的乙醇沉淀，沉淀部分命名为GLSW50。运用离子交换柱层析分离纯化GLSW50，水和氯化钠梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法对收集的每管进行检测，得到的多糖曲线如图2，发现共有2个多糖峰，分别命名为GLSW50A和GLSW50B。
GLSW50A经凝胶柱Sephacryl S-300HR进一步分离纯化，得到两个均一多糖GLSW50A-Ⅰ(图3)和GLSW50A-Ⅱ(图4)，多糖含量分别为95.94％和97.81％，重均分子量分别为1.526×105 Da和3.860×104 Da。
对GLSW50A-Ⅰ和GLSW50A-Ⅱ进行完全酸水解，运用HPAEC分析各样品的单糖组成。结果如表3所示，这两个多糖单糖组成单一，仅由葡萄糖组成，因此这两个多糖均为葡聚糖。
表3：单糖组成分析
运用甲基化分析、红外、核磁共振氢谱和碳谱以及二维谱鉴定出结构。 GLSW50A-Ⅰ是由→3)-β-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Glcp-(1→、→4,6)-β-D-Glcp-(1→和→6)-β-D-Glcp-(1→四种糖残基构成主链，由β-D-Glcp-(1→和β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→构成支链的葡聚糖，其化学结构为：
GLSW50A-Ⅱ和GLSW50A-Ⅰ的主链以及支链糖残基类型一样，但是具体结构存在差异，其化学结构为：
因此，这两个结构的胞壁多糖均为多分支的β-葡聚糖，在细胞水平没有表现出免疫作用，但在多种动物免疫模型实验上，发现该多糖具有多种免疫调节活性，是灵芝孢子粉中的主要活性成分。
实施例2 GLSW50A-Ⅰ和GLSW50A-Ⅱ的生物学活性
由于上面处理的灵芝孢子粉多糖在淋巴细胞和巨噬细胞的模型上没有明显的生物活性，而从灵芝孢子粉壁中获得主要多糖组分GLSW50A在动物实验上表现出较好的生物活性，显著提升环磷酰胺免疫抑制小鼠碳粒廓清指数。因此，活性实验验证采用动物实验进行。
运用实施例1纯化的灵芝孢子粉壁多糖GLSW50A为阳性对照，剂量为 0.2g/Kg；超微粉碎破壁处理0.5h的孢子粉壁壳样品(GLP1，多糖含量为2％)，三组剂量分别为0.5g/kg、1g/kg、2g/kg；另选用对应未处理的孢子粉壁壳GLP2，剂量为2g/kg。
运用ICR小鼠，雌雄各半，体重18～22g，连续灌胃给药7天，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，给药体积20ml/kg，除空白组外其余组在第1、3、5天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，空白组腹腔注射等体积生理盐水。末次给药后2h，小鼠尾静脉注射印度墨水10ml/kg，分别于其后2和10分钟，眼眶采血20μl，加入装有0.1％NaHCO3溶液2ml的试管，充分混匀，650nm 处测定吸收度OD值，按下列公式计算廓清指数(K)。
K＝(Log OD2-Log OD10)/(10-2)
研究结果如图5显示，与对照组相比，模型组小鼠廓清指数(K)显著下降(P<0.05)。超微破壁处理的灵芝孢子粉壁壳样品GLP1-1g/kg(P<0.05)， GLP1-2g/kg(P<0.01)和对应未处理的孢子粉壁壳样品GLP2-2g/kg(P<0.05) 都能够显著升高环磷酰胺免疫抑制小鼠的廓清指数，而GLP1-0.5g/kg有上调的趋势，但无统计学差异。而阳性药组(GLSW50A-0.2g/kg)较模型组小鼠K 值有极显著上调作用(P<0.01)。
因此，孢子粉壁壳经破壁处理后在1g/kg和2g/kg的剂量下对环磷酰胺引起的免疫抑制都有显著拮抗作用，且高剂量2g/kg达到极显著水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种灵芝孢子粉壁多糖，其特征在于，所述灵芝孢子粉壁多糖具有以下结构中的一种：
2.根据权利要求1所述的灵芝孢子粉壁多糖，其特征在于，所述灵芝孢子粉壁多糖为由→3)-β-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Glcp-(1→、→4,6)-β-D-Glcp-(1→和→6)-β-D-Glcp-(1→四种糖残基构成主链，由β-D-Glcp-(1→和β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→构成支链的葡聚糖。
3.根据权利要求1所述的灵芝孢子粉壁多糖，其特征在于，所述灵芝孢子粉壁多糖中单糖为葡萄糖。
4.一种如权利要求1～3任一项所述灵芝孢子粉壁多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取灵芝孢子粉，沸水提取两次，离心后的残渣烘干破壁、脱脂后，再经沸水提取，离心后上清分级醇沉，经醇沉得到GLW和GLM两个灵芝孢子粉的胞壁多糖；
2)所述GLW胞壁多糖，利用50％的乙醇沉淀，沉淀部分命名为GLSW50；
3)用离子交换柱层析分离纯化所述GLSW50，水和氯化钠梯度洗脱，收集多糖分别命名为GLSW50A和GLSW50B；
4)所述GLSW50A经凝胶柱Sephacryl S-300HR进一步分离纯化，得到两个均一多糖GLSW50A-Ⅰ和GLSW50A-Ⅱ，即得。
5.根据权利要求4所述的灵芝孢子粉壁多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中所述分级醇沉为分别经60％、75％醇沉得到GLW和GLM两个灵芝孢子粉的胞壁多糖。
6.根据权利要求4所述的灵芝孢子粉壁多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中GLW胞壁多糖的比例为大于70％。
7.根据权利要求4所述的灵芝孢子粉壁多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4中所述GLSW50A-Ⅰ的含量为95.94％，分子量为1.526×105Da；所述GLSW50A-Ⅰ的含量为97.81％，分子量分别为3.860×104Da。
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